part1 - QCNet

Bio-Rad Laboratories Munich Manufacturing
Biogenní aminy
pro HPLC
Dny kontroly kvality a speciálních
metod HPLC Bio-Rad
Lednice
8.-9. Listopadu, 2012
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories
München, Germany
Biogenní aminy
Biogenní aminy
Močové katecholaminy
Močové metanefriny
VMA/HVA/5-HIAA
(Kyseliny vanilmandlové (VMA), homovanilová kyselina (HVA), 5-Hydroxyindoloctová kyselina(5-HIAA))
Serotonin
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Klinické souvislosti
Proč měřit Biogenní Aminy:
- zvýšené vylučování biogenních aminů je ukazatelem pro nádory
chromafinní tkáně
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Klinické souvislosti
Biogení Aminy:
Katecholaminy :
- Epinefrin (Adrenalin)
- Noradrenalin
Kyseliny vanilmandlové (VMA)
Homovanilová kyselina (HVA)
- Dopamin
Metanefriny :
- Metanefrine
- Normetanefrine
- 3-Methoxythyramine
Serotonin
Tyto látky jsou vylučovány nádory v
chromafinní tkáni v ledvinách
=> Phaechromocytoma
(Feochromocytom)
5-Hydroxyindoloctová kyselina
(5-HIAA)
Tyto látky jsou vylučovány
enterochromafiními buňkami v např.
gastrointestinálním traktu
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Biogenní aminy – metabolismus
Tyrosine
Trypthophane
3-Methoythyramine
L-Dopa
Homovanillic Acid (HVA)
Dopamine
Serotonin
Normetanephrine
5-Hydroxyindolacetic Acid (5-HIAA)
Norepinephrine
Epinephrine
Vanilmandelic Acid (VMA)
Metanephrine
Metanephrines by HPLC
VMA/HVA/5-HIAA by HPLC
Catecholamines by HPLC
Serotonin by HPLC
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Biogenní aminy – chemické vlastnosti
HO
CH(OH)
CH2
NHCH3
H3CO
CH(OH)
CH2
NHCH3
H3CO
HO
HO
Epinephrine
HO
VMA/HVA/5-HIAA
Metanefriny
Katecholaminy
CH2
NH2
HO
H3CO
Vanilmandelic acid
CH(OH)
CH2
NH2
H3CO
HO
Norepinephrine
COOH
HO
Metanephrine
CH(OH)
CH(OH)
CH2
COOH
HO
Normetanephrine
Homovanillic acid
CH2
COOH
HO
HO
CH2
CH2
NH2
H3CO
CH2
CH2
NH2
NH2
N
HO
CH2
HO
HO
N
Dopamine
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
3-Methoxythyramine
5-Hydroxyindolacetic acid
H
Serotonin
CH2
Katecholaminy
Katecholaminy:
- Epinefrin (Adrenalin)
- Noradrenalin
- Dopamin
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Chemická struktura
HO
CH(OH)
CH2
NHCH3
HO
HO
HO
Noradrenalin
Adrenalin
HO
CH2
HO
Dopamin
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
CH2
NH2
CH(OH)
CH2
NH2
Vzorky
Druh vzorku:
- moč (24h, acidofilní)
žádná káva, banany, ananas, ořechy
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Princip separace u katecholaminů
4. Krok: Uvolnění z kolonky SP
1. Krok: Acidifikace
HO
HO
CH(OH)
CH2
NH3
OH
OOC
B
OH
HO
HO
HO
CH(OH)
O
B
HO
2. Krok: Vazba na separační kolonku (SP)
HO
HO
CH(OH)
CH2
NH3
OOC
Binding of positiv charged molecules
3. Krok: Promytí
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
NH2
Catechol-specific release
O
5. Krok: Acidifikace
HO
CH2
CH(OH)
CH2
HO
6. Krok HPLC analýza
NH3
HPLC Analýza
HO
Chromatografie
CH(OH)
CH2
NH3
HO
O
O
S
O
- chromatografie na reverzní fázi za vzniku dynamického
iontoměniče
Detekce
HO
CH(OH)
CH2
NHCH3
- Elektrochemická detekce (ELCD)
HO
HO
Oxidace na ELCD
O
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Norepinephrine - 4.07
Chromatogram
0.0
2.5
5.0
Nová verze
Dopamine - 9.84
Internal Standard - 6.54
Epinephrine - 4.70
Stará verze
7.5
Time (min.)
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
10.0
12.5
Nová souprava pro Močové
katecholaminy
Nové
(kat.č. 195-5370 / 195-5380)
•
Další reagencie pro rozpuštění a úpravu pH
•
Automatická kontrola pH u močových vzorků
•
•
Nový druh analytické kolony
Nová mobilní fáze
=> lepší separace
=> méně nebezpečné (žádný methanol)
=> stále kompatibilní se soupravou pro
Metanefriny
=> Mobilní fáze a kolona nejsou kompatibilní se
strarou verzí kitu
=> Příprava vzorku není kompatibilní se starou
mobilní fází
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Staré
•
(kat.č. 195-5841N / 195-5700)
Dostupné do března 2013
Močové metanefriny pro HPLC
Složení testu
•
•
(195-5370)
Souprava reagencií
REAG A
REAG B
REAG C
Acidic Reagent
Basic Reagent
Reconstitution Reagent
REAG 1
REAG 2
REAG 3
Dilution Reagent
Wash Reagent
Elution Reagent
DISP COL
Disposable Columns
INT STND
CAL
MP
Internal Standard
Calibrator
Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)
HPLC kolony
ANTL CRTR
Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.)
Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)
•
Nutné vybavení laboratoře
Vortex mixér
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Přehled produktu
• Příprava vzorku
– Acidifikace
– Iontová výměnná chromatografie
• HPLC Analýza
– Chromatografie na reversní fázi
– Isokratická eluce
– Iontové párování
– Elektrochemická detekce
=> Analytická kolona a mobilní fáze je identická jako
pro soupravu na Metanefriny
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Metanefriny
Metanefriny :
- Metanefrin
- Normetanefrin
- 3-Methoxythyramine
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Biogenní aminy – metabolismus
Tyrosine
3-Methoxythyramine
L-Dopa
Homovanillic acid
Dopamine
Normetanephrine
Norepinephrine
Epinephrine
Vanillylmandelic Acid
Metanephrine
Catecholamines
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Metanephrines
VMA/HVA
Chemická struktura
H3CO
CH(OH)
CH2
NHCH3
HO
HO
Normetanefrin
Metanefrin
H3CO
H3CO
CH2
CH2
HO
3-Methoxythyramin
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
NH2
CH(OH)
CH2
NH2
Vzorky
Druh vzorku:
- moč (24h, acidofilní)
zde není dietní omezení
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Separační princip u staré soupravy
1. Krok: Kyselá hydrolýza
Dekonjugace metanefrinů
5. Krok: Vazba na anion-intoměničovou
separační kolonku
H3CO
2. Krok: Komxletování katecholaminů
Borátový komplex v zásaditém prostředí
CH(OH)
CH2
NH2
CH2NR O
Odstranění nefenolických aminů
3. Krok: Vazba na kation-intoměničovou
separační kolonku
H3CO
CH(OH)
CH2
NH3
6. Krok: Uvolnění z kolonky
OOC
CH2NR
Vazba positivně nabitých molekul:
- Borát-Katecholaminový-komplex není vázán
- odstranění katecholaminů
HO
4. Krok: Uvolnění z kation-intoměničové
separační kolonky
NH4
H3CO
CH(OH)
CH2
O
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
OOC
NH2
H3CO
Změna pH
CH(OH)
HO
7. Krok: HPLC analýza
H3CO
HO
CH(OH)
CH2
NH3
CH2
NH3
Separační princip u nové soupravy
1. Krok: Kyselá hydrolýza
Dekonjugace metanefrinů
4. Krok: Eluce
Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem
(borát-komplex s vyšším pH)
2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou
separační kolonku
H3CO
HO
CH(OH)
CH2
NH3
OOC
OOC
H3CO
HO
B
Vazba kladně nabitých molekul
HO
3. Krok: Promytí
Promývací krok s destilovanou vodou
Odstranění slabě navázaných molekul
4. Krok: Promytí
Promytí borátovým roztokem
Odstranění katecholaminů
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
OH
OH
O
CH(OH)
CH2
Změna pH
NH2
Frakcionovaná eluce
5 ml Reag 3
promytí
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
4 ml Reag 3
eluce
množství Reag 3 / pH
Separační princip u nové soupravy
1. Krok: Kyselá hydrolýza
Dekonjugace metanefrinů
4. Krok: Eluce
Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem
(borát-komplex s vyšším pH)
2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou
separační kolonku
H3CO
HO
CH(OH)
CH2
NH3
OOC
OOC
H3CO
HO
HO
Promývací krok s destilovanou vodou
Odstranění slabě navázaných molekul
O
CH2
OH
5. Krok: změna pH
H3CO
CH(OH)
CH2
pH shift
HO
4. Krok: Promytí
Promytí borátovým roztokem
Odstranění katecholaminů
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
NH2
Změna pH
B
Vazba kladně nabitých molekul
3. Krok: Promytí
OH
CH(OH)
6. Krok: HPLC-Analýza
NH3
HPLC Analýza
H3CO
Chromatografie
CH(OH)
CH2
NH3
HO
O
O
S
O
- chromatografie na reverzní fázi za vzniku dynamického
iontoměniče
Detekce
- Electrochemická detekce (ELCD)
H3CO
CH(OH)
CH2
NHCH3
HO
H3CO
Oxidace na ELCD
O
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Chromatogram
Stará verze
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Nová verze
Souprava pro močové Metanefriny
Nový
•
•
•
•
(Kat.č. 195-5410 / 195-5420)
Příprava vzorku pomocí jedné separační
kolonky
Automatická kontrola pH vzorků moči
Nový druh analytické kolony
Nová mobilní fáze
=> lepší separace
=> méně zdraví nebezpečné (žádný MeOH)
=> stále plně kompatibilní se soupravou pro
Katecholaminy
=> Mobilní fáze a kolona nejsou kompatibilní se
starou verzí soupravy
=> Příprava vzorku není kompatibilní s starou
mobilní fází
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Starý
•
•
(Kat.č. 195-5935 / 195-6087)
Dvě separační kolonky
Dostupné do března 2013
Souprava pro močové Metanefriny
Přehled produktu:
•
Příprava vzorku
– Kyselá hydrolýza
Dekonjugace metanefrinů
– Katexová chromatografie
Odstranění interferujících látek a katecholaminů
– Eluce
frakční eluce
•
HPLC Analýza
– Chromatografie na reversní fázi
– Iontové párování
– Elektrochemická detekce
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Souprava pro močové Metanefriny
Komponenty testu
•
•
(195-5410)
Reagencie v soupravě
REAG A
REAG B
REAG C
Acidic Reagent
Basic Reagent
Reconstitution Reagent
REAG 1
REAG 2
REAG 3
Hydrolysis Reagent
Dilution Reagent
Wash/Elution Reagent
DISP COL
Disposable Columns
INT STND
CAL
MP
Internal Standard
Calibrator
Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)
HPLC kolona
ANTL CRTR
Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.)
Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)
•
Nutné vybavení laboratoře
Vortex mixér, vodní lázeň
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
VMA/HVA/5-HIAA
VMA/HVA/5-HIAA:
- Kyselina vanilmandlová (VMA)
- Homovanilová kyselina (HVA)
- 5-Hydroxyindoloctová kyselina (5-HIAA)
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Chemická struktura
H3CO
CH(OH)
COOH
H3CO
CH2
COOH
HO
HO
Kyselina vanilmandlová
Homovanilová kyselina
CH2
COOH
HO
N
5-Hydroxyindoloctová kyselina
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Vzorky
Druh vzorku:
- moč (24h, acidofilní)
žádná káva, čaj, čokoláda, banány, vanilka či oříšky
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Separační princip pro VMA/HVA/5-HIAA
1. Krok: Příprava vzorku pro vazbu
4. krok: Promytí
Promytí s (Reag 1)
H3CO
CH(OH)
COO
+ (Reag 1) a IS
HO
2. Krok: Příprava separační kolonky
5. Krok: Uvolnění analytu ze separační kolonky
Hydrogensulfát sodný
R N
HO S O
O R N
Strong Anion Exchange Resin + Buffer (Reag 1)
3. Krok: Vazba na kolonku
H3CO
CH(OH)
COO
R N
H3CO
CH(OH)
HO
HO
Binding of positiv charged molecules
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
O
6. Krok: HPLC analýza
COO
HPLC Analýza
H3CO
CH(OH)
Chromatografie
COO
H3C
HO
Detekce
H3CO
CH(OH)
COO
HO
H3CO
Oxidace na ELCD
O
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
N
R
- chromatografie na reverzní fázi za vzniku dynamického
iontoměniče
- Elektrochemický detektor (ELCD)
R
CH3
Chromatogram
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
VMA/HVA/5-HIAA pro HPLC
Přehled produktu
• Příprava vzorku
– Okyselení
– Iontoměničová chromatografie
• HPLC analýza
– Reverzní fáze
– Isokratická eluce
– Iontové párování
– Elektrochemická detekce
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
Electropherogram
[%]
100
90
Detected Analyte
80
70
60
50
40
30
20
10
300
400
500
600
700
Electrochemical Cell Potential
Internal Standard
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
800
900
[mV]
VMA/HVA/5-HIAA souprava pro HPLC
Komponenty testu:
•
•
Reagenční spouprava
REAG 1
REAG 2
DISP COL
Wash Reagent
Elution Reagent
Disposable Columns
INT STND 1
INT STND 2
CAL
MP
Internal Standard 1
Internal Standard 2
Calibrator
Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)
TEST MIX
Test mix
HPLC kolona
ANTL CRTR
Analytical Column (RP, 500 Inj.)
Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)
•
Vybavení laboratoře
Vortex Mixér, Centrifuga
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
VMA rychlá metoda
VMA rychlá methoda
• Analýza pouze VMA
• Snížení doby chromatografie (20
11 min)
• 2 vnitřní standardy (HICA + HIVA) v oddělených
lahvičkách
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
VMA rychlá metoda
triple test
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich
pouze VMA
Děkuji za pozornost!
Dr. Reiner Krey
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich