Stanovení glukosaminu ve výživových doplňcích pomocí kapilární

3. Stanovení glukosaminu ve výživových doplňcích
pomocí kapilární elektroforézy
Glukosamin (2-amino--2-deoxyglukóza) je klíčovou složkou chrupavky.
chrupavky Tento
monosacharid je široce distribuován ve tkáních lidského organismu jako složka
glykosaminoglykanů. Některé studie prokázaly,
prokázaly že glukosamin je účinný při zmírnění bolesti
při osteoartróze a zmírňuje artritidu. Výrobky obsahující glukosamin jsou komerčně
dostupné po celém světě jako doplňky stravy,
stravy a proto je důležité kontrolovat jejích obsah a
kvalitu.
Obr. 1. Struktura glukosaminu.
HPLC se spektrofotometrickou,
spektrofotometrickou fluorescenční detekcí a detekcí pomocí indexu lomu
jsou často využívány pro analýzu glukosaminu v potravinových doplňcích.
doplňcích. Stanovaní pomocí
kapilární elektroforézy nabízí kratší čas analýzy a nižší náklady. Nicméně,
Nicméně pro použití UV
detekce je nezbytná derivatizace,
derivatizace jelikož glukosamin neobsahuje žádný UV-absorbující
UV
chromofor.
Mezi
běžné
derivatizační
činidla
patří
o-ftalaldehyd,
N-(9-fluorenylmethoxykarbonyloxy)
fluorenylmethoxykarbonyloxy)sukcinimid a kyselina anthranilová.. O-ftalaldehyd má
vysokou reaktivitu vůči primárním aminům,
aminům reakce probíhá rychle už při pokojové teplotě a
dá se snadno automatizovat.
Obr. 2. Struktura o-ftalaldehydu.
Kapilární elektroforéza je separační technika založena na elektroforetické migraci iontů
v elektrickém poli, k separaci dochází na základě různé pohyblivosti jednotlivých látek.
Separace je uskutečňována v kapiláře, která je vyrobena z taveného křemene a je pokryta
vrstvou polyimidu, který zabezpečuje mechanickou odolnost. Polyimid je opticky
nepropustný, proto v místě detekce je potřeba jeho vrstvu odstranit. Konce kapiláry jsou
umístěny v nádobkách se separačním elektrolytem a do nádobek jsou vloženy platinové
elektrody. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí
od 0 do 30 kV. Separované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru, který je umístěn
na opačném konci kapiláry než dávkovaný vzorek.
Nejčastěji využívaný detektorem je spektrofotometrický založený na měření
absorbance v detekčním okénku na kapiláře. Při průchodu látky absorbující záření při zvolené
vlnové délce je zaznamenán úbytek intenzity záření, signál je sledován v závislosti na čase a
výsledný záznam se nazývá elektroferogram. Sledovány jsou obvykle látky, které obsahují
chromofor; je však možné využít nepřímé spektrofotometrické detekce, kdy elektrolyt
obsahuje vhodnou absorbující látku pro sledování látek, které neabsorbují záření při zvolené
vlnové délce. Druhou možností je derivatizovat sledované látky činidlem, které obsahuje
chromofor.
Derivatizaci je možné provádět během úpravy vzorku, avšak pokud jsou podmínky
derivatizační reakce nenáročné na teplotu a reakce je rychlá, je možné tento krok provést
přímo v kapiláře během vlastní separace. Výhodou tohoto provedení je úspora počtu kroků
při úpravě vzorku, zejména času, ale také materiálu; tento proces je možné snadno
automatizovat, čímž se významně zvyšuje prostupnost vzorků. Derivatizace může být
provedena nadávkováním zón vzorku a derivativního činidla vedle sebe a působením difuze
nebo vlivem migrace v elektrickém poli dojde k promíchání jednotlivých zón. Jinou možností
je použití základního elektrolytu, jehož součástí je i derivatizační činidlo. Pokud analyzovaný
produkt absorbuje záření při jiné vlnové délce než samotné činidlo, lze tento přístup použít
pro zlepšení výtěžku derivatizační reakce, jelikož je zaručeno, že derivatizační činidlo je
v nadbytku oproti stanovované látce.
V případě derivatizace glukosaminu pro analýzu kapilární elektroforézou je nutné
zvolit derivatizační podmínky tak, aby výsledný produkt obsahoval jednak chromofor, ale
také funkční skupinu schopnou disociace, aby vzniklý produkt migroval v elektrickém poli.
Z tohoto důvodu je do základního elektrolytu přidána kyselina merkaptopropionová; produkt
této reakce (obr. 3.) nese karboxylovou funkční skupinu, v zásaditém základním elektrolytu
tedy bude migrovat jako aniont.
Obr. 3. Derivatizační reakce o-ftalaldehydu v přítomnosti primárního aminu a kyseliny
merkaptopropionové.
Praktická část
Vybavení:
Agilent HP3DCE s UV detektorem, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, centrifuga, váhy
Pomůcky:
Kádinky, odměrné baňky, odměrný válec, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, křemenná
kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 48,5 cm), řezátko, vialky, centrifugační
zkumavky, eppendorfky
Chemikálie:
Boritá kyselina, NaOH, o-ftalaldehyd, merkaptopropionová kyselina, standard glukosaminu,
deionizovaná voda
Pracovní postup
Příprava elektrolytu:
- 20 mM boritá kyselina + 5 mM merkaptopropionová kyselina | NaOH pH 9,2
- odpovídající množství borité kyseliny rozpusťte v deionizované vodě
- přidejte merkaptopropionovou kyselinu, aby její koncentrace byla 5 mM
- přidejte odpovídající množství NaOH pro přípravu pufru o pH 9,2
- v plastové nádobce připravte 10 mL 5 mM roztoku o-ftalaldehydu v připraveném
roztoku borité a merkaptopropionové kyseliny a NaOH
Příprava standardů:
- ze zásobního roztoku odpipetujte odpovídající množství pro přípravu standardu
glukosaminu o koncentraci 20, 40, 60, 100 a 150 µg/mL
Příprava vzorku:
- navažte 100 mg přípravku a rozpusťte v 10 ml deionizované vody
- umístěte do ultrazvuku na 5 minut
- roztok přeneste do centrifugačních zkumavek, centrifugujte 5 min při 10 000 rpm
- supernatant 10x zřeďte a přeneste do vialky pro analýzu
Příprava separační kapiláry:
- podle pokynů vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry
- ve vzdálenosti 8,5 cm odstraňte pomocí vypalovače vrstvu polyimidu a okénko
otřete gázou navlhčenou v metanolu
- podle pokynů vedoucího cvičení umístěte kapiláru do interface a vložte kapiláru do
přístroje
- kapiláru promyjte 5 minut 1M NaOH, 5 minut vodou, a následně separačním
elektrolytem; nastavte parametry metody (25 kV, detekce při 340 nm, nástřik 50
mbar 5 sekund)
Měření vzorků:
- proměřte kalibrační roztoky glukosaminu
- proměřte vzorek, v případě potřeby vzorek nařeďte
- pomocí kalibrační křivky stanovte množství glukosaminu v přípravku
Vyhodnocení:
Vyhodnoťte plochy píků z měření roztoků glukosaminu o různých koncentracích. Vytvořte
kalibrační závislosti plochy glukosaminu na jeho koncentraci. Porovnejte záznamy
standardního roztoku a vzorku, na základě migračních parametrů rozhodněte, který ze
signálů patří glukosaminu a vypočítejte jeho množství v přípravku (mg/g).
Otázky k prozkoušení:
1. Proč je nutné glukosamin derivatizovat? Nakreslete strukturu produktu.
2. Jaké jsou výhody derivatizačního kroku přímo v kapiláře?
3. Proč je nutné odstranit polyimid z kapiláry v místě detekce?
Doporučená literatura:
1. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and
Sons Ltd, New York 1995.
2. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulík K. a kol.
3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod,
Chemické listy, 91 (1997) 320 – 329, V. Kašička.
4. Winter R.: A Consumer's Dictionary of Food Additives, 7th Edition, 2009.