Časopis - Beckman Coulter

Transkript

informační magazín číslo 11 - 2009
CENA ARNOLDA BECKMANA – VYHLÁŠENÍ VÍTĚZŮ
MEMBRÁNOVÉ MOLEKULY KREVNÍCH DESTIČEK
ŠTÍTNÁ ŽLÁZA A TĚHOTENSTVÍ
NOVINKA NA TRHU – DXH800
Jak se u nás probojovávala
imunologie jako obor - výzkum,
uplatnění a výhled do budoucnosti
Rozhovor s významným českým imunologem, nositelem
státního vyznamenání Prof. MUDr. Ivem Hánou, CSc.
Pane profesore, je o Vás známo, že jste se
významně podílel na prosazení imunologie
jako oboru biologie a především klinické
imunologie jako oboru medicíny u nás.
Jistě to nebylo nic snadného… Co všechno
tomu předcházelo?
Imunologie u nás pochopitelně nezačala existovat až
po druhé světové válce, jak by se mohlo zdát při
nahlédnutí do současných análů nebo kongresových
sborníků. Poznatky, práce a výuka byly dříve skryty pod
hlavičkami jiných, tehdy již uznaných medicínských
oborů, především pod mikrobiologií (ještě dříve bakteriologií a patologií) a infektologií, ale dotýkaly se jí
i jiné obory jako interna, pediatrie a další. Je třeba se
zmínit, že již ve 30. letech vyšla u nás Kabelíkova Serologie jako předzvěst startujícího samostatného oboru.
Ovšem vlastní rozkvět moderní imunologie musíme
položit až do doby po druhé světové válce, kdy došlo
ve světě k doslovné renesanci imunologického bádání
a poznatků a vlastnímu vymezení tohoto oboru proti těm oborům medicíny
a biologických věd, pod nimiž se tato vědecká sféra do té doby skrývala.
Tento pokrok byl samozřejmě zachycen také u nás v Československu – již
od začátku 50. let vznikla v Praze centra základního výzkumu v tehdejší Československé akademii věd (ČSAV) po vedením Jaroslava Šterzla a Milana Haška. To ale ještě neznamenalo, že imunologie byla uznána jako samostatná
vědní disciplína v medicíně a na vysokých školách. Existovala sice již zmíněná
a ve světě uznávaná tzv. Pražská imunologická škola (v ČSAV), ale dopad do
praxe na univerzitách a na práce v terénu nebyl zatím příliš patrný. Bylo nutno překonávat předsudky, někdy i určitou nechuť ke změnám, a tak nastávala fáze zahajování imunologických studií pomocí zapálených jedinců a celých
skupin, především mladých studentů a vědců. Ve druhé polovině 50. let se
začala vytvářet další centra výzkumu (např. Bratislava, Brno, Plzeň, Ústí nad
Labem, Martin, Banská Bystrica, Hradec Králové, České Budějovice, Olomouc,
Košice a další). Pozvolna se však objevovala také snaha aplikovat nové a často revoluční poznatky v medicínské (humánní a veterinární) praxi. Ve výzkumných ústavech se vytvořily celky nadšenců, kteří hltali nové údaje ze světové
literatury, jejíž dostupnost však byla většinou omezena jen na komunistickou
vládou fundované knihovny ve výzkumných ústavech, ČSAV a některých univerzitách, což pochopitelně práce a studie redukovalo jen na určité lokality.
Velice omezená byla i možnost zúčastnit se vědeckých kongresů v zahraničí,
která byla vyhrazena, zvláště v počátcích, prakticky jen pro členy komunistické strany, normálním vědeckým pracovníkům se to podařilo jako zcela výjimečný případ.
Rozhodně velice významnou pomocí pro rozvoj imunologie bylo vytváření
vědeckých společností, které v tehdejší době mezinárodní izolace, danou
2
komunistickým režimem, umožňovaly přece jen
určité šíření informací, přednášky. Později začaly
úspěšně organizovat i zájezdy na vědecké kongresy do zahraničí, které se tak stávaly dostupnými
i pro řadové členy. V Československu existovala
dvě seskupení zájemců o obor věnující se imunologickým otázkám teorie i praxe. Jejich osud však
nebyl identický. Jednou skupinou byla Česká alergologická společnost, později přejmenovaná na
Československou společnost alergologie a klinické
imunologie (ČSAKI), zabývající se převážně otázkami alergologické praxe bez výrazného zdůrazňování nejnovějších poznatků základního imunologického výzkumu. Tato společnost byla
vládnoucími kruhy uznána a legalizována. Druhou
skupinu tvořili zájemci o nejširší pojetí imunologie se všemi jejími odvětvími základního i aplikovaného výzkumu (včetně antiinfekční imunologie,
alergologie, veterinární imunologie, imunopatologie, transplantační imunologie atd.). Tato skupina byla z politických důvodů po roce 1968 dlouho
doslova proskribována, ačkoli měla výbornou
základnu právě ve zmíněné a uznávané Pražské
imunologické škole. I když její členstvo bylo v podstatě stále stejné a početné, prodělávalo sdružení
martyrium, jak dosvědčují jeho měnící se názvy:
Obsah
Časopis vydává a distribuuje
IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10
www.beckman.cz
Časopis připravují
Ing. Vanda Filová, PhD.
Ing. Kateřina Kožaná
Ing. Eva Králová
Ing. Hana Krátká
Mgr. Pavel Kružík
RNDr. Helena Kurzweilová, CSc.
Ing. Kateřina Lapišová
RNDr. Běla Říčařová, CSc.
Ing. Petr Suchan
Mgr. Patrik Šaf
RNDr. Jozef Smolka
Do časopisu přispěli
Prof. MUDr. Ivo Hána, CSc. - Rada vědeckých
společností ČR
RNDr. Běla Říčařová, CSc..
RNDr. Lubica Dráberová, CSc. - Ústav molekulární
genetiky AV ČR
MUDr. Martin Hřebíček - VFN a 1. LF UK
Ing. Ladislav Kmoch, CSc. - VFN a 1. LF UK
Mgr. Helena Skalníková, PhD. - Ústav živočišné
fyziologie a genetiky AV ČR
Ing. Eva Králová
Ing. Roman Vlček
Mgr. Pavel Kružík
RNDr. Kristián Koubek, DrSc. - Ústav hematologie
a krevní transfúze
Ing. Drahomíra Springer - VFN a 1. LF UK
RNDr. Zdeněk Veškrna - Nemocnice Znojmo
Ing. Mgr. Tereza Tietze
Ing. Kateřina Lapišová
Prim. MUDr. Annamária Bratková - 1. Súkromná
nemocnica Košice-Šaca
PharmDr. Eva Žemberová - RIA laboratórium s.r.o.
Ing. Petr Boudal
Bc. Jozefína Bernátová
Ing. Vanda Filová, PhD.
MUDr. Jana Granátová - Fakultní Thomayerova
nemocnice
RNDr. Štěpán Tintěra
Petr Jabůrek
Ing. Hana Krátká
Ing. Kateřina Kožaná
Ivan Šarkan - autor křížovky
Grafická podoba
Nina Nováková
Tiskárna
REPRO servis s. r. o.
Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5
Náklad čísla
1600 výtisků
Jak se u nás probojovávala imunologie jako obor
– výzkum, uplatnění a výhled do budoucnosti
2
Cena Arnolda Beckmana – Vyhlášení vítězů
7
Cena Arnolda Beckmana – 1. místo v kategorii
Buněčná biologie a imunologie
8
Genomika a genetika nukleových kyselin
9
Proteomika
11
Revoluční novinka v oblasti pH metrů
13
Pozvánka na akci DNA Analýza VI.
13
Nový počítač buněk a částic MULTISIZERTM 4
14
Cytometrická analýza
14
Nové výrobky Binding Site
15
Membránové molekuly krevních destiček
16
Poruchy funkce štítné žlázy v těhotenství
21
Ověření referenčního rozmezí FT4 při použití
soupravy Access Free T4 firmy Beckman Coulter
23
Anemie
24
Vyšetrenie protilátok proti vnútornému
faktoru pri pernicióznej anémii
24
UniCel DxH koncept – nová éra
v laboratorní hematologii
26
Predstavujeme ACL TOP 500 CTS
od výrobcu Instrumentation Laboratory
27
Nová ultrasensitivní ELISA souprava
na stanovení PAPP-A
30
Indikátorové proteiny v moči (3) – hematurie
31
Obchodní útvar
38
Útvar CAS / LOGISTIKA
39
Setkání uživatelů RIA a imunochemických
systémů Beckman Coulter
40
Pražská padesátka
41
Křížovka o ceny
42
Kde se můžeme setkat (leden – červen 2009)
44
3
Přípravná komise Československé společnosti imunologické, poté už Imunologická sekce Československé biologické společnosti ČSAV. Teprve v době
politického tání došlo konečně k založení a uznání Československé imunologické společnosti (ČSIS) jako reprezentanta všech odvětví imunologie u nás.
Vzpomínám, že jsem se jako vedoucí Subkomise lékařské imunologie tehdejší Československé společnosti mikrobiologické ČSAV stal v roce 1974 členem výboru Imunologické sekce. V této funkci jsem pokračoval i v ČSIS a ČIS
nepřetržitě až do roku 2003, protože jsem v této činnosti viděl ohromný
potenciál pro rozvoj oboru. Za výrazné pomoci pracovníků Imunologického
oddělení Mikrobiologického ústavu ČSAV se pořádaly přednášky, instruktáže,
kurzy a pracovní imunologické konference v různých místech republiky. První
kongres ČSIS s několika stovkami nadšených účastníků zorganizoval v roce
1976 Jindra Lokaj v Brně. Byl to velký přínos. Následovaly kongresy na různých místech v Čechách, na Moravě a na Slovensku. Po revoluci se mi podařilo v roce 1994 zorganizovat 7. Kongres českých a slovenských imunologů
(tak zněl oficiální název), poprvé v Praze, ve Svatoanežském klášteře. Akce
byla velmi úspěšná také díky výrazné účasti imunologických špiček ze zahraničí. Kongresy českých a slovenských imunologů pokračovaly dále i po rozdělení ČSIS na Českou imunologickou společnost (ČIS) a Slovenskou imunologickou společnost (SIS) až do současné doby s jedinou změnou, a to že
poslední z nich byly již organizovány společně s rovněž rozdělenou Českou
a Slovenskou společností alergologie a klinické imunologie. Dochází tak pozitivně k užšímu propojení teorie a praxe, i když někdy alergologická problematika trochu disproporčně převažuje a opakuje již známá fakta.
V otázce byl ovšem zmíněn proces vzniku imunologie jako oboru u nás. To
je sice navazující, ale trochu jiná historie. Prosadit nový obor je vždy otázkou
nejen jeho náplně, ale i vymezení vůči oborům stávajícím. To vyžaduje někdy
značné úsilí, taktiku a v současné době, řekli bychom, lobování. Vytvořit obor
fakticky je snazší než ho legalizovat nějakým výnosem či registrem. Fakticky
obor jako takový již v ČSAV existoval a měl pevnou a kvalitní základnu ve
velkém počtu pracovníků, ale prosadit ho jako lékařský nebo učební obor na
vysokých školách nebylo snadné. Myslím, že zde hrálo roli několik faktorů,
z nichž považuji za rozhodující získání zájmu o imunologii odboru protiepidemické péče Ministerstva zdravotnictví (z hlediska kontroly a podpory imunity populace), kde jsem tuto věc opakovaně projednával. Došlo k založení
imunologických laboratoří na krajských hygienických stanicích a tam následně také ke zřízení ordinací a obor byl najednou na světě. Zároveň byl jmenován tzv. hlavní odborník pro obor. (Existenci hlavních odborníků ministerstva
a na krajích pro medicínské obory dodnes považuji na přínosné a dnes nám
určitě chybí.)
Ruku v ruce s tím šlo i vymezení oboru jako lékařské specializace (a o něco
později také k vymezení s trochu jiným názvem pro nelékaře). Po mém naléhání zřídil v roce 1984 prof. Macúch, ředitel tehdejšího Institutu pro další
vzdělávání lékařů a farmaceutů (ILF), Kabinet lékařské imunologie pro vzdělávání a atestace z oboru, který se tak stal specializací. Byl to první útvar pro
postgraduální vzdělávání v této sféře a já jsem byl jmenován jeho vedoucím.
V oblasti imunologie jsem pak
prosadil koncepci klinického oboru
s nezbytným laboratorním zázemím,
což znamená, že lékař pracující
v ordinaci musel mít zažitou také
laboratorní složku práce, včetně
možných chyb metod a nákladů.
4
Brzy nato byl Kabinet přeměněn na katedru. To se
stalo faktickým startem pro následný vznik samostatných učebních programů a později také samostatných imunologických útvarů (kateder nebo
ústavů apod.) na univerzitách, i když na některých
z nich se v názvu instituce slovo imunologie už
dříve vyskytovalo, jako např. v Praze Ústav pro
lékařskou mikrobiologii a imunologii 1. LF UK, kde
odvedl velkou práci Ctirad John. Později se vytvářely imunologické laboratoře nebo imunologické
náplně práce jiných laboratoří (hlavně biochemie)
v nemocnicích a postupně vznikaly také ambulance a oddělení. V současné době existuje imunologie prakticky na všech úrovních jako základní
obor medicínského a obecně biologického vzdělávání – jak na univerzitní, tak na postgraduální
úrovni. Klinická imunologie jako aplikace imunologie v medicíně je klinický obor s nezbytným
laboratorním zázemím. Je obecně uznávána vzdělanými kliniky jako nezbytné vzdělání pro pochopení základních pochodů v živém organizmu
a pochopitelně zahrnuje všechny aplikace, včetně
alergologie, která má nejširší uplatnění v terénní
praxi. (U nás se po vzoru některých zahraničních
názvů již řadu let užívá pro obor termín alergologie a klinická imunologie, který je stejně nesmyslný, jako kdyby se používal např. termín hepatologie a vnitřní lékařství.)
Jste živoucím dokladem toho, že
odpovídající kvalitní vzdělání je jistě
nutný základ, ale pro kompetentní
působení v oboru je nezbytné průběžné
vzdělávání, které, má-li být účinné,
potřebuje určitý systém a řád. Na co
jste se především zaměřil v době svého
působení jako ředitel tehdejšího Ústavu
pro další vzdělávání lékařů
a farmaceutů?
Na tuto otázku jsem Vám už vlastně částečně dal
odpověď v tom, co jsem říkal o prosazování oboru.
Nicméně si myslím, že je na místě zmínit, že jsem
svou práci ředitele ILF, kterému jsem dal nový statut a přejmenoval ho na Institut postgraduálního
vzdělávání ve zdravotnictví (IPVZ) (vzdělávají
a atestují se tam totiž i jiní vysokoškoláci než jen
lékaři a farmaceuti), považoval za velmi důležitou
a věnoval jí spoustu energie a času, protože průběžné vzdělávání je především ve zdravotnictví
záležitostí základního významu, determinující
kvalitu poskytované péče. Rozšiřoval jsem útvary
o nově vznikající obory a podobory. V oblasti imunologie jsem pak prosadil koncepci klinického
oboru s nezbytným laboratorním zázemím, což
znamená, že lékař pracující v ordinaci musel mít
zažitou také laboratorní složku práce, včetně znalosti možných chyb metod a nákladů, a lékař
v laboratoři musel mít dostatečný přehled o klinice postižení imunitního systému, včetně vyšetření
Prof. MUDr. Ivo Hána, CSc.
(nar. 1928) je významný český vědec,
lékař, pedagog. Jako první u nás byl jmenován profesorem imunologie a alergologie. Je stále aktivní, předsedá Radě vědeckých společností ČR, účastní se
odborného života, kongresů, v ordinaci se
věnuje pacientům s poruchami imunity.
Po řadu let pracoval ve velmi náročných
podmínkách v rozvojových zemích
(v Indii, Etiopii, Íránu, Sýrii) jako expert
Světové zdravotnické organizace (WHO).
Je držitelem mnoha našich i zahraničních
vědeckých ocenění. V loňském roce, kdy
oslavil 80. narozeniny, mu byla prezidentem republiky udělena Medaile za zásluhy
o stát v oblasti vědy. V odůvodnění bylo
kromě jiného uvedeno: Je autorem rozsáhlého vědeckého díla, zasloužilým
pedagogem a organizátorem vědeckého
života.
pacienta při atestaci. Vycházel jsem přitom nejen
z objektivního posuzování oboru, ale především ze
své praxe – již jako student jsem pracoval na klinikách, poté jsem léta strávil v laboratořích v Československu a rok také v USA a v dalších letech
jsem se kromě velké organizační práce věnoval
ambulantní praxi v klinické imunologii, včetně
alergologie.
Začátkem 90. let, kdy jsem pracoval jako ředitel
IPVZ, jsem nepřipustil, aby byla privatizována
kolej IPVZ v Praze (měla z ní být akciová společnost, která by vydělávala na mladých špatně placených vysokoškolácích připravujících se na atestace). Jako následek mne tehdejší ministr
zdravotnictví Rubáš (ODS), který tuto privatizaci
favorizoval, odvolal. Jediné, co mi bylo vytknuto,
bylo, že jsem si rok předtím dal udělat nestranný
audit, který ukázal, že jsme hospodařili dobře!
Litoval jsem, že jsem nemohl dále rozvíjet tuto
práci, která mne upřímně těšila, protože jsme
organizaci zvládali a měli úspěchy – naši instituci
nám zahraniční návštěvníci vysloveně záviděli.
Dnes jsme svědky toho, jak současné Ministerstvo
zdravotnictví tuto instituci demontuje způsobem,
který považuji za skandální (např. zrušení rozsáhlé
vědecké knihovny).
V době totality bylo pro většinu
vědeckých a hlavně mladých
pracovníků obtížné získávat průběžný
přehled o vývoji toho oboru ve světě –
bez internetu, ne vždy s dostatečným
přístupem k vědeckým publikacím
a s velmi omezenými možnostmi
cestovat. Byl toto důvod, proč jste se
rozhodl pro pořádání pracovních imunologických konferencí,
pro něž se zažil název PIK?
Vy jste, vážená paní doktorko, vlastně odpověď našla již ve své otázce. Je
obecně známo, že se mi podařilo iniciovat a zorganizovat celkem 22 pracovních imunologických konferencí (PIK), které se konaly v rámci ČSIS a později
ČIS na různých místech Československa a Česka a věnovaly se určitému
vybranému tématu. První z nich se konala v Židlochovicích v roce 1975
a poslední v Rožnově v roce 2005. Cílem těchto malých sympozií, kterých se
zúčastňovaly desítky mladých imunologů a také kliničtí pracovníci, bylo
nahradit v době totality zcela omezené možnosti sdělování výsledků na kongresech a získávání nových poznatků, naučit se diskutovat v naprosto neformálním prostředí a navázat kontakty, jinak nesnadno dosažitelné. Ke všemu
se navíc dařilo od určitého data odpřednášené práce také publikovat ve sbornících jako původní práce s literaturou. Po revoluci se v 90. letech postupně
otevíraly dveře k setkáním i na mezinárodních fórech; narostl zájem nezbytného publikování výsledků v impaktovaných časopisech a diskusí v zahraničí,
a to vše ukázalo, že PIKy, ve své době tak vyhledávané a ceněné pro své přátelské, poučné, ale i vysoce kritické a neformální prostředí, již svou původní,
podle tehdejších možností nezastupitelnou funkci splnily, a bylo proto od
jejich dalšího konání upuštěno. Nicméně vzpomínky na jejich jedinečnou
atmosféru zůstávají.
Rozvoj mnoha oborů je exponenciální, orientace v záplavě
informací i možnosti sledovat obor v širším záběru jsou čím
dál obtížnější. Někdy si přestáváme vzájemně rozumět
i v příbuzných oborech. Domníváte se, že k tomu přispívá i to,
jak se vyjadřujeme? Jak se díváte na někdy až nekritické
(nebo možná pohodlné) přejímání výrazů především
z angličtiny, přestože v češtině máme výstižné a zavedené
výrazy?
Lingvistika byla vždy tak trochu mým koníčkem. Mluvím a jsem schopen
i myslet několika světovými jazyky, ale vždy mě fascinoval můj rodný jazyk –
čeština. Snad je na vině Karel Čapek se svou chválou rodné řeči nebo Pavel
Eisner (Chrám i tvrz) a naši básníci (Seifert, Nezval), ale i moji rodiče, kterým
vděčím za mnoho z toho, co ve mě je. Jako národ jsme měli v minulosti éru,
kdy jsme čelili germanizaci naší řeči, a poté přišlo období rusismů. Dnes jsme
svědky toho, že naše řeč je zraňována jednak chudobou a vulgarizací mediálního jazyka (jen málo novinářů svou řeč pěstuje), jednak naší leností překládat cizí termíny a vyhledávat jejich nejvýstižnější český ekvivalent a také
určitou snahou „být módní“ tím, že budu užívat především z angličtiny (nebo
američtiny) přejímané a často ještě navíc zkomolené výrazy. Setkáváme se
s tím bohužel často i ve vědě a ani imunologie není výjimkou. Myslím si, že
v tomto vědním oboru jsem se vždy snažil o slušnou češtinu. Určitým vzorem
a oporou mi byl Karel Nouza, který někdy až úporně hájil své české výrazy.
Musí být naší snahou, abychom byli schopni se vždy dobře česky vyjadřovat.
Na závěr si, vážený pane profesore, nemohu odpustit zeptat
se Vás na to, jak vidíte budoucnost imunologie?
Být haruspikem není ani snadné, ani vděčné. Přesto se Vaší otázce nevyhýbám.
Při pohledu do minulosti jsem byli svědky různých etap, kdy byly někdy celé
dekády věnovány preferenčně určitým tématům, která ovládala pole bádání.
Zažili jsme např. éru imunoglobulínů, éru vrozené imunity nebo éru cytokinů.
Tyto éry skončily, i když nepochybně přinesly spoustu důležitých poznatků.
Dnes jsou to regulační buňky, které udávají směr. Nebudu se pouštět do odvážných předpovědí zabírajících celé rozsáhlé pole imunologie, zkusím se věnovat
trochu těm oblastem, v nichž jsem se v posledních létech více pohyboval.
Na poli imunomodulace, která se bytostně začala dotýkat praktického a širšího užití v klinice, nevidím, na rozdíl od řady perspektivních očekávání, velké
5
V transplantační imunologii při
typizaci znaků HLA na úrovni tzv.
high level resolution je doslova
otázkou života a smrti nalézt
maximální shodu mezi dárcem
hematopoetických kmenových
buněk z kostní dřeně nebo periferní
krve a mezi příjemcem.
možnosti a úspěchy. Jistě se najdou jiné a lepší imunosupresivní látky (farmaceutický průmysl má pro tento výzkum jistě dost silné ekonomické zázemí) a snad se po létech bádání dočkáme i vyhovujících vakcín proti malárii
nebo HIV infekcím, ale látky působící selektivně na jednotlivé imunitní
pochody (třeba stimulačně) budeme těžko hledat. K potlačení alergických
reakcí určitě najdou produkční továrny nové generace léčiv a bude jistě snahou najít pro alergologickou imunoterapii (AIT) skutečně specificky působící
látky na vymezené složky jednotlivých alergenů, jak nazýváme většinou velice komplexní alergizující látky. Tam všude vidím možnosti určitého pokroku,
avšak v oblasti základních imunomodulačních zásahů do specifických složek
imunitní odpovědi vidím velké obtíže, protože imunologická síť je nesmírně
složitá, navzájem se ovlivňující na všech úrovních (jako jsou např. různá
působení cytokinů), a to v daleko komplexnější formě, než tomu je např.
v hormonálních funkcích. Čili pokroky je možné očekávat, ale těžko budeme
svědky revolučních převratných úspěchů.
V posledních dvaceti letech jsem se velmi věnoval transplantační imunologii.
Ta za tu dobu učinila veliký vývoj i praktický rozvoj v humánní medicíně, kdy
bylo za spolupráce především internistů a chirurgů dosaženo nevídaných úspěchů při transplantacích orgánů, ale i tkání. Zatímco na poli úspěšně a široce
prováděné transplantace orgánů hrála značnou roli složka organizační (získávání orgánů), kdy již klasická typizace znaků HLA dárce a příjemce na buněčné
úrovni a následná aplikace imunosupresiv zajišťovala úspěch, došlo na poli
transplantace kostní dřeně, tj. hematopoetických kmenových buněk, k ohromnému pokroku v oblasti zcela zásadní typizace znaků HLA molekulárními metodikami (tzv. high level resolution), vedoucí k rozvinutí nových laboratorních
postupů a poznání nových antigenů, jejich splitů a závislostí. Zde je dosažení
maximální shody mezi dárcem a příjemcem doslova otázkou života a smrti,
neboť hematopoetické kmenové buňky z kostní dřeně nebo z periferní krve
dárce mají kapacitu při větších rozdílech v HLA znacích snadno svého příjemce
zahubit. Zde není možnost retransplantace. Na našem imunologickém pracovišti v IKEM v Praze se nám za vedení Evy Ivaškové podařilo tyto metodiky
úspěšně zvládat. Dovolte, abych se při této příležitosti zmínil ocenění, jehož se
našemu týmu dostalo pozváním z USA, abychom na výročním kongresu NMDP
(National Marrow Donor Program) v Minneapolis realizovali před velkým publikem setkání dvou našich českých příjemců hematopoetických kmenových
buněk z kostní dřeně od amerických dárců (šlo o děti vyléčené z leukémie). Bylo
to na těchto kongresech první pozvání země mimo USA! (Dárcovství kostní
dřeně je anonymní a setkání dárců s příjemcem se uskutečňuje jen při zvláštních příležitostech.) Byli jsme oceněni obrovským aplausem v sále naplněném
zhruba 600 specialisty na transplantace kostní dřeně a transplantační imunologii z celého světa.
A to mne uvádí do oblasti vlastního odhadu, že v budoucnosti budou kmenové buňky hrát stále stoupající úlohu nejen v oblasti transplantace krvetvorných tkání spojených s transplantační imunologií, ale v daleko širších souvislostech, nepochybně také ve sféře základních imunitních mechanismů. Na
loňském kombinovaném kongresu českých a slovenských imunologů s meziná-
6
rodní účastí v Praze jsem zdůraznil, že bylo již dávno uznáno jako neplatné dřívější dogma, že kmenové buňky jsou predeterminovány jen k určitému,
již nezměnitelnému vývoji, jako tomu je třeba
u krvetvorných kmenových buněk kostní dřeně.
V posledních letech bylo nezvratně dokázáno, že
mezi kmenovými buňkami, které se nacházejí v různých embryonálních tkáních, existují základní formy, které jsou schopné vytvořit nejrůznější tkáně,
a to zcela odlišné od tkání, z nichž byly izolovány,
jsou tedy pluripotentní. Počáteční studie nacházely
tyto kmenové buňky prakticky jen v různých tkáních embryonálních a později fetálních, což výrazně limitovalo jejich použití a vytvářelo zároveň
půdu pro závažné etické i legislativní problémy pro
použití v humánní medicíně. Studie z posledních
let však vedly k dalším překvapivým nálezům, že je
totiž tyto pluripotentní kmenové buňky možné najít prakticky ve všech tkáních těla, včetně tkání
centrálního nervového systému, a to i u dospělých
jedinců, což rovněž poráží dřívější dogmata. Pro
tyto buňky se ujal název (trochu matoucí) „dospělé
kmenové buňky“ („adult stem cells“) a v posledních
letech je jim věnována ohromná pozornost. Jednak
je možné izolovat tyto buňky třeba z tukové nebo
svalové tkáně, pomnožit je (v tom zatím tkví určité
technické úskalí), aniž ztratí svou pluripotencionalitu, a např. po vstřiknutí do srdce pacienta docílit
reparace infarktem poškozeného myokardu nebo
reparace jater či poškozené míchy. Přitom existuje
možnost použít tyto kmenové buňky od samotného nemocného a odpadne tak nutnost typizace
HLA a obav ze zhoubné reakce štěpu proti hostiteli.
Navíc, což je krajně zajímavé, se ukázalo, že pluripotentní kmenové buňky jsou schopny významně
ovlivňovat funkce buněk a složek imunitního systému, určitým způsobem je modifikovat. To jsou
naprosto nové poznatky. Nestojíme tedy dnes na
prahu nových revolučních objevů a snad i aplikací,
které by možná mohly ovlivnit např. imunodeficience, či stimulovat nebo suprimovat imunitu nebo
vyřešit některá těžká alergická postižení? Je to určitě běh na dlouhou trať. Budoucnost nám ukáže,
zda se úvaha o možných dalších revolučních objevech v této oblasti kmenových buněk s dopady na
imunologii (nejen transplantační, a s výhledem
nejenom na poznatky základního výzkumu, ale i na
praktické využití) ukáže platnou.
Jménem našich čtenářů, redakce i jménem
svým Vám, pane profesore, upřímně děkuji za
rozhovor.
PROF. MUDR. IVO HÁNA, CSC.
RADA VĚDECKÝCH SPOLEČNOSTÍ ČR
E-MAIL: [email protected]
BĚLA ŘÍČAŘOVÁ
Cena Arnolda Beckmana
– vyhlášení vítězů
V roce 2008 byl, stejně jako před dvěma lety, společně
s Českou společností pro biochemii a molekulární
biologii uspořádán 2. ročník Ceny Arnolda Beckmana.
outěžící své práce přihlašovali do tří
kategorií - Buněčná biologie a imunologie, Genomika a genetika nukleových
kyselin, Proteomika.
Akce se shledala s velkým zájmem,
takže to ani tentokrát neměli odborní hodnotitelé v čele s předsedou
ČSBMB profesorem Václavem Pačesem snadné.
Prací se sešlo více než padesát.
Výhercům byla cena slavnostně předána na XXI.
biochemickém sjezdu České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a Slovenské spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu, který
se konal v září v Českých Budějovicích.
Hlavní ocenění 50 000 Kč a možnost čerpat 50 %
slevu na jakýkoli analyzátor z produkce koncernu
Beckman Coulter získaly v jednotlivých kategoriích
tyto práce.
Buněčná biologie a imunologie
RNDr. Lubica Dráberová, CSc.
Ústav molekulární genetiky AV ČR
Za práci: Regulation of Ca2+ signaling in mast cells by tyrosine-phosphorylated and unphosphorylated non-T cell activation linker.
J. Immunol. 179, 5169-80. 2007
Genomika a genetika nukleových kyselin
MUDr. Martin Hřebíček
Ústav dědičných a metabolických poruch 1.LF UK
Za práci: Mutations in TMEM76* Cause Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome)
Am. J. Hum. Genet. 2006;79:000–000.
Proteomika
Mgr. Helena Skalníková, PhD.
Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV, Liběchov
Za práci: A proteomic approach to studying the differentiation of neural
stem cells
Proteomics 2007, 7, 1825-1838
BLAHOPŘEJEME VÍTĚZŮM, DĚKUJEME VŠEM SOUTĚŽÍCÍM
A TĚŠÍME NA VAŠE PŘÍSPĚVKY DO SOUTĚŽE O CENU ARNOLDA
BECKMANA V ROČNÍKU 2008 – 2009.
7
1. místo v kategorii Buněčná
biologie a imunologie
za práci: Regulation of Ca2+ signaling in mast
cells by tyrosine-phosphorylated and unphosphorylated
non-T cell activation linker
AUTOŘI: Lubica Dráberová, Gouse Mohiddin Shaik, Petra Volná,
Petr Heneberg, Magda Tůmová, Pavel Lebduška, Jan Korb a Petr
Dráber
Laboratoř signální transdukce, Ústav molekulární genetiky AV
ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4-Krč
Práce se zabývá molekulárními mechanismy aktivace žírných
buněk. Tyto buňky jsou důležitou součástí imunitního systému, kde slouží
k obraně organismu před parazity, bakteriemi a toxiny a podílí se na zánětlivých procesech. Žírné buňky jsou klíčové při tak závažných onemocněních,
jakými jsou alergie a astma. Vazba antigenu (alergenu) na membránový
receptor vyvolává řadu biochemických dějů, které nakonec vyústí v uvolnění
obsahu sekrečních granul, obsahujících řadu farmakologicky aktivních látek,
jakými jsou histamin a proteázy. Molekulární mechanismy aktivace žírných
buněk nejsou ještě stále úplně objasněné. Nedávno jsme na našem ústavu
objevili nový protein buněčných membrán žírných buněk. Zjistili jsme, že
tento protein, označený NTAL (non T cell activation linker), je regulátor
buněčné aktivace. Předkládaná práce se zabývala
možnými mechanismy této regulace. Pomocí
genetických metod jsme hladinu této molekuly
buď zvýšili, nebo snížili a srovnávali aktivační
pochody u takto modifikovaných buněk. Zjistili
jsme, že v časných fázích buněčné aktivace se
NTAL uplatňuje jako negativní regulátor aktivace;
v přítomnosti NTAL dochází k snížené fosforylaci
jiné důležité adaptorové molekuly LAT, která se
zprostředkovaně podílí na přenosu vápníku do
buněk. V pozdních fázích aktivace funguje NTAL
jako pozitivní regulátor transportu vápenatých
iontů, které jsou důležité pro finální fázi buněčné
aktivace - uvolnění sekrečních komponent (viz.
přiložené schéma).
RNDR. LUBICA DRÁBEROVÁ, CSC.
LABORATOŘ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE, ÚSTAV
Dvojí regulační funkce adaptorového proteinu NTAL při aktivaci žírných
buněk. V časných stadiích buněčné aktivace (fáze I) se multivalentní antigen (Ag) naváže na imunoglobulin E (IgE), který je zakotven na IgE imunoreceptoru (IR). Tím dojde k agregaci a následné fosforylaci jak tohoto
receptoru, tak i dalších signálních molekul, včetně adaptorů NTAL (N) a LAT
(L). V přítomnosti NTAL dochází k částečnému útlumu aktivační odpovědi
z důvodu menší fosforylace LAT (soutěž o substrát). LAT je důležitý pro
aktivaci fosfolipázy C (PLC), která svou aktivitou vede k produkci inositolu
1,4,5 trifosfátu (IP3) a následnému uvolnění vápníku z endoplazmatického
retikula (ER). Uvolněný vápník pak ve fázi II způsobí otevření vápenatých
kanálů SOC (store operated channels) na plazmatické membráně (PM)
a prostup vápníku do buňky. Tento proces je však inhibován u buněk, které
postrádají NTAL.
8
MOLEKULÁRNÍ GENETIKY AV ČR, V.V.I.,
VÍDEŇSKÁ 1083, 142 20 PRAHA 4 – KRČ
1. místo v kategorii Genomika
a genetika nukleových kyselin
za práci: Mutations in TMEM76* Cause
Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome)
Gen pro mukopolysacharidosu III C
Lysosomální choroby jsou skupina klinicky různorodých dědičných onemocnění, jimž je společné
hromadění („střádání“) makromolekulárního materiálu v lysosomech uvnitř buňky. Většina z nich je
způsobena absencí aktivity některé z lysosomálních
hydroláz v důsledku mutací v genech, které ji kódují. Deficit hydrolázy určuje charakter střádání –
deficit enzymu katalyzujícího krok při odbourávání
glykolipidů, řekněme glukosylceramidasy, vede
k hromadění glukosylceramidu jako hlavní střádané látky v lysosomech. Nejběžnějšími jsou lysosomální onemocnění postihující katabolismus lipidů
a mukopolysacharidů (glykosaminoglykanů): lipidosy a mukopolysacharidosy. Od šedesátých let
bylo popsáno zhruba 40 enzymových deficitů, které vedou k lidským onemocněním a do roku 2006
byly postupně nalezeny geny, které příslušné enzymy kodují. Výjimkou byl enzym chybějící u jednoho
typu mukopolysacharidosy typu III – Sanfilippovy
choroby typu C.
Tento syndrom má své jméno podle amerického pediatra Sylvestera Sanfilipa, který jej se
spolupracovníky popsal v roce 1963 [1]. Všem
typům Sanfillipova syndromu (A, B, C, D) je
společná porucha lysosomálního odbourávání glykosaminoglykanu heparansulfátu, i když
jednotlivé typy jsou způsobeny deficity různých
enzymů. Klinicky mezi jednotlivými typy nejsou podstatné rozdíly. Onemocnění má pomalu postupující průběh. Relativně mírné tělesné
postižení (malé zvětšení jater a sleziny, hrubé
rysy obličeje, postižení kostí, hrubé vlasy aj.)
kontrastuje s těžkým postižením nervového
systému. Děti s MPS IIIC se po narození nějakou
dobu vyvíjejí normálně, po měsících nebo několika málo letech po narození se projeví vývojové
opoždění. Mezi druhým a šestým rokem začínají být děti s MPS IIIC výrazně hyperaktivní,
někdy až agresivní a současně se projeví porucha spánku, díky které děti spí jen několik hodin
denně, třeba jen tři nebo čtyři. V dalším stadiu
dítě postupně začne ztrácet nabyté schopnosti
a dovednosti. Zhoršuje se mluvení, současně se
zhoršuje schopnost porozumět řeči. Zhoršuje se
také chůze a postupně vede k upoutání pacienta na lůžko a k používání kolečkového křesla.
V důsledku postupujícího postižení mozku jsou
svaly končetin spastické. Později se objevují další komplikace. Mohou se
objevit křeče, ve spánku bývají běžné pauzy v dýchání (apnoické pauzy).
Některé děti začnou mít potíže s polykáním a musí být krmeny sondou.
Pacienti umírají obvykle mezi 15 – 25 rokem věku. Léčba je pouze symptomatická, není známa žádná terapie, která by zvrátila nepříznivý průběh
nemoci.
U typu C chybí aktivita acetyl koenzym A: glukosaminid N-acetyl transferasy (N-acetyltransferasy). Tento enzym není hydrolasa, naopak katalyzuje jedinou syntetickou reakci v lysosomu – acetylaci terminálních
glukosaminových zbytků na oligosacharidech vzniklých přechozím enzymatickým štěpením heparansulfátu. Acetylace je zapotřebí pro další krok
– odštěpení N-acetylglukosaminu alfa-N-acetylglukosaminidasou. Reakci
katalyzovanou N-acetyltransferasou objasnili v osmdesátých letech minulého století Karen Bame a Leonard Rome [2]. Jejich model předpokládá
acetylaci enzymové bílkoviny na cytosolární straně lysosomální membrány
– zdrojem acetylu je acetyl koenzym A, translokaci acetylového zbytku do
nitra lysosomu a jeho přenos na glukosaminový zbytek uvnitř lysosomu.
N-acetyltransferasa je extrémně hydrofobní membránový protein a díky
jeho nestabilitě se doposud podařila pouze parciální purifikace aktivity
[3]. Nebylo tedy možné ze sekvence purifikované enzymové bílkoviny určit
parciální sekvenci transkriptu a na jejím základě identifikovat gen.
Skupina Alexeje Psezhetského z Montréalu se pokusila identifikovat gen
pomocí genové vazby v několika desítkách rodin. Onemocnění mapovali jako
autosomálně recesivní vlohu. Podařilo se jim zjistit, že gen se nachází v pericentromerické oblasti na chromozomu 8 [4], ale přes několikaleté úsilí se jim
9
Z biochemických studií jsme
věděli, že N-acetyltransferáza je
extrémně hydrofobní membránový
protein, bylo tedy možné očekávat,
že protein kodovaný genem
bude mnohočetné predikované
transmembránové domény.
nepodařilo jej identifikovat. Nepodařilo se to ani sofistikovanými proteomickými postupy založenými na analýze acetylovaných proteinů z lysosomální
membrány [5].
Naše pracoviště (Ústav dědičných metabolických poruch (ÚDMP) Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty UK) se zabývá diagnostikou
a péčí o pacienty s dědičnými metabolickými onemocněními (v těsné spolupráci s Klinikou dětského a dorostového lékařství VFN). Sledovali jsme čtyři
rodiny s MPS IIIC. Z diagnostické práce jsme věděli, že stanovení aktivity Nacetyltransferázy dovede nejen zcela spolehlivě určit pacienty, ale i poměrně
velmi spolehlivě odlišit přenašeče od zdravých homozygotů a rozhodli jsme
se toho využít při mapování MPS IIIC. Lidé přenášející mutaci mají aktivity zhruba poloviční oproti kontrolním osobám. Onemocnění jsme mapovali
pomocí genové vazby na základě výsledků enzymového vyšetření jako kodominantní vlohu, nikoli jako autosomálně recesivní. Díky tomu byl pro mapování postačující i malý počet čtyř rodin. Enzymovou aktivitu jsme vyšetřili
u všech dostupných členů čtyř českých rodin s MPS IIIC a na základě aktivity
jsme je klasifikovali jako přenašeče, zdravé homozygoty nebo sporné. U všech
jsme vyšetřili polymorfní markery v pericentomerické oblasti chromosomu
8 a jejich vazbu s vlohou pro onemocnění, tak jak jsme ji vyšetřili pomocí
enzymového stanovení. Dosáhli jsme maximálního lod skore 6.5 a kandidátní
oblast jsme zúžili na úsek obsahující 32 známých nebo predikovaných genů
mezi markery D8S1115 a D8S1831. Úsek bohužel obsahoval i v podstatě neznámou oblast centromery.
Gen jsme v kandidátní oblasti hledali dvěma metodami. První bylo hledání kandidáního genu podle známých vlastností genového produktu
- N-acetyltransferasy. Z biochemických studií jsme věděli, že N-acetyltransferáza je extrémně hydrofobní membránový protein, bylo tedy možné očekávat, že protein kodovaný genem bude mnohočetné predikované
transmembránové domény. Z 32 genů v kandidátní oblasti pouze jeden
obsahoval více než čtyři transmembránové domény, predikovaný gen
označovaný jako TMEM76.
Druhá metoda hledání genu využívala analýzu genové exprese a byla založena na předpokladu, že u řady mutantních alel je množství transkriptu snížené.
Pomocí DNA čipů, které jsme si připravili, jsme vyšetřili expresi oněch 31 genů
a hledali jsme takové geny, jejichž exprese byla významně nižší u pacientů
s MPS IIIC než u kontrolních osob. Po statistické analýze výsledků vyšel jako
positivní opět pouze TMEM76.
Osekvenovali jsme gen u pacientů s MPS IIIC a nalezli jsme mutace.
Mutace v rodinách plně segregovaly se sníženými aktivitami N-acetyltransferasy. To byl přesvědčivý výsledek a byli jsme si jisti, že máme správný gen. Dalšími analýzami jsme ověřili strukturu genu a jeho vlastnosti.
V závěru jsme spojili úsilí s konkurenční skupinou Dr. Alexeje Psezhetského z Montrealu, která gen doposud neúspěšně hledala. To nám umožnilo
publikovat výsledky vyšetření mnohem většího počtu pacientů, kteří měli
mutace v TMEM76. Skupina Dr. Psezhetského biochemicky prokázala, že
TMEM76 skutečně kóduje N-acetyltransferasu. Výsledky jsme společně
uveřejnili (6).
10
Pro hledání genu byla nezbytná pomoc rodin
s MPS IIIC, které se nám plně dostalo. Odběry krve
u desítek osob znamenaly pro mnohé nepohodlí
a nadbytečné cestování. Jsme všem zúčastněným
velmi zavázáni a zvlášť musíme poděkovat za podporu české Společnosti pro mukopolysacharidosu
(http://www.mukopoly.cz) a jejímu předsedovi Dr.
Janu Michalíkovi.
[1] Sanfilippo, S. J.; Podosin, R.; Langer, L. O., Jr.;
Good, R. A. : Mental retardation associated with
acid mucopolysacchariduria (heparitin sulfate
type). J. Pediat. 63: 837-838, 1963.
[2] Bame KJ, Rome LH: Acetyl coenzyme A: alphaglucosaminide N-acetyltransferase. Evidence for
a transmembrane acetylation mechanism. J Biol
Chem. 1985 Sep 15;260(20):11293-9.
[3] Freeman C, Clements PR, Hopwood JJ: Acetyl
CoA:alpha-glucosaminide N-acetyl transferase:
partial purification from human liver. Biochem Int.
1983 May;6(5):663-71.
[4] Ausseil J, Loredo-Osti JC, Verner A, DarmondZwaig C, Maire I, Poorthuis B, van Diggelen OP,
Hudson TJ, Fujiwara TM, Morgan K, Pshezhetsky
AV: Localisation of a gene for mucopolysaccharidosis IIIC to the pericentromeric region of chromosome 8. J Med Genet. 2004 Dec;41(12):941-5.
[5] Ausseil J, Landry K, Seyrantepe V, Trudel S,
Mazur A, Lapointe F, Pshezhetsky AV: An acetylated
120-kDa lysosomal transmembrane protein is
absent from mucopolysaccharidosis IIIC fibroblasts:
a candidate molecule for MPS IIIC. Mol Genet
Metab. 2006 Jan;87(1):22-31.
[6] Hrebicek M, Mrazova L, Seyrantepe V, Durand S,
Roslin NM, Noskova L, Hartmannova H, Ivanek R,
Cizkova A, Poupetova H, Sikora J, Urinovska J, Stranecky V, Zeman J, Lepage P, Roquis D, Verner A,
Ausseil J, Beesley CE, Maire I, Poorthuis BJ, van de
Kamp J, van Diggelen OP, Wevers RA, Hudson TJ,
Fujiwara TM, Majewski J, Morgan K, Kmoch S,
Pshezhetsky AV: Mutations in TMEM76 Cause
Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome). Am J Hum Genet. 2006 Nov;79(5):807-19.
MUDR. MARTIN HŘEBÍČEK
ING. STANISLAV KMOCH, CSC.
ÚSTAV DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH
PORUCH, VFN A 1. LF UK,
KE KARLOVU 2D, 128 01 PRAHA 1
1. místo v kategorii Proteomika
za práci: A proteomic approach to studying the
differentiation of neural stem cells
Proteomika nervových
kmenových buněk
V polovině 90. let minulého století bylo prokázáno, že
v některých oblastech centrálního nervového systému (CNS) mohou vznikat nové neurony a že se tyto
neurony diferencují z nervových kmenových buněk.
Nervové kmenové buňky (NKB) jsou nediferencované
buňky podobné buňkám, ze kterých během embryonálního a fetálního vývoje vzniká mozek a mícha. Dalším výzkumem bylo zjištěno, že z NKB vznikají nejen
neurony, ale i podpůrné gliové buňky (oligodendrocyty a astrocyty). Tyto poznatky vzbudily velký zájem
o NKB pro jejich možné aplikace při léčbě některých
onemocnění CNS. V dnešní době se předpokládá, že
přenos NKB do postiženého CNS nemusí nutně vést
pouze k diferenciaci NKB do neuronů, ale že přenesené buňky jsou schopné produkovat růstové faktory,
hormony a další signální molekuly, které mohou aktivovat pacientovy endogenní kmenové buňky a opravné mechanismy [1].
Obrovský zájem o tvorbu neuronů z NKB je doprovázen intenzivními in vitro kultivačními a diferenciačními experimenty a zároveň transplantačními
pokusy s cílem najít vhodné buňky pro léčbu poškození nebo degenerací CNS, jako např. míšních lézí,
mozkové mrtvice, Parkinsonovy, Alzheimerovy
a Huntingtonovy choroby nebo amyotrofické laterální sklerózy. Nervové kmenové buňky a prekurzory
neuronů je možné v dnešní době izolovat nejen
z fetálního nebo dospělého centrálního nervového
systému, ale lze je také získat cílenou diferenciací
embryonálních kmenových buněk.
Pro pochopení mechanismů řídících sebeobnovu
a diferenciaci se NKB staly objektem molekulárního
profilování, ať už na úrovni genové exprese nebo proteinů. Transkriptomové studie, např. pomocí cDNA
mikročipů, umožňují charakterizaci exprese mnoha
tisíců genů v jednom experimentu. Díky amplifikaci
pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) jsou tyto
metody velice citlivé a lze sledovat i mRNA přítomné
v buňkách ve velmi malém počtu kopií za použití
malého výchozího množství biologického materiálu.
I když je nasnadě, že hladina mRNA určuje množství
následně syntetizovaného proteinu, řada dynamicky
regulovaných procesů (např. stabilita konkrétní mRNA,
různé sestřihové varianty mRNA, účinnost translace
a stabilita proteinu) ve výsledku často vede k nízké
korelaci mezi expresí genu a hladinou proteinu. Např.
při studiu vlivu transfekce a exprese genu pro GDNF
(glial cell line-derived neurotrophic factor) do linie
striatálních nervových progenitorů byla mezi GDNF-
transfekovanou a výchozí netransfekovanou linií pozorována změna hladiny 43
proteinů, ale mikročipová analýza genové exprese odhalila změnu pouze v jednom
případě [2]. Je nutné si uvědomit, že proteiny podléhají různým posttranslačním
úpravám (např. proteolytickému štěpení, fosforylacím, glykosylacím, metylacím,
acetylacím aj.), které jsou klíčové pro aktivitu proteinu, jeho interakci s dalšími
molekulami i subcelulární lokalizaci. Příkladem mohou být receptory pro steroidní
hormony, které pro svou aktivitu vyžadují konformační změnu vyvolanou vazbou
ligandu, dimerizaci, fosforylaci a přesun z cytoplasmy do jádra buňky, kde spouští
transkripci genů, na jejichž responzivní element se vážou. Posttranslační modifikace
proteinů jsou pouze omezeně predikovatelné z genové sekvence, a proto je nutné
sledovat nejen expresi mRNA, ale také studovat kódované proteiny.
Analýza proliferace a diferenciace nervových kmenových buněk na úrovni proteinů je velmi obtížná díky variabilním fyzikálně-chemickým vlastnostem proteinů
a vysokým požadavkům na vstupní biologický materiál. Pro analýzu proteomu
jsou obvykle potřeba miliony až desítky milionů buněk. K separaci proteinů se nejčastěji používá dvojrozměrná gelová elektroforéza, při které jsou proteiny děleny
v gelu nejprve dle svého izoelektrického bodu a následně podle molekulové hmotnosti. Po obarvení lze proteiny z gelu vyříznout, naštěpit proteázou na menší peptidy a identifikovat hmotnostní spektrometrií. Nevýhodou 2D elektroforézy je
obtížnost analýzy extrémně malých/velkých proteinů, proteinů s extrémním izoelektrickým bodem a zejména proteinů, které jsou v buňkách zastoupeny jen
v malém počtu molekul (např. signální proteiny). Mezi nové metody pro analýzu
proteomu patří separace peptidů pomocí kapalinové chromatografie s přímým
Obr. 1
Mikroskopická fotografie nervových kmenových buněk kultivovaných in vitro
ve formě neurosfér (A) a buněk po 5 dnech diferenciace v přítomnosti kyseliny retinové; (B) fázový kontrast.
Imunocytochemická detekce přítomnosti základních typů diferencovaných
nervových buněk: (C) barvení neuronů na antigen βIII-tubulin, zeleně; jádra
buněk jsou barvená červeně; (D) barvení astrocytů na antigen GFAP, červeně;
i n f o r mjádra
a č nbuněk
í m ajsou
g abarvená
z í n č ímodře;
s l o 1 (E)
1 -barvení
2 0 0 9oligodendrocytů na antigen CNPasa, zeleně; jádra buněk jsou barvená červeně.
11
napojením na hmotnostní spektrometr. Zde lze využít i izotopová značení pro
kvantifikaci peptidu při hmotnostní spektrometrii, např. iTRAQ (isobaric tags for
absolute and relative quantification). Nevýhodou analýzy na úrovni peptidů je
ztráta informace o původním proteinu (molekulová hmotnost nebo náboj proteinu), které jsou ovlivněny právě posttranslačními modifikacemi. Pro detekci proteinů přítomných v buňkách v nižších koncentracích je výhodné použít specifické
protilátky, např. techniky imunoblotu, imunocytochemie nebo protilátkových
mikročipů. Přehled dosavadních výsledků proteomových studií nervových kmenových buněk je shrnutý v Skalníková aj. 2008 [3].
V naší práci [4] oceněné cenou Arnolda Beckmana jsme použili 2D elektroforézu
a hmotnostní spektrometrii k charakterizaci prasečích fetálních nervových kmenových buněk. Narozdíl od hlodavců je prase anatomicky a fyziologicky velmi blízké
člověku a je tak výhodným zvířecím modelem pro biomedicínský výzkum [5]. Nejprve jsme zmapovali proteiny přítomné v nervových kmenových buňkách a poté
sledovali rozdíly v hladinách proteinů mezi kmenovými a diferencovanými buňkami. V kmenových buňkách byly nejčastěji identifikovány proteiny účastnící se
metabolismu a úprav RNA a proteinů včetně chaperonů, dále následovaly proteiny
účastnící se buněčné organizace (cytoskelet a anexiny). Během diferenciace nervových kmenových buněk docházelo ke snižování hladin DNA vazebných proteinů
paraspeckle protein 1 alpha a Far upstream element binding protein 1 a zvýšení
hladin proteinů účastnících se úprav a transportu mRNA (heterogenních jaderných
ribonukleoproteinů hnRNP A1, hnRNP A2/B1, hnRNP H). Dále docházelo ke změnám hladin proteinů účastnících se odpovědí na stres, skladování železa a regulace
redox potenciálu a porinu voltage-dependent anion channel 2. Zvýšení hladin
hnRNP A1, hnRNP A2/B1 a α-B crystalinu během diferenciace jsme potvrdili imunoblotem a lokalizaci těchto proteinů u jednotlivých typů diferencovaných buněk
jsme studovali imunocytochemickým barvením. Přítomnost faktorů sestřihu premRNA (splicing factors) byla již dříve pozorována v dendritech neuronů [6], kde se
mohou spolupodílet na různorodosti postsynaptické odpovědi. Studie proteomu
fetálních NKB prasete byla doplněna i analýzou změn signálních proteinů a jejich
fosforylací během diferenciace za použití protilátkového mikročipu [7].
Obr. 2
Separace proteinů nervových kmenových buněk pomocí dvojrozměrné gelové
elektroforézy. Proteiny byly separovány izoelektrickou fokusací v gradientu pH
3-10 a následně SDS elektroforézou v 12% polyakrylamidovém gelu. Výřezy
ukazují zvětšenou oblast gelu, kde byly detekovány změny v hladinách heterogenních jaderných ribonukleoproteinů hnRNP A1 (modře) a hnRNP A2/B1
(červeně). Horní výřez představuje gel připravený z nervových kmenových
i n fnervových
o r m a č nbuněk.
í magazín číslo 11 - 2009
buněk a spodní z diferencovaných
12
Poznatky získané z proteomových analýz představují prvotní náhled do biologie NKB. Další validace
výsledků a zejména funkční studie budou nutné pro
odhalení konkrétní role proteinů v diferenciaci NKB.
Teprve spojení poznatků z kultivačních, transplantačních, transkriptomových, proteomových a dalších
studií povede k úspěšným a v prvé řadě bezpečným
protokolům pro použití nervových kmenových buněk
v transplantační medicíně.
Poděkování
Děkuji kolegům z Ústavu živočišné fyziologie
a genetiky AV ČR Mgr. Petru Vodičkovi, Ph.D., RNDr.
Haně Kovářové, CSc. a prof. Janu Motlíkovi, DrSc.
za výbornou spolupráci a dále Ing. Petru Haladovi,
Ph.D. z Mikrobiologického ústavu AV ČR, v.v.i.,
a Mgr. Pavlu Řehulkovi, Ph.D. z Ústavu analytické
chemie AV ČR, v.v.i. za identifikace proteinů. Práce
vznikla za finanční podpory výzkumného záměru
ÚŽFG AV0Z50450515 a Centra buněčné terapie
a tkáňových náhrad 1M0538.
MGR. HELENA SKALNÍKOVÁ, PHD.
ÚSTAV ŽIVOČIŠNÉ FYZIOLOGIE A GENETIKY
AV ČR, V.V.I. A CENTRUM BENĚČNÉ TERAPIE
A TKÁŇOVÝCH NÁHRAD,
RUMBURSKÁ 89, 277 21 LIBĚCHOV
[1] Einstein O, Ben-Hur T. The changing face of
neural stem cell therapy in neurologic diseases.
Arch Neurol 2008;65(4):452-6.
[2] Hoffrogge R, Beyer S, Hübner R, Mikkat S, Mix
E, Scharf C, Schmitz U, Pauleweit S, Berth M,
Zubrzycki IZ, Christoph H, Pahnke J, Wolkenhauer
O, Uhrmacher A, Völker U, Rolfs A. 2-DE profiling of
GDNF overexpression-related proteome changes in
differentiating ST14A rat progenitor cells. Proteomics 2007;7(1):33-46.
[3] Skalníková H, Vodička P, Gadher SJ, Kovářová H.
Proteomics of neural stem cells. Expert Rev Proteomics 2008;5(2):175-86.
[4] Skalníková H, Halada P, Vodička P, Motlík J,
Řehulka P, Hørning O, Chmelík J, Jensen ON, Kovářová H. A proteomic approach to studying the differentiation of neural stem cells. Proteomics
2007;7(11), 1825–38.
[5] Vodička P, Smetana K Jr., Dvořánková B, Emerick
T, Yingzhi ZX, Ouředník J, Ouředník V, Motlík J. The
miniature pig as an animal model in biomedical
research. Ann NY Acad Sci 2005; 1049:161–71.
[6] Glanzer J, Miyashiro KY, Sul JY, Barrett L, Belt B,
Hazdon P, Eberwine J. RNA splicing capability of
live neuronal dendrites. Proc Natl Acad Sci USA
2005;102,16859–64.
[7] Skalníková H, Vodička P, Pelech S, Motlík J,
Gadher SJ, Kovářová H. Protein signalling pathways
in differentiation of neural stem cells. Proteomics
2008;8(21):4547-59.
roce 1935 Dr. Arnold Beckman vynalezl
tzv. kyselinoměr (acidimetr), který se
později stal základním kamenem společnosti Beckman Instruments Inc.
Zpočátku byl tento přístroj využíván firmou
Beckmanova spolužáka, zpracovávající citrusy,
k měření kyselosti citrónové šťávy. Později byl
kyselinoměr přejmenován na pH metr a záhy se stal
nepostradatelnou pomůckou v každé chemické
laboratoři.
Od té doby však pH metry prošly řadou změn
a nyní přichází společnost Beckman Coulter
v oblasti pH metrů s revoluční novinkou.
Jedná se o pH metry série Φ 400 a 500, ruční
přenosné a stolní pH metry, které vynikají např.
možností připojení k PC a přenosu dat pomocí
Bluetooth technologie. Bezdrátově tak můžete
ovládat svůj pH metr až do vzdálenosti 10 metrů.
pH metry vynikají samozřejmě jednoduchým
ovládáním a výkonným softwarem, pomocí kterého
Revoluční novinka
v oblasti pH metrů
přístroj jednoduše připojíte k vašemu PC. Software umožňuje stahovat data
a exportovat je v obvyklých formátech, stejně tak jako přímo přístroj přes PC
ovládat.
Ergonomický design ručních pH metrů série Φ 400 s povrchem ze silikonu
umožňuje nejen snadnou manipulaci a ovládání jedním palcem, ale také jednoduchou údržbu v případě znečištění přístroje.
Všechny ruční pH metry jsou voděodolné a vodotěsné. Jsou schopny dokonce plavat na hladině. Vodotěsné konektory znemožňují proniknutí vlhkosti dovnitř stroje i při připojení klasických nevoděodolných elektrod.
Ke všem pH metrům je k dispozici široká škála elektrod a měřících sond od
kombinovaných, 3 v 1, referenčních, indikačních, iontově selektivních, ORP
elektrod v různých délkách (pro mikrozkumavky až po velké lahve), tvarech
a materiálech těla (skleněné, epoxy).
V nabídce naleznete také sondy pro měření konduktivity a rozpuštěného kyslíku designované přímo pro pH metry série Φ 400 a 500.
EVA KRÁLOVÁ
Pozvánka na akci
DNA Analýza VI.
(19.- 20. května 2009)
Místo konání akce:
hotel Novotel, Kateřinská ulice, Praha 2
1. den - genetika a analýza nukleových kyselin
2. den - buněčná analýza
Přihlášky, prosím, posílejte na
e-mail: [email protected]
13
Nový počítač
buněk a částic
MULTISIZERTM 4
MultisizerTM 4 je nejnovějším členem rodiny
počítačů buněk a částic, která pamatuje svůj
počátek již v roce 1956, kdy byl bratry Coultery
sestrojen první COULTER COUNTER A.
rvní typ byl tedy uveden pro komerční použití již před 53 lety
a od té doby spatřila světlo světa již celá řada inovativních počítačů buněk a částic využívající osvědčenou a dosud nepřekonanou Coulterovu impedanční metodu.
V MultisizeruTM 4 jsou zahrnuty veškeré nejnovější výhody digitální
technologie spolu s uživatelsky velmi přístupným softwarem a externí počítačovou stanicí pracující pod Microsoft Windows*. Vysokorychlostní digitální
signál, použitý v Mulitisizeru TM 4, umožňuje přesnější vyhodnocení pulzů a tím
jejich vyšší rozlišení s dosažením vyšší citlivosti.
Vzorky mohou být načteny a evidovány pomocí zabudované čtečky čárového kódu. Změřená data mohou být uchována pro pozdější reanalýzy
a vyhodnocení bez nutnosti opětovné analýzy vzorku.
Použití SMART technologie (sample management), která zaručuje vysokou
reprodukovatelnost analýz a EZAccess (reagent management) pro jednoduchou manipulaci s reagenciemi a nosnými roztoky, dělá práci s MultisizeremTM 4
opravdu snadnou. Software je plně ve shodě s 21 CFR část 11.
Všechny tyto vlastnosti dělají z MultisizeruTM 4 jeden z nejvhodnějších, nejpřesnějších a uživatelsky nejjednodušších přístrojů pro měření velikosti buněk
a částic na trhu.
Hlavní výhody MultisizeruTM 4:
Pracuje s vysokorychlostním digitálním signálem (DPP)
Vyšší rozlišení
Osvědčená a dosud nepřekonaná technologie
Umožňuje dynamické měření velikosti
Umožňuje měřit distribuci počtu, objemu, hmotnosti a plochy povrchu
buněk a částic
Celkový rozsah pro měření je 0,4 až 1600 μm
Nový design přístroje umožňuje umístění nosných roztoků přímo v přístroji
(nižší nároky na prostor)
Umožňuje použití čárových kódů pro načítání a evidenci vzorků
* všechny registrované ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků
14
Cytometrická
analýza
Cytometrická analýza devíti
subpopulací lymfocytů metodou
bez lýzy erytrocytů.
Základní součástí přípravy vzorků z plné krve pro
analýzu průtokovým cytometrem je lýza erytrocytů.
K tomu lze použít řadu lyzačních činidel (VersaLyse,
OptiLyse C nebo B, Whole blood lysing kit). Pro pracoviště s velkým počtem vzorků je výhodné použít
pracovní stanici TQ-Prep, která provede automaticky
v karuselu s 32 zkumavkami lýzu erytrocytů pomocí
soupravy ImmunoPrep. Plně automatickou přípravu
vzorků, včetně pipetování monoklonálních protilátek, plné krve, inkubace, přidání lyzačního činidla
a kalibračních partikulí pro stanovení absolutních
počtů, zajišťuje automatická stanice FP1000.
Při manuální přípravě vzorků metodou bez promývání představuje lýza erytrocytů 10 – 15 min.
Průtokový cytometr CyAn ADP 9-color umožňuje
načítat buňky při průtoku 150 – 200 μl za vteřinu.
Za těchto podmínek cytometr za 30 vteřin zanalyzuje 35 000 leukocytů, z toho přibližně 11 500 lymfocytů. Toto velké množství dat lze získat z jediné
zkumavky s 50 μl krve.
K této analýze je nezbytný mix monoklonálních
protilátek značených různými fluorochromy: CD45Cascade Yellow, CD8-Pacific Blue, CD14/CD15-FITC,
CD56-PE, CD19-ECD, CD4-PC5, CD20-APC, CD5PC7, CD3-APC-Cy7.
Cytometrický software Summit verze 4.3 usnadňuje nastavení kompenzací devíti fluorochromů
pomocí nástroje „Auto Compensation“. Správnost
nastavení kompenzací je poté možno ověřit pomocí funkce „VisiComp“.
Použitím devítibarevné imunofluorescence metodou bez promývání lze ušetřit 10 – 15 min na přípravu vzorků. Tímto způsobem lze velmi rychle stanovit
základní subpopulace lymfocytů v jediné zkumavce.
Po přidání referenčních partikulí získáme také absolutní počty těchto subpopulací.
S použitím Bulletin CyAn ADP 9 Color No-Lyse
Lymphocyte Subset Enumeration.
ROMAN VLČEK
PAVEL KRUŽÍK
Nové výrobky
Binding Site
VZV Glycoprotein IgG
Binding Site uvádí na trh EIA soupravu v řadě VaccZymeTM pro stanovení specifických
protilátek třídy IgG proti glykoproteinu viru
Varicella zoster (VZV). Souprava je určená
pro stanovení protilátek tvořených jako
reakce na infekci VZV i na imunizaci vakcínou VZV. Přesné stanovení specifických
protilátek IgG proti VZV má z klinického hlediska velký význam, poskytuje informaci
o stavu imunity.
Virus Varicella zoster, známý též jako lidský herpes
virus 3 (HHV-3), patří mezi osm herpetických virů patogenních pro člověka. VZV způsobuje při prvotní infekci
plané neštovice, později se během života může reaktivovat a vyvolat pásový opar. U zdravých dětí mívají
plané neštovice mírný průběh, avšak u osob s oslabenou imunitou, u těhotných žen, novorozenců a dospělých může být průběh choroby závažný a dokonce
i život ohrožující. Novorozencům, jejichž matky prodělaly infekci VZV během prvních 20 týdnů těhotenství,
hrozí riziko vrozených vývojových vad v 1 – 2 %.
Virion VZV má strukturu typickou pro herpetické viry.
Virovou dřeň, tvořenou lineární dvojvláknovou DNA
a proteiny, obklopuje kapsida ve tvaru pravidelného dvacetistěnu tvořená 162 kapsomerami, nad ní následuje
vrstva vyplněná bílkovinnou hmotou, označovaná jako
tegument, a vnější lipidní obal, z něhož vyčnívají hroty
glykoproteinů. Právě tyto povrchové glykoproteiny mají
pro mechanismus infekce VZV klíčový význam; usnadňují virové částici uchycení a průnik do hostitelské buňky. Následně exprese virových glykoproteinů na povrchu
hostitelských buněk napomáhá buněčné fúzi a rozšíření
viru na další buňky. Protilátky namířené proti epitopům
povrchových glykoproteinů VZV mají neutralizační účinek, blokují schopnost živého VZV infikovat.
Možnost stanovení protilátek specificky rozeznávajících pouze povrchové glykoproteiny VZV představuje
významný posun ve výpovědní hodnotě vyšetření
v porovnání se stanovením protilátek metodou, kde je
jako cílový antigen extrakt z buněčné kultury infikované VZV. Hladina specifických protilátek proti glykoproteinu VZV je indikátorem hladiny imunity a schopnosti
chránit daného jedince před další infekcí, je také vodítkem při rozhodování, zda použít terapeutický specifický
imunoglobulin proti VZV.
Souprava je kalibrována proti prvnímu standardu pro
VZV imunoglobulin (1987) kód W1044 Světové zdravotnické organizace, standard je dodáván Národním
ústavem pro biologické standardy a kontroly (NIBSC),
Velká Británie.
Název soupravy
Katalogové číslo
Rozsah stanovení
Ředění vzorku
Počet testů
Doba stanovení
Anti C1q EIA
V řadě BINDAZYMETM byla vyvinuta nová EIA souprava pro stanovení autoprotilátek třídy IgG proti
složce komplementu C1q. Stanovení protilátek
proti C1q napomáhá v diferenciální diagnostice
pacientů s SLE (systémový lupus erythematodes)
určit, zda se jedná o lupus nephritis nebo ne.
Složka komplementu C1q je prvním článkem
klasické aktivační dráhy komplementu. C1q má
zásadní význam při odstraňování imunokomplexů
a apoptotických tělísek z tkání. Vrozený deficit
C1q je známým rizikovým faktorem pro rozvoj autoimunitních onemocnění,
zejména SLE. I když se autoprotilátky proti C1q mohou vyskytovat i při některých dalších autoimunitních i infekčních onemocněních, jednoznačnou prevalenci mají tyto protilátky u pacientů s lupusovou nefritidou, přičemž u pacientů s difúzní proliferativní lupusovou nefritidou se tyto protilátky vyskytují až
v 80 % případů. Nárůst titru má také prediktivní hodnotu, může předcházet
propuknutí lupusu nebo relapsu. Na druhé straně mají tyto autoprotilátky
vynikající negativní prediktivní hodnotu (v rozmezí 95 až 100 %), nepřítomnost
anti C1q protilátek indikuje, že k rozvoji lupusové nefritidy nedojde.
Název „anti-C1q“ trochu svádí k záměně s „CIK C1q“. Je potřeba mít na zřeteli, že se jedná o zcela jiné stanovení než stanovení imunokomplexů vazbou na
C1q (CIK C1q).
Přestože autoprotilátky anti C1q se především vyskytují u lupusové nefritidy,
jejich přítomnost není omezena jen na tuto
chorobu (mohou se vyskytovat při různých
revmatických, infekčních neoplastických
i metabolických poruchách). Z tohoto důvomolekula C1q
du je zapotřebí sledovat průběh onemocnění
a jeho aktivitu zjišťováním hladin anti C1q
protilátek spolu s dalšími laboratorními testy,
jako je stanovení autoprotilátek proti dsDNA
i anti-dsDNA s vysokou aviditou.
Souprava pro semikvantitativní stanovení anti-C1q tak vhodně doplňuje řadu
testů doporučovanou pro diagnostiku
SLE (z produkce Binding Site EIA souprava BINDAZYMETM anti-dsDNA - kód MK017, IFA soupravy Crithidia luciliae
– kód FK002.1 a FK002.2 a EIA souprava FARRZYMETM High Avidity antidsDNA - kód MK072).
BĚLA ŘÍČAŘOVÁ
Název soupravy
BINDAZYMETM Anti-C1q EIA
MK072
1,23 – 100 U/ml
1 : 100
96-jamková mikrotitrační destička
– 12 řad po 8 jamkách
Méně než 2 hodiny
Katalogové číslo
Rozsah stanovení
Kalibrace
Ředění vzorku
Počet testů
Doba stanovení
VaccZymeTM VZV glycoprotein IgG
Low Level EIA
MK092
10 – 810 mIU/ml
NIBSC W1044
1 : 100
96-jamková mikrotitrační destička
– 12 řad po 8 jamkách
Méně než 2 hodiny
15
imunokomplex
vazba
imunokomplexu
na C1q
vazba
autoprotilátky
anti C1q na C1q
Krevní destičky
Krevní destičky jsou bezjaderné krevní elementy
hrající významnou roli v hemostáze. Vznikají jako
úlomky polyploidních megakaryocytů v kostní dřeni. Jedná se o složitý proces kontrolovaný cytokiny
a hormony. Fyziologická koncentrace destiček se
pohybuje v rozmezí 150 – 350 x 109/l krve a jejich
průměrná životnost je 9,5 dne. Krevní destičky hrají důležitou roli při obranných mechanismech organismu a jejich hlavní funkcí je účast při vzniku
hemostatické zátky. Nezanedbatelný je také jejich
vliv na hojení ran, alergické a imunitní reakce.
Vývojová řada krevních destiček
Krevní destičky vznikají z pluripotentní kmenové
buňky. Následující obrázek (obr. 1) podává přehled
o výskytu CD znaků na prekurzorech krevních destiček, destičkách a faktorech působících na tuto řadu.
Membránové
molekuly krevních
destiček
Souhrn
Na povrchu krevních destiček jsou membránové molekuly, které se uplatňují při
různých normálních a patologických procesech. V rámci inventarizace lidského
leukocytárního systému do CD nomenklatury je snaha i jednotlivým destičkovým molekulám přiřadit jejich CD označení. U membránových znaků se detailněji objasňuje molekulární hmotnost, genetická determinace, jejich exprese
a funkce. Mimo to se zpřesňuje jejich význam pro patogenezi a patofyziologii
krevních destiček u různých nemocí. Cílem tohoto sdělení je podat ucelený
přehled o základních vlastnostech membránových molekul krevních destiček
zahrnutých do CD nomenklatury.
Úvod
V průběhu posledních let probíhají v mnoha laboratořích studie mající za cíl
charakterizovat membránové molekuly z hlediska jejich exprese, genetické
determinace a funkce. Vzhledem ke vzrůstajícímu počtu těchto molekul bylo
nutné vytvořit určitý systém. Vznikla tedy tzv. CD nomenklatura, která byla
původně zamýšlena pouze pro lidské leukocytární antigeny. Časem však bylo
nutné rozšířit její užívání i na jiné buňky a elementy lidského těla, tedy i na
krevní destičky.
CD nomenklatura u krevních destiček není příliš užívána a stejné znaky se
označují různými synonymy. Cílem tohoto článku je podat ucelený přehled
o membránových molekulách krevních destiček, které jsou do tohoto systému
zahrnuty.
16
Morfologie krevních destiček
Tvar krevních destiček se mění v závislosti na stupni
jejich aktivace. Neaktivované destičky jsou diskoidního tvaru o průměru 1,5 – 3,5 μm, tloušťce 1 – 1,5
μm a objemu 8 – 12 fl. Anatomické znaky destiček
lze rozdělit do čtyř funkčních zón: periferii, rozpustný gel, organely a membránové systémy. Obrázek
podává základní představu neaktivované krevní destičky z hlediska morfologických struktur (obr. 2).
Struktury periferní zóny komunikují na molekulární úrovni s mimobuněčným prostředím. Tvoří je vnější obal, vlastní membrána a submembránové oblasti.
Vnější obal krevních destiček obsahuje glykoproteiny
(GP) označované podle elektroforetické pohyblivosti
číslicemi I – IX a písmeny a nebo b. GP jsou nepostradatelné pro správnou funkci destiček, např. GPIa-IIa
(CD49b/CD29) je důležitý při adhezi destiček na
subendoteliální matrix a GPIIb-IIIa (CD41/CD61) se
podílí na agregaci. Povrchové GP obsahují molekuly
kyseliny sialové, která pomáhá udržovat negativní
povrchový náboj. Ten zabraňuje adhezi destiček na
neporušený endotel a jejich vzájemné agregaci.
Intracelulární část GP je ve spojení s vnitřním kontraktilním systémem. Vlastní membrána destiček je
tvořena fosfolipidovou dvojvrstvou obsahující membránové proteiny. Důležitým faktorem pro funkci
destiček je asymetrické rozložení membránových
fosfolipidů, kde fosfatidylcholin s fosfatidylethanolaminem jsou lokalizovány vně a sfingomyelin s fosfatidylinositolem uvnitř membrány.
Struktura zóny rozpustného gelu je tvořena převážně fibrilárními proteiny. Oblast zahrnuje obvodový pás mikrotubulů, submembránové filamenty,
mikrofilamenty a proteinové podjednotky. Tyto
struktury představují základní jednotku destičkového kontraktilního systému.
Zóna organel se nachází v cytoplazmě a tvoří ji
mitochondrie, glykogen a tři různé typy granul.
Granula slouží jako skladovací místa pro proteiny
a další látky nezbytné pro funkci destiček. Mezi
Obr. 1: Vývojová řada krevních destiček
s vybranými CD znaky
Progenitor
CFU-Meg
Myeloidní
progenitor
CFU-GEMM
HLA-DR
granula patří denzní tělíska, α-granula a lysosomy.
Denzní tělíska obsahují řadu látek jakými jsou: ATP,
ADP, Ca2+ a serotonin. α-granula jsou zásobárnou
bílkovin tvořených v megakaryocytech (destičkový
faktor 4, vWf = von Willebrandův faktor) i bílkovin
získaných z plazmy endocytosou (fibrinogen, IgG,
albumin). Na povrchu destiček se kromě receptorů
pro jejich stimulaci či inhibici vyskytují např. receptory pro složky komplementu, insulin a Fc fragmenty imunoglobulinů.
Membránový systém zahrnuje otevřený kanálkový systém a denzní tubulární systém. Otevřený
kanálkový systém je tvořen početnými zvlněnými
vychlípeninami povrchové membrány, které zvětšují povrch destičky a urychlují tak membránový
transport. Denzní tubulární systém je odvozen od
endoplazmatického retikula a utváří souvislou síť
úzkých kanálků. Je hlavní zásobárnou vápníku, který je důležitý při procesech kontrakce destiček.
Aktivace krevních destiček
Aktivace destiček probíhá od interakce agonisty
s membránovým receptorem, přes přenos signálu
do buňky až po specifickou odpověď krevních destiček. Jedná se o komplexní proces zahrnující metabolické změny, změnu tvaru, aktivaci povrchových
receptorů a změny v uspořádání fosfolipidové
membrány. Tvar se mění z diskoidního na sférický
s řadou pseudopodií. Dochází k centralizaci organel
a sekreci látek z granulí, které aktivují další krevní
destičky. Po navázání ligandu na příslušný membránový receptor dochází ke stimulaci G-proteinů.
Obrázek 3 představuje mechanismus přenosu signálu krevních destiček podle M. Gawaze v naší částečné úpravě. G-proteiny aktivují enzymy: fosfolipasu C, fosfolipasu A2 a adenylátcyklasu.
Fosfolipasa C katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátu (PIP2) na druhé posly inositol1,4,5-trifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3
navozuje uvolňování vápenatých iontů z denzního
tubulárního systému, zatímco DAG aktivuje proteinkinasu C. Dochází k přeorganizování cytoskeletu, centralizaci organel a sekreci granul. Při tvorbě
stabilní membrány pseudopodií je nutná polymerace monomerního G-aktinu za vzniku F-aktinových vláken, která jsou spojena se strukturními
membránovými proteiny. Centralizace organel
a následná sekrece granul nastává díky aktomyosinu, který vzniká po navázání aktinových filament
na zpolymerovaný myosin (polymerace myosinu je
indukována proteinkinasou C). K sekreci granul
dochází splynutím s otevřeným kanálkovým systémem nebo exocytosou.
CD nomenklatura
Nomenklatura CD antigenů je vytvářena na základě
mezinárodních pracovních setkání, na kterých je
jednotlivým znakům přiřazováno určité číslo. Zavedení CD systému bylo nutné vzhledem k velkému
CD1 1c
CD13
CD14*
CD15*
CD33
CD34
CD1 10*
CD1 11*
CD1 12*
CD1 17
CD123
CDw131
CD133*
CD173*
CD174*
CD176
CD227*
CD228
EPO
TPO
GM-CSF
IL3
IL6
IL1 1
Promegakaryoblast
Megakaryoblast
Megakaryocyt
CD41
CD1 10
CDw123
CDw131
CD1 16
CD4*
CD41
CD1 10
CD1 16
CDw123
CDw131
CD41
CD42a
CD42b,c,d
CD49f
(CD51)
CD61
CD1 10
(CD1 16)
CDw123
CDw131
CD151
CD203c
Krevní
destičky
Krevní
destičky
aktivované
HLA-DR
CD34
(CD38)
CD41
CD61
CD109
CD1 10
CD1 17
CDw123
CD133
EPO
TPO
GM-CSF
SCF
IL3
IL6
IL7
IL1 1
EPO
TPO
GM-CSF
IL3
IL6
IL7
IL1 1
EPO
TPO
GM-CSF
IL3
IL6
IL7
IL1 1
EPO
TPO
IL6
IL1 1
CD9
CDw17
CD23
CD31
CD36
CD41
CD42a-d
CD49b
CD49f
(CD51)
CD60
CD61
CD84
CD92
CD102
CD109
CD1 10
CD147
CD151
CD173
CD226
Základní
znaky
destiček
+
CD29
CD62P
CD63
CD107a
CD107b
EGF
TGF-β
PDGF
IL1
HGP
CXCL1
PD-ECGF
Destičková řada
Kostní dřeň
Krev
Obr. 2: Morfologie neaktivované krevní destičky
v podélném řezu (DTS = hustý tubulární systém; GLY = glykogen;
GR = granula; MIT = mitochondrie; MT = mikrotubuly; SCS = otevřený
kanálkový systém; VD = denzní tělíska)
Obr. 3: Mechanismus přenosu signálu při aktivaci
krevních destiček
rozšíření monoklonálních protilátek v průtokové cytometrii, kdy docházelo
k označování totožných znaků různými názvy.
První setkání se uskutečnilo v Paříži roku 1982 a do nomenklatury bylo zahrnuto prvních patnáct molekul, které získaly označení pomocí písmen CD („cluster of
differentiation“). Od té doby proběhlo již dalších sedm setkání (Boston 1984,
Oxford 1986, Vídeň 1989, Boston 1993, Kobe 1996, Harrogate 2000, Adelaide
2004) a počet CD znaků se vyšplhal již na 350. Ve skutečnosti je počet znaků
mnohem vyšší, neboť pod některými čísly je zahrnuto několik podskupin znaků.
Systém byl původně zamýšlen pouze pro lidské diferenciační leukocytární
antigeny. Časem však bylo nutné rozšířit užívání CD nomenklatury i na jiné
17
Obr. 4: Schéma uspořádání některých membránových
molekul krevních destiček
buňky a elementy lidského těla, tedy i na krevní
destičky.
CD znaky krevních destiček
CD znaky krevních destiček můžeme rozlišovat
podle toho, zda-li se nacházejí na neaktivovaných
krevních destičkách nebo se objevují až po jejich
aktivaci. Na neaktivovaných destičkách je zastoupeno 53 CD znaků a po aktivaci se k nim přidává
dalších 7 znaků (CD62P, CD63, CD68, CD107a,
CD107b, CD109, CD154). Tabulka 1 udává základní
přehled CD znaků krevních destiček s jejich synonymy, molekulovými hmotnostmi a typy uspořádání membránových molekul. CD znaky, které nalézáme na buňkách a elementech ve vývojové řadě
krevních destiček se vyskytují až na malé výjimky
i na jiných elementech a buňkách lidského těla
(tab. 2).
Tab. 1: Základní přehled CD znaků krevních destiček
CD
synonyma
MW*
synonyma
MW*
CD9
p24, MRP-1
24/24, 26
typ** CD
g
CD63
LIMP, MLA1, LAMP-3
40-60/-
typ**
g
CDw12
p90-120
90/120
a
CD68
gp110, macrosialin
110/110
a
CDw17
lactosylceramide
150-160/120
f
CD69
AIM, EA 1, MLR3
60/28+32
i
CD23
FceRII, BLAST-2, B6
45/-
e
CD82
R2, C33, IA4, 4F9, KAI-1
45-90/-
g
CD29
VLA , 1integrin, GPIIa
110/130
b
CD84
GR6
68-80/72-86
f
CD31
PECAM-1, endocam
135/135
a
CD92
CTL1
70/70
a
CD32
Fc RII, Ly-17
40/40
a
CD102
ICAM-2
55-65/-
a
CD36
GPIV (plt), GPIIIb
88/113
a
CD107a
LAMP-1
100-120/-
a
CD41
GPIIb, integrin 2
135/120, 23
b
CD107b
LAMP-2
100-120/-
a
CD42a
GPIX
22/17-22
a
CD109
8A3, 7D1, E123
170/170
h
CD42b
GPIb
160/145
a
CD110
MPL, TPO-R, C-MPL
85-92/-
a
CD42c
GPIb
160/24
c
CD111
HIgR, PRR1, nectin-1
64-72/64-72
a
CD42d
GPV
82/82
a
CD112
PRR2, nectin-2
64-72/64-72
a
CD43
leukosialin, sialophorin
115/135
a
CD114
HG-CSFR, G-CSFR
130/130
a
CD46
MCP
64/68
a
CD132
IL-2R,4R,7R,9R,15R
64
a
CD47
IAP, gp42, OA3
47-55/50
f
CD140a
PDGF-R, PDGF-Ra
180/180
a
CD47R
MEM-133, IAP
115/125
CD140b
PDGF-Rb
180/180
a
CD49b
VLA-2 , GPIa
160/165
d
CD141
TM, fetomodulin
105/105
a
CD49e
-5integrin, VLA-5
155/135+25
a
CD147
neurotelin, EMMPRIN
50-60/55-65
a
CD49f
VLA-6 , GPI
140/120
c
CD148
HTPT-ETA, DEP-1
250/250
a
CD51
VNR- , vitronectin.rec.
150/124,24
c
CD151
PETA-3, SFA-1
32/-
g
CD54
ICAM-1
90/95
a
CD154
CD40ligand, gp39
32-39/33
e
CD55
DAF
80/80
h
CD165
AD2, gp37
37/42
CD58
LFA-3
55-70
a
CD173
krevní skupina H typu 2
CD59
protectin, MIRL, MACIF
19-25/19-25
h
CD226
DNAM-1, PTA-1
65/65
CD60a
GD3
120/-
f
CD245
p220/240
/220-240
CD60b
9-O-acetyl GD3
90-94/120
f
CD295
Leptin R, LEPR, OBR
130/150
a
CD60c
7-O-acetyl GD3
f
CD298
Na+/K+-ATPase
32
II
CD61
GPIIIa, 3integrin
90/110
a
CD321
JAM-1, KAT, JCAM
32/35
a
CD62P
P-selectin, GMP-140
120/140
a
CD323
JAM-C,JAM-3, VE-JAM
43
a
f
a
Poznámky: * = molekulová váha v kDa: neredukovaná/redukovaná forma; ** = uspořádání membránových receptorů: a = monomer, b = heterodimer
nekov. typu, c = heterodimer kov. typu, d = homodimer nekov. typu, e = homotrimer, f = sacharidová struktura antigenu, g = protein 4x procházející
membránou, h = GPI-kotvený protein, i = homodimer kov., II = molekula typu II.
18
Typy uspořádání membránových
molekul krevních destiček
Membránové molekuly mohou být asociovány
s membránou různým způsobem. Rozeznáváme
čtyři typy membránových molekul. Molekuly jedenkrát procházející membránou, vícekrát procházející
membránou, molekuly kotvené GPI-kotvou a molekuly kotvené k membráně.
Obrázek 4 představuje uspořádání některých
membránových molekul krevních destiček (obr. 4).
Nejhojněji zastoupeným typem membránových
molekul na krevních destičkách je monomer (obr.
4a). Častěji je zastoupena molekula, u kterého je
NH2 lokalizován vně, zatímco COOH konec je lokalizován uvnitř. Na krevních destičkách je monomer
zastoupen např. molekulami CD32, CD36 a CD61.
Dalším typem je homodimer, který může být spojen
kovalentně pomocí disulfidových můstků nebo
nekovalentně. Příkladem nekovalentního homodimeru (obr. 4b) je molekula CD49b a kovalentního
homodimeru molekula CD69 (obr. 4c). Heterodimer
se může vyskytovat také jak ve formě kovalentní, tak
i nekovalentní. Zástupci nekovalentního heterodimeru na krevních destičkách jsou např. molekuly
CD29 a CD41 (obr. 4d) a kovalentního heterodimeru
CD51 a CD69 (obr. 4e). Homotrimerem na krevních
destičkách jsou molekuly CD23 a CD154 (obr. 4f).
Dalším typem je protein, který prochází čtyřikrát
membránou, který je zastoupen molekulami CD9
a CD63 (obr. 4g). Posledním typem je protein kotvený tzv. GPI-kotvou (GPI = glykosylfosfatidylinositol).
Na krevních destičkách se tento typ vyskytuje jako
CD55, CD59 a CD109 (obr. 4h).
Tab. 2: Výskyt CD znaků krevních destiček na jiných buňkách
a elementech
CD
výskyt
CD9
TL, BL, MON, BAS, EOS,
END, EPI
CD63
CDw12
GRA, MON, NK, MB
CD68
CDw17
TL, BL, MON, BAS, DB,
GRA, END, EPI, MB
CD69
CD23
BL, MON, EOS
CD82
CD29
CD31
CD
TL, BL, GRA, NK, END, EPI,
CD84
MON, AS, ŽB
TL, BL, MON, KB, NK, END,
CD92
GRA, AS
výskyt
MON, DB, END, MAK, NEU,
FIB
MON, MAK, NEU, BAS, KD,
BL, MB
TL, BL, NEU, EOS, THY, GRA
TL, BL, NK, MON, GRA, LEU
TL, BL, MON, DB, MAK,
THY
MB, MON, GRA, NEU, END
TL, BL, MON, NK, END,
LEU, MON, AS
TL, MON, GRA, MAK, END,
EPI, DB
CD32
MON, DB, KB, ERY, END
CD102
CD36
MEG
CD107a
CD41
MEG
CD107b
GRA, END, EPI, NB
CD42a
MEG
CD109
TL, KB, END, EPI
CD42b
MEG
CD110
KB, MEG
KB, MAK, NEU, MB, END,
EPI
MEG, KB, MON, NEU, END,
EPI
NEU, KD, END, MB, NB,
KB, GRA, MON
TL, BL, EPI, END, KD, THY,
MB, NEU, MAK
CD42c
MEG
CD111
CD42d
MEG
CD112
CD43
TL, NEU, THY, NK, GRA,
MON, MAK, KD
CD114
CD46
PBK, END, FB, EPI, NB
CD132
CD47
TL, BL, MON, ERY, EPI,
END, FIB, NB, AS, ŽB
CD140a
END, FIB
CD47R
EOS, MON, NEU, BL, TL
CD140b
END, FIB
CD141
END, MEG, MON, NEU
CD147
TL, BL, MON, GRA, NK,
ERY, END
CD148
MB, MON, GRA, DB,
CD151
KB, MEG, END, EPI, MON
CD154
ŽB, BAS, TL
CD49b
BL, NK, MON, KB, MEG,
END, EPI, TL, MEG
MON, THY, MON, AS, END,
EPI, TL, BL
TL, BL, MON, KB, MEG,
END, EPI, THY, AS
MON, END, MEG, NK,
MAK, NEU
TL, BL, MON, FIB, EPI, NB,
ERY, END, AS
Základní funkce CD
znaků krevních destiček
V následující tabulce jsou stručně popsány funkce
jednotlivých CD znaků krevních destiček (tab. 3).
U některých však funkce není přímo objasněna
nebo je známa na jiných typech buněk a elementech lidského těla.
CD49e
Nemoci krevních destiček v souvislosti
s membránovými receptory
Nemoci krevních destiček mohou být vyvolány
změnou počtu nebo funkce krevních destiček.
Nemoci z funkční nedostatečnosti se nazývají
trombocytopatie. V souvislosti s poruchami membránových receptorů mluvíme o trombocytopatiích
vrozených. Počet krevních destiček je většinou normální, případně lehce zvýšený či snížený.
Bernard-Soulierův syndrom je autozomálně
recesivní onemocnění vzniklé důsledkem dědičného defektu komplexu CD42a, CD42b, CD42c
a CD42d (glykoproteinu Ib/IX a glykoproteinu V). Za
normálních okolností dochází po vazbě von Willebrandova faktoru k přilnutí krevních destiček
k endotelu. Onemocnění je charakterizováno rozličným spektrem projevů krvácení destičkového
CD55
široký
CD165
TL, BL, THY, MON, NB, EPI,
AS
CD58
ERY, END, EPI, THY, MAK,
MON, AS
CD173
KB, ERY, END, ERY
CD59
LEU, ERY, END, EPI
CD226
TL, BL, MON, KB, NK, THY
CD60a
TL, BL, GRA, EPI, FIB, THY
CD245
TL, MON, GRA, BL, NK
CD60b
TL, KB, GRA, EPI, FIB
CD295
široký
CD60c
EPI, FIB
CD298
široký
CD61
MON, END, FIB, MAK, ŽB
CD321
EPI, END, LEU, ERY
CD62P
MEG, END, AS
CD323
TL, NK
CD49f
CD51
CD54
Poznámky:
AS = adhezní struktury, BAS = basofily, BL = B-lymfocyty, DB = dendritické buňky, END
= buňky endotelu, EOS = eosinofily, EPI = buňky epitelu, ERY = erytrocyty, FB = fibroblasty, GRA = granulocyty, KB = kmenové buňky, KD = kostní dřeň, MAK = makrofágy, MB =
myeloidní buňky, MEG = megakaryocyty, MON = monocyty, NB = nádorové buňky, NEU
= neutrofily, NK = NK buňky, PBK = periferní buňky krve, THY = thymocyty, TL = T-lymfocyty, ŽB = žírné buňky; široký = zastoupení na různých typech buněk a elementech
lidského těla
19
Tab. 3: Funkce receptorů krevních destiček
CD
funkce
CD
funkce
CD9
induktor agregace destiček; buněčná adheze
a migrace
CD63
lysosomální membránový protein; po aktivaci
vystaven na povrch
CDw12
není dosud objasněna
CD68
lysosomální membránový protein
CDw17
možná role u fagocytózy
CD69
CD23
nízkoafinitní receptor pro Fc-IgE; signální
transdukce
přispívá k aktivaci destiček, aktivace a proliferace
lymfocytů
CD82
signální transdukce
CD29
fibronektinový receptor; uplatnění při
embryogenezi
CD84
kostimulační molekula, zřejmě role při přenosu
signálu
CD31
adhezivní molekula
CD92
pravděpodobně role při přenosu signálu
CD32
úloha při imunitních mechanismech
CD102
CD36
receptor pro kolagen; adhezivní molekula
adhezivní a kostimulační molekula; asociuje
s CD11a/CD18
CD41
receptor pro fibrinogen, fibronektin, von
Willebrandův faktor, trombospondin
CD107a
vystaven na povrch
CD42a
adheze destiček; komplex CD42(=a+b+c+d)
- receptor pro vWF a trombin
CD107b
vystaven na povrch
CD109
možná role při signální transdukci
CD42b
CD110
regulace tvorby megakaryocytů a destiček
CD42c
CD111
adhezivní molekula
CD112
adhezivní molekula
CD42d
CD114
proliferace a diferenciace neutrofilů, myeloidní
diferenciace a proliferace
CD43
adheze; aktivace T-buněk; migrace neutrofilů
CD46
regulace aktivace komplementu
CD132
aktivace a proliferace T-buněk, B-buněk,
thymocytů, NK buněk a makrofágů
CD47
adheze, migrace a aktivace leukocytů
CD140a
CD47R
interakce s integriny; uvolňování intracelulárního
vápníku během adheze
receptor pro PDGF A a PDGF B; proliferace
a diferenciace
CD140b
receptor pro PDGF B; proliferace a diferenciace
CD49b
adheze; asociuje s CD29 - váže kolagen a laminin
CD141
možný fibrinolytický receptor; iniciace proteinu C
CD49e
adheze; asociuje s CD29 - váže fibronektin, invasin
CD147
adhezivní molekula
CD49f
adheze; asociuje s CD29 - váže laminin, invasin,
merosin
CD148
signální molekula regulující různé buněčné
procesy
CD51
adheze; asociuje s CD61 - váže vitronektin, vWF,
fibrinogen, trombospondin
CD151
buněčná adheze; asociuje s β1-intergriny
CD154
CD54
adheze; váže CD11a/CD18 a CD11b/CD18 - role při
imunitní reakci
ligand pro CD40; induktor B buněčné proliferace
a aktivace
CD165
role při tvorbě destiček; adheze
CD55
regulace aktivace komplementu
CD58
kostimulační signalizace; adheze
CD173
krevní skupina H typu II; osidlování
hematopoetických kmen. buněk
CD59
membránový inhibitor reaktivní lýzi; signální
transdukce
CD226
adhezivní molekula; cytolytická funkce
zprostředkovaná NK buňkami
CD60a
permeabilita mitochondrií během apoptózy;
kostimulace
CD245
signální transdukce a kostimulace T-buněk
a NK-buněk
CD60b
kostimulace
CD295
regulace metabolismu tuků
CD60c
kostimulace
CD298
CD61
asociuje s CD41-receptor pro fibrinogen nebo
s CD51-receptor pro vitronektin
transport sodných a draslíkových iontů přes
buněčnou membránu
CD321
spojená s agregací krevních destiček
CD62P
adheze destiček a monocytů; rolování leukocytů
na endotel
CD323
buněčná adheze a interakce s endotelovými
buňkami
20
typu. V nátěru se nacházejí obří destičky, je prodloužena doba krvácení a diagnostika se také opírá
o absenci reakce mezi monoklonálními protilátkami proti komplexu CD42b,c/CD42a.
Glanzmannova-Naegeliho trombastenie je vzácné autozomálně recesivní onemocnění s poruchou
retrakce a neschopností agregace. Klasifikace rozeznává dva klasické a jeden variantní typ. Onemocnění je zapříčiněno defektem molekul CD41/CD61
(glykoproteinu IIb/IIIa), který za normálních okolností váže fibrinogen, jenž je nutný k agregaci
trombocytů. V klinickém obrazu převládá krvácivá
diatéza, zřídka spontánního charakteru, ale mnohdy závažná i po drobných chirurgických zákrocích.
Periferní počet destiček je normální, chybí však
agregační odpověď po indukci ADP, adrenalinem,
kolagenem a trombinem.
Aby byl výčet trombocytopatií úplný, musíme
doplnit i poruchy, při kterých dochází k poruchám
skladovacích granul, tzv. storage pool disease,
a k poruchám při uvolňovací reakci, tzv. aspirin-like
disease, kdy dochází k poruše metabolismu kyseliny
arachidonové a cyklických peroxidů. Poruchou prokoagulační aktivity destiček je Scottův syndrom, kde
vázne vazba faktorů Va-Xa a VIIIa-IXa. Výsledkem je
snížení generace trombinu a na destičkách závislé
tvorby fibrinu na cévních endoteliích. Poruchy zmiňované v tomto odstavci nesouvisí přímo s membránovými receptory, jsou však mezi vrozené trombocytopatie řazeny, a proto jsou zde zmíněny.
Poruchy funkce
štítné žlázy
v těhotenství
Onemocnění štítné žlázy patří mezi
nejčastější endokrinopatie, postihující
5 - 7 % populace při stoupající frekvenci.
Závěr
Převratný objev přípravy monoklonálních protilátek se velmi rychle odrazil v definování antigenů na
hematopoetických buňkách. Spolu s rychlým rozvojem techniky dochází k velkému nárůstu znalostí
týkajících se lidského těla, a to hlavně na molekulární úrovni. Potrvá jistě dlouhou dobu než bude
objasněno, proč se ta či ona molekula vyskytuje na
určitém místě lidského těla a jaká je její funkce.
Velký počet znalostí vede ovšem ke značné
nepřehlednosti informací a je nutno tyto informace vhodně třídit a pokud možno vytvořit vhodný
systém „inventarizace“. Snad i tento článek přispěl
k lepšímu zpřehlednění informací o membránových
molekulách krevních destiček, které byly zahrnuty
do CD nomenklatury. O výskytu molekul na destičkách pojednává rozsáhlé písemnictví, které je možné vyhledat na internetu.
Práce byla podpořena vědeckým záměrem ÚHKT
pro rok 2009.
RNDR. KRISTIÁN KOUBEK, DRSc.
ING. JANA HŘEBAČKOVÁ
KLINICKÝ ÚSEK, ÚSTAV HEMATOLOGIE
A KREVNÍ TRANSFÚZE,
U NEMOCNICE 2, 128 20 PRAHA 2
yznačuje se výrazně nerovnoměrnou distribucí; ženy jsou
postiženy častěji než muži (poměr 6-8:1), většinou prevalence
stoupá s věkem, např. ženy nad 45 - 50 let jsou postiženy v 10 i více
procentech. Pacienti postižení poruchou funkce štítné žlázy mají řadu
i nespecifických projevů (únava, snížená výkonnost, spavost, sklon
k depresím, suchá kůže apod.). Důsledky neléčené nedostatečnosti štítné
žlázy - hypotyreózy, jsou závažné: jsou spojeny s poruchami lipidů, což ve
svých důsledcích vede k rozvoji aterosklerózy a ICHS, s poruchami krvetvorby,
obtížemi gastrointestinálního traktu i depresemi. Včasná diagnóza a adekvátní léčba omezují výrazně vliv dlouhodobých komplikací, zkvalitní a zlevní léčbu základního onemocnění a významnou měrou přispějí ke kvalitě života těchto osob, proto
by se nemělo při vyšetřování zapomenout i na starší část populace.
K mnohým změnám ve funkci štítné žlázy dochází během těhotenství, přičemž
některá její onemocnění mohou mít vliv jak na těhotnou, tak na plod. Z vyskytujících se poruch, které jsou shodné s těmi v běžné populaci, je v těhotenství nejzávažnější hypotyreóza, která i zde může probíhat nepozorovaně pod obrazem
nespecifických potíží, připisovaných těhotenství. Důsledky neléčené hypotyreózy
mohou být závažné, negativně ovlivňují nejen průběh gravidity, ale i vývoj plodu.
Zatímco hyperfunkce v graviditě se projeví většinou klinickými příznaky, nebo jde
o relaps již dříve léčené choroby, snížená funkce je svojí bezpříznakovostí nebezpečnější. Příznaky hypotyreózy - únava, snížená výkonnost, spavost, psychická
labilita provázejí často i fyziologické těhotenství, některé ženy se subklinickou
hypotyreózou jsou zcela asymptomatické, a nelze tedy při diagnostice funkční
poruchy spoléhat pouze na klinický obraz.
Doporučení vyšetřovat poruchy funkce štítné žlázy u těhotných žen vychází
z recentních světových studií, založených na zpracování výsledků vyšetření
mnoha tisíc žen.
21
Obr. 1 Free beta hCG ve skupinách rozdělených podle
hladiny TSH
Obr.2 Četnost hladiny TSH u těhotných žen
Obr. 3 Pozitivita anti-TPO ve skupinách rozdělených podle
hladiny TSH
22
Spojení hypothyreózy v těhotenství (nedostatek
jodu) s mentální retardací dítěte je známo více než
100 let. Poškození plodu je způsobeno nedostatkem
hormonů štítné žlázy v séru matky. V roce 1991 Man
a pak v r. 1999 Pop prokázali, že nízká koncentrace
hormonů štítné žlázy v časném stádiu těhotenství je
spojena se signifikantním poklesem IQ u dětí testovaných v 7 letech nebo 10 letech. Studie z 90. let na
25 000 vzorcích prokázala, že děti (6-9 let) matek
s poruchou funkce štítné žlázy v těhotenství měly
v 15 % IQ nižší než 85, kontrolní skupina dětí euthyroidních nebo léčených matek měla IQ nižší než 85 jen
v 5 %.
Asymptomatické postižení štítné žlázy, vyžadující
nepochybnou léčbu v těhotenství, se vyskytuje
u 3 - 5 % žen, a u dalších 10 % má být léčba zvažována. Záněty štítné žlázy mohou výrazně komplikovat
těhotenství a poporodní průběh u dětí i u matek.
Zásadní význam má časná diagnostika a léčba tyreopatií při poruchách fertility u žen, zejména před in
vitro fertilizací, jak z hlediska zdravotního, tak společenského a ekonomického.
Stanovení TSH v séru je základním vyhledávacím
postupem v diagnostice funkce štítné žlázy v běžné
populaci. Jeho regulace je založena na mechanismu
zpětné vazby, v graviditě se však navíc uplatní i jiné
mechanismy, např. suprese TSH vysokou koncentrací
hCG. V 1. trimestru těhotenství se fyziologicky zvyšuje
hladina choriového gonadotropinu (hCG), který je
i stimulátorem tvorby tyreoidálních hormonů prostřednictvím receptorů pro TSH a participuje na zvýšení produkce mateřského tyroxinu mezi 11. – 14.
týdnem, v době kritického vývoje nervového systému.
Suprimované TSH v počátku těhotenství nebývá většinou důsledkem hyperfunkce, která je v těhotenství
vzácná, ale je často způsobováno touto thyreotropní
aktivitou hCG. Souvislost vysoké hladiny hCG a suprimované hladiny TSH je patrná z obrázku č.1.
Posunutí hladin TSH v počátcích těhotenství oproti
netěhotné populaci k nižším hodnotám, je patrné
i z obrázku č. 2:
Přítomnost anti-TPO protilátek je všeobecně považována za rizikový faktor komplikací při otěhotnění
i v graviditě. Vysoké hladiny anti-TPO protilátek jsou
prokazovány u žen s častějšími aborty, neúspěšnými
pokusy in vitro fertilizace a jsou potvrzeným prediktivním faktorem poporodní thyreoiditidy. Až 50 % žen se
zvýšenou hladinou protilátek má v poporodním období některou z forem poruch štítné žlázy. Takto vzniklá
hypotyreóza může ovlivnit průběh případné další gravidity. Proto je nezbytné tyto ženy i nadále sledovat.
Vztah mezi koncentrací anti-TPO a TSH není jednoznačný, ale obecně lze říci, že ženy s vysokými hladinami TSH měly častěji i vysoké koncentrace anti-TPO.
Tato skutečnost je vidět i na obrázku č.3
Světový konsensus diagnostiky a terapie tyreopatií
v graviditě se stále tvoří. Při nastavení všeobecné horní
meze pro TSH v graviditě na 3,0 mU/l se záchyt patologie zvyšuje, ale je možné stanovit vlastní referenční
meze v každé laboratoři. Za supresi TSH v 1. trimestru
je považována až hodnota menší než 0,01 mU/l, vzhledem k jeho ovlivnění hladinou hCG. Referenční meze
pro FT4 a anti-TPO protilátky je možné používat
u těhotných shodné s ostatní dospělou populací.
Jeden z možných přístupů je zaměřit se při vyšetřování funkce štítné žlázy pouze na skupinu rizikových
žen, tj. žen s pozitivní rodinnou nebo osobní anamnézou tyreopatie nebo autoimunitních onemocnění,
zvláště diabetu mellitu 1. stupně, žen s prodělanou
léčbou zevním zářením v oblasti krku a hrudníku (především při M Hodgkin) a vzácnější situace léčby méně
častými léky (lithium, cytokiny, amiodaron). Vyšetřením jen těchto rizikových žen by ale podle zahraniční
studie kolem 30 % žen se subklinickou funkční poruchou uniklo diagnóze. Podle našich odhadů je v České
republice dokonce více než polovina těhotných žen
s pozitivním nálezem, které nemají žádnou rodinnou
anamnézu či výše zmíněná rizika.
Poruchy funkce štítné žlázy v těhotenství mají vliv
na vývoj novorozence i průběh těhotenství a výskyt
poporodní tyroiditidy u matky. Na základě mnohých
zahraničních i českých studií a zkušeností by bylo
vhodné prvotní vyšetření u těhotných rozšířit o stanovení hladiny TSH, FT4 a anti-TPO protilátek ke zjištění
funkce štítné žlázy. V dalším postupu je důležité sjednocení diagnostických postupů i interpretace výsledků
a navázání užší systematické spolupráce gynekologů,
endokrinologů, praktických lékařů a laboratoří.
Diskuse o screeningu funkčních tyreopatií v graviditě probíhají na světových fórech nejméně 15 let,
doporučení jsou formulována přes 10 let. Všichni souhlasí s významem takového vyšetřování, ale vždy závisí na ošetřujícím lékaři, zda těhotnou k vyšetření odešle nebo ne.
V první polovině roku 2009 bude ve vybraných
okresech České republiky probíhat pilotní studie
vyšetřování poruch štítné žlázy v těhotenství. Nemá
přesvědčit o významu takového vyšetřování, o tom
jistě není pochyb, cílem je především vyzkoušet
a nastavit komunikaci mezi gynekology, laboratoří
a endokrinology. Vzhledem k nutnosti zahájit případnou léčbu co nejdříve a přitom co nejšetrněji k těhotné, je někdy právě komunikace tím největším problémem. Půlroční projekt financuje VZP pro své
pojištěnkyně a zahrnuje vyšetření TSH, FT4 a anti-TPO
protilátek mezi 9. a 11. týdnem těhotenství. Spolupracující endokrinologové přislíbili přijetí těhotné v ordinaci během jednoho týdne. Svůj nezastupitelný podíl
mají i gynekologové, kteří těhotnou poučí a informují
o případném pozitivním nálezu. Věříme, že výsledky
projektu povedou k plošnému zavedení vyšetřování
poruch štítné žlázy v těhotenství.
Ověření referenčního
rozmezí FT4 při
použití soupravy
Access Free T4 firmy
Beckman Coulter
V roce 2007 uvedla firma Beckman Coulter na trh modifikovanou soupravu pro stanovení FT4. Důvodem byla především
snaha o zlepšení variací mezi jednotlivými šaržemi.
Současně byla provedena rozsáhlá klinická studie za účelem
upřesnění referenčního rozmezí této soupravy. Jako jedna
z mála souprav na trhu nabízí souprava Access FT4 normály
pro jednotlivé trimestry těhotenství. To se ukazuje být důležité
především v této době, kdy se stále častěji mluví o nutnosti vyšetřovat štítnou
žlázu u těhotných.
Vzorky pro klinické studie byly sbírány ve východní, střední a západní části
USA.
Výsledky klinické studie (uvedeny rovněž v návodu k soupravě):
Počet vzorků
95 % referenční limit (pmol/L)
316
7,86 – 14,41
V těhotenství:
Trimestr
95 % referenční
limit (pmol/L)
Počet vzorků
1. trimestr
131
6,67 – 13,86
2. trimestr
120
5,79 – 12,70
3. trimestr
121
6,11 – 12,20
Protože referenční intervaly hormonů štítné žlázy se mohou v jednotlivých destinacích lišit, např. vlivem jodovaných potravin a podobně, rozhodli jsme se ve spolupráci s OKB Nemocnice Znojmo ověřit tyto hodnoty
na vzorku 200 dárců krve. Ve vzorcích byla kromě FT4 stanovena rovněž
hladina TSH. 5 vzorků bylo vyřazeno na základě hodnot TSH mimo referenční rozmezí.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Počet vzorků
95 % referenční limit (pmol/L)
195
7,70 – 13,81
RNDR. ZDENĚK VEŠKRNA
OKB, NEMOCNICE ZNOJMO, P.O., JÁNSKÉHO 11, 670 35 ZNOJMO
ING. DRAHOMÍRA SPRINGER
TEREZA TIETZE
ÚSTAV KLINICKÉ BIOCHEMIE A LÉKAŘSKÉ
DIAGNOSTIKY, VFN A 1. LF UK,
KARLOVO NÁMĚSTÍ 32, 121 11 PRAHA 2
KATEŘINA LAPIŠOVÁ
23
Anemie
nemie je soubor příznaků, při kterém je v krvi snížený počet červených krvinek (erytrocytů) a množství krevního barviva (hemoglobinu). Za normálních okolností na pokles hladiny kyslíku reagují ledviny zvýšením tvorby hormonu zvaného erytropoetin. Erytropoetin se
přenáší krevním řečištěm do kostní dřeně, kde vydává signál ke zvýšení produkce červených krvinek. Stav se tak kompenzuje. V některých případech, zejména u nádorových onemocnění nebo chronických zánětlivých procesů, je však tento přirozený proces nedostačující
a dochází ke vzniku anemie. Klasifikaci anemií shrnuje tab. č. 1. Nejčastější
formou anemie je anemie z nedostatku železa. V případě, že je zjištěn nedostatek vitamínu B12, je potřeba ověřit, zda je to způsobeno jeho nedostatečným příjmem v potravě, nebo poruchou jeho vstřebávání. K tomu slouží specifické biochemické vyšetření protilátek proti vnitřnímu faktoru.
V diagnostice anemií jsou k dispozici také další parametry, které poskytují
ucelený obraz o stavu pacienta a jeho typu onemocnění. Kromě „tradičních“
stanovení (vit. B12, ferritin, folát) je možné vyšetřovat již dříve zmiňovaný
erytropeoetin (EPO), protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb) a solubilní
transferinový receptor (sTfR), viz. tab. č. 2.
KATEŘINA LAPIŠOVÁ, E-MAIL: [email protected]
TEREZA TIETZE, E-MAIL: [email protected]
Tab. 1: Klasifikace ANEMIÍ
mikrocyt/hypochrom
MCV snížené
normocyt/normochrom
MCV normální
makrocyt/hyperchrom
MCV zvýšené
Vyšetrenie
protilátok proti
vnútornému
faktoru pri
pernicióznej
anémii
Úvod
Feritin
snížený
Feritin
norm/zvýš
Reti
snížené/
norm
Reti
zvýšené
IDA
Anemie
z nedostatku
železa
Thalasemie
Selhávání
ledvin
Akutní
krvácení
Megaloblastická
Stav po
krvácení
Infiltrace
kostní
dřeně
Hemolytická
anemie
B12 def.
Kys. listová
def.
Stav po
hemolýze
Sideroblastická
anemie
Anemie
chronických
chorob
Reti
snížené/
norm
Normoblastická
Anemie
chronických
chorob
Jaterní
onemocnění
MDS
Reti
zvýšené
Úspěšná
léčba
deficitu
(Fe, B12…)
MDS
Tab. 2: Diagnostika ANEMIÍ
VARIABLE
ACD
IDA
BOTH
Iron (Fe)
Transferrin (Tf)
N
Tf.Satur%
Ferritin (Ferr)
N
N
N
Sol.Tf.Rec (sTfR)
N
sTfR/log Ferr
N
Cytokines IL-1/IL-6
N normální
snížené
24
zvýšené
Perniciózna anémia (PA) je plíživá choroba, ktorá
väčšinou začína v strednom a staršom veku. Ide
o autoimúnne ochorenie, ktoré vedie k imúnnej
deštrukcii žalúdočnej sliznice. Chorobný proces
môže začať a trvať celý život až do nástupu
megaloblastovej anémie. Protilátky proti parietálnym bunkám žalúdka (APCA) sa vyskytujú cca
u 60 % pacientov s atrofickou gastritídou a u 90
% pacientov s pernicióznou anémiou, častejšie
u tyreopatií, ale len v 5 % populácie 30 – 60 rokov.
Konverzne pacienti s pernicióznou anémiou majú
vyššiu incidenciu protilátok proti epitelu štítnej
žľazy, lymfocytom, bunkám renálnych tubulov.
Protilátky proti vnútornému faktoru (IFAB) sú
vysoko špecifické pre pernicióznu anémiu. Protilátky I. typu tzv. blokujúce protilátky bránia tvorbe
komplexu vnútorný faktor – kobalamín (IF-Cbl),
vyskytujú sa do 70 % pacientov s PA. Protilátky II.
typu tzv. viažúce protilátky bránia komplexu IFCbl naviazať sa na jeho receptory v ileu, vyskytujú
sa cca u polovice pacientov s blokujúcimi protilátkami.
Perniciózna anémia je častá u pacientov s inými
autoimúnnymi ochoreniami – ochoreniami štítnej
žľazy, prištítnych teliesok, inzulíndependentným
diabetes mellitus, Addisonovou chorobou, ulceróznou kolitídou, vitiligom, infertilitou.
dependentný diabetes meliitus u 2 pacientov (3,5 %), autoimúnnu hemolytickú
anémiu u jedného pacienta (1,8 %), autoimúnnu trombocytopéniu u jedného
pacienta (1,8 %). Z pacientov, ktorí mali negatívne APCA (11 pacientov) 72,7%
malo pozitívne IFAB. Len u 3 pacientov (5,3 %) boli negatívne APCA i IFAB,
94,7% malo pozitívne APCA alebo IFAB.
Diagnóza pernicióznej anémie je postavená na
náleze megaloblastovej anémie a špecifických
príznakoch deficitu vitamínu B12. IFAB sú odporúčaným diagnostickým testom, lebo sú vysoko
špecifické pre PA. Kombinácia megaloblastovej
anémie, znížených sérových hladín vitamínu B12
a prítomnosti protilátok proti vnútornému faktoru
znamená de facto diagnózu pernicióznej anémie.
Detekcia týchto protilátok môže eliminovať potrebu ďaľších testov, ako je Schillingov test.
Diskusia
Metodika, súbor pacientov
Záver
Súbor tvorilo 57 pacientov, 25 mužov a 32 žien, M:Ž =
1:1,28, s priemerným vekom 63,25 (39 – 85, medián
63) rokov. Všetci pacienti mali megaloblastovú anémiu, verifikovanú cytologickým vyšetrením kostnej
drene. Odoberali sme vzorku natívnej krvi, uzavretým
systémom (Sarstedt), minimálne jeden týždeň od
poslednej injekcie vitamínu B12, respektíve u pacientov v rámci diferenciálnej diagnostiky makrocytovej
anémie pred započatím terapie. Vzorka séra bola
vyšetrená metódou kompetitívneho väzbového imunoenzymatického stanovenia na analyzátore Access 2,
súpravou Intrinsic factor Ab firmy Beckman Coulter.
Výsledky pod 1,20 AU/ml boli hodnotené ako
negatívne, výsledky nad 1,53 AU/ml boli hodnotené ako pozitívne, výsledky od 1,20 do 1,53 AU/ml
boli hodnotené ako nejednoznačné, respektíve
v šedej zóne.
Na základe našich skúseností v súlade s literárnymi údajmi môžeme odporúčať
vyšetrenie protilátok proti vnútornému faktoru u pacientov vrámci diferenciálnej diagnostiky makrocytovej anémie, u ktorých na základe prvotných vyšetrení je suponovaná perniciózna anémia.
Výsledky
Priemerná hladina vitamínu B12 bola 93,4 ± 54,7 (17
– 350, medián 69) pg/ml. Priemerná hodnota IFAB
bola 21,4 ± 24,3 (0-123, medián 11,9) AU/ml. Pozitívne hodnoty sa vyskytli u 54,3 %, negatívne u 21,7 %,
nejednoznačné u 23,9 % pacientov. APCA boli pozitívne u 52,6 % pacientov, negatívne u 26,8 %.
Atrofická gastritída verifikovaná endoskopicky
a histologicky u 16 pacientov (28,1 %).
Pokiaľ sme vyhodnotili výskyt koincidujúcich
autoimúnnych ochorení: ochorenie štítnej žľazy
sme zaznamenali u 15 pacientov (26,3 %), inzulín-
Výskyt protilátok proti intrinsic faktoru v našom súbore bol porovnateľný s literárnymi údajmi, pretože prítomnosť protilátok proti vnútornému faktoru sa
uvádza u 30 – 76 % pacientov s pernicióznou anémiou. Negatívne alebo nejednoznačné výsledky nevylučujú prítomnosť protilátky v nízkom titri. Ak by sme
zahrnuli k pozitívnym výsledkom IFAB i hodnoty v tzv. šedej zóne, výskyt by bol
vyšší, a to 76,2 % pacientov z nášho súboru. Incidenciu protilátok v našom
súbore určite ovplyvnil výber pacientov súboru, do ktorého sme zahrnuli len
pacientov s potvrdenou megaloblastovou anémiou, deficitom vitamínu B12,
často s iným autoimúnnym ochorením (33,3 %).
Použitá literatúra:
1. Lichtmann M. A., Beutler E., Kipps T. J., Seligsohn U., Kaushansky K., Prchal J.
T.Williams Hematology. Seventh edition. McGraw-Hill. 2006
2. Gueant J. L. Autoantibodies in pernicious anemia type I patients recognize
sequence 251-256 in human intrinsic factor. Proc. Assoc. Am. Physicians. 1997.
109/5/: 462-469.
3. Carmel R. Reassessment of the relative prevalences of antibodies to gastric
parietal cell and to intrinsic factor in patients with pernicious anaemia: influence od patient age and race. Clin. Exp. Immunol. 1992. 89: 74-77.
4. Hippe E., Olesen H. Nature of vitamin B12 binding:III. Thermodynamics of
binding to human intrinsic factor and transcobalamins. Biochim. Biophys.Acta.
243:83, 1999.
5. Toth B.H., VanDriel I. R., Gleeson P. A.: Pernicious anemia. N. Engl. J. Med. 337:
1441, 1997.
6. Shojania A. M.: Physician,s management od suspected vitamin B12 deficiency. CMAJ 123: 1127, 1999.
PRIM. MUDR. ANNAMÁRIA BRATKOVÁ
HTO, I. SÚKROMNÁ NEMOCNICA KOŠICE – ŠACA,
LÚČNA 57, 040 15 KOŠICE - ŠACA
PHARMDR. EVA ŽEMBEROVÁ
RIA LABORATÓRIUM S.R.O., AMERICKÁ TRIEDA 17, 040 13 KOŠICE
25
UniCel DxH
koncept - nová
éra v laboratorní
hematologii
nešní rutinní hematologické laboratoře čelí neustále rostoucímu
tlaku na zvyšování produktivity práce, zkracování doby zpracování
vzorku (Turnaround Time = TAT) a důslednou redukci všech nákladů laboratoře. UniCel DxH koncept byl navržen tak, aby vám umožnil tyto náročné požadavky plnit a zároveň pomohl transformovat
každodenní hematologický provoz na kvalitativně vyšší úroveň, která
nemá na současném hematologickém trhu obdoby. UniCel DxH koncept přináší bez nadsázky do vašich laboratoří opravdu revoluční řešení všech problémů
rutinního provozu a také zcela nový analytický pohled na krevní obraz, především pak na diferenciální rozpočet leukocytů a detailní analýzu atypických,
nezralých a patologických buněčných subpopulací.
Uvedení systému UniCel DxH na světový hematologický trh předcházel více
než pětiletý vývoj, který byl završen příhodně o Vánocích v prosinci 2008 certifikací FDA a představením celého konceptu na celosvětové laboratorní výstavě
v USA. Během dlouhého a pečlivého vývoje bylo současně s technickou stránkou systému řešeno i několik desítek klinických studií v předních světových
hematologických centrech. Veškeré analýzy během náročných studií byly současně srovnávány, vyhodnocovány a verifikovány nejen s tradičními manuální-
26
mi metodami, ale vždy i s plnohodnotnou průtokovou cytometrií jako referenční metodou. Výsledky
těchto studií spolu se zkušenostmi uživatelů stávajících hematologických systémů Beckman Coulter
umožnily vznik naprosto unikátního analytického
softwaru, který v sobě spojuje intuitivní jednoduchost ovládání, uživatelskou přístupnost a klinickou relevanci výsledků. Prostorové 3D zobrazení
výsledků je dalším, kvalitativně vyšším krokem do
světa buněčných subpopulací a rutinní průtokové
cytometrie.
Unikátní bloková koncepce systému UniCel DxH
vám poprvé umožní vyřešit váš laboratorní provoz
přesně podle vašich potřeb a požadavků, včetně
prakticky neomezené možnosti růstu a modifikace
v budoucnosti. UniCel DxH koncept nabízí stejné
hodnoty malým i velkým laboratořím, rutinním, klinickým a výzkumným provozům. Detailně vám UniCel DxH koncept představíme v příštím čísle IVD.
Pouze vaše volba rozhoduje o parametrech, vlastnostech a výkonu vaší hematologické laboratoře.
Nakonfigurujte si tedy s námi svůj hematologický
provoz, svou vlastní hematologickou budoucnost.
PETR BOUDAL
ad hemostazeologických systémov
ACL TOP Family predstavuje nový
štandard pre analytickú výkonnosť a jednoduchosť prevádzky, čím v plnej miere
spĺňa požiadavky na komplexné automatizované testovanie aj v náročnejších
hemostazeologických laboratóriách. Prístroje patriace do tejto rodiny sú vyvinuté na základe spätnej
väzby od laboratórnych pracovníkov - užívateľov
koagulačných analyzátorov a vyrábané spoločnosťou Instrumentation Laboratory (IL), ktorá počas 50
rokov svojej existencie zastáva popredné miesto vo
vývoji laboratórnej diagnostiky ako aj vo výrobe
prístrojovej techniky a reagencií pre klinické laboratóriá. Rad ACL TOP Family reprezentujú systémy
ACL TOP, ACL TOP CTS a novinka ACL TOP 500 CTS,
ktorá sa dostala na trh koncom minulého roka.
Okrem toho, že ACL TOP 500 CTS je najmladším
členom radu ACL TOP Family je zároveň aj najmenším
v tejto skupine, avšak koncipovaný na báze rovnako
vyspelej technológie ako ACL TOP alebo ACL TOP CTS.
V kombinácii s vysokokvalitnými automatizovanými
metodikami od IL je ACL TOP 500 CTS excelentným
hemostazeologickým systémom schopným prispôsobiť sa prevádzke vášho laboratória. Poskytuje:
kompletné riešenie pre stredné až vysokokapacitné rutinné a špeciálne laboratóriá
širokú ponuku rutinných a špeciálnych testov
kontinuálny chod a vynikajúcu walkaway kapacitu
real-time testovanie statimových vzoriek
prácu s uzavretými skúmavkani a prepichovacím
modulom CTS (Closed Tube Sampling)
automatizovaný manažment reagencií, kontroly
kvality a údržby
Predstavujeme
ACL TOP 500 CTS
od výrobcu
Instrumentation
Laboratory
stredne až vysokokapacitný testovací systém
s flexibilitou, rýchlosťou a inteligenciou najväčších
hemostazeologických analyzátorov
ACL TOP 500 CTS je automatizovaný stolový random – access analyzátor
určený na in vitro testovanie koagulačných a fibrinolytických parametrov.
Užívateľ si môže zvoliť, prispôsobiť a spustiť testovanie v priebehu sekúnd,
výberom zo širokej ponuky rutinných a špeciálnych testov bežne typických
iba pre oveľa väčšie prístroje. IL má k dispozícii rozsiahly panel automatizovaných metodík, čím je zabezpečené potrebné testovanie vo všetkých fázach
v manažmente chorôb.
HemomosIL® Assays
Základný skríning
a monitoring antikoagulancií
PT
APTT
Fibrinogén Clauss
Trombínový čas
Hepatocomplex*
Pro-IL-Complex*
Heparín (FXa)
HŽT a DIK
D-Dimér HS
D-Dimér
Lupus Anticoagulant
Silica Clotting Time
LAC Skríning/Konfirmačný
Krvácavé ochorenia
Faktory vnútornej cesty
Faktory vonkajšej cesty
FXIII Antigén
VWF Antigén
VWF Aktivita
Trombofília
Antitrombín
Proteín C (Chromogénny)
Proteín C (Koagulačný)
Free Protein S (Antigén)
Free Protein S (Koagulačný)
FV Leiden (APC-R V)
Homocysteín
ThromboPathTM*
Fibrinolýza
Plazminogén
Plazmín Inhibítor
Niektoré aplikácie metodík sú vo
vývoji a čakajú na validáciu.
* Nie je dostupné vo všetkých krajinách
27
Zabezpečenie
funkčnosti
ACL TOP 500 CTS ponúka konsolidované riešenie testovania pre koagulačné,
chromogénne a imunologické metodiky. Poskytuje tak výsledky pre priamo
merané, ako aj pre odvodené – vypočítané parametre. Pre jednu vzorku si
užívateľ môže naprogramovať až 30 rôznych testov. Počet nadefinovateľných
metodík je 500, z toho 250 je užívateľsky definovateľných.
Prístroj sa skladá z 2 modulov. Kontrolný modul vytvára užívateľské rozhranie a kontrolu funkčnosti analytického modulu. Pozostáva z osobného
počítača pracujúceho s operačným systémom Windows® XP, klávesnice, dotykovej obrazovky, myši a komunikačných rozhraní pre analytický modul
a externé zariadenia. Vykonáva manažment dát, redukciu dát, komunikáciu
s LIS, identifikáciu vzoriek, manažment reagencií a spotrebného materiálu,
reporting, manažment priebehu testovania a kontroly kvality a monitoruje
chod systému.
Analytický modul je hardvérom určeným na primárne spracovanie vzoriek
a reagencií. Zahrňuje:
počítač pre analytický modul
systém pre manipuláciu s kyvetami pohybujúcimi sa po dopravníkovom páse
(prístroj pracuje so stripmi, z ktorých každý má 4 kyvety)
priestor pre 80 vzoriek, v ktorom sa pohybuje rameno s prepichovadlom/
pipetorom pre vzorky
priestor so 40 chladenými pozíciami pre reagencie a diluenty, v ktorom sa
pohybuje rameno s pipetorom pre reagencie a diluenty
28
rozvod pre kvapaliny
systém pre manipuláciu so vzorkami a reagenciami - 2 pipetory s vlastnými pumpami, premývacie stanice
systém zabezpečujúci vykonanie reakcií a meraní
- inkubátory, meracie komory a 3 štvorkanálové
optické čítacie jednotky schopné merať pri 405
a 671 nm
preplachovací a čistiaci systém – 4 l zásobník na
premývací a 0,5 l zásobník na čistiaci roztok
systém pre manipuláciu s odpadom – 10 l odpadová nádoba na tekutý odpad a nádoba na tuhý
odpad s kapacitou 150 použitých stripov
napájací zdroj a prepojenia
vlastná oporná konštrukcia - karoséria prístroja
a bezpečnostný kryt
Spracovanie väčšieho počtu
vzoriek za kratší čas
Vyskoká priechodnosť vzoriek systémom ACL TOP
500 CTS vyhovuje potrebám prevádzok s rýchlym
chodom a s koncepciou predchádzania „úzkym
hrdlám“ analýzy a minimalizovaním potreby zásahu užívateľa.
vysoká priechodnosť: 240 PT za hod a 180 PT /
APTT za hod
vysoká kapacita: 800 kyviet, 80 vzoriek
kontinuálne vkladanie a vyberanie vzoriek, reagencií a kyviet
zabudovaná čítačka čiarových kódov pre vzorky
a reagencie
detekcia prítomnosti materiálov neoznačených
čiarovým kódom
Efektivita v spojení
s nenáročnou obsluhou
Automatizovaný manažment vzoriek, reagencií
a manažment výsledkov uľahčuje prácu užívateľa,
šetrí čas a redukuje nároky na personál v laboratóriu. Intuitívne menu poskytuje aj menej skúsené-
mu užívateľovi pohodlný prístup do roziahlych
testovacích funkcií.
Priateľské užívateľské rozhranie
17“ farebný dotykový LCD displej
operačný systém Windows® XP
on-line Help zabudovaná do ponuky SW
Automatizovaný manažment vzoriek
práca s uzavretými skúmavkami
kontinuálne vkladanie (stojany)
pozitívna identifikácia vzorky (v palube zabudovaná čítačka barkódov)
automatická predilúcia vzoriek
STAT vyšetrenia
spracovanie STAT vzoriek v reálnom čase
bez predurčených stojanov alebo pozícií
výsledok PT do 3min
nepretržitý chod, 24 hod/deň, 7 dní/týždeň
Manažment reagencií v reálnom čase
kontinuálne vkladanie (stojany)
pozitívna identifikácia reagencií (v palube zabudovaná čítačka barkódov)
monitorovanie objemu v reálnom čase (meranie
objemu)
Vysoká priechodnosť vzoriek
systémom ACL TOP 500 CTS
vyhovuje potrebám prevádzok
s rýchlym chodom a s koncepciou
predchádzania „úzkym hrdlám“
analýzy a minimalizovaním
potreby zásahu užívateľa.
monitorovanie stability reagencií v prístroji
automatické načítanie pridelených hodnôt z 2D barkódov
Automatizovaná kontrola kvality
užívateľom definovaná frekvencia vykonania kontrol
Westgardove pravidlá
Levey – Jennings grafy
Jednoduchá údržba
redukovanú dennú údržbu v čase špecifikovanom užívateľom vykonáva systém
plne automatizovaná údržba pre všetky ostatné denné aktivity
aktívny protokol údržby
Správa výsledkov
Systém vykonáva autovalidáciu výsledkov v reálnom čase a v prípade detekcie
abnormálnych nálezov je schopný testovanie opakovať. Na základe užívateľom
definovaných pravidiel je možné naprogramovať prídavné testy (napr. rerun,
reflex), ktoré sú následne vykonané automaticky. Výsledky sú uchovávané
v pamäti (databáza má kapacitu 20 000 vzoriek) a sú pripravené k nahliadnutiu
v ktoromkoľvek čase.
reflexné testovanie prostredníctvom multipravidiel
faktor paralelizmus s automatickým mnohonásobným riedením
validácia výsledkov prostredníctvom multipravidiel
zobrazenie rekčných kriviek pre všetky typy testov
výsledky sú exportovateľné do PDF, XLS a TXT formátov
Bezpečnosť dát
Systém vyniká aj v takých nevyhnutných potrebách
moderných laboratórií, ako je zálohovanie a garancia
bezpečnosti dát.
heslom kontrolovaný bezpečnostný prístup
konfigurovateľný viacúrovňový užívateľský prístup
zázman udalostí a užívateľských prístupov
pomocný program zálohovania databázy na ochranu identifikačných údajov pacientov
Systém ACL TOP 500 CTS ponúka vysokú produktivitu, pracuje výkonne a pohotovo s dôrazom na užívateľský komfort a časovo náročné výkony, ako sú údržba a kontrola kvality optimalizuje. Pevne verím, že
čoskoro budeme môcť publikovať aj prvé užívateľské
skúsenosti s týmto systémom v Slovenskej a Českej
republike.
JOZEFÍNA BERNÁTOVÁ
29
Nejcitlivější
dostupná souprava,
určeno pro stanovení
PAPP-A při časné
diagnostice koronárních
onemocnění.
Literatura
1. Pudil R, Tichý M, Vojáček J. Kardiomarkery na
prahu třetího tisíciletí. Interv Akut Kardiol
2007;6:20–23.
2. Bonno M, Oxvig C, Kephart GM, et al. Localization
of pregnancy-associated plasma protein (PAPP)-A
and colocalization of pregnancy-associated plasma
protein-A messenger ribonucleic acid and eosinophil
granule major basic protein messenger ribonucleic
acid in placenta. Lab Invest 1994; 71:560-66.
3. Khosravi J, Diamandi A, Krishna RG et al. N. Pregnancy associated plasma protein-A: ultrasensitive
immunoassay and determination in coronary heart
disease. Clin Biochem 2002; 35:531–538.
4. Lund J, Qin QP, Ilva T et al. Circulating pregnancyassociated plasma protein A predicts outcome in
patients with acute coronary syndrome but no troponin I elevation. Circulation 2003;108:1924–1926.
5. Heeschen C, Fichtlscherer S, Hamm CW. Pregnancy-associated plasma protein-A (PAPPA) plasma level independently predict outcome in troponin negative patients with acute coronary
syndrome. Circulation 2003;108 (Suppl IV):470.
6. Friedecký, B., Engliš, M., Franeková et al. Doporučení České společnosti klinické biochemie ke stanovení biochemických markerů poškození myokardu,
29.11.2007.
Nová ultrasensitivní
ELISA souprava na
stanovení PAPP-A
APP-A (Pregnancy associated plasma protein A) je glykoprotein syntetizovaný syncytiotrofoblastem v průběhu těhotenství a uvolňovaný do krevního oběhu matky1. Cirkuluje převážně jako heterotetramerický komplex
sestávající ze dvou PAPP-A podjednotek a proMBP (eosinofilní Major Basic Protein)2. Jeho stanovení je využíváno při screeningu Downova syndromu.
PAPP-A je v řádově nižších koncentracích uvolňován do cirkulace také při
ruptuře nestabilního aterosklerotického plátu3,4. Stabilní pláty PAPP-A neuvolňují. V těchto případech se PAPP-A vyskytuje volný – tedy nikoli v komplexu
s pro-MBP. Zvýšený PAPP-A je nezávislým časným prediktorem výskytu ischemie myokardu a pomáhá při indikaci koronárních intervencí5,6.
SOUPRAVA ACTIVE® cPAPP-A ELISA
ELISA, 8 x 12 jamek potažených specifickou
Formát
protilátkou
Vzorek
Sérum, 50 μl
Rozsah soupravy
Kalibrátory 0; 0,5 – 2,5 – 10 – 25 – 50 μIU/ml
Kontrolní vzorky (CS)
2
Inkubace
2 hod + 1 hod + cca 10 min, laboratorní teplota
Analytická citlivost
0,18 μIU/ml
Stabilita soupravy
Stabilita kontrolních
vzorků
Kat. č. soupravy
18 měsíců
10 dní po rozpuštění, pak nutno zamrazit
v alikvotech
10 dní po rozpuštění, pak nutno zamrazit
v alikvotech
DSL-10-27600
Kat. č. kalibrátorů a CS
DSL-10-27609-54, objednává se zvlášť
Specifita
Stanovuje PAPP-A volný i vázaný s proMBP
Použití
Jen pro výzkumné účely, není určena pro IVD
Stabilita kalibrátorů
30
VANDA FILOVÁ
Kardiologické testy
Posouzení
rizika
Časná
detekce
Cholesterol
Triglyceridy
LDL
Homocystine
Diagnóza
Troponin I
CKMB
BNP
Sledování
Stratifikace/
účinnosti
terapie
léčby
Troponin I
BNP
Hs CRP
cPAPP-A
Požadavky v kardiologii:
Časná detekce
Stratifikace rizika
Řízená terapie
ro stanovení původu hematurie je
nejčastější laboratorní metodou
vyšetření morfologie erytrocytů ve světelném mikroskopu ve fázovém kontrastu (1, 2).
V literatuře jsou uváděny další metody, kterými
lze odlišit glomerulární a neglomerulární původ
erytrocytů v moči – rozptyl jejich velikosti při
automatizované průtokové cytometrii (5), exkrece apolipoproteinu A1 (6), posouzení vzájemných
exkrečních poměrů vhodně zvolených indikátorových bílkovin (albuminu, IgG, alfa-1-mikroglobulinu a alfa-2-makroglobulinu – viz IVD 1/2007
a 2/2007) (7, 8) a poměr močového albuminu
k celkové proteinurii (3, 4).
Při vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu
je hodnocen podíl tzv. dysmorfních erytrocytů
a přítomnost jejich specifického typu - akantocytů, G1 buněk, což jsou tzv. koblihovité erytrocyty
se zesílenou membránou s výběžky cytoplazmy
(obr. 1). Nález ≥ 80 % dysmorfních erytrocytů
v moči svědčí pro jejich glomerulární původ; je-li
přítomno ≥ 5 % akantocytů, je přítomnost glomerulární hematurie vysoce pravděpodobná,
stejně tak jsou-li přítomny erytrocytární válce.
Nález ≥ 80 % izomorfních erytrocytů ukazuje na
jejich neglomerulární původ (1). Zahur a kol.
(2000, 2) doporučují pro hodnocení posuzovat
oba parametry: pro nález ≥ 50 % dysmorfních
erytrocytů a současně ≥ 1 % akantocytů uvádějí
senzitivitu 60 % a specificitu 91% pro průkaz
glomerulární hematurie, pro nález ≥ 50 %
dysmorfních erytrocytů nebo ≥ 1 % akantocytů
senzitivitu 93 % se specificitou 44 %.
Třebaže je vyšetření erytrocytů ve fázovém
kontrastu považováno za tzv. zlatý standard, má
určité nevýhody:
neexistuje jednoznačný standard definující
dysmorfii erytrocytů
hodnocení je závislé na individuálních vlastnostech lidského oka, je subjektivní a vyžaduje
určitou hodnotící zkušenost
ne vždy lze jednoznačně odlišit skutečně
dysmorfní erytrocyty od izomorfních erytrocytů změněných v důsledku fyzikálně chemických vlastností moče (pH, osmolalita)
reprodukovatelnost nálezů mezi jednotlivými
pracovišti je malá
hodnocení může být obtížné a informační
hodnota nálezu snížená, zejména jsou-li přítomny současně oba typy hematurie (smíšené
hematurie)
existuje široká šedá zóna mezi tzv. jednoznačně glomerulárním a tzv. jednoznačně neglomerulárním nálezem
nález neglomerulární hematurie nevylučuje
současné renální onemocnění
Indikátorové
proteiny v moči (3)
– hematurie
Hematurie a/nebo proteinurie jsou jedním
z nejčastějších patologických laboratorních
nálezů při vyšetření moče. Vyloučíme-li kontaminaci krví z jiných zdrojů nebo zbarvení moče
nehemoglobinového původu (viz. tab. 1), je
u skutečné hematurie třeba odlišit její původ,
zejména rozlišit glomerulární hematurii (v praxi
někdy označovanou jako „nefrologickou“) od
postrenální hematurie (tzv. „urologické“). Určení typu hematurie rozhoduje často o dalším
postupu lékaře.
třebaže jsou akantocyty vysoce specifické pro glomerulární typ hematurie, jejich nepřítomnost nevylučuje glomerulární onemocnění (Zahur,
2000 ve své studii (n = 82 glomerulopatií) u 38 % glomerulonefritid
a u 34 % biopticky verifikovaných glomerulopatií nenalezl žádné akantocyty v močovém sedimentu)
u tzv. „chudého močového sedimentu“ (tj. s málo buňkami) je nález
nehodnotitelný
Tab. 1: Příčiny hematurie skutečné a hematurii napodobující
extrarenální:
- antikoagulační terapie
- antiagregační terapie
- hematologická onemocnění (leukémie, polycytemia
vera, krvácivé stavy)
- menstruace
- gynekologická onemocnění (např. eroze na
děložním čípku, gynekologické záněty a nádory)
intrarenální:
- glomerulární
- glomerulonefritidy
- glomerulopatie (např. diabetes mellitus,
hypertenze, systémové choroby pojiva, syndrom
tenkých membrán/benigní familiární hematurie,
tumory, trauma)
- tubulointersticiální - tubulointersticiální nefropatie a záněty
postrenální
- urolitiáza
(pánvička, močovody, - nádory
močový měchýř,
- infekce
močová trubice):
- malformace vývodných močových cest
- traumata
- onemocnění prostaty
hematurii
napodobující:
- pigmenty (bilirubin, myoglobin, porfyriny, kyselina
homogentisová, melanin, methemoglobin
- léky (např. ibuprofen, Fe-sorbitol, chlorochin,
fenolftalein, fenazopyridin, rifampicin,
nitrofurantoin)
- potravinová barviva (červená řepa, ostružiny)
- arteficiální (simulace)
31
Obr. 1: Erytrocyty v moči ve světelném mikroskopu
s fázovým kontrastem
(Teplan V. a kol.: Praktická nefrologie, 2006, s. 27)
Tab. 2: Typ hematurie podle distribuce velikosti
erytrocytů (FSC)
glomerulární
≥ 80% erytrocytů s FSC ≤ 126 a současně < 80% s FSC ≥ 84
neglomerulární ≥ 80% erytrocytů s FSC ≥ 84 a současně < 80% s FSC ≤ 126
nebo:
≥ 80% erytrocytů s FSC ≤ 126 a současně ≥ 80% s FSC ≥ 84
smíšený
< 80% erytrocytů s FSC ≤ 126 a současně < 80% s FSC ≥ 84
Graf 1: Odlišení postrenální a renální hematurie podle
exkrece α-2-makroglobulinu
(Guder WG, Hofmann W: Differentiation of proteinuria and
hematuria by single protein analysis in urine, Clin Biochem,
1993 26 (4), 277-282)
32
většina autorů uvádí nutnost hodnocení do
15 min od vymočení (znehodnocení rozpadem
erytrocytů), v praxi to znamená potřebu zajistit vymočení pacienta co nejblíže laboratoře
časová dostupnost vyšetření (objednací doba
na některých pracovištích i několik týdnů)
Ve starších pracích (např. Hyodo, Kumano,
1999, cit. 5) je původ hematurie hodnocen podle
distribuce velikosti erytrocytů na podkladě histogramů FSC (forward scatter intensity) v automatizované průtokové cytometrii močového sedimentu (UF-100, Sysmex). Hodnocení vychází
z předpokladu, že dysmorfní erytrocyty glomerulárního původu jsou menší než izomorfní erytrocyty, tedy mají nižší hodnotu FSC. Jako diskriminační meze jsou uváděny hodnoty FSC 84 a 126,
které odpovídají průměrné velikosti erytrocytu
4 μ, resp. 6 μ (viz. tab. 2). Autoři uvádějí, že tímto
způsobem je jednoznačně hodnotitelných 90 %
nálezů. Obtížné může být automatizované hodnocení podle FSC v případech, kdy došlo již k lýze
erytrocytů nebo při současné infekci močových
cest (účinek bakterií, cytokinů uvolňovaných
z leukocytů, změn pH a ev. osmolality moče na
morfologii erytrocytů).
Alternativní možností může být diferenciace
pomocí exkrece apolipoproteinu A1 (apoA1). Němečtí autoři Verwiebe, Weber a Kallerhoff (1993,
cit. 6) vycházejí z předpokladu, že komplex cholesterol-apoA1 neprochází bazální membránou
glomerulu ani při poškození glomerulární stěny
pokročilého stupně - tedy zvýšená exkrece apoA1
svědčí pro postrenální hematurii. Diagnostická
senzitivita apoA1 ve zmíněné práci je 0,5 ml krve/
ml moče. Vzhledem k předpokládaným nízkým
koncentracím apoA1 v moči autoři doporučují
nefelometrické stanovení. ApoA1 v moči se však
běžně v rutinní laboratoři nestanovuje, takže
tento způsob hodnocení se zdá pro praxi nepřínosný.
Jednu z novějších možností hodnocení uvádějí
v recentních pracích japonští autoři Ohisa, Kanemitsu a spol. (2007, 2008, cit. 3,4). Hodnocení na
podkladě poměru močového albuminu k celkové proteinurii vychází z předpokladu, že albumin
za fyziologického stavu tvoří maximálně 40 % celkové proteinurie. Postižení glomerulární bazální
membrány je provázeno často proteinurií, která je
charakterizována zejména zvýšenou exkrecí albuminu, zatímco u stavů s postrenální proteinurií
není exkrece albuminu významně zvýšená. Jako
diskriminační pro rozlišení glomerulární a neglomerulární hematurie uvádějí hodnotu 0,59 (při
hodnotách albuminurie i celkové proteinurie v mg/
l). Limitací vyšetření je celková proteinurie nižší než
40 mg/l. Hodnota poměru ≥ 0,59 svědčí pro glomerulární hematurii, < 0,59 pro neglomerulární se
senzitivitou 97,1 % a specificitou 100 % pro průkaz
glomerulární hematurie, p < 0,001 (hodnocen soubor n = 143 čerstvých močí, z toho 104 s glomerulárním onemocněním, 39 s neglomerulárním; jako
mikroskopická hematurie byl hodnocen nález ≥ 5
erytrocytů v zorném poli). Současně byly hodnoceny i albuminurie vztažená na močový kreatinin
a celková proteinurie vztažená na močový kreatinin, avšak na podkladě hodnot obou těchto poměrů nebylo možné vždy jednoznačně rozhodnout
mezi glomerulárním a neglomerulárním onemocněním (překryv distribuce hodnot). Hodnocení
pomocí poměru močového albuminu k celkové
proteinurii může být obtížnější u smíšených hematurií; u hematurií s hodnotou poměru pohybující se
kolem diskriminační meze doporučují autoři pro
zvýšení diagnostické efektivity alespoň 2 vyšetření
v krátkém časovém odstupu. Autoři srovnávali
u téhož souboru diagnostickou efektivitu poměru
močového albuminu k celkové proteinurii s vyšetřením erytrocytů ve fázovém kontrastu: senzitivita
(SN) i specificita (SP) pro průkaz glomerulární
hematurie byla pro fázový kontrast nižší (v první
studii SN 88 %, SP 81 %; ve druhé studii s podobným designem (n = 579, z nich 329 s glomerulárním onemocněním, 250 s neglomerulárním) byla
u vyšetření fázovým kontrastem SN 83,3 % a SP
75,2 %).
Na našem pracovišti máme více než tříletou
zkušenost s hodnocením proteinurie a hematurie
na podkladě vyšetřování tzv. močových indikátorových proteinů, vycházející z prací kolektivu
autorů Hofmann, Guder, Ivandič (1992, 1993,
1996, 2000, např. 7,8). Diferenciaci původu
hematurie podle poměru exkrecí vhodně zvolených indikátorových proteinů lze využít při
hematurii spojené s exkrecí albuminu vyšší než
100 mg/l. Při nižší exkreci albuminu autoři doporučují jako metodu volby vyšetření erytrocytů ve
fázovém kontrastu. Hodnotícími kritérii jsou
poměry exkrece alfa-2-makroglobulinu k albuminu (A2M/A), alfa-1-mikroglobulinu k albuminu
(a1m/A) a IgG k albuminu (IgG/A). Pro rozlišení
postrenální a renální hematurie je rozhodující
poměr exkrece alfa-2-makroglobulinu k albuminu. Alfa-2-makroglobulin je makromolekula
(Mr 720 000), která podobně jako apoA1 neprochází bazální membránou glomerulu ani při jejím
těžkém strukturním poškození - jeho zvýšená
exkrece je proto relativně specifická pro postrenální hematurii. Postrenální hematurie má poměry exkrecí podobné poměrům plazmatických koncentrací hodnocených proteinů. Je-li vyloučen
postrenální typ hematurie, lze při současném
porovnání poměrů IgG/A a a1m/A rozlišit ještě
mezi glomerulárním a tubulointersticiálním
původem erytrocytů, viz tab. 3. Odlišné exkreční
poměry jsou patogeneticky vysvětlitelné tím, že
molekula IgG je filtrována přes glomerulární
bazální membránu úměrně poškození její integri-
Graf 2: Distribuce exkrecí indikátorových proteinů
u jednotlivých typů hematurie
(in Hofmann W, Rossmüller B, Guder WG, Edel HH: A New
Strategy for Characterizing Proteinuria and Hematuria from
a Single Pattern of Defined Proteins in Urine. Eur J Clin Chem
Clin Biochem, Vol. 30, 1992: 707-712)
ty a struktury, avšak IgG může být také syntetizován v intersticiu ledvin při
jeho zánětu. Poruchu tubulární reabsorpce odráží především exkrece alfa-1mikroglobulinu. Vyšší poměr IgG/A je popisován u hematurie při tubulointersticiální nefropatii, zvýšená exkrece alfa-1-mikroglobulinu přítomnost
tubulointersticiální nefropatie potvrzuje.
Současné posouzení tří indexů kombinující různé proteiny s různým původem umožňuje hodnotit i smíšené hematurie. Pro hodnocení nálezu, tak
jako u posuzování proteinurie (viz. IVD 7/2007) je třeba znát anamnestická
data pacienta, je tedy nezbytná spolupráce klinického biochemika, který
nález hodnotí, s indikujícím lékařem.
Postižení glomerulární bazální
membrány je provázeno často
proteinurií, která je charakterizována
zejména zvýšenou exkrecí albuminu,
zatímco u stavů s postrenální
proteinurií není exkrece albuminu
významně zvýšená.
33
Z biochemických studií jsme
věděli, že N-acetyltransferáza je
extrémně hydrofobní membránový
protein, bylo tedy možné očekávat,
že protein kodovaný genem
bude mnohočetné predikované
transmembránové domény.
Tab. 3: Typ hematurie podle poměru exkrecí indikátorových
proteinů
(Hofmann W, Rossmüller B, Guder WG, Edel HH: A New Strategy for
Characterizing Proteinuria and Hematuria from a Single Pattern of
Defined Proteins in Urine. Eur J Clin Chem Clin Biochem, Vol. 30,
1992: 707-712)
A2M/A
a1m/A
IgG/A
postrenální
> 0,02
< 0,1
> 0,2
renální:
- glomerulární
< 0,02
< 0,1
< 0,2
- tubulointersticiální
< 0,02
> 0,1
> 0,2
smíšený
v lednu 2007: celková proteinurie 2,56 g/d, , Skreatinin 91 μmol/l, urea 4,4 mmol/l, glomerulární filtrace (MDRD) 1,34 ml/s, moč chemicky:
bílkovina +++, krev ++++, mírně zvýšené S-IgA
(4,8 g/l); v průběhu vyšetření se objevil exantém
na dolních končetinách a na břiše. Vyšetřeny
erytrocyty ve fázovém kontrastu se závěrem:
hematurie smíšená, nelze jednoznačně charakterizovat, spíše neglomerulární. V téže době
jsme u pacienta vyšetřili v moči indikátorové
proteiny (viz. tab. A).
Po zhodnocení výsledků všech vyšetření i přes
normální hodnotu glomerulární filtrace a sérového kreatininu a nejednoznačný závěr spíše
neglomerulární hematurie při vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu nefrolog indikoval
provedení renální biopsie, kde byl histologický
nález imunopatologické glomerulonefritidy
(fokálně segmentální mesangioproliferativní
forma IgA nefropatie se srpky, současně
Henoch-Schönleinova purpura) s vysokým rizikem rychlého vývoje selhání ledvin; pacient byl
na podkladě nálezu hospitalizován a zahájena
včasná terapie.
kombinace
Tab. A (renální glomerulární hematurie)
mg/l
mg/g
(U-kreat.
9,3 mmol/l)
celková proteinurie
1 870
1 780
U-albumin
1 460
1 389,3
69x
U-IgG
74,3
70,7
5x
U-transferin
79,3
45,5
35x
U-alfa-1-mikroglobulin
28,5
27,1
2x
U-alfa-2-makroglobulin
3,6
35
2x
relat..
zvýšení
poměry:
A2M/A
0,002
IgG/A
0,051
a1m/A
0,02
nově: A/TPU
0,82
závěr:
poškození charakteru primární glomerulopatie s glomerulární proteinurií mírného stupně
neselektivity, hraniční sekundární poškození
intersticia,
hematurie: glomerulární (oba typy indexů)
Následující praktické příklady ukazují základní typy nálezů:
A. renální glomerulární hematurie
Kazuistika: J. T., muž, nar. 1946, vyšetřovaný v prosinci 2006 v ambulanci
urologa pro nález mikroskopické hematurie (krev ++). Postupně byly
instrumentálními a zobrazovacími metodami vyloučeny urolitiáza, infekce
vývodných močových cest a onemocnění prostaty, proto byl nemocný
odeslán k dalšímu vyšetření do ambulance nefrologa. Z výsledků vyšetření
34
B. renální tubulointersticiální
hematurie
Kazuistika: M. Z., žena, nar. 1939. Přivezena na
ambulanci interní kliniky s anamnézou 4-denních
teplot kolem 39°C, v laboratorním nálezu S-kreatinin 367 μmol/l, S-urea 20,2 mmol/l (později
max. hodnota kreatininu 471 μmol/l, urey 31,1
mmol/l), S-Na 127 mmol/l, K 3,6 mmol/l, CRP
391,8 mg/l, výrazně snížená glomerulární filtrace
ze sbírané moči 0,15 ml/s/1,73 m2, polyurie
(diuréza 5,7 l/d). V krevním obraze leukocytóza
(11,3 109/l) bez posunu doleva, anémie. V moči
bílkovina +, krev ++++, v sedimentu leukocyty
1580/μl a erytrocyty 783/μl, kulaté epitelie 6/μl).
Vyšetřena proteinurie s typizací podle exkrece
indikátorových proteinů (viz. tab. B).
U pacientky byla diagnostikována akutní pyelonefritida, které odpovídá močový nález (proteinurie
i hematurie), postrenální podíl hematurie byl vs.
arteficiální (zavedený permanentní močový katetr),
nelze však vyloučit již preexistující poškození ledvin
(v medikaci analgetika, v anamnéze hypertenze),
bylo by vhodné kontrolní vyšetření v čase, ev. nefrologická dispenzarizace.
C. postrenální hematurie:
Kazuistika: S. H., muž, nar. 1929, odeslán nefrologem cíleně k vyšetření původu hematurie.
Z anamnézy: několik měsíců trvající hematurie
mikroskopická až makroskopická, při vyšetření
erytrocytů ve fázovém kontrastu nejednoznačný
nález smíšené hematurie. V době vyšetření nezvýšený sérový kreatinin ani urea, věku přiměřená
glomerulární filtrace.
Provedeno vyšetření proteinurie podle exkrecí
indikátorových proteinů (viz. tab. C).
Po zhodnocení všech výsledků nefrolog jako
příčinu hematurie uvádí obstrukční uropatie
s distenzí močového měchýře při hyperplazii prostaty, urolog indikoval prostatektomii. Údaj
o možné současné glomerulopatii byl pro nefrologa překvapující, i když podle jeho názoru nález
ve fázovém kontrastu by tomu mohl nasvědčovat. Anamnéza neposkytla žádné vysvětlení,
renální biopsie zatím nebyla provedena, pacient
je dále sledován v nefrologické ambulanci.
Diagnostická efektivita
vyšetření pro diferenciaci
původu hematurie
(vlastní zkušenosti)
Tab. B (renální tubulointersticiální hematurie)
mg/l
mg/g
(U-kreat.
1,3 mmol/l)
240
1 630
U-albumin
86
585,4
U-IgG
36,5
248,5
25x
U-transferin
5,6
38,4
15x
46,0
313,1
22x
2,4
16,3
29x
poměry:
A2M/A
0,028
IgG/A
0,424
a1m/A
0,535
nově: A/TPU
0,36
závěr:
Cíl:
posoudit na vlastním souboru diagnostickou
efektivitu tří používaných vyšetření (morfologie
erytrocytů ve fázovém kontrastu, poměry exkrecí
indikátorových proteinů a poměr exkrece albuminu k celkové proteinurii) pro stanovení typu
hematurie.
Soubor a metodika:
Pacienti z nefrologické ambulance vyšetřovaní
pro mikroskopickou hematurii v období června
2006 až června 2008 (n = 64, věk 21 – 82 let).
Srovnávali jsme závěr (tj. typ hematurie) stanovený podle vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu (FK) na jiném pracovišti se závěrem podle
poměrů exkrecí indikátorových proteinů (P) na
našem pracovišti v rámci typizace proteinurie;
obě vyšetření byla provedena ve srovnatelné
době. Jen část hodnocených pacientů s mikroskopickou hematurií (26/64, tj. 41 %) však měla
vyšetřené erytrocyty ve fázovém kontrastu
(u některých v průběhu sledování hematurie
vymizela, proto nebyl fázový kontrast indikován,
někteří se k vyšetření nedostavili nebo dokonce
s vyšetřením nesouhlasili), proto je soubor rozdělen na podskupinu s fázovým kontrastem a bez
fázového kontrastu. U všech hodnocených pacientů byl zpětně dopočítán poměr močového
albuminu k celkové proteinurii (A). Tři indikující
nefrologové posuzovali retrospektivně typ hematurie podle klinického pohledu (K) u všech svých
pacientů na podkladě znalosti jejich osobní anamnézy, přidružených chorob, medikace a všech
dostupných výsledků vyšetření (laboratorních
i zobrazovacích), hodnocena byla klinická shoda
se závěrem jednotlivých laboratorních vyšetření.
Výsledky jsou shrnuty v tab. 3.
Albumin v moči byl stanoven imunoturbidimetricky, kreatinin v moči Jaffé kineticky, celková
bílkovina v moči turbidimetricky s benzethoni-
relat..
zvýšení
malá proteinurie charakteru primární tubulointersticiální nefropatie (TIN) s výraznou
zánětlivou syntézou IgG v intersticiu, mírné
glomerulární poškození, které může být
sekundární při TIN nebo jako projev vaskulární
nefropatie při hypertenzi
hematurie: neglomerulární (oba typy indexů) podle indikátorových proteinů: tubulointersticiální a postrenální s převahou tubulointersticiálního podílu
Tab. C (postrenální hematurie)
mg/l
mg/g
(U-kreat. 7,6
mmol/l)
1 360
1 580
U-albumin
663,0
772,2
U-IgG
162,0
188,6
19x
U-transferin
44,2
51,5
20x
8,1
9,4
nezvýš.
39,2
45,6
relat..
zvýšení
39x
poměry:
A2M/A
0,059
IgG/A
0,244
a1m/A
0,012
nově: A/TPU
0,49
závěr:
střední proteinurie charakteru spíše primární
glomerulopatie s neselektivní glomerulární
proteinurií bez sekundárního poškození intersticia. vysoká exkrece IgG je pravděpodobně
částečně postrenálního původu při susp. infekci
močových cest
hematurie: neglomerulární (oba typy indexů)
podle indikátorových proteinů: postrenální,
nevylučuje renální podíl, vhodná kontrola
s odstupem
umchloridem (biochemický analyzátor pro rutinní vyšetření), IgG, alfa-1mikroglobulin a transferin v moči nefelometricky, alfa-2-makroglobulin
nefelometricky (Beckman Coulter, Immage).
35
Tab. 3: Hodnocení původu hematurie na podkladě jednotlivých
vyšetření (použité zkratky: FK – fázový kontrast, P – indikátorové
proteiny, A – poměr U-Alb/TPU, K – klinik; závěr: G – glomerulární,
NG – neglomerulární, RB – renální biopsie; jako „+“ hodnocen závěr
„přítomna glomerulární hematurie“, jako „-„ hodnocen závěr
„nepřítomna glomerulární hematurie“)
3a: Exkrece albuminu nad 100 mg/l
(lze hodnotit dle exkrece indikátorových proteinů)
vyšetřené
erytrocyty
ve fázovém
kontrastu
(n = 18)
shoda
neshoda
8/18 P+ FK+ (44,4%)
10/18 (55,6%)
(závěr: 7/8 jako G, 1/8 jako NG)
9/10 P+FK- (90%)
z toho: 8/8 K+
z toho: 9/9 K+
5/8 A+
8/9 A+,
1/9 hraničně +/1/9 P-FK+, ale současně K-Anevyšetřené
erytrocyty
ve fázovém
kontrastu
(n = 33)
(závěr: 28/33 jako G, 5/33 jako
NG)
31/33 P+K+ (93,9%)
1/33 P+K- (3,0%)
1/33 nejednoznačný dle P i K
NG: 5/5 shoda P-K-A- (100%)
G: 26/26 P+K+ (100%)
z toho: 17/26 A+ (65,3%)
9/26 A- (34,6%)
(3 hraničně +/-,
6 jako NG dle A,
z nich 1 jako NG, dle RB+ )
3b: Exkrece albuminu pod 100 mg/l
(nelze hodnotit dle exkrece indikátorových proteinů)
shoda
vyšetřené
erytrocyty ve
fázovém kontrastu
(n = 7)
neshoda
dle FK: 3 jako G, 4 jako NG
G: 3/3 FK+K+, nelze dle
A (100%)
0/3
(TPU < 0,04 g/l)
NG: 1/4 FK-K-A- (25%)
3/4 NG: 1 FK-K+A- (75%)
1 FK-K-A+
1 FK-K-A nelze
(TPU < 0,04 g/l)
nevyšetřené
erytrocyty ve
fázovém kontrastu
(n = 6)
dle A všichni NG:
2/6 A-K- (33,3%)
2/6 A-K+
2/6 A-K nejednoznačný
Výsledky a diskuse:
Ve skupině nemocných (n = 18), kteří měli provedena všechna tři laboratorní vyšetření (viz. tab. 4a) měla nejvyšší diagnostickou efektivitu pro stanovení glomerulární hematurie diferenciace podle poměrů exkrecí indikátorových proteinů - klinická shoda v 94,4 % (17/18), pro stanovení podle
poměru močového albuminu k celkové proteinurii klinická shoda v 72,4 %
(13/18), pro fázový kontrast pouze 44,4 % (8/18). Při hodnocení poměru
močového albuminu k celkové proteinurii se všechny výsledky hodnocené
jako glomerulární shodovaly s hodnocením podle exkrece indikátorových
proteinů a závěrem klinika, stejně tak jako jediný výsledek neglomerulární
hematurie (1/1). U hematurií hodnocených ve fázovém kontrastu jako glo-
36
merulární bylo jen 50 % nálezů shodných alespoň s jedním z dalších vyšetření; u hematurií
určených ve fázovém kontrastu jako neglomerulární (viz. tab. 4b) však bylo 8 z 9 hematurií hodnoceno jako glomerulární podle indikátorových
proteinů i klinika, v 7 z 8 těchto neshodných
výsledků byla diagnóza glomerulární hematurie
podpořena i poměrem močového albuminu k celkové proteinurii, v 1 případě navíc i pozitivním
histologickým nálezem imunokomplexové glomerulonefritidy v renální biopsii. Je vidět, že
minimálně 7 z 9 (77,8 %) možných glomerulárních hematurií tak mohlo být při hodnocení podle erytrocytů ve fázovém kontrastu chybně
posouzeno, resp. nediagnostikováno; navíc u dalších 5/23 celkem vyšetřených pacientů nebylo
možné erytrocyty ve fázovém kontrastu hodnotit
vůbec pro tzv. „chudý močový sediment“ s nedostatečným počtem buněk – přestože u 4 z 5 pacientů jejich celková proteinurie byla vyšší než
0,3 g/l (0,32 – 3,15 g/l, resp. 0,84 – 6,19 g/g kreat.,
u 1 z 5 pacientů se jednalo o proteinurii hraniční
v přepočtu na močový kreatinin (tj. 0,08 g/g).
U podskupiny nemocných (n = 33), kteří neměli vyšetřeny erytrocyty ve fázovém kontrastu,
byla klinická shoda s hematurií určenou oběma
typy indexů (indikátorové proteiny i poměr
močového albuminu k celkové proteinurii) jako
neglomerulární 100 % (viz. tab. 4b), tedy u všech
5 neglomerulárních hematurií v obou vyšetřeních. U hematurií určených jako glomerulární
byla klinická shoda 100 % (26/26) pro hodnocení
podle poměrů exkrecí indikátorových proteinů,
65,3 % (17/26) pro hodnocení podle poměru
močového albuminu k celkové proteinurii (viz.
tab. 4a). Ze zbývajících 9 nálezů hodnocených
jako neglomerulární podle poměru močového
albuminu k celkové proteinurii byla 1/3 hraničních, tj. těsně kolem cut-off hodnoty, další vyšetření by mohlo pomoci v hodnocení. Podle poměru
exkrece indikátorových proteinů se jednalo
o smíšené hematurie s glomerulární složkou,
i v těchto případech by opakované vyšetření
v čase mohlo být diagnosticky přínosné. Dalších 6
z 9 hematurií bylo podle klinika spíše glomerulárních, v jednom z těchto případů byl nález imunokomplexové glomerulonefritidy verifikovaný histologickým nálezem v renální biopsii.
Ve skupině nemocných (n = 13), kde vzhledem
k nízké exkreci albuminu nebylo možné posuzovat původ hematurie podle poměru exkrece indikátorových proteinů, ale byly vyšetřeny erytrocyty ve fázovém kontrastu, jsme zaznamenali tyto
výsledky: u glomerulárních hematurií (viz. tab.
4a), byla klinická shoda s fázovým kontrastem ve
100 % (3/3), u všech těchto pacientů nemohl být
vzhledem ke stopové celkové proteinurii hodnocen ani poměr močového albuminu k celkové
proteinurii. Hodnocení neglomerulárních hema-
turií (viz. tab. 4b) podle erytrocytů ve fázovém
kontrastu však bylo zcela rozdílné – s klinickým
závěrem shodovalo jen v 50 % (2/4).
V podskupině, která neměla vyšetřené erytrocyty ve fázovém kontrastu, byly všechny hematurie (6/6) určené podle poměru močového albuminu k celkové proteinurii jako neglomerulární
(viz. tab. 4b); klinická shoda však byla jen u 1/3
pacientů (2/6), další 1/3 pacientů měla klinicky
nejednoznačný nález (nebylo možné rozhodnout,
zda je pravděpodobnější glomerulární nebo neglomerulární onemocnění).
Na rozdíl od japonských autorů (3,4) jsme při
hodnocení na podkladě poměru albuminu k celkové proteinurii pozorovali nižší diagnostickou
senzitivitu pro glomerulární hematurii (72,4 % ve
skupině s fázovým kontrastem a 65,3 % bez fázového kontrastu v porovnání s autory uváděnou
hodnota 97,3 %). Rozdílné výsledky však mohly
být ovlivněny velikostí souboru a jeho skladbou.
Závěr:
Stanovení vzájemných poměrů exkrecí močových
indikátorových proteinů vykazovalo v našem souboru nejvyšší klinickou shodu pro průkaz glomerulární hematurie (94,4 % ve skupině s fázovým kontrastem ve srovnání s 72,4 % při
hodnocení podle poměru močového albuminu
k celkové proteinurii a 44,4 % pro hodnocení
podle erytrocytů ve fázovém kontrastu). U hodnocení neglomerulární hematurie byla klinická
shoda stejná pro hodnocení podle poměrů exkrecí močových indikátorových proteinů i podle
poměru močového albuminu k celkové proteinurii (100 %). U vyšetření erytrocytů ve fázovém
kontrastu byla klinická shoda pro glomerulární
hematurii jen ve 44 % ve srovnání s hodnocením
podle poměrů exkrece močových indikátorových
proteinů a poměrem močového albuminu k celkové proteinurii. U nálezů hodnocených jako
neglomerulární hematurie ve fázovém kontrastu
se téměř v 80 % mohlo jednat o nepoznanou glomerulární hematurii.
Doporučení pro praxi:
Vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu
zůstává metodou volby u izolovaných erytrocyturií, kdy nelze využít porovnání exkrecí
jednotlivých proteinů. Pro validitu hodnocení je však nezbytné zajistit preanalytické
podmínky, mít určitou zkušenost s hodnocením (nejlépe jedním pracovníkem) a při sledování nemocných v čase využívat služeb
jedné laboratoře. Pro hematurie spojené
s proteinurií (a albuminurií vyšší než 100
mg/l) se zdá nejvhodnější hodnocení pomocí
exkrecí indikátorových proteinů. Poskytuje
indikujícímu lékaři nejvyšší míru informace
U hematurií určených jako
glomerulární byla klinická shoda
100 % (26/26) pro hodnocení podle
poměrů exkrecí indikátorových
proteinů, 65,3 % (17/26) pro
hodnocení podle poměru močového
albuminu k celkové proteinurii.
a umožňuje hodnotit i smíšené hematurie; je však dražší a vyžaduje
nefelometrický analyzátor. U proteinurií s exkrecí albuminu nižší než
100 mg/l nebo nelze-li indikátorové proteiny v laboratoři stanovovat, je
metodou volby hodnocení podle poměru močového albuminu k celkové
proteinurii; je levnější, snadno dostupné, avšak s nižší diagnostickou
senzitivitou pro glomerulární hematurii a interpretace může být obtížná u smíšených hematurií. Kombinace obou způsobů hodnocení zvyšuje informační hodnotu nálezu, může pomoci v diagnosticky nejednoznačných případech. Vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu se zdá
být u proteinurií vyšších než 40 mg/l pouze doplňkovou metodou.
Při interpretaci nálezů je třeba pečlivě posuzovat anamnestická data
pacienta, znát výsledky dalších jeho vyšetření. Pro cílený pacientsky
orientovaný interpretační komentář je nezbytná vzájemná spolupráce
mezi lékařem v laboratoři a indikujícím lékařem.
Literatura:
1. Teplan V. a kol.: Praktická nefrologie, Grada, Praha 2006, P. 27-28.
2. Zahur Z., Proesmans W: Dysmorphic erythrocytes and G1 cells as markers
of glomerular hematuria, Pediatr Nephrol (2000) 14: 980-984.
3. Ohisa N, Kanemitsu K, Matsuki R et al: Evaluation of hematuria using the
urinary albumin-to-total-protein ratio to differentiate glomerular and nonglomerular bleeding. Clin Exp Nephrol (2007) 11:61-65.
4. Ohisa N, Katsumi Y, Matsuki R et al: A Comparisson of Urinary AlbuminTotal Protein Ratio to Phase-Contrast Microscopic Examination of Urine
Sediment for Differentiating Glomerular and Nonglomerular Bleeding. Am J
of Kidney Disseases, 2008 (in press).
5. Hyodo T, Kumano K, sakai T: Differential Diagnosis between Glomerular
and Nonglomerular Hematuria by Automated Urinary Flow Cytometer.
Nephron 1999; 82:312-323.
6. Verwiebe R, Weber MH, Kallerhoff M et al: Differentiation between Renal
and Postrenal Type of Hematuria and Proteinuria measuring Urinary Apolipoprotein A1 Excretion. Kidney, protein and Drugs: An Update. Contib
Nephrol. Basel, Karger, 1993 Vol 101: 151-157.
7. Ivandic M, Hofmann W, Guder WG: Development and evaluation of a urine protein expert system. Clin Chem (1996) 42:8, 1214-1222.
8. Hofmann W, Rossmüller B, Guder WG, Edel HH: A New Strategy for
Characterizing Proteinuria and Hematuria from a Single Pattern of Defined
Proteins in Urine. Eur J Clin Chem Clin Biochem, Vol. 30, 1992: 707-712.
9. Guder WG, Hofmann W: Differentiation of proteinuria anad hematuria by
single protein analysis in urine, Clin Biochem, 1993 26 (4), 277-282.
MUDR. JANA GRANÁTOVÁ
ODDĚLENÍ KLINICKÉ BIOCHEMIE,
FAKUTLNÍ THOMAYEROVA NEMOCNICE,
VÍDEŇSKÁ 800, 140 59 PRAHA 4
37
Obchodní útvar
ejprve dovolte malé ohlédnutí do historie společnosti Immunotech a.s.
Naše kořeny sahají až do roku 1993, kdy z původního oddělení analytických metod Ústavu pro výzkum, výrobu a využití radioizotopů vznikla na základě privatizačního projektu společnost Adico s.r.o. Ta se stala
zárodkem společnosti Immunotech a.s., která je dnes součástí koncernu
Beckman Coulter. Již od samého počátku stála naše společnost před úkolem vybudovat obchodní oddělení pro zajištění prodejů a logistiky vyvíjených
a vyráběných diagnostických souprav. To vše se odehrávalo v době, kdy na trh
s IVD v České republice pronikaly silné západní společnosti. V té době vznikly
základy jednotlivých útvarů dnešní společnosti Immunotech a.s., a Beckman
Coulter company, jako jsou útvar administrativní podpory zákazníka (CAS, tj.
Customer administrative support), útvar logistiky, útvar exportu a útvar prodeje a marketingu (Sales and Marketing).
Útvar prodeje a marketingu je odpovědný za obchodní a marketingové aktivity koncernu Beckman Coulter v České a Slovenské republice. Tento útvar
zároveň podporuje obchodní aktivity dceřiné společnosti Immunotech s.r.o.
Bratislava na Slovensku.
Co vše si lze představit pod názvem útvar prodeje a marketingu? Vyřizování
objednávek, dodávky a fakturace jsou předmětem činnosti útvaru CAS a útvaru
logistiky. Útvar prodeje a marketingu přímo prodává, nabízí produkt a zabezpečuje podporu zákazníka a nabízených produktů.
Jakou konkrétní činnosti si pod tím máme vlastně představit? Obchodní
zástupci společnosti navštěvují zákazníky – pracovníky zdravotnických organizací, nemocnic, klinických laboratoří, výzkumných ústavů a laboratoří průmyslových podniků. Při svých návštěvách obchodní zástupci spolu s dalšími členy
obchodního týmu společnosti zjišťují potřeby zákazníka, získávají informace
o obchodních příležitostech a ty se pak snaží realizovat. Obchodní zástupce
zajišťuje podporu zákazníka na základě jeho potřeb, připomínek a doporučení.
Dále zjišťuje a shromažďuje informace o trhu a v rámci celého obchodního
týmu se podílí na jejich analýze, vyhodnocení, spoluvytváří obchodní strategii
společnosti na trhu, vede obchodní jednání a je odpovědný za vývoj v jednotlivých obchodních případech.
Dále se obchodní tým skládá z produktových specialistů. Produktový specialista podporuje produkty na trhu a u zákazníka, připravuje uvedení nového
produktu na trh, provádí průzkum trhu, analyzuje a vyhodnocuje informace
38
z trhu, školí zákazníka o produktech, školí obsluhu
analytických systémů v jejich používání a uživatelské údržbě. V neposlední řadě se také podílí na
tvorbě obchodní strategie společnosti na trhu s IVD
v České republice a na Slovensku.
Veškeré své aktivity obchodní tým koordinuje
s dalšími útvary společnosti Immunotech a.s., především však se servisním útvarem, útvarem administrativní podpory zákazníka a útvarem logistiky.
Český obchodní tým se ve spolupráci s evropským marketingovým centrem koncernu Beckman
Coulter podílí na tvorbě a realizaci marketingového
mixu, pořádá uživatelská setkání, odborné semináře, workshopy na odborných kongresech a sjezdech
odborných společností, navrhuje propagační materiály, připravuje a realizuje reklamní kampaně,
navrhuje a realizuje odborné studie, navrhuje způsoby komunikace se zákazníkem, s odbornou a širokou veřejností.
Obchodní tým a jeho jednotliví členové absolvují
řadu odborných školení o produktech, obchodních
dovednostech, týmové spolupráci a komunikaci.
Tým obchodního útvaru společnosti Immunotech
a.s. dosáhl v jeho novodobé historii (v letech 2000
– 2008) významných úspěchů na trhu v České
a Slovenské republice. Naším cílem je ještě více
posílit postavení koncernu Beckman Coulter
a dlouhodobě dosahovat vysoké spokojenosti
zákazníka. Naší vizí je vybudovat větší povědomost
o koncernu Beckman Coulter jako o společnosti
s vysokým morálním a společenským kreditem
a vybudovat partnerské vztahy se zákazníkem na
principu vzájemné důvěry a oboustranné výhodnosti. Naším posláním je přispět k vysoké úrovni
zdravotnictví v Čechách i na Slovensku.
ŠTĚPÁN TINTĚRA
ada čtenářů se již určitě setkala buď
přímo, nebo prostřednictvím svých
kolegů s útvarem CAS společnosti Immunotech a.s. Tento název ve volném překladu znamená oddělení zákaznické
podpory (v minulosti známé jako
„obchodní nebo prodejní“ oddělení).
Činnost tohoto oddělení přímo navazuje a je
konečným výsledkem aktivit obchodního útvaru naší
společnosti. Jedním z hlavních úkolů útvaru CAS
(z pohledu vás – čtenářů a zákazníků) je komplexní
zákaznický servis, tj. příjem a zpracování zákaznických objednávek, dodávky zákazníkům, fakturace
a vyřizování reklamací. To je však až finální akce, které předchází řada aktivit – činností obchodního
útvaru počínaje a „logistickými akcemi“ konče. Sem
patří zejména objednání zboží u dodavatelů na
základě zákaznických objednávek, zajištění procesu
dodání a naskladnění, vyskladnění, zabalení a konečně odeslání zásilky na pracoviště zákazníka. K tomuto účelu používáme jak smluvní firemní přepravu
(s jejímiž řidiči se určitě řada z vás již setkala), tak
i tuzemské kurýrní společnosti (PPL, TopTrans). Naší
snahou je v této oblasti dosáhnout vaší maximální
spokojenosti, proto každou vaši případnou reklamaci
týkající se úrovně dopravních služeb okamžitě individuálně projednáváme s příslušným dopravcem.
Útvar CAS/
LOGISTIKA
Vzhledem k tomu, že naše společnost neobchoduje pouze na tuzemském
trhu, ale dodává také do řady zemí celého světa, je nedílnou součástí útvaru
CAS rovněž vyřizování objednávek zahraničních distributorů, zajišťování mezinárodní přepravy a vyřizování celních formalit .
Útvar CAS/Logistika není však jen zákaznická podpora, ale je to také činnost
logistická – činnost oddělení expedice a příjmu, zahrnující správu a řízení skladů a optimalizaci skladových zásob v duchu dodržování zásad správné distribuční praxe. Protože většina produktů vyžaduje skladování a zacházení za stanovených teplotních podmínek, je kromě jiných činností úkolem oddělení
expedice a příjmu kontrola skladovacích teplot, kontrola teplot dosažených
během přepravy zásilek a následně jejich vyhodnocení. Jednou ze základních
činností tohoto oddělení je příjem a skladování veškerého materiálu a zboží
vstupujícího do naší společnosti. Nejedná se pouze o hotové produkty, se kterými se setkáváte na vašich pracovištích, ale také o suroviny, protilátky a další
výrobní a výzkumný materiál včetně obalového materiálu určený pro ostatní
útvary společnosti Immunotech a.s.
Cílem útvaru CAS/Logistika je neustálé zlepšování poskytovaných služeb,
zkvalitnění komunikace se zákazníkem, snaha o maximální zkrácení dodací
lhůty pro 100 % vyřízení objednávky. K těmto cílům směřuje každodenní činnost všech pracovníků útvaru CAS/Logistika.
PETR JABŮREK
39
Setkání uživatelů RIA
a imunochemických systémů
Beckman Coulter
radiční setkání uživatelů RIA a imunochemických systémů Beckman Coulter se uskutečnilo již začátkem letošního roku, 25.-27. ledna 2009. Tentokrát jsme se setkali v Čeladné na úpatí Beskyd. Na zdárný průběh akce
dohlížel přísným okem zbojník Ondráš, který bral na přelomu 17. a 18. století spravedlnost do svých rukou a, podobně jako jeho slavný kolega ze Slovenska – Juraj Jánošík, bohatým bral a chudým dával.
I přes šířící se chřipkovou epidemii jsme se sešli v hojném počtu, abychom se společně věnovali tématům z oblasti fertility, se zaměřením na
in vitro fertilizaci a prenatální screening vrozených vývojových vad. Na
tato témata jsme slyšeli mnoho zajímavých přednášek, nejen v podání
zástupců naší společnosti, ale zejména odborníků z laboratoří i přímo
z klinické praxe. RNDr. Knapková nás seznámila se situací novorozeneckého screeningu na Slovensku, MUDr. Petrová zase s problematikou a významem stanovení prolaktinu a Doc. MUDr. Oborná zaujala přednáškou
o vyšetřování pohlavních hormonů a optimalizaci stimulace v programu
IVF a ET. Možnosti screeningu vrozených vývojových vad detailně rozebrali ve své společné interaktivní přednášce Ing. Matějka a RNDr. Loucký
a podrobný přehled o vyšetřování hormonů v gynekologii a porodnictví
nám podala MUDr. Pražáková.
40
Přednáška MUDr. Šimánkové nám umožnila cenný pohled na problematiku z jiného úhlu, než je
většina z nás zvyklá, a sice z pohledu praktického
gynekologa.
Během setkání jsme také zhodnotili, co nám přinesl rok 2008 a nakoukli pod pokličku začínajícího
roku 2009.
A co jsme dělali ve volném čase? Vypravili jsme se
na exkurzi do pivovaru v Nošovicích, relaxovali při
masážích, v sauně a hotelovém bazénu. Bohužel,
regenerační účinky „teploty“ -120 °C v poláriu nám
zůstaly z důvodu poruchy zařízení utajeny. Tentokrát
vše úplně nevyšlo, tak věřme, že příště se to povede.
Příjemný pobyt jsme zakončili ochutnávkou
výborných vín z Bordeaux.
Těšíme se na další setkání s vámi!
HANA KRÁTKÁ
Pražská
padesátka
ovolte, abychom se s vámi podělili
i o naše mimopracovní zážitky. Protože
nejen prací je člověk živ a čas od času
je nutné protáhnout tělo a provětrat
mozkové závity, podnikáme různé sportovní akce. Hrajeme tenis, squash nebo
fotbálek a hlavně rádi jezdíme na kolech.
V záři 2008 jsme dokonce povýšili naše sportovní
úsilí účastí v cyklistickém závodu na horských kolech
Pražská padesátka na „závodní“ úroveň. Na trať vyrazili dva firemní týmy: muži Immunotech a ženy
Immnunotech. Fotodokumentace byla zajištěna jak
na startu a cíli, tak i během závodu na trati, která
vedla náročným terénem Divoké Šárky a dále na
severozápad od Prahy a zpět.
Zvolili jsme taktiku klidného startu ze zadních pozic
celého pelotonu, takže celých 50 km jsme měli možnost předjíždět naše soupeře. Jak už to u cyklistiky
bývá, ani my jsme nebyli ušetřeni technických defektů v podobě píchlé duše a zadřených brzd. Některým
jedincům nestačilo vytyčených 50 km a dobrovolně si
trasu prodloužili o další kilometry. Navzdory všem
nástrahám a překážkám jsem všichni dojeli ve zdraví
a dobré náladě. Protože po výkonu je nutné doplnit
energii a podělit se o zážitky, společně jsme se odměnili dobrým jídlem a mokem.
Co dodat na závěr? Celá akce se nám velmi líbila,
a proto plánujeme účast v dalších ročnících. Pokud
jsme vás tímto inspirovali, rádi se vámi v záři 2009 na
trati Praha-Okoř-Praha potkáme a možná i utkáme.
Týmy:
Tým Immunotech-ženy
Hana Krátká (divize MIB)
Eva Králová (obchodní divize)
Kateřina Kožaná (obchodní divize)
Helena Kurzweilová (divize MIB)
Hana Nováková (divize MIB)
Tým Immunotech-muži
Miroslav Kušiak (výrobní divize)
Vojtěch Drbohlav (výrobní divize)
Roman Vlček (obchodní divize)
Stanislav Blažek (externista)
Martin Kožaný (externista)
Za jednotlivce startovala
Lenka Chocenská (výrobní divize)
HANA KRÁTKÁ
Výsledky:
Název týmu: Immunotech-ženy
Čas týmu:
08:38:48
Poř. v týmu Abs. Poř St. č.
1
400
458
2
449
456
3
514
460
Pořadí týmu: 23
Závodník
Hanka Krátká
Helena Kurzweilová
Hana Nováková
čas závodníka
02:41:32
02:52:13
03:05:02
Název týmu: Immunotech-muži
Čas týmu:
08:43:09
Poř. v týmu Abs. Poř St. č.
1
371
452
2
447
454
3
537
466
Pořadí týmu: 24
Závodník
Vojtěch Drbohlav
Martin Kožaný
Miroslav Kušiak
čas závodníka
02:37:03
02:51:24
03:14:42
Nejlepší umístění
Kategorie: Ženy ZC roč. 1967-58
Poř.
St. č. Jméno
5
458 Hanka Krátká
7
456 Helena Kurzweilová
Cilový čas
02:41:32.7
02:52:13.5
41
50km
Ztráta
00:47:03.6
00:57:44.4
Česká křížovka
Po vyhodnocení krevní zkoušky na přítomnost alkoholu sděluje policista řidiči: „Alkohol jsme ve vaší krvi nenašli, ale test pomocí
nejnovější diagnostické metody ukázal,… (Tajenka.)
Slovenská křížovka
Křížovka o ceny
Po vyhodnotení krvnej skúšky na prítomnosť alkoholu vraví policajt vodičovi: „Alkohol sme vo vašej krvi nenašli, ale test
pomocou najnovšej diagnostickej metody ukázal,… (Tajnička.)
Pro 3 vylosované úspěšné luštitele jsou připraveny zajímavé ceny! Tajenky zasílejte e-mailem na adresu: [email protected] do
31. 5. 2009. Do předmětu uveďte „TAJENKA“. Nezapomeňte také, prosím, uvést své kontaktní údaje a název pracoviště.
TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: LÉK PROTI PTAČÍ CHŘIPCE. Výherci: Mária Hrdá, Eugen Liška, Lenka Stolinová
42
Více flexibility,
více bezpecˇnosti,
více produktivity - UniCel DxC 880i
PRO VÍCE INFORMACÍ KONTAKTUJTE
PRODUKTOVÉ SPECIALISTY:
Ing. Miroslav Bischof
tel.: 605 200 149
Ing. Lukáš Palivec
tel.: 603 538 361
Vaše laboratoř může již dnes splňovat náročné požadavky na výkon, kvalitu
a bezpečnost biochemických a imunochemických analýz díky analyzátorům
UniCel DxC 800 a DxI 800. Záleží jen na Vašem rozhodnutí, zda ještě zvýšíte
produktivitu a zjednodušíte průchod vzorku laboratoří prostřednictvím integrace obou analyzátorů v kombinovaný systém UniCel DxC 880i. Jak na to?
Naším řešením je modul CTA (Closed Tube Aliquotting).
Prostřednictvím CTA modulu získáte propojení mezi oběma analyzátory,
které Vám přinese:
jednoduché vkládání vzorků jak pro biochemické, tak imunochemické
analýzy,
maximální bezpečnost provozu díky odběru alikvotů a vzorků
z uzavřených zkumavek,
zkrácení doby analýzy díky paralelnímu průběhu biochemických
a imunochemických vyšetření,
široké spektrum parametrů,
schopnost nezávislé funkce biochemického a imunochemického modulu.
INTEGROVANÝ SYSTÉM UNICEL DXC 880i PŘEDSTAVUJE DALŠÍ
ZEFEKTIVNĚNÍ A ZVÝŠENÍ BEZPEČNOSTI PRÁCE VE VAŠÍ LABORATOŘI!
www.beckman.cz
Kde se můžeme setkat
(LEDEN – ČERVEN 2009)
Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku
22. – 24. 1. 2009
2. – 3. 4. 2009
20. – 22. 5. 2009
2. Středomoravské dny laboratorní
medicíny (Chrastice)
6. seminář „Pivovarnictví a kvasné
technologie 2009“ (Praha)
XXVII. Mezikrajské dny klinické
biochemie Jihočeského
a Východočeského kraje (Litomyšl)
28. – 29. 1. 2009
3. – 4. 4. 2009
RANK 2009 – Rutinní analýza
nukleových kyselin molekulárně
biologickými technikami (Pardubice)
Jarní hematologické sympozium Jižní
Morava a Vysočina (Havlíčkův Brod)
5. – 7. 4. 2009
21. – 23. 5. 2009
XVI. Česko-slovenská konference
o hemostáze a trombóze
(Hradec Králové)
11. 2. 2009
30. Imunoanalytické dny (Jihlava)
Pracovný deň prenatálnej diagnostiky
(Žilina)
14. – 15. 4. 2009
Mezikrajské dny (Žermanice)
18. 3. 2009
XIII. setkání biochemiků a molekulárních
biologů (Brno)
18. – 20. 6. 2009
Krajský laboratorní seminář
Karlovarského a Plzeňského kraje
(Karlovy Vary)
22. – 24. 4. 2009
International Symposium on Anaerobic
Mikrobiology (Liblice)
25. – 27. 3. 2009
26. – 28. 4. 2009
Martinské imunologické dni (Martin)
Špindlhorky 2009 (Špindlerův Mlýn)
Olomoucké hematologické dny
(Olomouc)
1. – 3. 4. 2009
11. – 12. 5. 2009
25. – 27. 6. 2009
LABMED (Bratislava)
Konference Evropské společnosti pro
imunodeficience (ESID) (Praha)
Laboratórna diagnostika v medicíne
2009 (Spišská Nová Ves)
15. – 16. 6. 2009
XVII. Cytoskeletální klub (Vranovská Ves)
24. – 27. 6. 2009

Časopis - Beckman Coulter

Transkript

Podobné dokumenty

Doporuceni_nefrologie 2014_final verze

114. bialelická igh rearanžmá u pacientů s indolentními

Výroční zpráva ÚDMP za rok 2015 - Ústav dědičných metabolických

4. Neformální proteomické setkání PRAHA

âESKÁ SPOLEâNOST PRO BIOCHEMII A MOLEKULÁRNÍ

X. české a slovenské sympózium o arytmiích a kardiostimulaci s

Nově indikovaná vyšetření pro onkologické nemocné

AVCR 2007.cdr - Akademie věd České republiky

„PROČ TO VYŠETŘOVAT KDYŽ TO NIKDY NA NIČEM NESVÍTÍ?!“

Svět RNA a bílkovin Transport a stabilita RNA Transport a stabilita

Biologické aplikace AFM - Laboratoř mikroskopie atomárních sil

Radovan Bílek, Ing

Program 2016 - Olomoucké Hematologické dny