zde - Bestservis.eu

Transkript

zde - Bestservis.eu

BEST Servis, Ústí nad Labem
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie,
UNESCO Laboratoř elektrochemie životního prostředí
Sborník přednášek
Květen 2010
1
ISBN 978-80-254-6710-7
2
BEST Servis, Ústí nad Labem
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie,
UNESCO Laboratoř elektrochemie životního prostředí
Sborník přednášek
mezinárodní odborné konference
XXX. Moderní Elektrochemické Metody
Jetřichovice 24. – 28. května 2010
Uspořádali:
Navrátil Tomáš, Barek Jiří
ISBN 978-80-254-6710-7
1
Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.
Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani
jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za předpokladu úplného
citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv
tištěné či elektronické formy a její prodej je možný pouze na základě písemného souhlasu
vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní
potřebu).
2
Electroanalysis with Bismuth-Based Electrodes and their Selected Applications
Lucie Baldrianová, Ivan Švancara, and Karel Vytřas
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical
Chemistry, Studentská 573 (HB/C), 532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
It is already ten years when bismuth-film electrodes have been introduced in voltammetry as a
suitable and nearly non-toxic alternative to mercury-film electrodes. Since then, many
electroanalysts have continued in the studies with these electrodes, when focusing their
attention on possible applicability in electrochemical stripping analysis. The number of papers
concerning bismuth-based electrodes has proven their suitability and electrochemical
properties similar to those of mercury-based electrodes with regard to the trace analysis of
inorganic compounds. As discussed below, our electroanalytical group has contributed to the
field with respect to advantageous combination of the bismuth concept with carbon paste
electrode material.
Key Words: Bismuth film, Bismuth-powder dispersion, Carbon paste electrode and microelectrode, Anodic stripping voltammetry.
Introduction
Electrochemical stripping analysis belongs to one of the key disciplines of scientific interest
of the electroanalytical group at the University of Pardubice, Department of Analytical
Chemistry. It is now more than two decades, when the electrochemistry and electroanalysis
with carbon paste electrodes, and related carbonaceous sensors had gained the main attention
of Pardubice's electroanalysts 1. Such a research orientation was found to be principal and, in
fact, it lasts up until now, when gathering also development and testing of new detection
systems; in particular, alternative to mercury electrodes whose popularity has declined rapidly
in the recent years. One of the alternate materials which could supply the role of controversial
mercury with respect to present day’s demands for “more environmentally friendly”
procedures and instrumentation has been shown to be bismuth. Today, bismuth-based
electrodes are classified as a specific group of sensors having achieved the successful
comeback from the beginning of the last century 2 into the contemporaneous electroanalysis.
And bismuth is now generally adopted as a metal offering electrochemical characteristics
nearly comparable to those of mercury. Up to now bismuth films have been electrolytically
deposited mainly onto the various carbonaceous substrates – glassy carbon (GCE), carbon
paste (CPE), screen printed carbon ink electrode (SPE), carbon fibres and boron-doped
diamond substrates (BDDE), but also onto non-carbonaceous, metal compact substrates such
as gold or platinum.
This contribution summarizes a part of Pardubice's group investigation which was focused on
testing of bismuth films and bismuth powder dispersions in combination with carbonaceous
electrode substrates 3, in particular carbon paste electrode (CPE), and comparison to some
metallic electrodes by means of square-wave anodic stripping voltammetry (SWASV) of
chosen inorganic compounds.
Survey of bismuth-based electrodes
Bismuth films plated in situ, BiFs, which can be formed onto the several electrode substrates,
are the most widely used bismuth-based configurations 3-5. Originally, this type of electrodes
has been extensively studied in combination with pyrolytic graphite or glassy carbon
electrode substrates 6. It was initially thought that bismuth film plated carbon paste electrodes
3
(BiF-CPEs) could not compete with other BiFEs when taking into account some analytical
criteria or their applicability to real samples. However, the detection capabilities of first
configurations of BiF-CPEs were typically worse and their practical application quite limited.
The reason for such unsatisfactory results should apparently be attributed to the specific
character of CPE surface that is highly hydrophobic and has a considerably irregular
morphology. Thus one should expect that, if CPEs were to be employed electrode substrates
for metallic films, they would require a very accurate optimization of the entire plating
process. Regarding configurations prepared and operated in situ, one of the most crucial
factors was attributed to the concentration of metal ions (Bi) to be plated and its ratio to the
concentration of the target analyte(s). This rule, originally postulated for MF-CPEs 7, we
wanted to confirm also for BiF-CPEs by systematic study monitoring the influence of the
bismuth concentration-to-metal ion concentration ratio on the sensitivity of heavy metal
determination employing CPE. In this extensive work the effect of Bi(III) concentration (over
the wide concentration range of 10-7 – 10-4 M) on the determination of the typical heavy metal
couple of Cd(II) and Pb(II) ions, in the 10-8 – 10-5 M range was investigated by means of
square wave anodic stripping voltammetry at in situ prepared BiF-CPEs 8. It was found out
that the sensitivity of square-wave anodic stripping voltammetry generally depends on the
Bi(III)-to-metal ion concentration ratio and that, unlike the usually recommended at least 10fold Hg(II) excess for in situ prepared mercury film electrodes (MFEs), Bi(III)-to-metal ion
ratios less than 10 are either optimal or equally effective at CPEs. Surprisingly, even a Bi(III)to-metal ion ratio 1:1 is enough to produce the highest Pb and Cd stripping peaks in all cases,
whereas when this ratio exceeded 40:1 value, a signal deterioration was obtained in most
cases at the BiF-CPE electrodes.
Similar study investigating the effect of bismuth-to-metal ion concentration ratio was
accomplished by employing the carbon microdisc electrode (CµE) 9 as well as the new type of
disposable electrode substrate based on carbon paste – carbon paste mini-electrodes
(CPmE) 10. Such electrodes combine the advantages of carbon paste (its outstanding
consistence together with its excellent conductivity and easily renewable surface) with those
of microelectrodes (enhanced mass transfer rates due to non-planar diffusion together with
small ohmic losses). Because the ohmic potential drop, IR, is decreased as the measured
currents are very low, electroanalysis in the presence of ambient or minimal electrolyte
content is possible. This can be a very important factor in environmental analysis since the
possibility to pollute the sample by addition of impurities incorporated in supporting
electrolyte is absent. Thus, our effort was further to test the effect of acetate buffer content in
the sample solution, in the 0 to 0.1 M concentration range. The results obtained have shown
similar phenomenon as in the case of macroelectrode substrates, such is a 10-fold excess of
Bi(III) concentration to be equally effective to gain high sensitivity of the detection with
possibility to use minimum or no buffer content. Due to the systematic optimization of
Bi(III)-to-metal ion concentration ratio very low detection limits for Pb(II) and Cd(II) were
estimated using above mentioned carbonaceous electrode substrates (see Tab.I overleaf).
Bismuth powder carbon paste electrodes, Bi-CPEs, is a special sort of bismuth-based
electrode which combines the advantageous properties of the carbon paste material with the
favorable electrochemical properties of bismuth 11. In principle, finely grounded metallic
bismuth is mixed with the carbon paste during its preparation in a suitable quantum. The
optimization of carbon paste composition with respect to graphite material and the content of
metallic bismuth (from 8 to 50% w/w) has been extensively studied 12, 13. However, the
differences between the tested electrodes were not significant (except for the carbon paste
4
containing 50% Bi w/w) and therefore, there was no need to define an accurate bismuth-tocarbon paste ratio.
Table I
Detection limits (10-9 mol.L-1) for Cd(II) and Pb(II) obtained with BiF plated carbonaceous
electrode substrates.
Cd
Pb
-1
cAcB/ mol.L
CµE
CPmE
CPE
CµE
CPmE
CPE
(30µm)
(70µm)
(0.2mm)
(30µm)
(70µm)
(0.2mm)
0.00
150
7.9
45
3.19
0.01
1.43
0.77
0.1
20
1.28
1.3
11
0.87
0.5
Performance independence in such a wide variation in Bi composition (ca. 10 – 30% Bi w/w)
seems to be advantageous since the preparation of the respective paste is not complicated by
additional operations necessary to ensure an accurate composition.
The major advantage of this type of bismuth-based electrode is the possibility to employ them
in analysis requiring slightly alkaline supporting media (e.g. ammonia buffer of pH 9.5 – 10),
a situation impossible bismuth-film electrodes plated in situ, owing to the hydrolysis of Bi(III)
ions. An electrolyte of such a high alkalinity in combination with extremely negative
deposition potential -1.7 V vs Ag/AgCl (which would be inaccessible for most of solid
electrodes) is necessary for the determination of i.e. manganese Mn(II), and only becomes
feasible when using Bi-CPE 12, 14. Bi-CPE has also been employed for the detection of copper
Cu(II) in 0.1 M ammonia buffer media (pH 10) that allowing the shift of the copper stripping
peak (-0.5 or -0.45 V vs Ag/AgCl depending on the Cu(II) concentration) before the oxidation
peak of bismuth (-0.2 V vs Ag/AgCl) 15. Normally, in the acetate buffer medium the stripping
peak of copper is placed more positively than bismuth peak. Therefore it would not be correct
to presume analysis on bismuth film electrode but rather the reaction between the electrode
substrate and copper ions, because copper can also be fairly deposited onto the bare electrode.
The shift of copper peak to more negative potentials in ammonia buffer is the consequent of
the transformation of Cu(II) into the corresponding tetraammino complex [Cu(NH3)4]2+ with a
stability constant of log β = 12.59 16.
Conclusion
Since the pioneering study of Wang’s group has been introduced the bismuth film electrodes
(BiFEs) and related bismuth-based sensors have already achieved a respectable position in
modern electroanalysis despite the relatively short period. Bismuth-based electrodes have
been primarily used for the trace analysis of heavy metals. Nevertheless, some papers have
shown their possible applicability also to the determination of selected organic compounds 17
or pharmaceutical preparatives 18.
Acknowledgements
Financial grants from the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic
(projects № LC 06035 and MSM0021627502) are gratefully acknowledged.
References
1. Vytřas K., Švancara I.: Chem. listy 88, 412 (1994).
2. Schwabe K., Schade W.: Pharmazie 3, 449 (1948).
5
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Švancara I., Vytřas K.: Chem. listy 100, 90 (2006).
Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005).
Kokkinos C., Economou A.: Curr. Anal. Chem. 4, 183 (2008).
Wang J., Lu J.M., Hočevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218
(2000).
Švancara I., Pravda M., Hvízdalová M., Vytřas K., Kalcher K.: Electroanalysis 6, 663
(1994).
Baldrianová L., Švancara I., Vlček M., Economou A., Sotiropoloulos S.: Electrochim.
Acta 52, 481 (2006).
Baldrianová L., Švancara I., Economou A., Sotiropoulos S.: Anal. Chim. Acta 580, 24
(2006).
Baldrianová L., Švancara I., Sotiropoulos S.: Anal. Chim. Acta 599, 249 (2007).
Hočevar S., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Electrochim. Acta 51, 707 (2005).
Švancara I., Baldrianová L., Tesařová E., Hočevar S.B., Elsuccary S.A.A., Economou A.,
Sotiropoulos S., Ogorevc B., Vytřas K.: Electroanalysis 18, 59 (2006).
Baldrianová L., Tesařová E., Švancara I., Hočevar S.B., Ogorevc B., Vytřas K.: 12th
Young Investigators' Seminar on Analytical Chemistry (YISAC '05), Sarajevo, Bosnia and
Herzegovina, Book of abstracts, pp. 25.
Baldrianová L., Tesařová E., Galík M., Švancara I., Vytřas K.: 11th International
Conference on Electroanalysis – ESEAC 2006, 11.-15.6., Book of abstracts P2-075,
Bordeaux, France.
Vytřas K., Baldrianová L., Tesařová E., Bobrowski A., Švancara I.: in Sensing in
Electroanalysis I, (K. Vytřas, K. Kalcher, eds.) pp. 49-57, University of Pardubice 2005,
Pardubice 2005.
Incyzédy J.: Analytical Applications of Complex Equilibria, p. 321. Akadémiai Kiadó,
Budapest 1976.
Guzsvány V.J., Kádár M., Gaál F.F., Bjelica L.J., Tóth K.: Electroanalysis 18, 1363
(2006).
Bučková M., Grundler P., Flechsig G.U.: Electroanalysis 17, 440 (2005).
6
Electrochemical characterization of short oligonucleotides
(Elektrochemická charakterizace krátkých oligonukleotidů)
Zdeňka Balcarová, Kamila Neplechová, and Libuše Trnková
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Chemistry, Kotlářská 2, 611 37 Brno,
Czech Republic, E–mail: [email protected]
Abstract
This study deals with the description and characterization of two hepta–oligonucleotides
(DNA and RNA) forming hairpin structures. We studied their electrochemical behavior by
means of cyclic voltammetry (CV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS) in
combination with adsorptive stripping. According to preliminary results we found differences
between heptadeoxyribonucleotide and its RNA analog.
Key Words: Hepta–oligonucleotides, Hairpin structure, Voltammetry, Elimination
voltammetry with linear scan.
Úvod
U nukleových kyselin hrají základní roli nukleotidy, jejich pořadí (sekvence), párování a
uspořádání struktury do vyšších molekulárních celků. Velmi důležitou roli v biologických
procesech mají vlásenkové struktury (hairpins). Tvoří část některých abnormálních struktur
DNA nebo RNA, jako jsou triplexy nebo kvadruplexy. Hairpiny se skládají z jednořetězcové
smyčky (loop) a dvouřetězcového rovného úseku (stem). Vyskytují se v jedno– i
dvouřetězcových DNA a RNA a hrají důležitou roli v mnoha biologických procesech.
Nejkratší stabilní hairpin dosud charakterizovaný je DNA heptamer d(GCGAAGC), který byl
zjištěn v replikačním počátku fága φX 174 1 a viru herpes simplex 2, v promotorové oblasti
genu kódujícího protein teplotního šoku u E. coli 3 a v RNA genech 4. Tento nejkratší
fragment, obsahující trinukleotidovou smyčku (GAA) a dvoupárový rovný region obsahující
pouze 2 G–C páry hraje důležitou úlohu při expanzi repetitivních sekvencí u některých
chorob (syndrom fragilního chromozomu X, Huntingtonova choroba, Friedrichova ataxie) 4,5.
Bylo zjištěno, že zatímco tento krátký DNA fragment má bod tání kolem 76 oC, jeho RNA
analog jen kolem 27 oC. Stabilita dvouřetězcové oblasti koreluje se stabilitou dvouřetězcové
B–DNA 6. Vysoká stabilita DNA heptametru se projevuje ve vysoké odolnosti vůči
nukleázám 7 a má neobvyklá CD spektra 8. Jak bylo navrženo v několika pracích 9–11, v
sousedství smyčky je preferován pár G–C před párem C–G. Je pravděpodobné, že stabilita
krátkých vlásenek závisí na stabilitě dvouřetězcové části a na páru bází, který smyčku
uzavírá 12. Struktura vlásenky d(GCGAAGC) byla studována také pomocí NMR
spektroskopie 4,13, která u fragmentů d(GCGAAAGC) a r(GCGAAGC) ukázala, že
vlásenková struktura je stočena mezi A4 a A5 a je stabilizována ne Watsonovským párem
G–A ve smyčce GAA 4,14,15. Bylo diskutováno, že rozdíly ve stabilitě mezi DNA a RNA
mini–vlásenkami mohou být způsobeny spíše rozdíly v konformaci (DNA je v B formě a
RNA v A formě) dvouřetězcové oblasti, než přítomností neobvyklého G–A páru ve
smyčkách. Dvouřetězcové oblasti v B formě mohou být upřednostňovány před A formou při
tvorbě stabilních mini–vlásenek 9. V nedávné době byla vlásenka d(GCGAAGC) studována
také pomocí elektroanalytických metod (CV, LSV, EVLS) 16,17.
Cílem práce je porovnat elektrochemické chování minivlásenky DNA a RNA v závislosti na
různých experimentálních parametrech, jako je pH, koncentrace hairpinu, doba akumulace
vlásenky na povrchu elektrody a rychlost polarizace.
7
Experimentální část
Syntetické oligodeoxyribonukleotidy a oligoribonukleotidy – heptamery 5´GCGAAGC 3´
(DNA) a 5´GCGAAGC 3´(RNA) byly syntetizovány firmou IDT (Integrated DNA
Technology, USA). Složky pufrů byly zakoupeny u Sigma–Aldrich Chemical (čistota ACS).
Voltametrická měření byla provedena na elektrochemickém analyzátoru AUTOLAB PGS20
(Ecochemie, Holandsko) spojeného s VA–Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Standardní
elektrochemické měření bylo prováděno ve tříelektrodovém zapojení. Visící rtuťové kapkové
elektrody (HMDE) o ploše 0.4 mm2 bylo využito jako pracovní elektrody. Ag/AgCl/3M KCl
elektroda sloužila jako referenční a platinový drátek jako pomocná elektroda.
Koncentrace heptamerů při elektrochemické analýze byla 5.10–6 M (pokud není uvedeno jinak
– koncentrační závislosti). Zásobní roztoky byly připraveny rozpuštěním lyofilizovaných
oligonukleotidů v třikrát destilované vodě. Jejich koncentrace byla stanovena absorpční
spektroskopií v UV oblasti s použitím průměrného absorpčního molárního koeficientu
(10 000 cm–2 mmol–1) při 260 nm. Vodné roztoky vzorků oligonukleotidů byly přidány k
fosfáto–acetátovému pufru (0,1 M) o různém pH roztoků. Hodnoty pH byly ověřovány
pomocí gelové elektrody ve spojení s pH–metrem Cyberscan PC 5500 (EUTECH
Instruments). Všechny pokusy byly prováděny při laboratorní teplotě.
Výsledky a diskuse
Na rtuťové elektrodě (HMDE) poskytují oba heptamery d(GCGAAGC) a r(GCGAAGC)
redukční signály A+C a oxidační signál redukčního produktu G. Tyto signály byly studovány
cyklickou voltametrií (CV) a eliminační voltametrií (EVLS – Elimination Voltammetry with
Linear Scan) v závislosti na pH, koncentraci oligonukleotidu, době akumulace na elektrodě a
rychlosti polarizace.
Obr. 1. Cyklický voltamogram heptameru d(GCGAAGC).
Bylo zjištěno, že při všech hodnotách pH heptamer r(GCGAAGC) poskytuje u G pouze jeden
anodický signál, zatímco heptametr d(GCGAAGC) vždy dva, přičemž jejich poloha a
vzájemný poměr se s pH dramaticky mění. Křivka závislosti maxim obou píků u
8
d(GCGAAGC) dosahuje vrcholu kolem pH 5,5 (pík při negativnějším potenciálu – GI ), resp.
6,0 (pík při pozitivnějším potenciálu – GII) a potom poměrně prudce klesá. U r(GCGAAGC)
je nárůst výšky anodického signálu G pozvolný, vrchol je málo patrný a až u nejvyšších
hodnot pH dochází k výraznému poklesu. Katodické píky A a C při CV nelze od sebe pomocí
LSV nebo CV separovat, daří se to pouze pomocí EVLS, i když u vyšších hodnot pH (kolem
6) byl patrný začátek jejich rozdělení i v CV. Závislost A+C píků na pH u obou
oligonukleotidů je podstatně odlišná od pH závislosti G píku, neboť s rostoucím pH A+C
signály kontinuálně klesají až do určité hodnoty a s dalším zvyšováním pH zůstávají na
konstantní hodnotě.
0,14
0,14
I (μ A)
0,10
0,12
A
pH 4,22
0,10
pH 5,45
0,08
I (μ A)
0,12
pH 5,73
0,06
pH 6,13
0,04
pH 4,12
pH 5,08
0,08
pH 5,73
0,06
pH 6,27
0,04
pH 6,45
pH 6,50
0,02
0,02
0,00
-250
B
-200
-150
-100
-50
0
0,00
-250
50
E (mV)
-200
-150
-100
-50
0
50
E (mV)
Obr. 2. Závislost anodického signálu G na pH pro heptamery DNA (A) a RNA (B) (5.10–6 M,
rychlost polarizace 400 mV/s).
Pokud jde o akumulaci hairpinu na elektrodě, pak adsorpce je podstatně rychlejší a
efektivnější v případě heptaribonukleotidu r(GCGAAGC). Koncentrační závislost výšky píků
G i A,C má u obou heptanukleotidů podobný průběh. V podstatě se jedná o dvě lineární
závislosti se zlomem při koncentraci cca 2 µM u RNA a 3 µM u DNA.
Velkým přínosem pro elektroanalýzu DNA, oligonukleotidů a jejich složek je spojení
adsorptivní rozpouštěcí techniky (AdS a AdTS) s eliminační voltametrií (EVLS) 16,17. Díky
EVLS jako matematické transformaci naměřených voltametrických signálů jsme schopni
eliminovat kteroukoliv složku proudu, u nichž je známá závislost dílčího proudu na rychlosti
polarizace. Pro stanovení detekčního limitu analytů ve voltametrii je důležité eliminovat
kapacitní proud, zejména při vyšších rychlostech polarizace a zde může být EVLS velmi
užitečná. Přehled šesti nejvíce používaných eliminačních funkcí, je uveden v následující
tabulce (Tab. I).
Tabulka I.
Typy eliminačních funkcí.
EVLS funkce
Charakteristika
E1
I d ≠ 0; I k = 0 ( I c zkreslený )
E2
I d ≠ 0; I c = 0 ( I k zkreslený)
E3
I d = 0; I k ≠ 0 ( I c zkreslený )
E4
I d ≠ 0; I k = 0; I c = 0
E5
I d = 0; I k ≠ 0; I c = 0
E6
I d = 0; I k = 0; I c ≠ 0
Rovnice f(I)
a1 I 1 + a2 I 2
a1 I 1 + a2 I 2 + a3 I 3
Id, Ik, Ic – difúzní, kinetický a kapacitní proud, a1, a2, a3 – eliminační koeficienty,
I1, I2, I3 – celkový proud naměřený při třech rychlostech polarizace (v1, v2 = vref a v3)
9
Pro výpočet koeficientů a1, a2 a a3 u jednotlivých eliminačních funkcí je třeba stanovit poměr
(tzv. integer) mezi rychlostmi polarizace vzhledem k referenční polarizační rychlosti.
Prozatím nejvíce využívaným poměrem byla hodnota poměru 2, to znamená, že nižší v1 je
poloviční než v2 = vref a vyšší v3 je dvojnásobná než vref. Nejvýznamnější a nejvíce
používanou EVLS funkcí pro studium DNA, ODN a podobných látek je funkce E4, která pro
adsorbovanou částici poskytuje specifický a dobře čitelný signál. Výsledek aplikace EVLS na
signály G pro obě vlásenky, DNA a RNA, je ukázán na obr. 3, z něhož je patrné, že nejlépe z
analytického hlediska vychází transformovaný signál EVLS E4 ( I d ≠ 0; I k = 0; I c = 0 ). Tvar
pík–protipík je ve shodě s teoretickým EVLS signálem pro zcela adsorbovanou částici a i v
tomto případě je EVLS signál 8–10krát vyšší než původně voltametrický pík naměřený při
referenční rychlosti polarizace.
0,60
0,30
0,20
A
0,50
B
refer.
elim. 1
0,40
elim. 2
elim. 3
0,10
0,30
elim. 4
elim. 5
0,20
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
f(I)
f(I)
0,00
elim. 6
0,10
E (mV)
-0,10
0,00
-300
refer.
-0,20
-250
-200
-150
-0,10
elim. 1
-100
-50
E (mV)
0
elim. 2
-0,20
elim. 3
-0,30
elim. 4
-0,30
elim. 5
elim. 6
-0,40
-0,40
Obr. 3. EVLS guaninového píku pro heptamer DNA (A) a RNA (B) (pH 5,5).
Pomocí obou variant (AdS EVLS, AdTS EVLS) byly zkoumány oba heptametry. Při AdTS
bylo zjištěno, že chování G píku se při přenosu do stejného pH ani po denaturačním přenosu
téměř nemění.
Závěr
V naší práci byl elektrochemicky studován RNA heptamer za účelem srovnání s jeho DNA
analogem 16. Bylo zjištěno, že elektrochemické chování těchto dvou, různě stabilních mini–
vlásenek se od sebe liší. Záměna deoxyribózy za ribózu vede ke změnám v konformaci
oligonukleotidu a ty se odrážejí v jejich elektrochemickém chování, především pokud jde o
dobu akumulace, o závislost voltametrických signálů na pH a hlavně pokud jde o přítomnost
jednoho nebo dvou anodických guaninových signálů.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů od MŠMT ČR č. MSM0021622412 (INCHEMBIOL)
a LC06035 (BIO–ANAL–MED).
Poděkování patří také paní Ireně Postbieglové za rady a technickou pomoc.
Literatura
1. Arai K., Low R., Kobori J., Shlomai, J. Kornberg, A.: J. Biol. Chem. 256, 5273 (1981).
2. Elias P., Lehman I.R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2959 (1988).
3. Cowing D. W., Bardwell J. C. A., Craig, E. A., Woolford, C., Hendrix, R. W., Gross,
C. A.: P. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2679 (1985).
4. Hirao I., Kawai G., Yoshizawa S., Nishimura Y., Ishido Y., Watanabe K. Miura, K.:
Nucleic Acids Res. 22, 576 (1994).
5. Suen I. S., Rhodes J. N., Christy M., McEwen B., Gray D.M., Mitas M.: BBA– Gene
Struct. Expr. 1444, 14 (1999).
10
6. Gotoh O., Tagashira Y.: Biopolymers 20, 1033 (1981).
7. Yoshizawa S., Ueda T., Ishido Y., Miura K., Watanabe K., Hirao I.: Nucleic Acids Res.
22, 2217 (1994).
8. Hirao I., Nishimura Y., Naraoka T., Watanabe K., Arata Y., Miura K.: Nucleic Acids Res.
17, 2223 (1989).
9. Antao V. P., Lai S. Y., Tinoco I.: Nucleic Acids Res. 19, 5901 (1991).
10. Antao V. P., Tinoco I.: Nucleic Acids Res. 20, 819 (1992).
11. Tuerk C., Gauss P., Thermes C., Groebe D.R., Gayle M., Guild N., Stormo G.,
Daubentoncarafa Y., Uhlenbeck O. C., Tinoco I., Brody E.N., Gold L.: P. Natl. Acad. Sci.
USA 85, 1364 (1988).
12. Hirao I., Nishimura Y., Tagawa Y., Watanabe K., Miura K.: Nucleic Acids Res. 20, 3891
(1992).
13. Nakamura S., Hirose H., Ikeguchi M., Shimizu K.: Chem. Phys. Lett. 308, 267 (1999).
14. Yoshizawa S., Kawai G., Watanabe K., Miura K., Hirao I.: Biochemistry 36, 4761
(1997).
15. Padrta P., Stefl R., Kralik L., Zidek L., Sklenar V.: J. Biomol. NMR 24, 1 (2002).
16. Trnkova L., Postbieglova I., Holik M.: Bioelectrochemistry 63, 25 (2004).
17. Trnkova L.: Bio–Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research 4th
chapter, Application of EVLS in Bielectrochemistry p. 51, Research Signpost, Kerala,
India 2007.
11
Quo Vadis, Electroanalytical Chemistry?
Jiří Barek, Vít Novotný, and Oxana Yosypchuk
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 12843 Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
New trends in voltammetric and amperometric methods are briefly discussed, namely the
development of new electrode materials, chemical modification of working electrodes,
miniaturization of electrochemical sensors and detectors, the application of nano particles in
voltammetry and amperometry and a combination of voltammetric and amperometric
techniques with a preliminary separation and preconcentration.
Key Words: New electrode materials, Pesticides, Genotoxic Pyrene derivatives.
Introduction
Fascinating and ever increasing possibilities of modern separation and spectrometric
techniques and their hyphenated combinations force electroanalytical chemistry to focus into
fields in which they can successively compete and make use of their advantages, namely low
cost, easy miniaturization and portability, reasonable sensitivity and acceptable selectivity.
The aim of this contribution is to show that monitoring of submicromolar concentrations of
electrochemically active organic compounds in various biological and environmental matrices
can be such a filed.
New electrode materials
There is no doubt that mercury is the best electrode material for voltammetric and
amperometric determination of submicro- and nanomolar concentrations of electrochemically
reducible organic substances. It is well documented by a number of voltammetric and
amperometric methods with limits of determination in submicromolar and even in namomolar
concentration range developed in our laboratory and summarized i.g. in review 1. However,
mercury electrodes are not mechanically robust and thus they are not too suitable for field
measurements and for measurements in flowing systems. Moreover, unreasonable fears of
mercury toxicity complicate their application in analytical laboratories. Therefore, there is a
never-ending search for new electrode materials.
Amalgam electrodes
There are several types of non-toxic amalgam electrodes, which - in some cases – can
successfully substitute mercury electrodes (see the review 2 and contributions of J. Fischer, V.
Vyskočil, D. Deýlová, and R. Šelešovská at this conference). Both polished and mercury
meniscus modified silver solid amalgam electrodes are proved and useful in trace
voltammetric and amperometric determinations. Analytical potential of mercury film
modified amalgam electrodes, amalgam paste electrodes both with and without organic
pasting liquids, single crystal and porous amalgam electrodes in the field of biologically
active organic compounds is recently intensively investigated in our laboratory (see the
contribution of A. Daňhel). Several examples of the application of amalgam electrodes for the
determination of trace amounts of various pesticides will be given 3.
Boron doped diamond film electrodes
Extremely broad potential window, very low noise, high mechanical and electrochemical
stability and resistivity towards passivation (see review 4) make these electrodes excellent
choice for both voltammetric and amperometric determination of trace amounts of both
reducible and oxidisable organic compounds (see contributions of J. Musilová and K.
12
Pecková at this conference). The practical usefulness of these electrodes will be demonstrated
on voltammetric and amperometric determination of submicromolar concentrations of
genotoxic amino and hydroxy derivatives of pyrene in urine 5.
Bismuth based electrodes
These electrodes have undoubtedly very promising future in the field of trace inorganic
analysis as documented by contributions of I. Švancara, S. Hočevar, L. Baldrianová, and E.
Tesařová at this conference. Their possibilities in organic trace analysis will request further
more detailed investigations.
Carbon paste electrodes
These electrodes are time-tested and proved work-horses in the filed of voltammetry and
amperometry (see review 6) which will be demonstrated by contributions of H. Dejmková and
L. Němcová. Moreover, many contributions from University of Pardubice, which is a
foremost research centre in this field, will undoubtedly deal with this topic.
Chemically modified electrodes
Their main advantage (i.e. higher sensitivity and selectivity) is offset by more complicated
preparation and lower reproducibility. Nevertheless, it is our firm conviction that the represent
the most promising field of future development of organic voltammetry and amperometry.
Self-assembled monolayers, modification with thiolated alkanes, cyclodextrines, calixarenes
etc. are among most frequent keywords at present. The same is valid for modification with
various nanoparticles, nanotubes etc. It is interesting to mention that more than 50% of papers
devoted to various “nanoaplications” in analytical chemistry are connected with
electroanalytical methods obviously in connection with broad miniaturization possibilities. It
is fair to say that complex chemically modified electrodes will be reliable tools only in the
hands of experienced electroanalytical chemists and it is somewhat difficult to imagine their
wide spread use in analytical laboratories. However, more and more scientists from other
fields (biological, medical and earth sciences) will probably resign on their own analytical
activities and will leave the task to experienced analysts.
Miniaturized electrodes
There are at lest two reasons for miniaturization. One is connected with construction of
electrochemical detectors for measurements in flowing systems where the detector volume
should be smaller than the volume of a theoretical plate. Recent trends towards capillary
techniques further underline this tendency. However, in the field of batch analysis we witness
the same tendency because of frequently limited volumes of analyzed samples and because
frequent preliminary separation and preconcentration resulting in small volumes of analyte
solutions. In this contribution, several examples of miniaturized electrodes compatible with
96 well microplate measurements or with capillary separation techniques will be
demonstrated 7.
Conclusions
It is necessary to stress that further intensive development of modern electroanalytical
methods is requested to keep up with fast progress in the filed of separation and spectrometric
methods. Equally important is to apply electroanalytical methods in those filed in which they
are competitive. The authors of this contribution believe that environmental monitoring of
organic pollutants can be one of those fields.
13
Acknowledgement
This research was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (MSM 0021620857, LC 06035, and RP 14/63), by the Grant Agency of Charles
University (SVV 261204), and by the NATO grant CBP.EAP.CLG.982972.
References
1. Vyskocil V., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39,173 (2009).
2. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
3. Novotný V., Barek J.: Unpublished results.
4. Peckova K., Musilova J. Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009).
5. Yosypchuk O.: Diploma Thesis. Charles University in Prague, Prague 2010.
6. Zima J., Svancara I., Barek J., Vytras K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009).
7. Barek J., Yosypchuk B.: Unpublished results.
14
Fullerene C60 in Aqueous Medium
Jana Bulíčková a,c, Miroslav Gál a, Magdaléna Hromadová a, Ladislav Kavan a,
Lubomír Pospíšil a,b, and Romana Sokolová a
a
J.Heyrovský Institute of Physical Chemistry AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, v.v.i, Flemingovo nám. 542/2, 160 00
Prague 6, Czech Republic
c
Chemistry, Studentská 573 (HB/C), 532 10 Pardubice, Czech Republic
Abstract
The aqueous solution of C60 was investigated by electrochemical and spectroscopic methods
such as UV-Vis, Raman, FTIR and AFM techniques. The association constants of fullerene-γcyclodextrin complex and methanofullerene conjugates with β-cyclodextrins in aqueous
solution were evaluated from the shifts of the formal redox potential of complexed and
uncomplexed fullerene. The most suitable techniques for electrochemical characterization of
fullerene derivatives proved to be the low-frequency phase-sensitive AC polarography and the
steady-state voltammetry.
Key Words: Fullerene C60, Aqueous solution, Electron transfer, Spectroscopy.
Úvod
Fulleren (C60) je vysoce hydrofobní sloučenina a je považován za ve vodě nerozpustný. Různé
způsoby úprav fullerenu již byly publikovány, tak aby vzrostla rozpustnost C60 v polárním
prostředí. Existují ve vodě rozpustné nekovalentní komplexy fullerenu a cyclodextrinu,
vznikající enkapsulací fullerenu do kavity γ-cyklodextrinu, C60 : γCD v poměru 1:2.
V nedávné době jsme ukázali, že elektrochemická konverze plynného dusíku na amoniak je
možná
pomocí
redukovaného
fullerenu
uvnitř
molekulární
kavity
1
γ-cyklodextrinu . Jinou možností je kovalentní spojení metanofullerenů s β-cyklodextriny za
vzniku ve vodě rozpustných konjugátů fullerenu 2. Byla popsána také příprava stabilního
koloidního vodného roztoku fullerenu bez přídavku stabilizačních činidel. Fullerenový vodný
roztok vzniká sonifikací dvoufázového roztoku, který je tvořen roztokem C60 v toluenu a
vodě 3.
Fulleren-C60 (99.9%) od firmy Sigma-Aldrich a γ-cyklodextrin od firmy CycloLab LTD byly
použity bez dalšího čištění. Chlorid draselný či fluorid draselný, elektrolyty do vodného
prostředí, byly analytického stupně kvality. Destilovaná voda byla ještě deionizována pomocí
systému Millipore.
Vzorky C60 ve vodě byly připravovány modifikací metody popsané Scharffem 3. Nejdříve
byly připraveny roztoky o různé koncentraci čistého fullerenu (>99.9% Sigma Aldrich) od 0.1
do 2.9 mg/ml v toluenu pomocí ultrazvukové lázně. Po smíchání toluenového roztoku se
stejným množstvím deionizované vody se okamžitě oddělily dvě fáze. Směs byla umístěna do
ultrazvukové lázně za konstantní pokojové teploty po dobu několika hodin (obvykle 24
hodin). Sonifikace byla zastavena jakmile došlo k úplnému odpaření toluenové fáze. Vodní
fáze získala žlutou až žluto-hnědou barvu podle počáteční koncentrace C60 v toluenu.
Nakonec byl nerozpuštěný fulleren odstraněn opakovanou filtrací přes mikrofiltr s póry 0.2
μm.
15
Sloučeniny 2, 4, 5 a 7 byly připravovány partnerským pracovištěm ENS v Paříži dle
popsaných procedur u Rassata a spolupracovníků.2 Sloučenina 6 byla syntetizována reakcí 2úndekanoyl-permethylovaného β-cyklodextrinu s malonyl dichloridem, s následnou
kondenzací s C60.
K elektrochemickému měření byly využity metody DC polarografie, cyklické voltametrie,
fázově citlivé AC polarografie, AC voltametrie. Přístrojové vybavení se skládalo z rychlého
potenciostatu, lock-in zesilovače (Stanford Research, model SRS830). Přístroje byly
k počítači připojeny přes IEEE-rozhraní (PC-Lab, AdvanTech Model PCL-848) a sběrnou
datovou kartu (PCL-818) pomocí 12-bitového převodníku pro A/D i D/A konverzi.
K charakterizaci vzorků C60 ve vodě byly také použity metody UV-VIS spektroskopie,
Ramanova spektroskopie, FTIR spektroskopie, STM a AFM. UV-VIS absorpční spektra byly
zaznamenány UV-VIS/NIR spektrometrem (Perkin Elmer Lambda 1050) spolu s 60mm
InGaAs integrační koulí. Ramanova spektra byla excitována Ar+ laserem při vlnové délce
514.5 nm (Innova 305, Coherent). Spektra byla zaznamenána pomocí spektrometru (T-64000,
Instruments, SA) se spektrálním rozlišením 2 cm-1. Vzorek tvořil tenký pevný film po
odpaření z vodného roztoku na povrchu měděného držáku vzorku. Měření bylo prováděno za
rotace kvůli zabránění rozpadu vzorku. ATR-FTIR spektra byla měřena FTS 7000 FTIR
spektrometrem (Digilab, USA). Spektra byla akumulována pomocí diamantového ATR
příslušenství. Tenký pevný film vzorku byl připraven odpařením vodného roztoku na povrchu
diamantu. Spektra byla derivována ze 64 skenů při rozlišení 2 cm-1.
AFM měření bylo prováděno na přístroji Agilent 5500 SPM, stanici s magneticky řízenou
AFM sondou. Měření AFM ex-situ (na vzduchu) bylo uskutečněno při resonanční frekvenci
konkrétní sondy (cca 50-60 kHz), s parametry zpětné vazby 3% - 8%, při velmi pomalé
rychlosti záznamu (cca 0.4 - 0.6 linek/sekundu), aby bylo dosaženo molekulárního rozlišení.
Výsledky a diskuse
Nedávno byly syntetizovány čtyři nové konjugáty fullerenu a cyklodextrinu
4 – 7. Předpokládalo se, že kovalentní připojení cyklodextrinu k fullerenu by mohlo vést k
intra-molekulární komplexaci. Deriváty 4 a 5 mají kovalentní spojení s primárním
cyklodextrinovým (CD) okrajem, tato modifikace dosahuje vysoké rozpustnosti sloučenin ve
vodě. Zatímco deriváty 6 a 7 mají cyklodextrinové ligandy připojené k sekundárnímu CD
okraji.
Nejdříve je třeba zkoumat, zda-li jsou redoxní vlastnosti fullerenu zachovány ve sloučeninách
4 -7. Předpokládáme, že se z posunu reverzibilního redoxního potenciálu kovalentně
vázaných cyklodextrinových derivátů fullerenu může potvrdit jejich vnitřní komplexace,
popřípadě by to mohlo dokonce vést k určení jejich konstanty stability v redukované formě.
Výpočet komplexační (asociační) konstanty r, která definuje zesílení inkluze, vyžaduje
znalost formálního reverzibilního potenciálu EF0 nekomplexované formy C60 v daném
rozpouštědle a formálního potenciálu komplexovaného fullerenu. Proto stanovení redoxních
potenciálů C60 v rozpouštědlech, v kterých je předpokládána komplexace s cyklodextrinem, je
prvním úkolem k naměření.
Nejvhodnější technikou elektrochemické charakterizace derivátů fullerenu se prokázala být
fázově citlivá AC polarografie a měření stacionární závislosti proudu na napětí. Formální
redox potenciály lze identifikovat buď jako půlvlnný potenciál u reverzibilní vlny stacionární
závislosti proudu na napětí nebo jako potenciál píku Re a Im komponenty admitance. Byly
stanoveny formální redoxní potenciály fullerenu 1, methanofullerenu 2, komplexu fulleren-
16
cyklodextrin 3, metanofullerenových konjugátů s cyklodextriny 4-7 ve vodném roztoku viz.
Tabulka I.
Obr. 1. Chemické struktury derivátů fullerenu.
Tabulka I.
Formální potenciály jednoelektronových redox reakcí ve vodě (vs. ferrocen/ferrocenium).
Sloučenina
1
2
3
3 stárnoucí
4
5
7
E1 (V)
-0.560
-0.650
-0.711
-0.707
-0.690
-0.790
(-0.815)
E2 (V) E3 (V) E4 (V)
-1.210
-1.183
-1.137
-1.057
-1.200
-1.333
-1.420
-1.525
-1.577
-1.775
Disperzní vodný roztok fullerenu byl charakterizovaný UV-VIS, Ramanovou a FTIR
spektroskopií a AFM technikou. Vzorek C60 ve vodě tvoří stabilní koloidní disperzi.
Ramanovská spektra ukazují deset aktivních vibračních módů (8Hg+2Ag) fullerenu, se
zachovanou symetrií C60. Na spektru ATR-FTIR jsou vidět čtyři IR aktivní vibrační pásy
volné molekuly C60 (F1u symetrie; 527, 576, 1183 and 1430 cm-1), ačkoliv dva pásy vysoké
frekvence jsou částečně překryty pozadím. Spektrum je dominantní vibračními pasy
valenčních vibrací C-O (≈ 1000 cm-1), C=O (≈1600 cm-1), C-H (≈ 2900 cm-1) a OH (≈ 3400
cm-1). Tyto vibrační vlastnosti dokazují přítomnost organické molekuly, která pravděpodobně
vzniká během sonofikace. Její přítomnost nejspíše napomáhá rozpouštění C60 ve vodě.
Charakter stabilizátoru ještě není přesně znám, nejspíše obsahuje hydrofilní (―OH or
―COO-) i hydrofobní skupiny (fenyl). AFM metodou byly získány monodisperzní klastry
molekul C60 viz. Obr. 2.
17
Obr. 2. AFM topografie a fázově citlivé zobrazení fullerenových klastrů adsorbovaných z
vodné koloidní disperze fullerenu na (111) monokrystalickém zlatě, měřených ex-situ.
Velikost obrázku 1μm.
Závěr
Byly nalezeny formální redoxní potenciály fullerenu (-0.560 V), methanofullerenu
(-0.650 V), komplexu fulleren-cyklodextrin (-0.711 V), metanofullerenových konjugátů
s cyklodextriny (4 -0.690 V, 5 -0.790 V) ve vodném roztoku. Vzorek C60 ve vodě tvoří
stabilní koloidní disperzi. Do vodného roztoku se C60 nejspíše dostává organickým
stabilizátorem vznikajícím sonifikací. Mohlo by se jednat o kyselinu benzoovou či benzyl
alkohol. Ramanovo spektrum ukazuje na zachovanou symetrii C60. Monodisperzní klastry
molekul C60 jsou patrny i na zobrazení metodou AFM.
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory Grantovou agenturou Akademie věd České republiky
(203/09/0705, 203/08/1157, 203/09/P502 and 203/09/1607) a Ministerstva školství (LC510
and COST OC140).
Literatura
1. Pospíšil L., Bulíčková J., Hromadová M., Gál M., Civiš S., Cihelka J., Tarábek J.,
Chem.Commun. 22, 2270 (2007).
2. Filippone S., Heimann F., Rassat A.: Chem Commun 14, 1508 (2002).
3. Scharff P., Risch K., Carta-Abelmann L., Dmytruk I.M., Biliy M.M., Golub O.A.,
Khavryuchenko A.V., Buzaneva E.V., Aksenov V.L., Avdeev M.V., Prylutskyy Y.I.,
Durov S.S.: Carbon 42, 1203 (2004).
18
Chronopotentiometry of Native and Denatured BSA
Hana Černocká and Veronika Ostatná
Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic v.v.i., Královopolská
135, 612 65 Brno, Czech Republic
Abstract
In contrast to previous reports claiming bovine serum albumin (BSA) denaturation at mercury
surfaces, recently it has been shown that BSA and other proteins do not denature as a result of
adsorption to the mercury electrodes in 50 mM sodium phosphate (pH 7). Higher phosphate
concentrations induced electric field-driven denaturation of BSA on the electrode surface.
Key Words: Protein denaturation, Constant current chronopotentiometry, Hanging mercury
electrode, Catalytic hydrogen evolution.
Introduction
Electrochemical responses of proteins have been known already from the 1930s. In recent
decades electrochemistry of proteins focused on a relatively small group of conjugated
proteins containing non-protein redox centers. Compared to these flourishing studies, research
into electrochemistry of a majority of proteins important in biomedicine and in proteomics
was only marginal. Recently we have shown that electroactivity of some amino acid residues
at carbon and mercury electrodes as well as the ability of proteins to catalyze hydrogen
evolution can be utilized in protein research and particularly in biomedicine 1-7. Using the
constant current chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) and hanging mercury drop
(HMDE) or solid amalgam electrodes we observed a well-developed electrocatalytic peak
(peak H) produced by all tested proteins at nanomolar concentrations. Peak H differs from the
previously studied electrochemical signals of proteins particularly (i) by its ability to detect
proteins down to nanomolar and subnanomolar concentrations 6,8 (regardless of the presence
or absence of cysteines in the protein molecules) and (ii) by its high sensitivity to local and
global changes in protein structures 6,9,10 and to protein redox states 2. Until very recently it
was believed that proteins are denatured when adsorbed at bare mercury electrode surfaces 6,9.
We have shown that depending on ionic conditions and speed of the electrode charging to
negative potentials 4, proteins can either retain their native structures or undergo surface
denaturation at bare mercury electrodes.
Experimental
BSA was purchased from Sigma-Aldrich, all other chemicals used were of analytical grade,
and solutions were prepared from triply distilled water.
Electrochemical measurements were performed with an AUTOLAB Analyzer (EcoChemie,
Utrecht, The Netherlands) in connection with VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland)
with the working electrode HMDE, the reference electrode Ag/AgCl/3M KCl and a platinum
wire as the auxiliary electrode.
The method utilized was adsorptive chronopotentiometric stripping analysis (AdCPSA): the
working electrode was immersed for accumulation time, tA and accumulation potential, EA
into the electrolytic cell containing the protein solution in the background electrolyte and
chronopotentiograms were recorded.
Results and discussion
Using the CPS catalytic peak H we are able to detect structural changes of BSA at the HMDE.
Significant structural changes of proteins appear during their denaturation. In concentrated
19
denaturant such as urea or guanidine hydrochloride (GdmCl) a highly unfolded state is
observed resembling the random coil, which is termed unfolded state. Removal of denaturing
conditions results in conformational state of the protein, which is considered as denatured. We
observed large differences in the heights of this peak for native and denatured BSA (Fig. 1)
regardless of denaturing by urea or guanidine. Separation of the accumulation step from the
electrode process using the adsorptive transfer stripping (ex situ) method showed that
presence of GdmCl in solution during electrode process enhanced peak H in contrast to urea,
which showed little effect or decreased the peak.
Fig. 1. Peak H of native (dashed line) and urea-denatured BSA (solid line). 150 nM BSA was
adsorbed on HMDE for accumulation time tA, 60 s, at accumulation potential EA, -0.1 V from
50 mM sodium phosphate buffer, pH 7 in presence 83 mM urea (dotted line) with stirring at
1500 rpm. Chronopotentiograms were recorded with stripping current Istr, -35 μA.
Denaturation of 14.4 M BSA in 8 M urea was performed overnight at 4 ◦C.
In 50 mM sodium phosphate at pH 7.0, peak H of 150 nM denatured BSA was much higher
than that of the native protein (Fig. 1). We observed similar responses with other proteins,
which suggested that native protein structures were not significantly disturbed at the electrode
surface. On the same electrode at increased ionic strengths (between 70-100 mM), native
BSA underwent surface denaturation and at ionic strengths higher than 100 nM produced
signals similar or almost identical to those of BSA which was denatured in solution by 8 M
urea. We explained the surface denaturation of proteins at higher ionic strength by the effect
of the electric field on the structure of the protein immobilized at the electrode surface.
Conclusion
This finding opens the door for electrochemical analysis of other changes in protein structures
induced by reduction, oxidation, aggregation, as well as by single amino acid exchange.
Our results suggest that electrochemical methods represent new and simple tools for the
investigation of changes in protein structures.
20
Acknowledgements
We are grateful to Prof. Paleček for critical reading. This work was supported by grants from
the Academy of Sciences of the Czech Republic: KJB100040901, M20004090, MEYS CR
(Research Centre LC06035) and institutional research plans Nos. AV0Z50040507 and
AV0Z50040702.
References
1. Dorcak V., Palecek E.: Electroanalysis 19, 2405 (2007).
2. Dorcak V., Palecek E.: Anal. Chem. 81, 1543 (2009).
3. Ostatna V., Dogan B., Uslu B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172
(2006).
4. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008).
5. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008).
6. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007).
7. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C. W., Jovin T. M.: Analyst 133, 76
(2008).
8. Scheller F., Janchen M., Prumke H.-J.: Biopolymers 14, 1553 (1975).
9. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Comm., 1685 (2009).
10. Palecek E., Ostatna V.: Analyst 134, 2076 (2009).
21
Single Crystal Silver Amalgam Electrodes for Voltammetric and
Amperometric Detection
Aleš Daňhel, Jana Tvrdíková, and Jiří Barek
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2,
Abstract
The single crystal silver amalgam electrode was used for voltammetric determinations of
4-nitrophenol using differential pulse voltammetry in batch analysis. The developed method is
applicable in the linear concentration range 1–100 μmol l-1 with LOD 2 μmol l-1 and RSD
lower than 3 %. The single crystal was also utilized for the construction of micro-cylindrical
detection flow cell. It was used for amperometric detection of nitrophenols in the mixture (2nitrophenol, 4-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, 2-methoxy-5-nitrophenol) after their separation
by HPLC at an RP-18 column. These measurements proved suitability of crystalline silver
amalgam for construction of voltammetric and amperometric detection cells.
Key Words: Silver amalgam, Flow cell, Amperometric detection, Electrochemical detector,
HPLC, Nitrophenols.
Introduction
The wide range of applications described in increasing number of scientific papers indicates
convenience of silver amalgam as a modern electrode material. Working electrodes prepared
from liquid, paste and/or solid silver amalgam are already used for voltammetric and
amperometric determinations of inorganic and organic substances.1,2 Crystallic silver
amalgam has been studied for its crystal morphology since 1930. Depending on amalgam
composition, the silver amalgam crystallizes in three crystal structures (phases): cubic (γ)
29–32.5 % Ag; hexagonal (β) 33–48 % Ag and face-centered cubic (α) >48 % Ag (w/w).3,4.
All these phases make needle like crystals. It is convenient to use them as new electrode
material for construction of micro-cylindrical electrodes. Ideally smooth electrode surface,
small proportions and potential of hydrogen overvoltage similar to mercury electrodes are its
main advantages. These attributes offer new range of possibilities and some of them are
described and discussed in this work.
Experimental
Silver powder (2–3.5 microns, 99.9+%, Aldrich, Germany) and three times distillated
polarographic mercury (99.999 %, Polarografie - Praha, Czech Rep.) were used for the
preparation of amalgam paste. 4-nitrophenol (4-NP, 98 % Aldrich, Germany) was used as a
standard substance for voltammetric measurements. N-Fenol MIX (NFM, Agra Group, Czech
Rep.) was used as a testing nitrophenol mixture for amperometric detection. It is a growth
stimulator composed from 2-nitrophenol (2-NP), 4-nitrophenol (4-NP), 2,4-dinitrophenol
(2,4-DNP) and 2-methoxy-5-nitrophenol (5-nitroguajakol, 5-NG). All acids, bases and salts
were p.a. purity and deionized water was produced by Milli-Q plus system (Millipore, USA).
Oxygen was removed from solution before measurements by nitrogen 4.0 (Linde, Czech
Rep.).
The crystals of silver amalgam were prepared by stepwise adding of total volume 300 μl (3 ×
100 μl) silver nitrate solution (0.5 mol l-1) to 25 ml baker containing 10 ml of deionized-water
covering a silver wire stacked into 1 g of silver amalgam paste (10 % Ag w/w). The amalgam
paste was prepared by 2 min mixing of exact weights of silver powder and metal mercury on
Vertex in Eppendorf tubes. The silver wire is not necessary to use but it is advisable because
22
it gets wet by mercury from the paste and it forms a new substrate for well shaped needle-like
crystals and than it is easier to pull up set of solid amalgam needles grown-up on its surface.
The amalgam paste becomes solid quite fast. After addition of first 100 μl of AgNO3 solution,
silver wire looses its sheen. Reduced silver saturates the amalgam paste untill the crystals of
amalgam start to grow. Therefore, it is better to use amalgam paste than pure mercury because
of higher consumption of AgNO3. Next addition of AgNO3 solution depends on growing of
crystals. The crystals have less surface defects when the growth is slow. Next 100 μl AgNO3
solution was not added earlier than two hours after the first and only in case when the crystals
do not grow. If they do, it is better to leave the crystals to grow over night and then if they are
short (less then 1 mm), just add next 100 μl of AgNO3 solution and to wait for a couple of
hours. Obtained needle-like crystals of silver amalgam are very fragile, so manipulation has to
be as careful as possible. It is advisable to use for example tissue or thin steel wire. Then, the
crystals were rinsed with 0.1 mol l-1 perchloric acid, to dissolve mercurous and mercuric salts
formed by the oxidation of metal mercury from amalgam paste during crystallization. Then
the crystals were washed with deionized water and finally left to dry on microscope slide. The
best defectless crystals were chosen for electrode construction using Digitus Digital USB
Microscope at 200 time magnification.
Well shaped single crystals without defects were used for the construction of single crystal
silver amalgam electrodes (CAgAE). The working electrodes used in batch arrangement were
made in 10 μL plastic pipette tip. Contact between the crystal and platinum wire was
mediated by silver amalgam paste (15 % Ag). Crystal sticks out from narrowed part of the tip
and it was isolated by film of polystyrene (~30 mg of polystyrene dissolved in 1 ml of
dichlorethane). This type of CAgAE was used for voltammetric determination of 4nitrophenol (4-NP) using Eco-Tribo Polarograph operated by software Polar Pro version 5.1
(Polaro-Sensors Praha, Czech Republic) in three electrode system where platinum wire
auxiliary electrode and an silverchloride reference electrode (3M) (both Monokrystaly
Turnov, Czech Republic) were used.
The micro-cylindrical flow cell applicable for amperometric detection was prepared in Teflon
tube (inside diameter 1 mm) commonly used in HPLC or FIA. The 5 cm long Teflon tube was
perforated in the middle in upright direction of its flow by Insulin syringe which has thin and
tough needle (outside diameter (o.d.) 0.2 mm). This perforation was made for working
electrode and it is enough for the crystals with frequent o.d. 50–100 μm. Selected silver
amalgam crystal (more than 2 mm long) was laced through the tube and on the one side
isolated by the film of polystyrene as it was used above. The platinum wire (o.d. 0.1 mm) was
contacted with the crystal on the other side and also isolated by polystyrene film. 2 mm below
(in flow direction), second perforation was done by the same Insuline syringe in the exact
parallel direction as the first one. Platinum wire (o.d. 0.1 mm) was laced through and it was
used as auxiliary electrode. Siloverchloride reference electrode (used in voltammetric
detection) was immersed together with the outlet side of the micro-cylindrical detection flow
cell into a mobile phase inside of the overflow glass vessel.
HPLC system was composed from Organiser, Pump (L-2130), Column Owen (L-2300) and
Diode-Array Detector (DAD, L-2450, all Merck Hitachi, USA) and Electrochemical Detector
(ED, Bioanalytical Systems, USA) connected to Analog Input Device (EZC/L-2000, Hitachi,
USA). HPLC system was operated by software EZChrome Elite (Agilent, USA). HPLC
column RP-18 Endcap. (5 μm) (LiChroCART 125-4, LiChrospher 100, No. 214551, Merck,
Germany) was used for separation of nitrophenol mixture.
23
Mobile phase consisted from the mixture of 0.2M acetate buffer pH 4.8 and methanol (40:60
V/V) and it was degassed 15 min in ultrasonic bath (PSO2000A, Notus-Powersonic,
Slovakia) and bubbled by nitrogen 10 min before and during all chromatographic
measurements. 20 μl of 100 times diluted N-Fenol MIX was injected using manual loop
injector (Rheodyne, USA) and separated at RP-HPLC column (at ambient temperature) using
flow rate 1.5 ml min-1. Chromatogram obtained by DAD was registered at wavelength
234 nm. Applied potential on working electrode of micro-cylindrical flow cell was set at -1.20
V (vs. silverchloride reference electrode).
Results and Discussion
The developed CAgAE can be used without any previous pretreatment (polishing,
amalgamation or activation) required by silver solid amalgam electrodes (AgSAE). It is
sufficient to wash the electrode by repeated immersion into the deionized water or into the
mixture of methanol and water (e.g. 50:50 V/V) before starting measurements. It is also
advisable not to evaluate a couple of first curves. The electrode needs to be “settled in” the
examined solution.
The hydrogen overvoltage determining available potential window of the CAgAE was
determined by direct current voltammetry in aqueous solutions of 0.1M HClO4, 0.01M HCl,
0.2M acetate buffer pH 4.8, 0.05M Na2B4O7 pH 9.2, and 0.01M NaOH. The potentials of
hydrogen overvoltage at CAgAE corresponding to cathodic current -1.0 μA were comparable
with values obtained at a hanging mercury drop electrode (HMDE). Electrochemically easily
reducible 4-NP was used as a testing compound for voltammetric application of the CAgAE.
Analytical method for voltammetric determination of 4-NP in 0.2M acetate buffer pH 4.8 was
developed using differential pulse voltammetry. The obtained calibration curve is linear in the
concentration range 1–100 μmol l-1 with a limit of detection 2 μmol l-1 (S/N= 3) and RSD
lower than 3 %. Sensitivity of the CAgAE is comparable with AgSAE, but it will be probably
possible to reach lower limits of detection by eliminating the crystal surface defections. The
preparation of ideal crystals is still to be improved. However, high repeatability of the
measurements and linearity of the calibration curves in the whole tested concentration range
are obvious advantages of the CAgAE. According to our opinion it is due to smooth electrode
surface where the products of electrochemical reaction are not adsorbed and they do not
passivate electrode surface.
The nitrophenol mixture composed from 2-nitrophenol (2-NP), 4-nitrophenol (4-NP), 2,4dinitrophenol (2,4-DNP) and 2-methoxy-5-nitrophenol (5-nitroguajakol, 5-NG) was already
amalysed by HPLC-ED in thin-layer and wall-jet arrangement utilizing polished AgSAE.5
The information obtained from the paper were used and modified for confirmation of
applicability of the developed micro-cylindrical flow cell using the single-crystal silver
amalgam working electrode. Chromatogram of the nitrophenol mixture registered by
amperometric detector using micro-cylindrical flow cell has relatively stable background
current with low level of back ground noise (see solid line in Fig. 1). The chromatogram
obtained from DAD is for comparison also attached (dashed line in Fig. 1). The retention
times of nitrophenols´ peaks at ED are about 3 s higher because ED is positioned after DAD.
Even if DAD provides more stabile signal it is obvious that the first results obtained by the
newly developed micro-cylindrical flow cell provide promising results for further research.
The biggest disadvantage of the crystallic amalgam is its fragility and time consuming
crystallization. However, the first results indicate its higher sensitivity and signal stability.
24
4-NP
-200
2-NP
2,4-DNP
I, nA
-100
5-NG
0
A, mAU
100
200
300
0
3
6
9
12
15
t, min
Fig. 1. Chromatograms of 20 μl N-Fenol MIX stock solution (100x diluted) obtained by:
DAD λ= 234 nm (---) and ED using micro-cylindrical CAgAE Ein = -1.2 V (___); mobile
phase 0.2M acetate buffer pH 4.8 - MeOH (40:60, V/V), flow rate 1.5 ml min-1, column RP18 Endcapped (125 × 4 mm, 5 μm).
Conclusion
It was proved that the single crystal silver amalgam electrode and micro-cylindrical detection
flow cell are applicable for voltammetric and amperometric determination of the
electrochemically reducible organic compounds. Further applications of this non-traditional
electrode material for constructions of new detection cells in micro-scale batch analysis and
micro-cylindrical or thin-layer flow cells applicable in flow systems (HPLC and FIA) are
under study in our laboratory.
Acknowledgment
Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic
(LC 06035, RP 14/63 and MSM 0021620857), Grant Agency of the Czech Republic (project
P206/10/P087) and Grant Agency of Charles University (SVV 261204 and 89710/2010/BCh/PrF) is gratefully acknowledged.
References
2. Yosypchuk B., Navratil T., Barek J., Peckova K., Fischer J.: Amalgam Electrodes as
Sensors in the Analysis of Aquatic System. Progress on Drinking Water Research
(Lefebvre M. H., Roux M. M., Eds.), p. 143, Nova Science Publishers, New York 2008.
3. Nirmala K.A., Gowda D.S.S.: J. Appl. Cryst. 8, 6 (1975).
4. Zakrzewski M.A., Burke E.A.J.: Mineral. Mag. 51, 360 (1987).
5. Danhel A., Shiu K.K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis
21, 303 (2009).
25
Electrochemical Determination of Propyl Gallate on Carbon Paste Electrode
Hana Dejmková, Marie Vysoká, Jaroslava Zavázalová, Jiří Zima, and Jiří Barek
Abstract
Two methods for the determination of propyl gallate, a controversial artificial antioxidant, are
developed, based on differential pulse voltammetry (DPV) and HPLC with electrochemical
detection (HPLC-ED), employing carbon paste electrode as the working electrode. Optimum
conditions for the determination were found. For the DPV measurement, the supporting
electrolyte consisted of 20% methanol (v/v) and B-R buffer pH 5. HPLC measurement was
performed on C18 column, mobile phase consisted of phosphate buffer pH 4 and methanol
(50 %, v/v) and detection potential was +0.8 V. The applicability of the methods was tested
on the sample of vegetable oil.
Key Words: Propyl gallate, Carbon paste electrode, HPLC-ED, Differential pulse
voltammetry, Antioxidant.
Introduction
Propyl gallate (PG) is an artificial antioxidant with structure derived from naturally occurring
gallic acid. It is used as an additive to fat-containing food, to prevent its autooxidation. This
application is legal, provided that the concentration is under regulation limits 1. In spite of
that, this compound is often considered dangerous, as it is a proven sensitizer 2 and some
studies suggested its mutagenicity 3. On the other hand, several studies show its anticarcinogenic effect 4.
The determination of PG is often based on flow methods, mainly reversed-phase HPLC 5-7,
flow injection analysis 8 and capillary electrophoresis 9. Spectrometric detection, including
mass spectrometry 5, is often used. Nevertheless, easy oxidizability makes PG a convenient
substance for the determination based on the electrochemical methods, both for the
amperometric detection in flow systems 7-9 and for the batch voltammetric measurements 10,11.
The most frequently employed electrode material is glassy carbon 11 and other carbon-based
materials 8, recently also boron-doped diamond electrode 10.
The aim of this work was the development of a new method for the determination of PG using
differential pulse voltammetry and HPLC with amperometric detection on carbon paste
electrode. The method is compared to the common HPLC determination with UV
spectrophotometric detection and applied for the determination of PG in vegetable oil.
Experimental
Apparatus
Differential pulse voltammetry (DPV) measurements were carried out using Eco-TriboPolarograph, controlled by software Polar Pro 5.1 (both PolaroSensors, Prague, Czech
Republic). Three-electrode arrangement was used with carbon paste working electrode,
platinum auxiliary electrode and Ag/AgCl (3 M KCl) reference electrode RAE 113
(Monokrystaly Turnov, Czech Republic), to which all the potential values are referred.
Chromatographic measurements with UV-spectrophotometric (HPLC-UV) and amperometric
(HPLC-ED) detection were performed on the system consisting of HPP 5001 pump, LCD
26
2083 spectrophotometric detector and ADLC 2 amperometric detector (all Laboratorní
přístroje, Prague, Czech Republic) with column LiChroCart 125-4, Superspher 100 RP-18.
Reagents
The stock solution (c = 1⋅10-3 mol⋅L-1) of propyl gallate (PG, Sigma-Aldrich) was prepared by
dissolving the exact amount of each substance in methanol. Britton-Robinson (B-R) buffer
and methanol (p.a., Lach-Ner, Neratovice, Czech Republic) served for the preparation of the
supporting electrolyte for DPV and 0.01M phosphate buffer and methanol (for HPLC, Merck)
served for the preparation of the mobile phase for HPLC. All chemicals used for buffer
preparation were of analytical grade purity and obtained from Lachema Brno, Czech
Republic. Deionized water (Millipore) was used throughout. Working carbon paste electrode
(CPE) was prepared by mixing 250 mg of glassy carbon microparticles (Alfa Aesar,
Germany) and 100 μL of mineral oil (Fluka). Vegetable oil (Lukana, Czech Republic) was
employed as the real sample.
Procedures
Differential pulse voltammograms were measured using the following parameters: scan rate
20 mV s–1, pulse amplitude 50 mV and pulse duration 100 ms. Electrode surface was renewed
for each DPV measurement by wiping with wet filtration paper.
Samples for chromatographic measurements were prepared by exact dilution of the stock
solutions to contain the required concentration of the analyte in 50% methanol (v/v in water).
The injected volume was 20 μL. The detection wavelength of 216 nm for the
spectrophotometric detection was selected from the UV spectra of the analyte. 1 mL⋅min-1
mobile phase flow rate was used throughout the measurements.
Calibration dependences were evaluated by least squares linear regression method. The
detection limits were calculated as the concentration of the analyte which gave a signal three
times the standard deviation of the lowest evaluable concentration.
PG from the model and real samples was extracted to methanol using method adapted from 7:
1.0 g of the oil sample was sonicated with 4.5 ml of methanol for 15 min. After separation of
both fractions by centrifugation, PG content in the methanolic fraction was determined by the
previously developed methods.
Method for batch measurement was developed using differential pulse voltammetry.
Optimization of the supporting electrolyte composition was carried out, concerning the pH of
B-R buffer, which represented the aqueous part of the solution. Besides, the supporting
electrolyte contained 20 % of methanol to ensure sufficient solubility of the analyte. PG gives
two peaks in the whole pH range, but the second peak is small and analytically unimportant.
The highest peak was obtained for pH 5 and therefore, this value was chosen for further
measurements.
Mobile phase containing 50 % (v/v) of methanol was selected for the chromatographic
determination of PG to ensure sufficient separation of the analyte peak from the eventual
peaks eluting near the dead time. Mobile phase pH and the detection potential were optimized
according to the demands of electrochemical detection. Hydrodynamic voltammograms were
measured in the media containing phosphate buffer of pH 2.5, 4 and 6 as the aqueous part.
27
Resulting curves show maximal response of the electrode for buffer pH 4 and detection
potential + 0.8 V.
100
I (nA)
90
80
70
60
50
40
0.2
0.3
0.4
0.5
E (V)
0.6
Fig. 1. DP voltammograms of the lowest detectable concentration range of PG (concentrations
200; 400; 600; 800; 1000 nmol L–1) in B-R buffer pH 5 (20 % methanol, v/v).
Concentration dependences were measured in the concentration range from 1·10–4 mol L–1 to
1·10–7 mol L–1 using both voltammetric and chromatographic methods. Their parameters are
summarized in Table I. The dependences are linear within the whole studied range, with
correlation coefficients between 0.9971 and 0.9992. Limits of determination are similar for
both techniques based on electrochemistry, reaching values 2.4⋅10–7 mol L–1 for DPV (Fig.1)
and 2.4⋅10–7 mol L–1 for HPLC-ED. HPLC-UV determination is less sensitive, its limit of
determination is 6.0⋅10–7 mol L–1.
30
I (nA)
25
20
IP (nA)
20
3
15
10
2
5
15
0
0.0
0.5
1.0
-1
c (mmol L )
1
10
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
t (min)
Fig. 2. Chromatograms of the PG extracted from vegetable oil sample (1), with addition of 0.5
μmol L–1 PG (2) and 1.0 μmol L–1 PG (3). Column LiChroCart 125-4, Superspher 100 RP-18,
mobile phase 50 % (v/v) methanol and phosphate buffer pH 4, EDET = +0.8 V.
PG from the real samples of edible oil was extracted with methanol. To test the efficiency of
the extraction step, model samples of PG in oil were prepared in concentrations 5; 10; 50 and
100 mg kg–1, extracted and determined using DPV. The recovery was from 95 % to 98 %,
proving, that he efficiency is sufficient. Final step of the study was the determination of the
PG content in the real sample of edible oil by the standard addition method (Fig 2). HPLCUV was not sensitive enough for the determination. DPV has shown the content to
3.20 ± 0.31 mg kg–1 (n = 3) and HPLC-ED 3.29 ± 0.11 mg kg–1 (n = 3). The values obtained
by the two methods are in a good agreement and well below the PG regulation limit of
200 mg kg–1.
28
Table I.
Parameters of the concentration dependences and the PG content in the real sample found by
DPV, HPLC-UV and HPLC-ED.
Method
Concentration
Correlation
Determination PG concentration
range,
coefficient
limit,
in oil sample,
–1
–1
mol L
mol L
mg kg–1
0.9992
3.20 ± 0.31
DPV
2.4⋅10–7
1⋅10–7 – 1⋅10–4
–7
–4
–7
0.9971
--- a
HPLC-UV
6.0⋅10
6⋅10 – 1⋅10
–7
–4
–7
0.9973
3.29 ± 0.11
HPLC-ED
1⋅10 – 1⋅10
2.6⋅10
a
below the determination limit
Conclusion
Two methods for the determination of PG on CPE were developed, based on differential pulse
voltammetry (DPV) and HPLC with electrochemical detection (HPLC-ED). For the DPV
measurements, the selected composition of the supporting electrolyte is 20% methanol (v/v)
and B-R buffer pH 5. Limit of determination using this method is 2.6⋅10–7 mol L–1. HPLC
measurement was performed on C18 column, with mobile phase consisting of phosphate
buffer pH 4 and methanol (50 %, v/v). The detection potential was +0.8 V. Limit of
determination reached value 2.4⋅10–7 mol L–1, similarly to the DPV method and
approximately twice lower in comparison with HPLC-UV. The applicability of the methods
was tested on the determination of PG in the real samples of edible oil after extraction to
methanol. The content of PG was found to be 3.20 ± 0.31 mg kg–1 by DPV and
3.29 ± 0.11 mg kg–1 by HPLC-ED.
Acknowledgement
Financial support of the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects No. MSM
0021620857, RP14/63 and LC06035) and of the Grant Agency of the Charles University in
Prague (project No. SVV 261204) is gratefully acknowledged. HD and JZ also thank for the
support of the Grant Agency of the Charles University in Prague (project No. 92010/2010/B)
References
1. Commission Directive 96/77/EC laying down specific purity criteria on food additives
other
than
colours
and
sweeteners
(OJ
L339,
p1,
30/12/1996).
http://www.fsai.ie/uploadedFiles/Commission_Directive_96_77_EC.pdf.
2. WHO; Environ Health Criteria Number 32: Toxicological Evaluation of Certain Food
Additives and Contaminants. p. 11 (1993).
3. Gulati D. K., Witt K., Anderson B., Zeiger E., Shelby M. D.: Environ. Mol. Mutagen. 13,
133 (1989).
4. Han Y. H., Park W. H.: Food Chem. Toxicol. 47, 2531 (2009).
5. Li X., Ji C., Sun Y., Yang M., Chu X.: Food Chem. 113, 602 (2009).
6. Saad B., Sing Y. Y., Nawi M. A., Hashim N., Ali A. S. M., Saleh M. I., Sulaiman S. F.,
Talib K. M., Ahmad K.: Food Chem. 110, 389 (2007).
7. Ruiz M. A., Garcia-Moreno E., Barbas C., Pingarron J. M..: Electroanalysis 11, 470 (1999).
8. Luque M., Rios A., Valcarcel M.: Anal. Chim. Acta 395, 217 (1999).
9. Wang J.Y., Zhang D. L., Chu Q. C., Ye J. N.: Chinese J. Chem. 28, 313 (2010).
10. Radovan C., Cinghita D., Manea F., Mincea M., Cofan C., Ostafe V.: Sensors 8, 4330
(2008).
11. Szymula M., Narkiewicz-Michalek J.: J. Appl. Electrochem. 36, 455 (2006).
29
Determination of 5-Nitrobenzimidazole using HMDE and AgSE in the Presence of
Surfactants
Dana Deýlová and Jiří Barek
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, Prague 2,
128 43 Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Optimal conditions were found for the determination of 5-nitrobenzimidazole by differential
pulse voltammetry on hanging mercury drop electrode and polished silver solid amalgam
electrode using surfactants Tritone X-100, cetyltrimethylamonium bromide and sodium
dodecylsulphate in the concentration range 1×10-4 to 1×10-7 mol/l as signal enhancers.
Key Words: 5-Nitrobenzimidazole, Tritone X-100, Cetyltrimethylamonium bromide, Sodium
dodecylsulphate, Differential pulse voltammetry, Hanging mercury drop electrode, Polished
silver solid amalgam electrode.
Introduction
5-nitrobenzimidazole (5-NBIA) is genotoxic substance and belongs to the nitrated
heterocyclic compounds. The occurrence of 5-NBIA in environment is expected in connection
with chemical processes during fossil fuels combustion 1. 5-NBIA was polarographically
determined as a part of photographic processing solutions in the seventies of the last century 2
and its properties have been studied in the area of metal corrosion protection 3. 5-NBIA is
known as proven carcinogen and mutagen 4.
The purpose of this work was to investigate how the presence of surfactants influence
electroanalytical response of 5-NBIA on hanging mercury drop electrode (HMDE) and
polished silver solid amalgam electrode (p-AgSAE).
Surfactants are surface active substances with bipolar chemical structure, which divides
according to the character of hydrophilic group to the ionic or non-ionic. According to the
ionic character of the molecules dissolved in water are ionic surfactants named anionactive,
cationactive and ampholytic. Anionactive ions have negative charge in aqueous solution,
cationactive have positive charge and the charge of ampholitic depends on the pH of the
solution. Non-ionic surfactants don’t have a charge in the molecule and their solubility in
water is given by the presence of hydrophilic group.
Good solubility, high conductivity, low toxicity and good chemical and electroanalytical
stability make this substance an advantageous variant for many applications. In analytical
chemistry, the presence of surfactants influences parameters of measurement, which often
leads to the design of new procedures and methods for the determination. Traditional
application of the surfactants in electrochemistry is the suppression of maxima on
polarographic curves 5. They may change the shape of the polarographic wave and the
reversibility of the electrode reaction. The character of changes depends on the structure and
concentration of the surfactant. By suitable choice, the limiting diffusion current might be
increased, although under some circumstances, the decrease may also occur.
For this work, three surfactants were selected: cationactive cetyltrimethylammonium bromide
(CTMAB) (Fig.1), non-ionic Tritone X-100 (Fig. 2) and anionactive sodium dodecylsulphate
(SDS) (Fig.3).
30
These surfactants might be used as modifiers for a variety of paste electrodes
electroanylytical sensors 7.
6
and
H3C H3C
H3C H3C
CH3
HO
O
O
9
Fig. 1. Structural formula of Tritone X-100.
CH3
+ CH3
Br
N
H3C
CH3
Fig. 2. Structural formula of cetyltrimethylammonium bromide.
O
H3C
O
S
-
O Na
+
O
Fig 3. Structural formula of sodium dodecylsulphate.
Exprimental
Reagents
5-NBIA (98%, CAS Name: 5-nitrobenzimidazole, CAS Registry number: 94-52-0) was
supplied by Sigma Aldrich in the form of nitrate. A 1×10-3 mol/l stock solution was prepared
by dissolving an exactly weighed amount of the substance in water. Diluted solutions were
prepared by exact dilution of the stock solution. The solutions were stored in refrigerator. The
dilute solutions were prepared every day.
The Britton-Robinson (BR) buffer solutions were prepared in a usual way by mixing a 0.04
mol/l solution of phosphoric acid, acetic acid and boric acid with an appropriate amount of
0.2 mol/l sodium hydroxide, using analytical-reagent grade chemicals obtained from Merck.
Deionized water was produced by Milli-Qplus system, Millipore.
Apparatus
Voltammetric measurements were carried out using Eco-Tribo Polarograph driven by Polar
Pro 2 software (all Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The software worked under the
operational system Microsoft Windows 98 Plus (Microsoft Corporation). All measurements
were carried out in a three-electrode system using platinum electrode PPE (Monokrystaly,
Turnov, Czech Republic) as an auxiliary electrode and silver/silver chloride electrode RAE
113 (3 mol/l KCl, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) as a reference electrode. As a
working electrode, polished silver solid amalgam electrode p-AgSAE and pen type hanging
mercury drop electrode HMDE (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) were used. The
valve opening time for HMDE was 100 ms, the mercury drop surface was 0.0137 cm2. For
DPV on both electrodes scan rate 20 mV/s, pulse amplitude -50 mV and pulse width 100 ms
were used.
Procedures
For voltammetric measurements, an appropriate amount of 5-NBIA stock solution was
measured into a polarographic vessel and filled up to 10 ml with BR buffer of appropriate pH.
31
Oxygen was removed from the measured solutions by bubbling with nitrogen for five
minutes. All curves were measured 3 times.
At the beginning, p-AgSAE was polished on the alumina with particle size 1.1 μm. Before
starting the work, as well as in the case of electrode passivation, the electrochemical
activation of electrodes was carried out in 0.2 M KCl at -2200 mV under stirring of the
solution for 300 seconds followed by rinsing with distilled water. The regeneration was
carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials -100 mV and -900 mV
during 30 seconds. Regeneration always ended at a more negative potential.
The parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept, limit of determination) were
calculated using statistic software Adstat which uses confidence bands (α = 0.05) for
calculation of the limit of determination (LQ). It corresponds to the lowest signal for what
relative standard deviation is equal 0.1 8.
As the optimal pH for measurement, pH 4 was selected for HMDE and pH 8 for p-AgSAE.
The next step was to find out, if surfactants have an influence on the peak of 5-NBIA (Fig 4.
and Fig. 5.). On both electrodes, the decrease of the signal with addition of SDS and Tritone
X-100 was observed. Different behavior has only CTMAB on p-AgSAE, where the signal is
increasing. Therefore, this combination was selected for further measurements. As the optimal
concentration of CTMAB for the measurement of calibration curves on p-AgSAE,
c = 1×10-4 mol/l was chosen. Calibration curves were measured in the concentration range of
5-NBIA from 1×10-4 to 2×10-7 mol/l with and without addition CTMAB (c = 1×10-4 mol/l)
(Fig. 6.). In Fig. 6 we can see that peaks with surfactant are twice higher then peaks without
surfactant. This trend is seen in whole concentration range. Parameters of calibration curves
are summarized in Table I. From the Table I, high linearity in whole concentration range is
obvious, as well as a decrease of the limit of detection of 5-NBIA in presence of CTMAB and
higher slope of calibration dependences.
-300
Ip (nA)
-250
SDS
Triton X-100
-200
CTMAB
-150
-100
-50
0
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
c surfactant (mol/l)
Fig. 4. Relationship between the peak height of 5-NBIA (c = 1×10-5 mol/l) on HMDE in BRbuffer pH 4 and the surfactant concentration.
32
-1000
CTMAB
Ip (nA)
SDS
-800
TRITON X-100
-600
-400
-200
0
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
csur facta nt (mol/l)
Fig. 5. Relationship between the peak height of 5-NBIA (c = 1×10-5 mol/l) on p-AgSAE in
BR-buffer pH 8 and surfactant concentration.
-1200
-900
I (nA)
Ip (nA)
-1000
-600
-300
-800
0
0
-600
5
c5-NB IA ( mol/l)
10
-400
-200
0
-400
-500
-600
-700
-800
-900
E (mV)
-1000
-6
Fig. 6. Calibration curves of DPV determination of 5-NBIA (c = (2-10)×10 mol/l) with
CTMAB (1×10-4 mol/l) (―) and without CTMAB (-----) in BR-buffer pH 8 on p-AgSAE
(dotted line is the basic electrolyte).
Conclusion
Results from this measurements are, that the addition of surfactants doesn’t influence the
determination of 5-NBIA at HMDE and at p-AgSAE, only CTMAB have influence. Under
the selected conditions, the 5-NBIA detection limit obtained using on p-AgSAE decreased by
adding CTMAB in comparison to the measurement of pure 5-NBIA with keeping good
accuracy.
33
Table I.
Parameters of the determination of the calibration dependences for DPV of 5-NBIA with
CTMAB and without CTMAB in BR-buffer pH 8 on p-AgSAE.
c 5-NBIA
c CTMAB
Slope
Intercept
LQ
Electrode
R
(mol/l)
(mol/l)
(mol/l)
(nA·mol/l)
(nA)
-280.5
0.9992
1×10-4
-7.87×108
(2-10) ×10-5
8
0
132.6
0.9971
-2.60×10
-4
8
-22.6
0.9964
1×10
-7.91×10
p-AgSAE (2-10) ×10-6
0
3.1
0.9981
-2.09×108
-4
8
2.9
0.9953
1×10
-1.62×10
2.5×10-7
(2-10) ×10-7
0
5.9
0.9969
-4.18×107
4.3×10-7
Acknowledgement
This research was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (MSM 0021620857, LC 06035, and RP 14/63) and by the Grant Agency of Charles
University (SVV 261204).
References
1. Barek J., Cvacka J., Muck A., Quaiserova V., Zima J.: Electroanalysis 13, 779 (2001).
2. Canterford D. R.: J. Photogr. Sci. 26, 65 (1978).
3. Popova A., Christov M., Raicheva S., Sokolova E.: Corros. Sci. 46, 1333 (2004).
4. Rosenkranz H. S., Karol M. H.: Mutat. Res. 431 81 (1999).
5. Zýka J.: Nové směry v analytické chemii, Vol. III. SNTL, Praha 1988.
6. Manjunatha J.G., Kumara Swamy B.E., Deepa R., Krishna V., Mamatha G.P., Chandra
U., Shankat S.S., Sherigara B.S.: Int. J. Electrochem. Sci. 4, 662 (2009).
7. Wei D., Ivaska A.: Anal. Chim. Acta 607, 126 (2008).
8. Meloun M., Militký J., Forina M.: Chemometrics for Analytical Chemistry, PC-Aided
Regression and Related Methods, Vol. 2, p. 1-175. Ellis Horwood, Chichester 1994.
34
Voltammetric Determination of Selected Pesticides at a Meniscus Modified Silver Solid
Amalgam Electrode
a
a
Jan Fischer , Aleš Daňhel , Kwok Keung Shiu b, Jiří Barek a, and Joseph Wang c
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, UNESCO Laboratory of Environmental
Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Praha 2, Czech Republic,
Email: [email protected]
b
Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University, Waterloo
Road, Kowloon, Hong Kong
c
Laboratory for Nanobioelectronics, Departments of Nanoengineering, University California
San Diego (UCSD), La Jolla, CA 92093-0448
Abstract
Voltammetric determinations of dinitroaniline based pesticides Benfluralin, Butralin,
Dinitramine, Fluchloralin, and Trifluralin were developed using differential pulse
voltammetry (DPV), and square wave voltammetry (SWV) at a meniscus modified silver
solid amalgam electrode (m-AgSAE). Optimal conditions were found for their determination
in the concentration range 1.10-4 – 1.10-6 mol.l-1 of each pesticide in mixture of BrittonRobinson buffer and methanol in ratio 1:1. The applicability of the newly developed methods
was verified by direct determination of testyed pesticides in ground water matrix.
Key Words: Benfluralin, Butralin, Dinitramine, Fluchloralin, Trifluralin, Pesticides,
Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode, Differential Pulse Voltammetry, Square
Wave Voltammetry.
Introduction
The aromatic nitro compounds play a significant role in organic electrochemistry due their
easy reducibility. From the practical point of view they also play an important role because
some nitro compounds are active components of formulations for the protection of plants.
One of widely used groups of nitrocompounds are dinitroanilines. This structural group of
compounds shows quite sensitive response on dropping mercury electrode (DME) or static
mercury drop electrode (SMDE) 1 due two electrochemical active nitro groups on aromatic
ring. However, because of fears of liquid mercury toxicity, there is a tendency to substitute
mercury with other non-toxic materials 2. For that reason, non-toxic dental amalgam based
electrode was selected as an alternative for this research. Practically non-toxic mercury
meniscus-modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE), which has a good mechanical
stability and a simple handling can substitute classical liquid mercury electrodes 3. Therefore,
we selected group of five pesticides of dinitroaniline type (Benfluralin, Butralin, Dinitramine,
Fluchloralin, Trifluralin) for confirmation of applicability of m-AgSAE for this type of
substances.
Experimental
All reagents were of analytical grade. Stock solutions of 1 mmol.l-1 Benfluralin (99.7%,
CAS#: 1861-40-1), Butralin (99.8%, CAS#: 33629-47-9), Dinitramine (98.3%, CAS#: 2909105-2), Fluchloralin (97.1%, CAS#: 33245-39-5), Trifluralin (99.2%, CAS#: 1582-09-8) (all
form Fluka, Germany) were in methanol (TEDIA, USA). Britton–Robinson buffer from 0,04
mol.l-1 boric acid (Sigma-Aldrich, Japan), phosphoric acid (Merck, Germany), and acetic acid
(Lab-Scan Asia, Thailand) mixed with sodium hydroxide (Advanced Technology &
Industrial, Hong Kong), all in re-distillated water, was used as a supporting electrolyte.
Voltammetric experiments were performed using computer controlled Electrochemical
Workstation CHI 6300 (CH Instrument, Texas). DPV was carried out at a scan rate of
35
20 mV.s-1, pulse amplitude of –50 mV, pulse duration of 100 ms, sampling time of 20 ms
beginning 80 ms after the onset of the pulse and interval between pulses of 100 ms. Pulse
amplitude 25 mV, and frequency 500 Hz were used for SWV. The reference electrode was
Ag / AgCl / 3 mol.l-1 KCl type CHI 111 (CH Instrument, Texas). The working electrode was
meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) with diameter of amalgam
disk of 0.5 mm. Before starting experiments, and for each new meniscus of m-AgSAE the
electrochemical activation was carried out in 0.2 mol.L-1 KCl (Advanced Technology &
Industrial, Hong Kong) at –2200 mV under stirring of the solution for 300 s followed by
rinsing with distilled water.
Oxygen was removed from measured solutions by nitrogen from NITROX UHP nitrogen
generator UHPN0751 (Domnick Hunter, England). Solutions for batch measurements were
bubbled for 5 min.
In the first part of research, the content of organic solvent necessary for measurement down to
submilimolar concentration level of pesticides was optimized. The highest electrode response
was obtained in the mixture of Britton - Robinson buffer and methanol in ratio 1:1 (Fig. 1).
Further, pH of Britton - Robinson buffer for quantitative determination of each tested
pesticide was optimized. Effect of pH on DP and SW voltammetric signal was explored in the
range of pH 2 to 12 (for Trifluralin see in Fig.2). For further measurements pH 6 was used
where all substance gave well developed peaks for the both voltammetric techniques.
Afterwardes, repeatability of measurements at m-AgSAE was checked. For all substances at
optimal conditions repeatability was on acceptable level (for Trifluralin see in Fig. 3). It was
not necessary to use regeneration of electrode surface.
Found optimal conditions were used for measuring calibration dependences in the
concentration range from 1.10-4 to 2.10-6 mol.l-1 with both techniques and for all of pesticide
substances. Parameters are summarized in Table I. According to obtained results, DPV seems
to be slightly more sensitive and more linear then SWV, but SWV is not sensitive to the
presence of oxygen in measured solutiond and measurement time is much shorter. Therefore,
SVW method is probably more rewarding for fast screening analysis and DPV for exact
pollutants determination. Newly developed methods were applied for the determinations of
these organic pollutants in the concentration range from 1.10-5 to 2.10-6 mol.l-1 in model
environmental samples of ground water. The results show similar sensitivity in this matrix as
for previous measurements in Britton-Robinson buffer thus confirming the applicability of the
newly developed methods.
36
A
12
11
10
9
8
I
7
6
5
4
3
2
I
100 nA
-400
B
12
11
10
9
8
7
6
5 500 nA
4
3
2
-800
-1200
E, mV
-400
-800
E, mV
Fig. 1. DP voltammograms (A) and SW voltammograms (B) on m-AgSAE of 0.1 mmol.l-1
Trifluralin in Britton – Robinson buffer pH 6 – methanol (1:1). Numbers correspond to given
pH, dot-lines are for voltammograms of supporting electrolyte.
-100
Ip, nA
A
100
-750
1
2
I, nA
-50
750
B
1
2
Ip, nA
375
-I, nA
0
0
25
0
50
N
25
50
N
-375
50
0
0
-400
-600
0
-800 -1000
E, mV
-400
-600
-800 -1000
E, mV
Fig. 2 DP voltammograms (A) and SW voltammograms (B) on m-AgSAE of repetitive
measurements of 0.1 mmol.l-1 Trifluralin in Britton – Robinson buffer pH 6 – methanol (1:1).
1st, 2nd, 3rd and 48th curve shown as solid lines, from 4th to 47th curve as doted lines. Inset the
dependence of first (1) and second (2) peak current on the number of measurements N.
37
A
I, nA
-12
6
5
0
5
4
3
I, nA
200
0
5
10
-6
-1
c, 10 mol.l
2
1
6
5
4
3
2
100
E, mV
-900
0
2p
0
5
10
-6
-1
c, 10 mol.l
1
1
-700
1p
Ip, nA
40
3
2
-500
80
B
2p
-5
6
4
-6
1p
-10
Ip, nA
-500
-700
-900
E, mV
Fig. 3 DP voltammograms (A) and SW voltammograms (B) on m-AgSAE of 0 (1), 2 (2), 4
(3), 6 (4), 8(5), 10 µmol.l-1 (6) Trifluralin in Britton – Robinson buffer pH 6 – methanol (1:1).
Inset the calibration dependence of first (1p) and second (2p) peak current on the
concentration of Trifluralin.
Table I.
Parameters of calibration straight lines for the determination of dinitroaniline pesticides using
DPV and SWV at m-AgSAE in Britton – Robinson buffer pH 6 – methanol (1:1).
DPV
SWV
Concentration
Interc.
Slope
Interc. R
LQ
Slope
R
LQ
range
µmol l-1
Benfluralin
1. peak 20 – 100
2. peak 20 – 100
1. peak 2 – 10
2. peak 2 – 10
Butralin
1. peak 20 – 100
2. peak 20 – 100
1. peak 2 – 10
2. peak 2 – 10
Dinitramine
1. peak 20 – 100
1. peak 2 – 10
Fluchloralin
1. peak 20 – 100
2. peak 20 – 100
1. peak 2 – 10
2. peak 2 – 10
Trifluralin
1. peak 20 – 100
2. peak 20 – 100
1. peak 2 – 10
2. peak 2 – 10
nA mmol-1 l
µmol l-1
nA
µA mmol-1 l
µmol l-1
nA
–878 –2.4 –0.9991
–872 –1.4 –0.9995
–883 0.6 –0.9979
–988 1.2 –0.9995
––
––
4.1
2.9
–6.42 -105 –0.9921 ––
–4.19 -86 –0.9903 ––
–10.97
-1 –0.9990 2.2
–8.08
0 –0.9978 3.5
–969 –5.7 –0.9985
–1046 –4.4 –0.9992
–1185 –0.1 –0.9995
–1205 0.0 –0.9999
––
––
1.7
0.7
–9.02 -188 –0.9889 ––
–6.42 -140 –0.9842 ––
–17.09 12 –0.9964 5.3
–13.56 20 –0.9941 7.2
–875 –2.3 –0.9997
–1059 1.3 –0.9998
––
2.1
–5.64
–10.05
–1001 0.8 –0.9998
–847 –3.9 –0.9995
–1040 0.6 –0.9997
–1053 0.0 –0.9996
––
––
1.8
1.4
–6.16
–3.18
–9.51
–5.31
–1012 –1.0 –0.9987
–899 0.3 –0.9995
–1088 –0.5 –0.9971
–886 0.3 –0.9970
––
––
1.6
4.4
–5.76 -119 –0.9865 ––
–3.95 -38 –0.9919 ––
–7.50
-7 –0.9982 2.3
–3.98
-2 –0.9912 6.6
38
-96 –0.9957 ––
-19 –0.9926 4.5
-93
-73
-16
-21
–0.9968
–0.9944
–0.9900
–0.9775
––
––
5.8
7.4
Conclusions
The m-AgSAE showed good electrochemical response towards dinitroaniline pesticides with
good reproducible results without any surface passivation. This indicated that m-AgSAE is a
suitable sensor for the determination of micromolar concentrations of these substances. The
limit of determination was on micromolar level for all tested substances and both used
voltammetric techniques, but for DPV it was generally slightly lower then for SWV. The easy
renovation of electrode surface makes the method easier than the use of other solid electrodes
and thus it represents an effective and simple alternative to the HMDE.
Acknowledgements
This research was supported by Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (LC 06035, MSM 0021620857 and RP1 4/63), the Grant Agency of the Czech
Republic (project P206/10/P087), and the Grant Agency of Charles University (project SVV
261204). J.F. thanks the Croucher Foundation and the Faculty of Science, HKBU for financial
support.
References
1. Kotoucek M., Opravilova M.: Anal. Chim. Acta 329, 73 (1996).
2. Melo A. M. D., Valentim I. B., Goulart M. O. F., de Abreu F. C.: J. Braz. Chem. Soc. 19,
704 (2008).
3. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
39
Electrochemical Analysis of DNA: When, How and Why to Use Electroactive Labels and
Indicators
a
a
Miroslav Fojta , Luděk Havran , Petra Horáková a,b, Pavel Kostečka a, Hana Pivoňková a,
Eva Šimková a, Jan Špaček a, Zdenka Vychodilová a, and Pavlína Vidláková a
a
Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská
135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of
Pardubice, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic
Abstract
DNA possesses intrinsic electrochemical activity due to the presence of electrochemically
reducible or oxidizable nucleobases and exhibits characteristic, structure-sensitive
adsorption/desorption behavior at mercury or amalgam electrodes. Thus, label-free
electrochemical DNA sensing is in principle possible, and especially in connection with
mercury-based or carbon electrodes the intrinsic DNA electroactivity has been utilized to
detect DNA damage. In other applications, such as sequence-specific DNA sensing, typing of
single-nucleotide polymorphisms (SNP) etc., utilization of electroactive labels has appeared
advantageous. We present several examples of using redox-active or enzymatic DNA tags in
the detection of DNA damage, DNA hybridization and minisequencing of the SNP.
Key Words: DNA electrochemistry, Label-free, Electroactive labels, Redox indicators,
Enzyme-linked assays, Signal amplification, Etructure probes.
Introduction
DNA is an electroactive substance yielding analytically useful redox as well as tensammetric
electrochemical signals (reviewed in 1-4). Nucleobases adenine (A), cytosine (C) and guanine
(G) are reducible at mercury-based electrodes while all nucleobases can be oxidized at carbon
electrodes; particularly A and G produce analytically useful anodic peaks. In weakly alkaline
media at mercury and some amalgam electrodes, characteristic capacitive (tensammetric)
responses of nucleic acids can be measured. In general, these intrinsic electrochemical
responses of DNA are influenced by the DNA structure. The sensitivity of an electrochemical
signal to changes in DNA conformation is determined by changes of accessibility of the given
electroactive moiety. In addition to intrinsic DNA responses, electroactive markers have been
utilized to obtain reversible electrode processes at less extreme potentials than those produced
by DNA itself, or catalytic signals to attain higher sensitivity (reviewed in 2-4). Some of the
covalently (e.g., ferrocene 5 or osmium tetroxide complexes 6-8) or non-covalently (e.g.,
intercalators) bound redox markers exhibit also selectivity to DNA structure. In addition to
the electroactive moieties, enzymes catalyzing production of electrochemically detectable
indicators have been applied in DNA labeling as well.
To label or not to label
Choice of a particular detection technique on the basis of answering the question “to label or
not to label” depends on the type of analysis and electrodes used (Table I). Although there
have been efforts to prefer label free techniques due to their inherent simplicity, low costs and
biocompatibility, not always these criteria meet requirements of the given assay, and
sometimes an advantage of a detection technique in one respect is accompanied by
disadvantages in another. Intrinsic DNA responses can be effectively measured only at
mercury (amalgam) or carbon electrodes 9. Thus, when another type of electrode is to be used
(such as gold, featuring often a substrate for immobilization of capture probes to create a
biosensor for DNA hybridization 3 ), using electroactive markers or indicators is usually
necessary. While DNA damage can be easily and sensitively detected with the mercury-based
40
electrodes using intrinsic reduction or tensammetric responses of DNA without any labeling,
signals due to nucleobase oxidation are much less sensitive to changes in the DNA structure
and e.g., formation of a few single-strand breaks within several hundreds or thousands of base
pairs has practically no measurable effect on the guanine oxidation peak 1. A high sensitivity
of DNA damage sensing with carbon electrodes has been attained through application of an
electroactive probe selectively binding to the damaged DNA 10 (see below). In sequencespecific DNA sensing via DNA hybridization, label-free techniques (using intrinsic DNA
electroactivity) are well applicable for nucleotide sequences showing remarkably
asymmetrical distribution of an electroactive nucleobase (such as guanine) between the two
complementary strands 11. In such case, one strand can be distinguished from another (or form
the hybrid duplex) by relative intensity of the guanine oxidation peak. In the cases of
“random” nucleotide sequences (with even distribution of all four nucleobases between the
two strands, which is typical for most of gene sequences), another recognition event has to be
included, such as application of intercalative redox indicators selectively binding to the hybrid
duplex DNA or distinction between single- (before hybridization) or double stranded (after
hybridization) DNA through changes in the density of negative charge using e.g.,
electrochemical impedance spectroscopy 12. However, these techniques inherently suffer from
rather low specificity at low hybridization yields (when only minor portion of a DNA probe
has hybridized with the target DNA, which may be typical situation in analysis of real DNA
samples). From this point of view, application of redox labels covalently attached to reporter
(signaling) probes 6 or sequence-specific enzymatic incorporation of labeled nucleotides may
provide more reliable responses 13. These techniques are well compatible with various ways to
signal amplification, such as using tail-labeled reporter probes, utilization of enzymes and/or
nanoparticles. Application of suitable labels proved particularly advantageous in
electrochemical sensing of point mutations (single nucleotide polymorphisms, SNP), when
substitution of a single base with another at a specific position is to be detected 13,14.
Osmium tetroxide complexes as electroactive probes of DNA damage and mispaired
thymine residues
Osmium tetroxide complexes with nitrogenous ligands (Os,L) form covalent adducts with
pyrimidine residues, exhibiting a significant preference for thymine. Depending on the ligand
L, the reaction is usually sensitive to DNA structure, being facile for thymines in singlestranded or distorted duplex DNA but not for those paired in canonical B-DNA 15. The DNAOs,L adducts yield faradaic signals at different electrode types 8,15,16, and at mercury-based
electrodes, the final reduction step of the osmium moiety is accompanied by catalytic
hydrogen evolution 7,16. Sensitivity of Os,bipy (bipy=2,2’-bipyridine) towards unpaired
thymine residues has recently been utilized in a technique for the detection of DNA damage
combining application of DNA repair enzymes to create single-stranded regions in the
damaged DNA and the Os,bipy to introduce an electroactive marker into them 10, as well as to
detect apurinic lesions (exposing thymines in the opposite DNA strand) in DNA duplexes 17.
In addition, quite recently we have utilized Os,bipy to probe thymines located within singlebase mismatches and/or insertions (P. Kostečka et al., in preparation).
41
Table I.
Typical examples of label-free and label-based electrochemical DNA assays
Purpose
Label
Electrode
Molecular principle
(indicator) material
DNA
label-free
mercury,
strand breakage and/or
damage
amalgam
enzymatic DNA digestion,
double-helix unwinding at the
electrode
label free
carbon
damage to an electroactive
nucleobase (usually guanine)
DNA
hybridization
DNA
minisequencing;
SNP typing
enzymatic DNA digestion
combined with selective
chemical modification of
ssDNA
double helix formation of
complementary strands,
differing in guanine content
Source of the
signal
adsorption
/desorption of
DNA
usually
guanine
oxidation
Os,bipy
carbon
label-free
carbon, ITO
label-free
carbon, gold double helix formation of
complementary strands;
distinction between ss and ds
DNA by negative charge
density
EIS with
anionic
depolarizer
soluble
indicators
carbon, gold double helix formation of
complementary strands;
distinction between ss and ds
DNA by binding selectivity of
the indicator
carbon, gold double helix formation between
a ss target and labeled
complementary probe
redox of the
indicators
labeled
reporter
probes:
Os,L,
ferrocene
labeled
carbon, gold site-specific incorporation of
dNTP:
labeled nucleotides
ferrocene,
nitrophenyl,
[Os(bpy)3]2+
redox of
Os,bipy/DNA
adducts
guanine
oxidation
redox of
covalently
bound tags
redox of
covalently
bound tags
DNA hybridization with labeled reporter probes
DNA hybridization is based on the ability of a single-stranded DNA to form a DNA double
helix (double-stranded DNA) with its complementary counterpart. In DNA hybridization
sensors, ssDNA probe with a defined nucleotide sequence is used as a recognition element to
test nucleotide sequence of target DNA (tDNA) in a sample solution. If the target sequence is
complementary to the probe, hybrid dsDNA is formed. For the above-mentioned reasons, it is
advantageous to use labeled hybridization probes (reporter or signaling probes) and thus attain
reliable discrimination between the probe and the unlabeled tDNA. In addition, by combining
42
DNA labels differing in their electrochemical responses (yielding signals at sufficiently
different potentials), one can analyze more target nucleotide sequences in parallel. Besides
ferrocene, being the most prominent electroactive DNA label 5,18,19, other (often
electrochemically “tunable”) electroactive DNA tags have been applied, such as different
Ru(II) or Os(II) complexes, Os,L 6-8, anthraquinone 20, chalcogenide nanoparticles (“quantum
dots”) 21, or biotin usually serving as an adaptor for enzyme attachment 14.
DNA minisequencing via enzymatic incorporation of tagged nucleotides
Various electroactive tags can be introduced into DNA by DNA polymerases using labeled
deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). In recent years, preparation of electrochemically
labeled nucleotides (“electrotides” 20) and their incorporation into DNA using primer
extension (PEX) techniques have opened novel possibilities in electrochemical DNA sensing.
Incorporation of the labeled nucleotides into DNA is potentially useful not only for
preparation of labeled tDNA or reporter probes for the purpose of “classical” DNA
hybridization assays, but also for approaches based on sequence-specific introduction of the
tags. When position of a particular mutation or SNP of interest within the gene nucleotide
sequence is known, it is relatively easy to probe such site. PEX-based DNA “minisequencing”
strategies involving fluorescent tags and/or DNA synthesis terminators have been developed
and applied on the DNA chip platform 22. An analogous approach can be combined with
electrochemical techniques. Sequence-specific incorporation of a nucleotide coded with a tag
producing a specific signal (such as nitrophenyl 23, ferrocene 5 or a Os(II) complex 13) results
in an easy identification of the SNP type according to the peak potential and/or character of
the electrode reaction (reversible or irreversible, reduction or oxidation) 13,23. Analogous
technique using biotin tags for subsequent attachment of alkaline phosphatase has recently
been utilized in an enzyme-linked electrochemical assay for the detection of mutant p53 gene
expression in cancer cell lines 14.
Conclusions
Electrochemistry has been utilized (or proposed to being utilized) for various analytical
applications, including detection of DNA damage, sequence-specific DNA sensing via DNA
hybridization and typing of single-nucleotide polymorphisms. Various detection steps have
been employed depending on the particular purpose, including label-free DNA
electrochemistry, utilization of electroactive markers binding selectively to single- or doublestranded DNA, covalently attached redox labels or enzymes.
Acknowledgements
This work was supported by Grant Agency of the ASCR (grant IAA400040901), by the
ASCR (AV0Z50040507 and AV0Z50040702) and by the MEYS CR (LC06035).
References
1. Fojta M.: Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical
sensors for genomics and proteomics. (Palecek E., Scheller F., Wang J., Eds.), p. 386,
Elsevier, Amsterdam 2005.
2. Fojta M., Jelen F., Havran L., Palecek E.: Curr Anal Chem 4, 250 (2008).
3. Palecek E., Fojta M.: Bioelectronics (Wilner I., Katz E., Eds.) p. 127, Wiley VCH,
Weinheim 2005.
4. Palecek E., Jelen F.: Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards
electrochemical sensors for genomics and proteomics. (Palecek E., Scheller F., Wang J.,
Eds.), p. 74, Elsevier, Amsterdam 2005.
43
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
Brazdilova P., Vrabel M., Pohl R., Pivonkova H., Havran L., Hocek M., Fojta M.:
Chem-Eur. J. 13, 9527 (2007).
Fojta M., Kostecka P., Trefulka M., Havran L., Palecek E.: Anal. Chem. 79 (2007).
Palecek E., Trefulka M., Fojta M.: Electrochem. Commun. 11, 359 (2009).
Flechsig G. U., Reske T.: Anal. Chem. 79, 2125 (2007).
Fojta M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 715 (2004).
Havran L., Vacek J., Cahova K., Fojta M.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 1751 (2008).
Hason S., Pivonkova H., Vetterl V., Fojta M.: Anal. Chem. 80, 2391 (2008).
Gooding J. J.: Electroanalysis 14, 1149 (2002).
Vrabel M., Horakova P., Pivonkova H., Kalachova L., Cernocka H., Cahova H., Pohl R.,
Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem.-Eur.J. 15, 1144 (2009).
Horakova P., Simkova E., Vychodilova Z., Brazdova M., Fojta M.: Electroanalysis 21,
1723 (2009).
Fojta M., Havran L., Kizek R., Billova S.: Talanta 56, 867 (2002).
Havran L., Fojta M., Palecek E.: Bioelectrochemistry 63, 239 (2004).
Bartosik M., Gajdos V., Kostecka P., Fojta M., Palecek E., Volkov E., Oretskaya T.,
Hianik T.: Electroanalysis 21, 295 (2009).
Fan C., Plaxco K. W., Heeger A. J.: Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 100, 9134 (2003).
Patolsky F., Weizmann Y., Willner I.: J Am Chem Soc 124, 770 (2002).
Di Giusto D. A., Wlassoff W. A., Giesebrecht S., Gooding J. J., King G. C.: J. Am.
Chem. Soc. 126, 4120 (2004).
Wang J.: Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical
sensors for genomics and proteomics. (Palecek E., Scheller F., Wang J., Eds.), p. 369
Elsevier, Amsterdam 2005.
Shumaker J. M., Tollet J. J., Filbin K. J., Montague-Smith M. P., Pirrung M. C.: Bioorg.
Med. Chem. 9, 2269 (2001).
Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem.-Int. Edit. 47, 2059 (2008).
44
Use of Paramagnetic Particles for the Isolation of Oligonucleotides with Different
Sequence and Chain Length
(Využití paramagnetických částic pro izolaci oligonukleotidů s různou sekvencí a délkou
řetězce)
a
a
Martina Fojtíková , Jana Bartošková , Sylvie Holubová b, Eva Kaletová c, Libuše Trnková b,
and René Kizek c
a
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Biochemistry, Kotlářská 2, 611 37
Brno, Czech Republic,
b
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Chemistry, Kotlářská 2, 611 37
Brno, Czech Republic
c
Mendel University in Brno, Faculty of Agronomy, Department of Chemistry and
Biochemistry, Zemědělská 1, 613 00 Brno, E-mail: [email protected]
Abstract
Studies of biomolecules strongly depend on efficiency of their isolation from biological
materials. Using paramagnetic particles (MPs) represents a new method for these purposes.
This method is based on hybridization of target molecules on a surface of particles. MPs can
be modified with different molecules, for example sequences of thymine or other nucleotides
for isolation of nucleic acids. This method is faster and less laborious then commonly used
phenol chloroform extraction. Using MPs we studied the isolation of ODN with different
sequence and chain length.
Key Words: Paramagnetic particles (MPs), Oligonucleotide, Adenine, Cytosine, Thymine,
Adsorptive transfer stripping, Linear sweep voltammetry.
Úvod
Studium biomolekul je závislé na účinnosti jejich izolace z nativního biologického materiálu.
Neustále existuje snaha nalézt nové postupy a technologie, které by co nejvíce zefektivnily
tento proces, s ohledem nejen na rychlost, ale i na kvalitu a množství izolovaného, často velmi
drahého, materiálu. Pro izolaci nukleových kyselin (NK) byly vypracovány různé technologie
a postupy založené například na odstranění interferujících proteinů a následném vysrážení
alkoholem. Tyto metody vykazují relativně vysoké výtěžky, ale jsou časově náročné a
vyžadují přesný laboratorní postup, proto může docházet k chybám způsobených lidským
faktorem. Jednou z metod pro izolaci NK je využití paramagnetických částic (MPs - magnetic
particles). Velkou výhodou této metody je to, že volbou velikosti paramagnetické částice a
úpravou její obalové vrstvy můžeme efektivně izolovat různé molekuly. Navíc, vzorek
nemusíme nijak složitě upravovat, čímž se podstatně zkracuje doba potřebná pro získání
cílových molekul a zároveň se snižuje riziko jejich poškození. Metoda je neinvazivní a je
založena na fyzikálně chemických vlastnostech paramagnetických částic. Skládá se ze tří
kroků: vazba nukleové kyseliny na povrch MPs, promývání a uvolnění cílové molekuly a její
detekce. V této práci jsme se zaměřili na studium izolace oligonukleotidů (ODN) pomocí
magnetických kuliček v závislosti na nukleotidové sekvenci a na délce ODN řetězce a pro
detekci ODN byla zvolena detekce elektrochemická 1,2.
Jednotlivé vzorky oligonukleotidů (Termo Fischer Scientific, Ulm, Německo; Tabulka I.)
byly připraveny z lyofilizovaných oligonukleotidů (ODN) na koncentraci 50 µg.ml-1 (obsah
adeninu byl u všech ODN stejný). Jejich koncentrace byla kontrolována spektrofotometricky
(Spectronic Unicam, Anglie). Povrch magnetických mikročástic - MPs (Invitrogen Dynal AS,
Norsko) byly modifikovány sekvencí dT25. Velikost částic se pohybovala v rozmezí
2,80 ± 0,2 µm. MPs byly 3x promyty fosfátovým pufrem I (0,1 M NaCl; 50 mM Na2HPO4; 50
45
mM NaH2PO4). Poté byly přemístěny do magnetického stojanu (Dynal Biotech AS, Norsko),
kde byly přitaženy ke stěně mikrozkumavky a zbytek pufru byl odsát. Po promytí následovala
hybridizace. K MPs byl přidán hybridizační roztok, fosfátový pufr a vzorek ODN. Tato směs
byla umístěna na centrifugu (Multi-spin MSC-3000, Biosan, Litva), kde docházelo střídavě
k třepání a centrifugaci. K hybridizaci docházelo na základě párování bází mezi adeniny
v ODN a sekvencí dT25 na povrchu MPs. V dalším kroku byly MPs s navázanými ODN
zkoncentrovány pomocí magnetického stojanu, dále byl odstraněn hybridizační roztok a
následovalo promytí. Poté byl k MPs přidán fosfátový pufr II a vzorky byly umístěny na
thermoblok (Thermomixer 5355 Comfort/Compact, Eppendorf, Německo), kde při teplotě
85˚C docházelo k uvolnění navázaných ODN z magnetických mikročástic. Posledním krokem
bylo opětovné zkoncentrování MPs a odsátí vzorku s izolovaným ODN. Pro
elektrochemickou detekci byla využita pracovní cela s tříelektrodovým uspořádáním,
referenční elektroda - Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda - uhlíková tyčinka, pracovní
elektroda – visící rtuťová kapková elektroda o ploše 0,4 mm2 (HMDE – Hanging Mercury
Drop Electrode). Základním elektrolytem byl octanový pufr o pH 4,5 (0,2 M CH3COOH; 0,2
M CH3COONa). Byla využita metoda adsorptivního přenosu. Vzorek byl nanesen na
parafilm, následovala 120 s akumulace, poté byla pracovní elektroda omyta v destilované
vodě a vložena do elektrolytu. Měření bylo prováděno pomocí LSV (AUTOLAB analyzátor,
EcoChemie, Holandsko; VA-Stand 663, Metrohm, Švýcarsko). Dále byly měřeny ODN
v závislosti na zvyšující se době akumulace (10, 30, 60, 120, 240 a 360 s).
Tabulka I.
Charakteristika ODN.
ODN
Počet adeninu/sekvence
ε
[cm2 mmol-1]
dA9
dA12
dA18
dA36
Poly(dA)
H9 double
H10 double
H11 double
9
12
18
36
400
ACC CAC CCA ACC CAC CCA
CCC CCC AAA CCC CCC AAA
CCA CAC ACC CCA CAC ACC
12378
12283
12189
12094
12009
9078
8933
8944
Molekulová
hmotnost
[g.mol-1]
2757,9
3697,5
5576,8
11214,6
400000
5288,5
5288,5
5288,5
Teplota
tání
[°C]
18,0
24,0
37,6
60,1
73.2
57,7
60,9
51,8
Molekulové hmotnosti a teploty tání byly získány z protokolů dodaných výrobcem. Molární
absorpční koeficienty ε ODN o délce n nukleotidů byly vypočítány dle vztahu:
Σ1n−1 ( ε nejbližší soused ) − Σ 2n−1 ( ε individuá lní )
ε 260 =
n
s využitím hodnot molárních absorpčních koeficientů nejbližších sousedů uvedených v
tabulce II a hodnot individuálních molárních absorpčních koeficientů:
dA = 15400, dC = 7400, dG = 11500, dT = 8700 3,4.
46
Tabulka II.
εnejbližších sousedů. [cm2 mmol-1]
5´→3´
dA
dC
dG
dT
dA
27400
21200
25200
23400
dC
21200
14600
17600
16200
dG
25000
18000
21600
19000
dT
22800
15200
20000
16800
Výsledky a diskuse
Jednotlivé ODN byly měřeny pomocí adsorptivní přenosové techniky a byla sledována
závislost výšky redukčního píku adeninu (A) a cytosinu (C) na době akumulace. Dali jsme si
za cíl studovat signály A, popř. A+C u ODN před izolací a u ODN po izolaci pomocí
magnetických mikročástic. ODN byly na rtuťové elektrodě akumulovány od 5s do 360 s.
Hodnoty redukčních píků byly měřeny s rychlostí polarizace 100 mV.s-1 při pH 4,5.
Závislost na délce ODN řetězce
Před izolací jsme provedli u nestejně dlouhých ODN a poly(dA) AdS voltametrický
experiment se záznamem redukčního píku A. Výsledky ilustruje Obr.1.
Obr. 1. Závislost výšky redukčního signálu A na době akumulace pro dA9, dA12, dA18,
dA36 a poly(dA) před izolací.
Poly(dA) poskytuje nejvyšší signál A (zhruba osmkrát větší než dA36). Nejvyšší hodnota
redukčního píku byla pozorována při akumulačním čase 120 s. Z obr. 1 vyplývá, že signál A
není proporcionálně zvyšován s jeho počtem v ODN řetězci. Protože se od dA9 po dA36
velikosti píků snižují, můžeme předpokládat velký vliv struktury jednotlivých ODN. Průběh
křivek je podobný a časová změna signálu A během akumulace svědčí o dynamice ODN
v elektrodové dvojvrstvě. Z křivek lze usuzovat na podobnou strukturu dA9 a dA12 oproti
dA18 a dA36.
U studovaných ODN a poly(dA) jsme provedli izolaci pomocí MPs podle protokolu
uvedeného v experimentální části. Velikosti redukčního signálu A na době akumulace
reprezentuje obr. 2. Nejvyšší redukční signál A i po izolaci pomocí MPs poskytuje opět
poly(dA), nejnižší dA18 a dA36. Pro hodnoty akumulace 10 – 60 s se hodnoty čtyř ODN moc
neliší, rozdíl je patrný až u delších dob akumulace. Dá se předpokládat, že izolované ODN
mohly během procesu změnit strukturu, např. při kroku disociace ODN a poly(dA) z MPs,
kdy jsme výrazně překročili jejich teplotu tání.
47
Obr. 2. Závislost výšky redukčního signálu A na době akumulace ODN izolovaných pomocí
MPs.
Závislost na sekvenci nukleobází v ODN řetězci
Jednotlivé ODN s různou sekvencí šesti A a dvanácti C - H9 double,H10 double, H11double
byly studovány podobně jako homo-ODN s různou délkou řetězce: před izolací a po izolaci.
Stejně jako homo-ODN jsou tyto osmnáctimerní hetero-ODN velmi silně adsorptivní. Již
v čase 10 s dochází k pokrytí povrchu elektrody a poté se výška signálu pohybuje v podstatě
na konstantní hodnotě (Obr. 3).
Obr. 3. Závislost výšky redukčního signálu A a C [μA] na době akumulace [s] ODN s různou
sekvencí A a C (H9 double = ACC CAC CCA ACC CAC CCA, H10 double = CCC CCC
AAA CCC CCC AAA, H11 double = CCA CAC ACC CCA CAC ACC).
Sekvence H10 double poskytuje výrazně nejnižší signál. Tento jev lze zdůvodnit sekvencí 6
cytosinů a 3 adeninů jdoucích po sobě, které mohou nekovalentně interagovat a vytvářet imotif. Báze jsou tudíž hůře přístupné k redukci na elektrodě. Sekvence H9 double a H11
double jsou zrcadlově uspořádány a jsou k sobě navzájem opačné. Vyšší signál u H9 můžeme
vysvětlit tak, že sekvence tohoto ODN končí adeninem, který je v pH 4.5 protonizován a lépe
interaguje s negativně nabitou elektrodou.
48
Obr. 4. Závislost výšky redukčního signálu A a C [μA] na době akumulace [s] ODN
izolovaných pomocí MPs (H9 double = ACC CAC CCA ACC CAC CCA, H10 double =
CCC CCC AAA CCC CCC AAA, H11 double = CCA CAC ACC CCA CAC ACC).
Při izolaci pomocí MPs dochází k pozvolnější adsorpci izolovaných ODN na povrchu
elektrody (Obr.4). Můžeme pozorovat určité maximum, které se u jednotlivých sekvencí liší.
Na rozdíl od původního signálu (Obr.3) ODN H10 double poskytuje vyšší signál, což může
být způsobeno rozbitím sekundárních struktur ODN (i-motif) v důsledku tepelné denaturace
při disociaci ODN z MPs. Podobně jako u experimentu sledujícího vliv délky ODN řetězce je
možné pozorovat změnu struktury ODN přímo na povrchu elektrody (dynamika).
Závěr
Předběžnými pokusy bylo zjištěno, že experiment před a po izolaci pomocí magnetických
částic je ovlivněn sekvencí i délkou řetězce. V případě neizolovaných ODN poskytla nejlepší
signál poly(dA), pak následovaly dA9, dA12, dA18 a dA36. Zatím experimenty nasvědčují
tomu, že nejlépe proběhla izolace poly(dA), pak následovaly ODN dA9, dA18 a dA36. Je
zajímavé, že ODN dA36 se izoloval ze všech ODN nejhůř, což dokazuje i účinnost
hybridizace, která byla jen 30%. Výška signálu A a C se vzhledem k původní hodnotě u
sekvence H9 double po izolaci snížila na 49%, u sekvence H11 double na 28%. U sekvence
H10 double došlo k nejmenšímu poklesu a to na 72% původní výšky signálu. U ODN H10
double pravděpodobně došlo k nejmenšímu poklesu signálu díky tomu, že při izolaci došlo
k rozrušení struktury a báze byly více přístupné redukci na elektrodě. Dalším důvodem tohoto
jevu je fakt, že sekvence obsahuje 3 adeniny jdoucí po sobě, které umožňují nejúčinnější
izolaci v porovnání s dalšími dvěma sekvencemi. U sekvencí H9 double a H11 double jsou
rozdíly pravděpodobně způsobeny koncovým nukleotidem. Závěrem lez konstatovat, že
účinnost izolace pomocí MPs je ovlivněna strukturou ODN a možná i změnou struktury
v průběhu denaturace.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu č. MSM 0021622412 (INCHEMBIOL) a MŠMT ČR
BIO-ANAL-MED č. LC06035.
Literatura
1. Huska D., Hubalek J., Adam V., Vajtr D., Horna A., Trnkova L., Havel L., Kizek R.:
Talanta 79, 402 (2009).
2. Huska D., Adam V., Trnkova L., Kizek R.: J. Magn. Magn. Mater. 321, 1474 (2009).
3. Warshaw M. M., Tinoco I.: J. Mol. Biol. 20, 29 (1966).
4. Cantor C. R., Warshaw M. M.: Biopolymers 9, 1059 (1970).
49
Utilization of Electrochemical Activity of 7-Deazaguanine in the Monitoring of PCR
Amplification of G-rich DNA Strands
a,c
Miloslava Fojtová , Petra Horáková a,b, Hana Pivoňková a, Zdenka Vychodilová a, and
Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská
135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of
Pardubice, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic
c
Division of Functional Genomics and Proteomics, Department of Experimental Biology,
Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic
Abstract
7-Deazaguanine (G*) is an analogue of guanine incorporable sequence-specifically into DNA
but incapable of forming Hoogsteen base pairs. Reduced tendency of G* to form alternative
DNA structures is utilized in PCR amplification of guanine-rich nucleotide sequences. G* is
electrochemically active, being oxidized at significantly lower potentials, compared to
guanine and all other nucleobases. We show that incorporation of G* into PCR amplicons can
easily be monitored by voltammetric analysis of the modified DNA at carbon electrodes.
Densely G*-modified DNA fragments exhibit quenching of fluorescence of SYBR Green I
dye, commonly used for gel staining and real time PCR applications, the electrochemical
detection provides G*-specific signal suitable for the quantification of the amplified DNA as
well as for the determination of the DNA modification extent.
Key Words: 7-Deazaguanine, Electrochemical analysis, DNA labeling, PCR, Real-time PCR.
Introduction
Nucleic acids possess intrinsic electroactivity due to the presence of electrochemically
oxidizable or reducible nucleobases 1,2, making it possible to analyze them electrochemically
without any labeling. In addition, application of various redox indicators and labels proved
useful particularly in sequence-specific DNA sensing requiring reliable discrimination
between two complementary strands (e.g., target DNA and hybridization probe 3,4),
determination of newly synthesized DNA stretches 5-7 or detection of particular nucleobases
incorporated at a specific position (in SNP typing 7-9). 7-deazaguanine (G*) is an analogue of
standard guanine nucleobase (G) retaining the ability to form Watson-Crick base pairs with
cytosine, but unable to form Hoogsteen pairs due to absence of the N7 atom. Reduced
tendency of the G*-modified DNA to adopting multi-stranded conformations has been
utilized to improve PCR amplification of G-rich sequences such as (CGG)n repeats 10.
Compared to G, G* exhibits significantly lower potentials of its oxidation 7,11,12, which can be
utilized analytically for the monitoring of DNA synthesis by PCR in the presence of dG*TP
partially or fully substituting standard dGTP in the reaction mixture.
Experimental
Preparative PCR: Amplification of the DNA fragment: 500 ng of a DNA template was mixed
with forward and reverse primers (0.5 µM each), Pfu DNA Polymerase (3 U) and mix of
dNTPs (125 µM each) in total volume of 100 µL. The PCR usually involved 30 cycles if not
stated otherwise (denaturation 94 °C / 90 s, annealing 60 °C / 120 s, polymerization 72 °C /
180 s) and was run using C1000 Thermal Cycler (BioRad). The PCR products were purified
using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and their concentration was determined
spectrophotometrically using NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop
Technologies, USA).
50
Real time PCR: Reactions were prepared in duplicates in 20 μL hand-made PCR mix
consisting of 30 ng DNA template, forward and reverse primers at concentrations 0.5 μM, 1 ×
DyNAzyme II buffer, 1.25 mM MgCl2, 20 000 × diluted SYBR Green I, each dNTP (or sum
of dGTP+dG*TP) 125 μM, 1 U of DyNAzyme II DNA polymerase. PCR involved 20 cycles
(denaturation 94 °C / 30 s, annealing 56 °C / 30 s, polymerization 72 °C / 30 s, fluorescence
measurement in SYBR Green I channel 15 s / 78 °C, wavelength of the source 470 nm,
wavelength of the detection filter 585 nm; final extension 72 °C / 3 min) and was run and
evaluated using the RotorGene-3000 (Qiagen, Germany).
Electrochemical analysis: The PCR products were analyzed using adsorptive transfer
stripping (AdTS) square-wave voltammetry (SWV). The DNA was accumulated at the basalplane pyrolytic graphite electrode (PGE) surface from 5 µL aliquots containing 0.3M NaCl
for 60 s. Then the electrode was rinsed by deionized water and was placed into the
electrochemical cell. SWV settings: initial potential -1.0 V, final potential +1.5 V, pulse
amplitude 25 mV, frequency 200 Hz, potential step 5 mV. The measurements were performed
at ambient temperature in 0.2M acetate buffer pH 5 using CHI440 Electrochemical
Workstation (CH Instruments, Inc., USA) in a three-electrode setup (with the PGE as working
electrode, Ag/AgCl/3M KCl as reference, and platinum wire as counter electrode). Baseline
correction of the voltammograms was performed by means of a moving average algorithm
(GPES 4 software, EcoChemie).
We used G* as an independently detectable marker, yielding a specific signal (peak G*ox, Fig.
1) due to its electrochemical oxidation at a potential differing from the potential of oxidation
of natural purine bases (producing peak Gox and peak Aox, Fig. 1). PCR experiments using
dNTP mixes containing both dGTP and dG*TP at different ratios were performed and the
0.7x10-5
0.6x10-5
i /A
0.5x10-5
0.4x10-5
0.3x10-5
0.2x10-5
G*ox
0.1x10-5
0
-0.1x10-5
0.25
Aox
Gox
0.50
0.75
1.00
E/ V
1.25
1.50
1.75
Fig. 1. Baseline-corrected square-wave voltammograms of DNA fragments amplified by PCR
with standard 0 % (dotted), 50 % (dashed) and 100 % (solid) G* (of G+G* total) in the
reaction mixture.
51
resulting PCR products were analyzed electrochemically. As demonstrated in Fig.1, changes
in the relative abundances of G and G* in the PCR product (given by the molar fraction of the
respective dNTP) were reflected in changes of corresponding electrochemical signals (peak
Gox and peak G*ox). Full replacement of dGTP with dG*TP resulted in appearance of an
intense peak G*ox and decrease of the intensity of peak Gox. Strikingly, the latter peak never
reached zero in agreement with the presence of G residues in the primer stretches of the G*modified amplicons. Intensity of the peak Aox due to adenine, whose content was constant for
all amplicons analyzed in this experiment, did not show any significant trend, thus giving
evidence on about constant yields of the PCR products obtained for any dGTP/dG*TP ratio
after the 30 PCR cycles. Both unmodified and G*-substituted DNA amplicons showed
approximately linear regions of concentration dependences of peak Gox or peak G*ox
intensities, respectively, below 10 μg mL-1 and tendency to saturation of the electrode surface
at higher DNA concentrations. Detection limits were around 1 μg mL-1 in both cases.
A
1 2
3
4
5
B
2
1
3
4
5
Fig. 2. Real time PCR amplification of a DNA fragment in the presence of 0 % (1), 30 % (2),
50 % (3) and 100 % (4) of G*; non-template control (5) (all samples are shown in duplicates).
Panel A shows raw data, panel B take-off plot.
Despite the approximately same yields of the PCR amplicons after 30 cycles, we attempted to
monitor amplification rates of the unmodified and G*-modified DNA. Previous data13
revealed less feasible DNA amplification by PCR in the presence of dG*TPs, compared to
PCR with standard dNTPs only. We followed electrochemical signals of the unmodified and
fully G*-substituted PCR products after 5, 10, 20 and 30 cycles. After 5 cycles, peak Gox
52
produced by the unmodified fragment was remarkably higher than peak G*ox of the G*modified PCR product, suggesting lower amount of amplified DNA in the latter case.
Differences between the signal intensities observed after 10 amplification cycles were still
significant, while after 20 and 30 cycles both peaks reached their limiting values. We further
performed a real-time PCR experiment using standard and dG*TP-containing dNTP mixes.
Fig. 2A shows increase of the fluorescence of SYBR Green I (used here as fluorescent dye
indicating progression of DNA amplification) as a function of the number of PCR cycles for
0, 30, 50 and 100 % G* (of G+G* total amount). The steepest increase of the signal was
observed for the unmodified amplicon, while in the presence of G* the initial rate of
amplification decreased, depending on the G*/G ratio (Fig. 2A), which was further confirmed
by calculating the “take off” value of amplification attained in different dNTP mixes (see Fig.
2B: the take-off points for each reaction are calculated from the second derivatives of raw
data and it is taken as 80 % below the peak of second derivative i.e. below the point where the
amplification curve is increasing most steeply). The amplification factors of approx. 1.85,
1.78, 1.75 and 1.66 were obtained for reactions with 0, 30, 50 and 100 % G*, respectively.
We also observed strong quenching of SYBR Green I fluorescence by G* incorporated, both
in the real time PCR experiments and in DNA staining in agarose or polyacrylamide gels.
Thus, for densely G*-modified DNA amplicons these routinely used techniques may fail to
give correct data. On the other hand, the electrochemical technique appears to yield G- or G*specific responses reflecting relative abundance of the given base in the amplified DNA, but
without significant mutual interference. Our preliminary results suggest general applicability
of this approach in PCR-coupled DNA sensing, and especially in analysis of G-rich DNA
sequences such as telomeric repeats or some microsatellite elements connected with severe
inherited diseases.
Conclusions
We show that total or partial substitution of G with G* in PCR-amplified DNA results in
appearance of a new anodic signal, peak G*ox, at potential less positive than potentials of
oxidation of any natural nucleobase, allowing independent determination of G* incorporated.
Considering problems with quenching of fluorescence of ethidium 14 or “SYBR” dyes, the
electrochemical technique appears an attractive alternative providing G*-specific signal
suitable for quantification of the amplified DNA as well as for the determination of the DNA
modification extent.
Acknowledgements
This work was supported by Grant Agency of the ASCR (grant IAA400040901), by the
ASCR (AV0Z50040507 and AV0Z50040702) and by the MEYS CR (LC06035,
MSM0021622415).
References
1. Fojta M., Jelen F., Havran L., Palecek E.: Curr. Anal. Chem. 4, 250 (2008).
2. Palecek E., Jelen F.: Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards
electrochemical sensors for genomics and proteomics. (Palecek E., Scheller F., Wang J.,
Eds.), p. 74, Elsevier, Amsterdam 2005.
3. Flechsig G. U., Reske T.: Anal. Chem. 79, 2125 (2007).
4. Fojta M., Kostecka P., Trefulka M., Havran L., Palecek E.: Anal. Chem. 79, 1022 (2007).
5. Brazdilova P., Vrabel M., Pohl R., Pivonkova H., Havran L., Hocek M., Fojta M.: ChemEur. J. 13, 9527 (2007).
6. Patolsky F., Weizmann Y., Willner I.: J. Am. Chem. Soc. 124, 770 (2002).
53
7. Vrabel M., Horakova P., Pivonkova H., Kalachova L., Cernocka H., Cahova H., Pohl R.,
Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem.-Eur. J. 15, 1144 (2009).
8. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem.-Int. Edit. 47, 2059 (2008).
9. Horakova P., Simkova E., Vychodilova Z., Brazdova M., Fojta M.: Electroanalysis 21,
1723 (2009).
10. Cao J., Tarleton J., Barberio D., Davidow L. S.: Mol. Cel. Probes 8, 177 (1994).
11. Kelley S. O., Barton J. K.: Chem. Biol. 5, 413 (1998).
12. Yang I. V., Ropp P. A., Thorp H. H.: Anal. Chem. 74, 347 (2002).
13. Seela F., Roling A.: Nucleic Acids Res. 20, 55 (1992).
14. Latimer L. J. P., Lee J. S.: J. Biol. Chem. 266, 13849 (1991).
54
Electrochemistry of Selected Radiosensitizer-Etanidazole
Miroslav Gál a,b, Ján Híveš c, Romana Sokolová a, Magdaléna Hromadová a, Jana Bulíčková a,
Viliam Kolivoška a, and Lubomír Pospíšil a,d
a
J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague,
Czech republic ;E-mail: [email protected]
b
Dipartimento di Scienze dell'Ambiente e della Vita, Universita degli Studi del Piemonte
Orientale 'A. Avogadro', Viale T. Michel 11, 15 100 Alessandria, Italy
c
Faculty of Chemical and Food Technology, STU Bratislava, Radlinského 9, 812 37
Bratislava, Slovakia
d
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, v.v.i., Flemingovo n. 2, 160 00
Prague, Czech Republic
Abstract
The first electron transfer to radiosensitizer Etanidazole (ETN) and ETN radical anion
formation in buffered aqueous media was studied by means of voltammetric techniques and
Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS). The heterogeneous electron transfer rate
constant for the first reduction of ETN (radical anion production) k0 for the redox couple and
so called E 17 potential were calculated. The obtained values of k0 and E 17 potential indicate
that ETN compared to some other possible chemical radiosensitizers requires lower energy to
accept the first electron during metabolic pathway.
Key Words: Etanidazole, Cyclic voltammetry, Radiosenzitizers, Electrochemical impedance
spectroscopy, Hypoxic cells, Radiotherapy.
Introduction
Organic compounds that reversibly accept single electron yielding a reactive radical
intermediate (anion or cation radical) represent a very important class of redox systems.
Radical formation in tissues is the first step of the effect of many pharmaceuticals. Many
reactions formally involving multi-electron couples A / A n − are known to proceed in several
one-electron steps; the intermediate is a free radical A •− . Therefore, the reduction potentials of
one-electron couples are of value in predicting the direction or feasibility, and in some
instances the rate constants, of many free radical reactions. Electrochemical methods have an
excellent applicability in measuring these properties of frequently unstable species.
Hypoxic radiosensitizers are drugs that make cancer cells more sensitive to radiation therapy.
Radiosensitizers work to increase the normally low level of oxygen found in cancer cells.
Cancer cells that have normal or higher levels of oxygen are more receptive to radiation
treatment. One can conclude that radiotherapy is a free radical therapy: ionizing radiation
implies free radical production. As DNA is the critical target in the living cells, it is possible
that these nitro radical anions interact with cellular DNA and DNA components causing DNA
damage within the cell 1-5.
The reactivity of radical anions from most of the nitrogen-containing compounds has been
studied mainly by the pulse radiolysis technique 6. High resolution and sensitive techniques
can be also utilized to monitor organic compounds behavior in vitro and/or in vivo 7-10.
Recently electrochemical techniques have been also used to study the behavior of the nitro
radical anions 4,5.
Drugs with higher electron affinity (EA; with smaller reduction potential) are generally the
most toxic and mutagenic, being also more quickly metabolized. Furthermore, there are a lot
of other studies dealing with the relationship between reduction potentials and
55
pharmacological activity showing that this parameter is of interest from electrochemical and
pharmacological points of view 4,5.
Etanidazole (Fig. 1) belongs to the important class of electron-affinic radiosensitizers 4,5. An
important property of the electron-affinic compounds is that they appear to radiosensitize
hypoxic cells, but have no measurable effect in well-oxygenated cells. ETN is also useful as
an imaging agent for identifying hypoxic, drug-resistant regions of primary tumors or
metastases.
Fig. 1. Etanidazole structure.
Experimental
Etanidazole (98%) was obtained from Sigma-Aldrich, CO. and was used without any
purification. All other chemicals were of p.a. or higher quality. Buffers were prepared using
Millipore MilliQ water (resistance > 18.2 MΩ). Oxygen was removed from the solution by
purging with argon (Messer, min 99.998 Vol %) prior to the each measurement.
Electrochemical measurements were performed using AUTOLAB instrument PG STAT 30
equipped with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). Impedance data were
collected in the range 1 Hz to 25 kHz. Each impedance curve consisted of 100 measured
points. An electrochemical data from cyclic voltammetry, phase-sensitive ac polarography,
and dc polarography and EIS were analyzed using AUTOLAB software. AC amplitude of
10 mV was derived from an internal oscillator. A three-electrode electrochemical cell was
used. The reference electrode (RE), Ag|AgCl|1M LiCl, was separated from the test solution
by a salt bridge. The working electrode (WE) was a valve-operated static mercury electrode
(SMDE2, Laboratorní Přístroje, Prague) with an area of 5.15 × 10-3 cm2. The counter
electrode (CE) was cylindrical platinum wire with area approximately 100 times higher than
area of WE. All pH measurements were carried out with a WTW pH Meter (model 340)
equipped with a glass electrode WTW Sentix 50 4,5.
Results and discusion
Typical approach to study nitro-radical itself is utilizing either mixed or aprotic media.
However, we focus our attention on the study of ETN anion radical in pure aqueous
solutions 4,5. We found that, in the case of ETN, in the strong alkaline solutions (pH > 10)
peak I (reduction of nitro moiety to hydroxyamine) is divided into two peaks Ia and Ib,
respectively (Fig. 2) 4,5. Peak Ia corresponds to the nitro radical-anion production and peak Ib
to the hydroxyamine production:
ETN − NO 2 + e − → ETN − NO •2− (peak Ia)
(1a)
ETN − NO •2− + 3 e − + 4 H + → ETN − NHOH + H 2 O (peak Ib).
(1b)
56
i/μA
-5
Ib
-4
600 s
60 s
II
-3
-2
-1
Ia
IV
baseline
0
1
0.0
III
-0.4
-0.8
-1.2
E / V(vs. Ag,AgCl(1M LiCl))
-1.6
Fig 2. Dependence of the first reduction peak splitting on the accumulation time;
[ETN] = 3.87×10-4 M in 0.1 M Britton-Robinson buffer (pH = 11.10); scan rate 0.5 V s-1.
Baseline - dashed line; taccum = 60 s dashed line; taccum = 600 s solid line; taccum = 600 s +
E(vertex) = -0.65 V vs. Ag|AgCl|1M LiCl dotted line 4.
Nitro/nitro radical-anion couple of ETN thus can be under suitable experimental conditions
directly studied without adding any supporting co-solvent Obtained value for ΔEp radical
anion couple confirmed exchange of one electron 4,5.
It is known that the separation of peak potentials should be a measure of the standard rate
constant k0 for electron transfer. According to Nicholson method for quasi-reversible systems
we can define equivalent parameter ψ as follows:
D
⎞
ψ = ⎛⎜ O
⎟
D
R ⎠
⎝
α
2
(ζ v )− 12 k 0
(2)
where ζ = (π D O F RT ) , DO is a diffusion coefficient and other symbols have an usual
meaning. The ΔEp values are independent of α and depend only on ψ for α ∈ (0.3, 0.7 ) . Except
for the unusual cases of very large differences between DO and DR, the ratio DO/DR is near
unity regardless of α. Therefore, the standard rate constant k0 for redox couple
ETN − NO 2 + e − ς ETN − NO•2− can be estimated according to the equation (2). The diffusion
coefficient was calculated to be 4 D O = (2.77 ± 0.09 ) × 10 −5 cm 2 s −1 . In Fig. 3 the slope of the
line represents k0 for our couple. Calculated value of k 0 = (9.32 ± 0.70)× 10 −2 cm s −1 is
comparable with the values obtained for other nitro compounds in the mixed water:ethanol
medium 11.
57
ξ ψ
0.3
0.2
0.1
0.0
1
2
3
-1/2
v
-1/2
/V
1/2
s
Fig 3. Plot of the equivalent parameter ψ multiplied by constants with usual meaning at
different scan rates 4.
Electrochemical impedance spectroscopy can be used as an alternative method for
heterogeneous electron transfer rate constant, k0, determination 5. The frequency dependence
of the faradaic phase angle φ F can be calculated according the equation as follows:
(
Z'
2ωD 0
1
cot φ F = 'F' = 1 + = 1 +
ζ
ZF
k0
)
1
2
(3)
where D0 is a diffusion coefficient, ζ is the rate parameter defined as
12
12
ζ = k f (2ωD R ) + k b (2ωD O ) ; kf, kb are the potential dependent rate constants of
reduction and oxidation, respectively, DR, DO are the respective diffusion coefficients, ZF´ and
ZF´´ are the components of the faradaic impedance. Assuming that DR = DO = D0 and
k0 = kf + kb the heterogeneous electron transfer rate constant, k0, for redox couple
ETN − NO 2 + e − ς ETN − NO •2− can be estimated according to the equation (3) 5.
The plot of cot φ F against ω1/2 should be a strait line and the rate constant can be evaluated
from the slope (Fig. 4).
cot φF
2.0
1.5
1.0
0
10
ω1/2
20
Fig 4. The dependence of the cotangent of faradaic phase angle cot φ F on square root of
angular frequency ω1/2 ( ω = 2πf ); ETN in 0.1 M Britton-Robinson buffer, pH = 11;
E = -0.585 V vs. RE 5.
58
From this slope the heterogeneous electron transfer rate constant for the first reduction of
ETN (radical anion production) was calculated 5 to be k 0 = (12.8 ± 2.3)× 10 −2 cm s −1 . This
value is well comparable with CV value.
Drugs with higher electron affinity are generally more toxic and mutagenic. The E 17 values
are parameters that account for the energy necessary to transfer the first electron to an
electroactive group at pH 7 in aqueous medium to form a radical anion. Therefore, in the case
of nitro compounds, the E 17 values represent the ability to form the nitro radical anion 4. The
E 17 values were firstly obtained experimentally by electron pulse radiolysis. According to the
study published by Breccia et al. 12 an excellent correlation between the cathodic peak
potentials Epc of the first reduction peak of the several nitro-compounds measured in
dimethylformamide (DMF) and the E 17 values obtained with pulse radiolysis in the water can
be seen. We found Epc (for ETN) in DMF to be -0.96 V vs. RE (data not shown) 4. According
to the linear dependence of the first reduction peak Epc in DMF of several nitro-compounds on
E 17 potential in water obtained by pulse radiolysis, the value of E17 ≈ −0.34 V for ETN in
water is expected.4 At very high scan rates the results from CV measurements are close to the
results from the pulse radiolysis. Therefore, to obtain this value from CV measurements in
aqueous solution without any additional organic solvents the dependence of the peak
potentials EpcI and EpcII on the scan rate v was examined. For ETN
E 17 = −0.374 ± 0.006 V which is close to the expected value from the pulse radiolysis
measurements ( E17 ≈ −0.34 V ) 4.
Acknowledgement
This research was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (project
203/09/P502) and the Ministry of Education (LC510 and COST D36 OC140).
References
1. Biaglow J.E., Jarabson B., Greenstock C.L., Raleigh J.: Mol. Pharmacol. 13, 269 (1977).
2. Viode C., Bettache N., Cenas N., Luise Krauth-Siegel R., Chauviere G., Bakalara N.,
Perie J.: Biochem. Pharmacol., 57, 549 (1999).
3. Trinh S., Reysset G.: Mutat. Res., 398, 55 (1998).
4. Gál M., Hromadová M., Pospíšil L., Híveš J., Sokolová R., Kolivoška V., Bulíčková J.:
Bioelectrochemistry 78,118 (2010).
5. Gál M., Híveš J., Sokolová R., Hromadová M., Kolivoška V, Pospíšil L.: Coll. Czech.
Chem. Commun. 74, 1571 (2009).
6. Wardman P.: Rep. Prog. Phys., 41, 259 (1978).
7. Oriňák A., Talian I., Efremov E.V., Ariese F., Orinakova R.: Chromatographia 67, 315
(2008).
8. Talian I., Oriňák A., Preisler J., Heile A., Onofrejová L., Kaniansky D., Arlinghaus H.F.:
J.Sep.Sci. 30, 2570 (2007).
9. Oriňák A.,Oriňáková R.,Arlinghaus H.F.,Vering G.,Hellweg S.: Surf. Interface Anal. 38,
599 (2006).
10. Talian I., Aranyosiova M., Oriňák A., Velič D., Haško D., Kaniansky D., Oriňáková R.,
Hübner J.: Appl. Surf. Sci. 256, 2147 (2010).
11. Carbajo L.J., Bollo S., Nunez-Vergara L.J., Campero A., Squella J.A.: J. Electroanal.
Chem., 531, 187 (2002).
12. A. Breccia, G. Berrilli, S. Bofia: Int. J. Radiat. Biol. 36, 85 (1979).
59
What is New in Labeling and Functionalization of DNA for Electrochemical Analysis
(Co je nového ve značení a funkcionalizaci DNA pro elektrochemickou analýzu)
Luděk Havran a, Petra Horáková a, Hana Pivoňková a, Milan Vrábel b,
Hana Macíčková-Cahová b, Jan Riedl b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics ASCR v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR v.v.i., Flemingovo nám. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
Modified deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) were synthesized by simple cross-coupling
reaction in aqueous media. These modified dNTPs were incorporated into the oligonucleotide
chain by using enzymes – DNA polymerases. Prepared reporter probes modified by
electroactive tags were used in development of electrochemical sensors for the analysis of
nucleotide sequences.
Key Words: Labeling of DNA, DNA sensors, Electrochemical methods.
Úvod
Elektrochemická analýza nukleových kyselina zažívá v posledních dvou dekádách bouřlivý
rozvoj 1. Jednou z významných hnacích sil tohoto rozvoje je vývoj elektrochemických
senzorů pro detekci hybridizace DNA. Tyto senzory mohou pro detekci hybridizace používat
například elektroaktivitu samotné DNA, redox-aktivní interkalátory a nebo tzv. signální sondy
(reporter probes) – krátké oligonukleotidy (ON) modifikované elektroaktivní značkou.
Modifikované ON se připravují řadou různých postupů. Jedním z nich je enzymatická
inkorporace značených deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTP) pomocí DNA polymeráz.
Značené dNTP lze připravit jednoduchou cross-coupling reakcí ve vodném prostředí 2.
V předkládaném příspěvku bude demonstrována aplikace výše uvedené metody přípravy
signálních sond za užití dNTP značených: ferocénem 3, nitro nebo amino skupinou 4,
komplexy Ru(II) nebo Os(II) 5 a tetrathiafulvalenem 6 při vývoji elektrochemických senzorů
pro analýzu nukleotidové sekvence DNA.
Značené dNTP byly syntetizovány pomocí přímé jednokrokové cross-coupling reakce
halogenidovaných dNTP ve vodné fázi 7. Značené signální sondy pak byly připravovány
inkorporací modifikovaných dNTP pomocí metody prodlužování primeru (primer extension
method (PEX)) za použití různých DNA polymeráz (Klenowův fragment, DyNAzyme,
Vent(exo-), Pwo - New England Biolabs (UK), PEQLAB (SRN), Finnzymes (Finsko)).
Princip PEX a magnetické separace produktů je ilustrován na Obr. 1. Průběh PEX byl
kontrolován elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Produkty PEX byly separovány
pomocí kitu Qiagen Nucleotide Removal nebo pomocí magnetických kuliček pokrytých
streptavidinem (Dynabeads® M-270 Streptavidin, Dynal A.S. Norsko) – v tomto případě byl
oligonukleotid sloužící jako templát na konci modifikován biotinem, který se specificky váže
na streptavidin. Všechna voltametrická měření byla prováděna za použití
potenciostatu/galvanostatu Autolab (Ecochemie, Holandsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako
pracovní elektroda byla použita elektroda z pyrolytického grafitu (PGE), jako referenční
elektroda byla použita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Analýza
produktů PEX byla prováděna adsorptivní přenosovou rozpouštěcí voltametrií s vnuceným
pravoúhlým napětím (AdTS SWV). Značené dNTP byly analyzovány pomocí konvenční
SWV. Všechna měření byla prováděna při laboratorní teplotě a za přístupu vzduchu. Pouze
v případě analýzy v ON modifikovaných nitroskupinou byl kyslík z roztoku odstraněn.
60
prodlužovaný úsek
primer
biotin
templát
DNA polymeráza
+ dNTP
DB-STV
oplach
denaturace a oddělení řetězců
měření
Obr. 1. Schéma PEX inkorporace značených dNTP a separace modifikovaného řetězce
pomocí magnetických kuliček se streptavidinem (DB-STV).
Výsledky a diskuse
Cross-coupling reakcí byly připraveny dNTP značené ferocénem, nitro nebo amino skupinou,
komplexy Ru(II) nebo Os(II) a tetrathiafulvalenem (Obr.2).
A
B
C
D
Obr. 2 dNTP značené: ferocénem (A), nitro skupinou (B), tetrathiafulvalenem (C) a
[Ru(bipy)3]2+ (D).
Jejich elektrochemické chování bylo studováno pomocí elektrochemických metod především
na PGE (ke studiu dNTP značených nitroskupinou byly použity i rtuťové elektrody). Tyto
61
dNTP pak byly inkorporovány do molekul DNA pomocí PEX. Připravené značené ON byly
analyzovány na uhlíkových a rtuťových elektrodách (Obr.3). Některé z takto značených ON
byly použity jako signální sondy při vývoji senzorů pro detekci bodových mutací (tzv.
jednonukleotidových polymorfizmů (SNP)).
ferocén
[Os(bipy)3]2+
NH2
redukce
7-deazaG
oxidace
NO2
Obr. 3. Elektrochemické „multicolor“ značení DNA pomocí dNTP modifikovaných různými
elektroaktivními skupinami.
Závěr
dNTP značené různými elektroaktivními značkami připravené cross-coupling reakcí byly
inkorporovány do molekul DNA pomocí PEX za užití různých DNA-polymeráz. Takto
vzniklé signální sondy byly použity při vývoji senzorů pro analýzu nukleotidové sekvence
DNA.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu GA AVČR (IAA 400040903 a IAA400040901),
podporou MŠMT centru základního výzkumu LC06035 a institucionálními výzkumnými
plány AV0Z50040507 a AV0Z50040702.
Literatura
1. Palecek E.: Electroanalysis 21, 239 (2009).
2. Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 6, 2233 (2008).
3. Brazdilova P., Vrabel M., Pohl R., Pivonkova H., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem.-Eur. J. 13, 9527 (2007).
4. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem., Int. Ed. 47, 2059 (2008).
Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem. Eur. J. 15, 1144 (2009).
6. Riedl J., Horakova P., Sebest P., Pohl R., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Eur. J. Org.
Chem. 3519 (2009).
7. Capek P., Pohl R., Hocek M.: Org. Biomol. Chem. 4, 2278 (2006).
62
Development of the Scope of Polarography with Time (Review)
Michael Heyrovský
J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Abstract
The classical definition of polarography was "electrolysis with dropping mercury electrode
(DME)". This definition characterized originally d.c. voltage-controlled method containing
theoretical equations of different currents obtained with DME as well as its practical
applications in analysis and in general science. Gradually, next to dropping electrode other
types of mercury electrodes were used, as streaming and hanging drop. Development of the
instrumental side of polarography introduced also methods of current-controlled electrolysis
and beside pure mercury also amalgam electrodes. Nowadays polarography can be best
characterized as physico-chemical branch of science developed from simple electrolysis with
dropping mercury electrode.
Key Words: Dropping mercury electrode, Polarography, Half-wave potential, Hanging
mercury drop electrode, Voltammetry, Chronopotentiometry.
Introduction
In order to improve precision and reproducibility of measurements of electrocapillarity of
mercury by Gabriel Lippmann’s capillary electrometer, Bohumil Kučera 1 suggested
replacing the stationary method by weighing electrically polarized spontaneously renewed
drops of mercury falling out of a glass capillary into the solution. When instead of weighing
the mercury drops Jaroslav Heyrovský then started measuring electric current flowing through
the Kučera’s circuit 2, a new exact electrochemical method was born. The precise
reproducibility of current - voltage curves measured with dropping mercury electrode (DME)
was in fact realization of the Walther Nernst´s idea of an electrochemical analogy of
spectroscopic methods 3. After recording of the current - voltage curves was made
automatic 4, the method has been called polarography, as it was providing graphs which
characterized electrochemical polarization. Later Kolthoff and Laitinen 5 suggested general
term "voltammetry" for potential-controlled electrolytic methods irrespective of the type of
working electrodes used. That term was later approved of by the IUPAC nomenclature
commission, so that officially polarography became voltammetry with DME.
Theory
The reproducibility of experimental measurements allowed exact theoretical formulations of
equations of polarographic instantaneous and mean currents passing through the DME,
controlled by the rates of migration and of diffusion of electroactive substances, of various
chemical and electrochemical reactions and of catalytic and adsorption processes 6-11. Special
attention of theoreticians was concentrated on the reversibility of electrode reactions. As the
polarographic curves because of their shapes were called waves, the quality of
polarographically active species was characterized by their half-wave potentials - many tables
of polarographic half-wave potentials of various chemical species have been published 12. The
high precision of polarography allowed theoreticians to improve the exactness of their
theoretical models of currents - e.g., it has been experimentally verified that electroactive
particles in polarography move towards the electrode according to experimental conditions either by spherical or by linear diffusion 13,14. Some authors applied definite current to the
polarographic electrode system and measured the changes of the indicator electrode potential
with time; there appeared theoretical equations for various mechanisms of the corresponding
chronopotentiometric electrode reactions 15,16.
63
Instrumental development
During his life-time J. Heyrovský considered polarography as physico-chemical method with
wide applications in analytical chemistry and in other areas of research. In course of Second
World War polarography was mainly used for its analytical applications. That led then and in
the following years to various instrumental modifications of the original, so-called d.c., or
classical polarography. There appeared in-phase and out-of-phase a.c.polarography, d.c. and
a.c. oscillographic polarography, tast polarography, square-wave polarography, normal and
differential pulse polarography, chronopotentiometry and many other modified methods 6.
Their main aim was to increase the analytical sensitivity; some served to study kinetics and
reversibility of the electrode reactions, some - like the a.c. polarography - enabled precise
measurements of surface tension and of differential capacity of the electrode and thereby of
adsorption at the electrode surface. At present the various modifications of polarographic
measurements are carried out by single computer-controlled instruments equipped with
variety of appropriate software programs.
Voltammetry
Especially important in the development of polarography was introduction of the hanging
mercury drop electrode (HMDE), although electrolysis with stationary working electrode
does not officially belong to polarography, but to voltammetry. Many new instrumental
methods developed originally for DME have been applied also to HMDE. The HMDE
spurred the development of d.c. current-controlled electrolysis, called constant current
chronopotentiometry. The combination of dropping and hanging mercury drop electrodes
brings many advantages for exact electrochemical research, both basic and applied. It allows
to achieve highest sensitivities of analytical determinations by accumulating the studied
species under constant potential at constant electrode surface for certain time and then by
"stripping" it, i.e., by tracing its electrochemical reaction during the following potential scan.
Methods of voltammetry widen the field of research of electroactive species from true
solutions to systems of various degrees of dispersion 17-19. Very important contribution to
electrochemical studies is the combination of direct current derivative chronopotentiometry
with catalytic evolution of hydrogen which produces a sensitive signal called peak H - it
enables study of properties of many biomacromolecules, including peptides, proteins,
polysaccharides and nucleic acids 20, 21. Utilizing drawn-out capillaries for generating
miniature mercury drops 22 the measurements can be carried out in minute solution volumes.
Present state
While the role of mercury as electrode material in electrochemistry is undisputable, to satisfy
the actual unjustified fear of mercury the present polarography/voltammetry offers silver
amalgam electrodes 23, which behave electrochemically much like pure mercury electrodes,
and being mechanically more sturdy than those, allow precise measurements also in field
conditions. It can be said that what is nowadays understood by polarography in wider sense is
the result of 80 years of complex development of d.c. polarography together with
voltammetry and chronopotentiometry, which has become a basically electrochemical branch
of science with refined physico-chemical theory and numerous highly sensitive
applicabilities, built on exceptionally low-cost instrumentation.
Acknowledgement
The author thanks the Czech GAAV, grant No. IAA 400400806, for financial support.
64
References
1. Kučera G.: Drud. Ann. Phys., IV. F. 11, 529, 698 (1903).
2. Heyrovský J.: Chem.Listy 16, 256 (1922).
3. Bennewitz K.: Naturwiss. 31, 268 (1943).
4. Heyrovský J., Shikata M.: Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 44, 496 (1925).
5. Kolthoff I.M., Laitinen H.A.: Science 92, 152 (1940).
6. Bard A.J., Faulkner L.R.: Electrochemical Methods. Fundamentals and Applications.
John Wiley and Sons, New York 2001.
7. Wang J.: Analytical Electrochemistry. Wiley-VCH, New York 2000.
8. Kalvoda R.: Electroanalytical Methods in Chemical and Environmental Analysis.
Springer 1987.
9. Bond A.M.: Modern Polarographic Methods in Analytical Chemistry. Marcel Dekker,
New York 1980.
10. Heyrovský J., Kůta J.: Principles of Polarography. Academic Press, New York 1966.
11. Meites L.: Polarographic Techniques. Interscience, New York 1965.
12. Meites L., Zuman P., Rupp E.B., Fenner T.L., Narayanan A.: CRC Handbook Series in
Organic Electrochemistry. Vol. I.-VI. CRC Press, Boca Raton, Florida 1983; CRC
Handbook Series in Inorganic Chemistry. Vol. I.-VII. CRC Press, Boca Raton, Florida
1986.
13. Koutecký J.: Czechoslov. J. Phys. 2, 50 (1953).
14. Nicholson R.S., Shain I.: Anal. Chem. 36, 706 (1964), correction ibid. p.1212.
15. Delehay P., Berzins T.: J. Am. Chem. Soc. 75, 2486 (1953).
16. Fischer O., Dračka O.: Coll. Czech. Chem. Commun. 27, 2727 (1962).
17. Korshunov A.V., Heyrovský M.: Electroanalysis 18, 423 (2006).
18. Korshunov A.V., Heyrovský M., Bakardjieva S., Brabec L.: Langmuir 23, 1523 (2007).
19. Korshunov A.V., Heyrovský M.: Elchim.Acta 54, 6264 (2009).
20. Paleček E., Scheller F., Wang J. (Eds): Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins.
Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics. Elsevier, Amsterdam
2005.
21. Paleček E.: Electroanalysis 21, 239 (2009).
22. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002).
65
Ten Years of Bismuth Electrodes in Modern Electroanalysis
Samo B. Hocevar and Bozidar Ogorevc
Analytical Chemistry Laboratory, National Institute of Chemistry, Hajdrihova 19,
SI-1000 Ljubljana, Slovenia, E-mail: [email protected]
Abstract
It has been ten years since the first report about the application of bismuth film electrode
(BiFE) in anodic stripping voltammetry. This first report was focused on measurement of only
few heavy metal ions in combination with in-situ preparation of the BiFE at the surface of a
glassy carbon electrode and carbon fiber microelectrode serving as substrate transducers.
Following some further early introductory reports, many groups have been encouraged to
explore and exploit the attractive characteristics of the novel electrode, and by now, bismuth
based electrodes have been well-accepted in many electroanalytical laboratories world wide
and represent, along with their different configurations, an efficient alternative for their most
commonly used mercury counterpart.
Key Words: Bismuth electrode, Trace metal analysis, Electrochemical Stripping analysis.
Introduction
Advanced electrochemical techniques undeniably take an important place in contemporary
electroanalysis, in particular due to their several inherent features, such as relatively
inexpensive, simple and portable instrumentation and straightforward operation, which
facilitates rapid environmental monitoring, biomedical measurements, and industrial control,
and enables convenient miniaturization of the electrodes/sensors down to micro- or even
nano-meter size, thus offering unsurpassed suitability for operation in more challenging
environments, such as measurements at micro-locations and in micro-volume samples etc. 1.
Among electrochemical techniques, particularly electrochemical stripping analysis attracts
great attention as one of the most convenient protocols for measuring analytes, e.g. trace
heavy metal ions, at their very low concentration levels, due to its characteristic and unique
ability of pre-concentrating analytes of interest at/in the surface of the working electrode 2.
Hitherto, a great variety of electrode materials have been examined to successfully address
this task, such as gold, platinum, silver, mercury, iridium, a number of alloys and amalgams,
different modifications of carbon, etc. 3-8. However, owing to the unsurpassed
electroanalytical (stripping) performance of mercury over the other proposed electrode
materials, and despite of its well-known toxicity and difficulties associated with its handling,
storage and disposal, different configurations of mercury based electrodes have been widely
used in the last six decades for these purposes 9-10.
In a search for a novel, environmentally friendly alternative, the bismuth film electrode
(BiFE) was introduced and reported in the year 2000 as an attractive replacement for mercury
film electrode approaching mercury's electroanalytical performance and in certain cases even
surpassing it 11. By now, bismuth based electrodes have been widely accepted in numerous
electrochemical laboratories and have been suggested in different configurations, e.g. in-situ
and ex-situ bismuth film electrode (BiFE), bismuth bulk electrode (BiBE), bismuth powder
modified carbon paste electrode (Bi-CPE), Bi2O3-modified carbon paste electrode, etc. 11-15.
There is a plethora of metal analytes which have been conveniently measured using bismuthbased electrodes, e.g. lead, cadmium, zinc, indium, thallium, tin, copper, nickel, cobalt,
aluminum, iron, selenium, arsenic, uranium, chromium, molybdenum, vanadium etc., by
means of different stripping protocols, e.g. anodic stripping voltammetry, adsorptive stripping
voltammetry and potentiometric stripping analysis, and using different complexing agents
when necessary 11,16-27.
66
There is also a constantly increasing selection of works reporting on organic compounds
which can be successfully measured with bismuth-based electrodes, e.g. aminosalicylate
drugs, cystein, nitrophenols, daunomycin, thiamethoxam, metamitron, tetracycline, azo dyes,
methyl paration and some others 28-36.
Apart form its non-toxic character, one of the most important feature of the bismuth based
electrode is a relatively wide operational potential window with favorably negative hydrogen
overvoltage and its insensitivity towards dissolved oxygen. Fig. 1 depicts the comparison of
the accessible operation potential windows of the ex-situ prepared mercury (a) and bismuth
(b) film electrode. Under these conditions, it is evident that bismuth electrode posses very
similar character to that of its mercury counterpart in both anodic and cathodic region of its
voltammetric operation.
Fig. 1. Comparison of the accessible operational potential windows of the ex-situ prepared
mercury (a) and bismuth (b) film electrodes prepared at the glassy carbon substrate electrode.
Linear scan voltammetry with a scan rate of 100 mV s-1 in 0.01 M HCl.
Further comparison of the ex-situ plated bismuth film electrode (a) and the ex-situ prepared
mercury film electrode (b) also reveals favorable electroanalytical properties of the bismuth
electrode. From Fig. 2, it can be seen, that both signals for Pb(II) and Cd(II) are shifted
slightly towards more negative potentials, and, at the same time, exhibiting somewhat broader
potential window between the stripping signals of Pb(II) and Cd(II). This propitious feature
might allow measurement of another potentially interesting metal analyte in-between these
two stripping signals, e.g. Tl(I).
67
Current / μA
a
Cd
Pb
5 μA
b
-1
-0.8
-0.6
-0.4
Potential / V vs Ag/AgCl
Fig. 2. Anodic stripping voltammograms for 60 μg L-1 Pb(II) and Cd(II) in 0.01 M HCl
recorded at the ex-situ prepared bismuth (a) and mercury (b) film electrode. Square wave
anodic potential scan with a deposition potential of -1.0 V and deposition time of 60 s.
Conclusions
The introduction of bismuth electrode has opened a new chapter in the contemporary
electroanalysis and has paved a new "environmentally friendly" way of using electrochemical
(stripping) techniques, which have started to be pushed slowly behind due to several strict
regulations / provisions against the application of mercury, unfortunately sometimes also
exaggerating. It seems that bismuth-based electrodes have successfully entered many
electroanalytical laboratories and have been subjected to several interesting studies. Recently,
a great number of the applied-oriented researches have emerged as a logical continuation of
the first, early stage investigation focused mainly toward introduction of new analytes and
studying the fundamentals of bismuth electrode.
Acknowledgements
Financial support from the Slovenian Research Agency (P1-0034, and BI-CZ/09-10-004) is
gratefully acknowledged.
References
1. Zoski C. G.: Electroanalysis 14, 1041 (2002).
2. Wang J.: Analytical Electrochemistry, 3rd ed.; Wiley-VCH: Hoboken, New York 2006.
3. Achterberg E. P., Braungardt C.: Anal. Chim. Acta 400, 381 (1999).
4. Wang J., Tian B.: Anal. Chem. 65, 1529 (1993).
5. Nolan M. A., Kounaves S. P.: Anal. Chem. 71, 3567 (1999).
6. Wang J., Hocevar S. B., Deo R. P., Ogorevc B.: Electrochem. Commun. 3, 352 (2001).
7. Mikkelsen Ø., Schrøder K. H.: Electroanalysis 13, 687 (2001).
8. Fischer J., Barek J., Yosypchuk B., Navratil T.: Electroanalysis 18 127, (2006).
9. Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005).
10. Economou A., Fielden P. R.: Talanta 46, 1137 (1998).
68
11. Wang J., Lu J. M., Hocevar S. B., Farias P. A. M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218
(2000).
12. Hocevar S. B., Daniele S., Bragato C., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 53, 555 (2007).
13. Pauliukaite R., Hocevar S. B., Ogorevc B., Wang J.: Electroanalysis 16, 719 (2004).
14. Hocevar S. B., Svancara I., Vytras K., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 51, 706 (2005).
15. Krolicka A., Pauliukaite R., Svancara I., Metelka R., Bobrowski A., Norkus E.,. Kalcher
K, Vytras K.: Electrochem. Commun. 4, 193 (2002).
16. Wang J., Lu J. M.: Electrochem. Commun. 2, 390 (2000).
17. Wang J., Lu J. M., Kirgöz Ü. A., Hocevar S. B., Ogorevc B.: Anal. Chim. Acta 434, 29
(2001).
18. Hutton E. A., Hočevar S. B., Mauko L., Ogorevc B.: Anal. Chim. Acta 580, 244 (2006).
19. Wang J., Lu D.-L., Thongngamdee S., Lin Y.-H., Sadik O. A.: Talanta 69, 914 (2006).
20. Hutton E. A., Hočevar S. B., Ogorevc B., Smyth M. R.: Electrochem. Commun. 5, 765
(2003).
21. Chatzitheodorou E., Economou A., Voulgaropoulos A.: Electroanalysis 16, 1745
(2004).
22. Lin L., Thongngamdee S., Wang J., Lin Y.-H., Sadik O. A., Ly S.-Y.: Anal. Chim. Acta
535, 9 (2005).
23. Bobrowski A., Nowak K., Zarębski J.: Anal. Bioanal. Chem. 382, 1691 (2005).
24. Wang J., Thongngamdee S., Lu D.-L.: Electroanalysis 18, 59 (2006).
25. Kefala G., Economou A., Sofoniu M.: Talanta 68, 1013 (2006).
26. Long J.-J., Nagaosa Y.: Anal. Chim. Acta 593, 1 (2007).
27. Long J.-J., Nagaosa Y.: Anal. Sci. (Japan) 23, 1343 (2007).
28. Nigović B., Simunić B., Hočevar S. B.: Electrochim. Acta 54, 5678 (2009).
29. Baldrianová L., Agrafiotou P., Švancara I., Vytřas K., Sotiropoulos S.: Electrochem.
Commun. 10, 918 (2008).
30. Du D., Ye X.-P., Zhang J.-D., Liu D.-L.: Electrochim. Acta 53, 4478 (2008).
31. Claux B., Vittori O.: Electroanalysis 19, 2243 (2007).
32. Sattayasamitsathit S, Thavarungkul P., Kanatharana P.: Electroanalysis 19, 502 (2007).
33. Sánchez Arribas A., Bermejo E., Chicharro M., Zapardiel A.: Electroanalysis 18, 2331
(2006).
34. Guzsvány V., Kádár M., Gaál F., Bjelica L., Tóth K.: Electroanalysis 18, 1363 (2006).
35. Bučková M., Gründler P., Flechsig G.-U.: Electroanalysis 17, 440 (2005).
36. Hutton E. A., Ogorevc B., Smyth M. R.: Electroanalysis 16, 1616 (2004).
69
Proton Transfer across a Liquid|Liquid Interface Facilitated by Phospholipid Interfacial
Films
a
a
Karel Holub , Hana Jänchenová , Karel Štulík a,b, and Vladimír Mareček a
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
b
Hlavova 2030/8, 128 43 Prague 2, Czech Republic
Abstract
The five-step mechanism proposed earlier for the formation of phospholipid films at
aqueous/organic interfaces and for their behavior involving transfer of protons from the
aqueous to the organic phase was further studied by cyclic voltammetry. A theoretical model
was created for this mechanism and compared with the experimental results. Both the
experimental and theoretical results support the proposed mechanism and evaluate the
importance of the individual steps. It seems that the decisive step is the regeneration of the
zwitterionic form of the phospholipid at the interface, ensuring stability of the film in time
and its continuous functioning.
Key Words: Liquid|liquid interfaces; Proton transfer; Phospholipid layers; L-α-lecithin
(DPPC); Theoretical model; Cyclic voltammetry.
Introduction
Modeling of certain interactions occurring at biological cell membranes is one important
aspect of studies of interfaces between two immiscible electrolyte solutions (ITIES). The
formation of phospholipid films formed by L-α-lecithin (DPPC) at water/organic interfaces
and some properties of these films have recently been studied electrochemically, using
systems of weakly acidic aqueous electrolyte solutions. Cyclic voltammetric measurements
and determination of surface tension at the interface have led to the formulation of a five-step
mechanism for the formation of a DPPC layer at the interface and for its interactions with the
components of the two phases,
L±(o)
1
2
3
4
5
+
+
+
' L (ads) + H (w) ' HL (ads) ' HL (o) + A (o) → HLA(o) → HA(o) + L±(o).
±
(1)
In the first step, the DPPC zwitterion L± present in the organic phase (o), is adsorbed at the
interface, attaining an adsorption steady state or equilibrium. Subsequently it undergoes an
acid-base interaction with the hydrogen ions present in the aqueous phase (w), which leads to
a steady state or even an equilibrium in the adsorbed state (step 2). The protonated form
attains an adsorption/desorption steady state or equilibrium in step 3 and then it takes part in
homogeneous reactions in the organic phase. These reactions (steps 4 and 5) involve the
organic base anion, A-, and lead first to the formation of ion pair HLA(o) and then to
regeneration of the DPPC zwitterion which can again be adsorbed at the interface, regardless
of the potential difference across it.
In view of the general importance of controllable proton transfer across interfaces (see, e.g.,
modelling of biological membranes, or numerous technological applications), the present
paper is concerned with a more detailed study of the crucial steps of mechanism (1). To be
able to estimate their rates in dependence on some experimental parameters, an attempt is
made at formulation of a simplified mathematical model and at a comparison of the computed
values with the experimental data.
70
Formulation of a partial mathematical model of mechanism (1)
This model should permit a direct comparison with the results of the cyclic voltammetric
experiments and thus it considers the kinetics of only some of the five steps of mechanism
(1). It is assumed that a sufficient time has been allowed for the formation of a stationary
adsorbed layer of DPPC at the interface (step 1). Then the rates of its
protonation/deprotonation reactions (step 2) are characterized by rate constants k1/k2,
respectively. The protonated form is partially desorbed into the organic phase (step 3); it is
assumed that this process is sufficiently rapid and that a steady-state or an equilibrium has
been established. The rate of the reaction of the desorbed protonated form with the anion
present in the organic phase (step 4) is then characterized by rate constant k5 and the rate of
regeneration of the original DPPC (step 5) by rate constant k6.
The computing results can be demonstrated in a simplified form in Fig. 1. a-f, where the
important cyclic voltammetry characteristics of the process are plotted against combinations
of rate constants k5 and k6. As can be seen from Fig. 1.a,b, the forward peak current is
primarily affected by constant k6, whereas the reverse peak current by constant k5. Similar
effects can be observed for the forward and reverse peak potentials, see Fig. 1.d,e.
3.2
1.4
3.0
1.2
0.5
1.0
F
F
0.6
0.2
2.4
0.4
2.2
0.2
0
25
50
75
0.0
100
0.1
0
25
k / s-1
75
0.0
100
25
530
510
100
500
90
80
480
50
k / s-1
6
d
75
100
60
R
460
70
50
F
R
470
40
450
30
440
20
515
25
430
100
c
E - E / mV
E / mV
F
520
75
6
490
525
50
k / s-1
b
535
0
0
6
a
E / mV
50
k / s-1
6
510
0.3
R
R
2.6
0.4
0.8
i /i
i / A m-2
2.8
i / A m-2
0.6
10
0
25
50
k / s-1
6
75
100
0
25
50
75
k / s-1
6
e
f
Fig. 1. Computed dependences of the forward (a) and reverse (b) peak currents, their ratio (c),
the forward (d) and reverse (e) peak potentials and the difference of the peak potentials (f) on
the combinations of rate constants k5 and k6. The constant k5 values (s-1): 0 (), 25 (z), 50
(c), 75 (d) and 100 (¡).
A comparison of the theoretical and experimental values
In view of the complexity of the system and of many simplifications which have necessarily
been involved, only selected parameters are compared in Table I. As follows from this table,
71
100
the agreement between the experimental and theoretical values is rather poor. The main
reason lies in the fact that the comparison has been obtained for only one value of the
potential scan rate. If we take into account several potential scan rates, the effect of the
experimental errors is decreased and the agreement between the theory and experiment
improved (see Table II). A further improvement could be attained by increasing the number
of combinations of the rate constants k5 and k6 at several values of the potential scan rates,
which would, however, make the calculation of the model much more complicated.
Table I.
A comparison of the theoretical and experimental peak parameters for the potential scan rate
v = 3 V s-1.
Theory
Experiment
-1
k5 [s ]
0
50
50
100
k6 [s-1]
0
0
50
50
-2
IF [A m ]
2.253
2.321
2.619
2.828
2.40
IR [A m-2]
1.253
0.313
0.372
0.244
1.45
IR/IF
0.556
0.135
0.142
0.086
0.6
EF [V]
0.516
0.514
0.523
0.526
0.555
ER [V]
0.487
0.504
0.456
0.436
0.498
EF - ER [V]
0.029
0.010
0.067
0.090
0.057
Table II.
Slope and intercept values for the forward peak current dependence on the potential scan rate
(0.5 to 3.0 V s-1), calculated for different values of the rate constants k5 and k6 and their
comparison with the corresponding experimental values.
Theory
Experiment
k5 [s-1]
0
50
50
100
k6 [s-1]
0
0
50
50
slope [A s m-2 V-1] 0.730 0.742 0.633 0.638
0.752
-2
intercept [A m ]
0.065 0.100 0.710 0.913
0.173
Conclusions
It is demonstrated that the theoretical and experimental values match semiquantitatively,
supporting the proposed mechanism, and that the critical parameter is rate constant of step 5.
Therefore, it can be assumed that the regeneration of the DPPC zwitterion is the reaction rate
determining step in the whole five step cycle. The system is very complex and thus both the
experimental approach and the model created are simplified considerably. A further progress
will depend on extending the spectrum of the experimental methods employed and on
gradually making the model more sophisticated.
Acknowledgement
The support of this work by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (grant No. LC06063) and by the Grant Agency of the Academy of Sciences (grant
No. IAA400400806) is gratefully acknowledged.
Reference
1. Holub K., Jänchenová H., Štulík K., Mareček V.: J. Electroanal. Chem. 632, 8 (2009).
72
Utilization of Biocatalytic Signal Amplification in Electrochemical Analysis of
Nucleotide Sequences
(Využití biokatalytické amplifikace signálu při elektrochemické analýze nukleotidových
sekvencí)
a,b
Petra Horáková , Zdenka Vychodilová b, Eva Šimková b, and Miroslav Fojta b
a
b
Institute of Biophysics AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
Abstract
This contribution presents overview of typical applications of electrochemical enzyme-linked
techniques for sequence-specific DNA sensing. These techniques are based on biocatalytic
amplification of the measured signal using enzymes. Each enzyme molecule, tethered to
biotinylated DNA via streptavidin-biotin bond, can catalyze conversion of many molecules of
a suitable substrate into detectable product. Analysis of nucleotide sequences can be founded
on two approaches: hybridization of biotinylated probe with target DNA or sequence-specific
incorporation of biotin-labeled nucleotides into DNA by primer extension. These methods
were used for the detection of specific DNA sequences, monitoring of gene expression,
detection of trinucleotide repeats and SNP typing.
Key Words: DNA sequence, DNA hybridization, Electrochemical detection, Biocatalysis,
Enzyme.
Úvod
Deoxyribonukleová kyselina (DNA) je biopolymer, jehož hlavní funkcí je uchovávání, přenos
a vyjádření genetické informace. Strukturní jednotkou DNA jsou nukleotidy skládající se ze
zbytku kyseliny fosforečné, cukerné složky (2-deoxy-D-ribosy) a dusíkaté báze (adeninu,
guaninu, cytosinu nebo thyminu). Pořadím nukleotidů, resp. dusíkatých bází, tj. sekvencí, je
určen genetický kód, který je specifický pro každý organismus. Změny nebo poškození tohoto
kódu mohou vést k vážným onemocněním, mnohdy přenosným do dalších generací. Analýza
nukleotidových sekvencí je tedy nezbytná nejen pro základní molekulárně biologický
výzkum, ale její uplatnění je zejména v klinické diagnostice, zemědělství, forenzní
diagnostice a při detekci patogenů.
Enzymy jsou specifické bílkoviny schopné katalyzovat přeměnu substrátu na produkt za
daných podmínek. Detekce DNA nebo jiných biomolekul jako protilátek, bílkovin, atd. s
navázanými enzymy jako značkami je velmi výhodné, protože jedna molekula enzymu může
katalyzovat úbytek mnoha molekul substrátu, resp. vznik mnoha molekul produktu, čímž
dochází k výrazné amplifikaci sledovaného signálu. Toho je běžně využíváno v mnoha
standardně zavedených metodách, např. imunochemická technika zvaná ELISA 1,
kolorimetrické nebo chemiluminiscenční techniky využívající enzymem značené protilátky 2,3
a další. Bylo navrženo také mnoho elektrochemických metod analýzy DNA založených na
detekci substrátu a/nebo produktu enzymové reakce, které se od sebe liší svými
elektrochemickými vlastnostmi. Ve většině případů je substrát elektrochemicky neaktivní a
vhodnou metodou se sleduje nárůst signálu elektrochemicky aktivního produktu. Nejčastěji
jsou voleny enzymy ze skupiny oxidoreduktáz nebo hydroláz (např. peroxidáza, alkalická
fosfatáza, β-galaktosidáza a další).
Enzym je připojen k DNA nejčastěji pomocí vazby avidinu nebo streptavidinu s biotinem,
přičemž komerčně dostupné konjugáty enzymu se (strept)avidinem jsou navázány na
73
molekuly DNA nesoucí biotin. Komerčně dostupné jsou také konjugáty enzymů se
sekundární protilátkou, která se váže přes primární protilátku na rozpoznávanou molekulu.
V tomto příspěvku jsou představeny některé vybrané možnosti detekce různých
nukleotidových sekvencí využívající amplifikaci signálu enzymovou reakcí.
Přítomnost určité sekvence nukleotidů ve vzorku DNA je nejčastěji zjišťována pomocí
hybridizace, při níž se značená signální sonda (krátký oligonukleotid o známé sekvenci) váže
ke komplementárnímu úseku cílového řetězce (Obr.1A). Jinou možností je využití metody
prodlužování primerů, tzv. primer extension (PEX) (Obr.1B). I při tomto uspořádání dochází
k sekvenčně-specifické hybridizaci cílové DNA s krátkým úsekem DNA, avšak tento
oligonukleotid (primer) je enzymem DNA polymerázou prodloužen o nově inkorporované
nukleotidy podle cílové DNA, která slouží jako templát. Jsou-li v reakční směsi přítomné
nukleotid trifosfáty modifikované biotinem, dojde k jejich zařazení do nově vznikajícího
řetězce a tím ke vzniku úseku DNA nesoucího několik biotinů schopných navázat enzym.
Výsledky a diskuse
Jednoduchý postup byl navržen pro analýzu sekvence DNA pomocí hybridizace
s biotinylovanou sondou 4 (Obr.1A). Cílová DNA byla samovolnou adsorpcí zachycena na
uhlíkových tištěných elektrodách (screen-printed carbon electrode, SPCE) a volný povrch
elektrody byl zablokován hovězím sérovým albuminem (BSA). Po hybridizaci se sondou
nesoucí biotin a navázání streptavidinu s alkalickou fosfatázou (ALP) byla elektroda s celým
imobilizovaným komplexem ponořena do základního elektrolytu obsahujícího
elektroneaktivní 1-naftylfosfát, který byl během krátké inkubace přeměněn na 1-naftol
detegovaný lineární voltametrií. Tato procedura byla aplikována při analýze krátkých
oligonukleotidů, fragmentů genů p53 a rbcL amplifikovaných PCR, a také při analýze exprese
genu rbcL v různých tkáních rostliny tabáku.
Také druhý přístup, založený na začlenění biotinylovaných nukleotidů do DNA pomocí PEX
(Obr.1B), byl využit pro detekci fragmentů genů p53 a rbcL a exprese genu rbcL
v rostlinných tkáních 4. Prodloužený primer nesoucí značené nukleotidy byl adsorpcí
imobilizován na SPCE, jejíž volný povrch byl opět blokován BSA. Po navázání streptavidinu
s ALP byla SPCE ponořena do elektrolytu s 1-naftylfosfátem a byl detegován pík
odpovídající enzymovému produktu.
Signál 1-naftolu získaný po PEX inkorporaci biotinylovaných nukleotidů byl výrazně vyšší
než po hybridizaci stejné cílové DNA adsorbované na SPCE s biotinylovanou sondou
(Obr.1C). To bylo dáno především tím, že primer prodloužený při PEX obsahoval několik
biotinů, tudíž na něj mohlo být navázáno více molekul enzymu, zatímco na koncově značenou
hybridizační sondu, rozpoznávající stejnou sekvenci jako prodlužovaný primer, připadá pouze
jediná molekula enzymu.
74
Obr. 1. Možnosti analýzy nukleotidových sekvencí využívající amplifikaci detekovaného
signálu enzymovou reakcí. A) Schéma analýzy sekvence DNA pomocí hybridizace s
biotinylovanou sondou na povrchu SPCE. B) Sekvenčně specifické včlenění biotinylovaných
nukleotidů do DNA metodou primer extension, PEX. C) Srovnání signálů získaných po PEX
inkorporaci biotinylovaných nukleotidů do primeru prodlouženého podle cílové DNA a po
hybridizaci stejné cílové DNA adsorbované na SPCE s biotinylovanou sondou. D) Stanovení
počtu trinukleotidových opakování v sekvenci DNA pomocí hybridizace s biotinylovanými
sondami. E) Analýza jednonukleotidových polymorfismů založená na PEX prodloužení
primeru o jeden biotinylovaný nukleotid komplementární k SNP místu. F) Schéma
sendvičového uspořádání analýzy DNA, při němž enzymovou reakcí vzniká nerozpustný
produkt, který precipituje na povrchu elektrody a zabraňuje přenosu elektronů mezi
elektrodou a redoxním markerem.
V některých úsecích genomové DNA může docházet k opakování určitého sekvenčního
motivu, např. tří nukleotidů, což může způsobovat vážná onemocnění, jako myotonická
dystrofie, syndrom fragilního X nebo Friedreichova ataxie (opakování tripletů
(GAA)n·(TTC)n). Pro analýzu takovéto sekvence byla navržena metoda využívající
hybridizace krátkých biotinylovaných sond s opakujícími se úseky v cílové DNA na povrchu
grafitové elektrody 5 (Obr. 1D). Detekční postup byl stejný jako u hybridizace s jednou
signální sondou (viz Obr.1A). Po navázání streptavidinu s ALP byl opět detekován signál
1-naftolu, jehož velikost byla závislá na počtu navázaných sond, tudíž na počtu opakování
daného motivu nukleotidů.
DNA je také náchylná k různým změnám v sekvenci nukleotidů, mutacím. Jednou
z nejčastějších je záměna jednoho nukleotidu (resp. páru bází) v řetězci DNA za jiný, tzv.
75
jednonukleotidový polymorfismus (single-nucleotide polymorphisms, SNP), který může vést
k některým onemocněním. Místa a typy SNP jsou známá a jsou pro ně hledány rychlé a
spolehlivé detekční principy. Elektrochemická analýza SNP byla založena na PEX reakci 6
(Obr. 1E), při níž došlo k prodloužení primeru, který tvořil duplex s cílovou DNA těsně u
místa předpokládaného polymorfismu, o jeden nukleotid nesoucí biotin. Při dodržení
optimálních podmínek byl tento nukleotid připojen k primeru pouze tehdy, pokud bylo SNP
místo a značený nukleotid komplementární. Poté byl PEX produkt zachycen na magnetické
částice a došlo-li k připojení biotinylovaného nukleotidu, byl na biotin navázán streptavidin
s ALP, která katalyzovala přeměnu 1-naftylfosfátu na 1-naftol, který byl detegován.
Kromě naftylfosfátu lze jako substrát pro alkalickou fosfatázu použít různé další fosfoestery
fenolů nebo jiné molekuly obsahující fosfát. Např. 5-bromo-4-chloro-3-indoylfosfát ve své
práci využili Patolsky a kol. 7. Cílová DNA byla pomocí „záchytné“ sondy imobilizována na
povrchu elektrody a hybridizována se signální sondou nesoucí biotin. Po navázání
streptavidinu s ALP byla elektroda přenesena do roztoku substrátu, který byl hydrolyzován za
vzniku nerozpustného indigo-derivátu, jehož molekuly precipitovaly na povrchu elektrody a
tvořily tak nevodivou vrstvu zabraňující elektronovému přenosu mezi elektrodou a redoxním
markerem, [Fe(CN)6]3-/4- (Obr. 1F), což bylo detegováno impedanční spektroskopií.
Závěr
Během posledních 20 let bylo navrženo množství metod a senzorů pro elektrochemickou
analýzu DNA, která se zdá být přitažlivá díky možnosti získat informaci o nukleotidových
sekvencích rychlejším, jednodušším a často levnějším způsobem, ve srovnání s tradičními
elektroforetickými metodami. Techniky využívající amplifikaci signálu pomocí enzymové
biokatalýzy se vyznačují vysokou citlivostí umožňující analyzovat i malé množství DNA ve
vzorku. Spojení těchto přístupů proto může vést k vývoji metod a čidel vhodných pro
decentralizovanou analýzu sekvencí DNA v medicíně, soudnictví a jiných odvětvích.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou MŠMT (Centrum základního výzkumu LC06035), AV ČR
(AV0Z50040507 a AV0Z50040702) a GA AVČR (IAA400040901).
Literatura
1. Fojtová M., Bleys A., Bedřichová J., Van Houdt H., Křížová K., Depicker A., Kovařík
A.: Nucleic Acid Research 34, 2280, (2006)
2. Fojta M., Pivoňková H., Brázdová M., Němcová K., Paleček E., Vojtěšek B.: Eur. J.
Biochem. 271, 3865 (2004).
3. Pospíšilová S., Brázda V., Kuchaříková K., Luciani M.G., Hupp T.R., Skládal P.,
Paleček E., Vojtěšek B.: Biochem. J. 378, 939 (2004).
4. Horáková-Brázdilová P., Fojtová M., Vytřas K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008).
5. Fojta M., Brázdilová P., Cahová K., Pečinka P.: Electroanalysis 18, 141 (2006).
6. Horáková P., Šimková E., Vychodilová Z., Brázdová M., Fojta M.: Electroanalysis 21,
1723 (2009).
7. Patolsky F., Lichtenstein A., Willner I.: Chem. Eur. J. 9, 1137 (2003).
76
On the Mechanism of Electrochemical Reduction of Dodecylpyridinium Bromide in
Aprotic Media. An impedance study.
Magdaléna Hromadová a, Viliam Kolivoška a, and Lubomír Pospíšil a
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AV ČR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague,
Abstract
Reduction mechanism of n–dodecylpyridinium bromide (DPBr) in dimethylsulfoxide has
been studied. Based on the classical polarographic methods as well as on the use of AC
voltammetry and impedance spectroscopy techniques it was shown that DPBr is reduced in a
reversible one electron transfer step followed by the dimerization of the corresponding radical
species.
Key Words: Dodecylpyridinium bromide, Reduction mechanism, Impedance spectroscopy.
Úvod
Toto sdělení si bere za cíl prozkoumat redukční mechanizmus n–dodecylpyridinium bromidu
v nepolárních rozpouštědlech s bezprostředním cílem pozdějšího využití těchto znalostí při
studiu redukčních vlastností vodivých molekul na bázi prodloužených viologenů, protože je
obecně známé, že 1,1'–dimethyl–4,4'–bipyridin–1,1'–diium dichlorid (pesticid parakvat) se
připravuje z elektrochemicky redukovaných methylpyridiniových solí 1. Již dříve se studiem
podobných látek s menším alkalickým řetězcem zabývalo několik skupin 2–6. Vesměs všechna
měření byla prováděna ve vodném prostředí. V případě N–methyl-pyridiniových solí dochází
k jednoelektronové redukci na příslušný radikál s následnou dimerizací za tvorby dimeru
tetrahydrobipyridinu. Rychlostní konstanta bimolekulárního procesu (0.1–1)×107 M–1 s–1 byla
v těchto pracích 2,5 odhadnuta s tím, že mechanizmus celého procesu se dá vyjádřit
schematicky následovně:
R
R
+
N
N
+
e
-
R
N
2
H
R
N
H
N
R
Situace je značně komplikovaná v případě látek schopných tvorby micelárních systémů.
Takovým je právě DPBr ve vodním prostředí. Dalším komplikujícím faktorem je silná
adsorpce DPBr a jeho redukčních produktů 4. Z tohoto důvodu byl v této práci použit
dimethylsulfoxid jako nepolární rozpouštědlo.
Dodecylpyridinium bromid byl připraven a laskavě poskytnut pro experimentální účely
v rekrystalizované formě Dr. H. Jehringem (Institut fyzikální chemie, SRN). Další chemikálie
tetrabutylamonium hexafluorofosfát (TBAPF6) a dimetylsulfoxid (DMSO) byly pořízeny od
firmy Aldrich. Dimethylsulfoxid obsahoval méně než 50 ppm vody.
77
K elektrochemickému měření byly využity metody DC polarografie, cyklické voltametrie,
fázově citlivé AC polarografie a AC voltametrie. Jednou z důležitých metod výzkumu
reakčních parametrů byla impedanční spektroskopie. Přístrojové vybavení se skládalo z
rychlého potenciostatu, lock-in zesilovače (Stanford Research Systems, model SRS830) a
dvoukanálového frekvenčního analyzátoru (Stanford Research Systems, model SR780).
Přístroje byly k počítači připojeny přes IEEE-rozhraní (PC-Lab, AdvanTech Model PCL-848)
a sběrnou datovou kartu (PCL-818) pomocí 12-bitového převodníku pro A/D i D/A konverzi.
Výsledky a diskuse
Z hlediska co největšího zjednodušení systému byl DPBr studován v DMSO, kde nebyla
prokázána tvorba koloidních systémů. DC polarografická a voltametrická měření poukazují
na chemicky ireversibilní redukci v DMSO (Obr.1A). Z cyklické voltametrie je zřejmá
redukce DPBr při -1,2 V na produkt, který se oxiduje ireverzibilně při zhruba -0,35 V. Pokud
se mění potenciál od -0,6 V směrem k pozitivnějším hodnotám, tato oxidační vlna chybí, a
tudíž daná látka vzniká až po přenosu elektronu na DPBr reaktant. Výška oxidační vlny je
poloviční, což poukazuje na tvorbu produktu ve zhruba poloviční koncentraci oproti původní
koncentraci DPBr a podporuje tvorbu dimeru. Úplná elektrolýza při potenciálu -1,4 V
potvrdila přenos jednoho elektronu na jednu molekulu DPBr.
-0.6
-0.4
12
A
B
10
cotg φ
i / μA
8
-0.2
0.0
6
4
2
0.2
0
-0.5
-1.0
E/V
-1.5
0
20
40
60
80
100
1/2
ω
Obr. 1. A - Cyklický voltamogram 9.5×10–4 M DPBr v roztoku 0.3 M TBAPF6 v DMSO při
rychlosti polarizace 1V/s, HMDE. B - Analýza fázově citlivých impedančních měření pro
9.5×10–4 M DPBr v roztoku 0.3 M TBAPF6 v DMSO získaná při konstantním potenciálu
-1,18 V (○) a -1,23 V (●), HMDE.
Z fázového úhlu impedančních měření (Obr.1B) lze usuzovat na minimálně dvě časové
konstanty procesů probíhajících v dané soustavě. Při vyšších hodnotách frekvence ω = 2π f
sinusového signálu se směrnice cotg φ proti ω1/2 blíží k nule, což odpovídá velmi rychlému
přenosu elektronu a je důkazem ErevC procesu, přičemž C může být i dimerizace Cdim.
K potvrzení této domněnky byla použita studie redukčních vlastností DPBr při různých
počátečních hodnotách koncentrace reaktantu. Nutno podotknout, že v rozmezí koncentrací
DPBr od 10–6 do 10–3 M nebyly v DC polarografii pozorovány adsorpční předvlny.
V cyklické voltametrii také nebyly pozorovány adsorpční píky v rozmezí rychlostí od
0,05 V/s do 60 V/s (viz. Obr. 1A). Přítomnost adsorpce byla patrná jen z admitančních měření
při srovnání proudové odezvy na kapající a visící kapkové elektrodě při různých dobách
akumulace.
78
-1 .22
-1.1 6
A
-1.1 7
B
-1 .20
E1/2 / V
E/V
-1.1 8
-1 .18
-1.1 9
-1.2 0
-1 .16
49 ± 1 m V
-1 .14
1.5
2.0
2.5
lo g ( i
2 /3
3.0
-1.2 1
-1.2 2
-5.5
21 ± 1 m V
-5.0
-4.5
-4.0
-3.5
-3.0
lo g c
/ i d - i)
Obr. 2. A. Závislost potenciálu na logaritmu DC polarografického proudu pro 9.5×10–4 M
DPBr v roztoku 0.3 M TBAPF6 v DMSO, doba kapky 2s. Směrnice je udána v levém dolním
rohu. B. Závislost půlvlnového potenciálu DC polarografických křivek na logaritmu
koncentrace DPBr v roztoku 0.3 M TBAPF6 v DMSO. Směrnice je v pravém dolním rohu.
Při DC polarografických měřeních byla pozorována lineární závislost limitních proudů na
koncentraci reaktantu, přičemž analýza jednotlivých polarogramů prokázala lineární závislost
potenciálu na logaritmu i2/3/(id-i). Směrnice této závislosti činí 49 ± 1 mV (Obr. 2A), z čeho
vychází hodnota počtu přenesených elektronů 1.2 blízká hodnotě 1 nalezené při úplné
elektrolýze DPBr při -1,4 V. Z koncentračních měření a jejich analýzy v Obr. 2B byla
potvrzena přítomnost bimolekulární reakce, nejpravděpodobněji dimerizace radikálového
produktu. V případě následné monomolekulární reakce půlvlnový potenciál nezávisí na
koncentraci. Směrnice závislosti půlvlnového potenciálu na logaritmu koncentrace činí
21 ± 1 mV (Obr. 2B) a je v souladu s hodnotou 19,6 mV pro reversibilní redukci reaktantu
s následnou rychlou dimerizací produktu 7.
Závěr
Z výše uvedených analýz vyplývá, že dodecylpyridinium bromid se redukuje v nevodném
prostředí podle již dříve navrženého schématu pro redukci methylpyridiniových solí ve vodě.
Výběr prostředí nehraje zásadní roli při vzniku produktů, s jediným rozdílem, že v nevodném
prostředí neexistují komplikované rovnováhy tvorby micel a dochází k potlačení adsorpce
reaktantu a produktů.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu Grantové agentury České republiky (203/08/1157,
203/09/0705) a Grantové agentury Akademie věd AVČR (IAA400400802).
Literatura
1. J. E. Toomey: Electrochemical dimerizations of pyridinium salts. European Patent
EP0226319 (1991) http://www.freepatentsonline.com/EP0226319B1.html.
2. S. G. Mairanovskii: Dokl. Akad. Nauk SSSR 110, 593 (1956).
3. M. Naarová, J. Volke: Collect. Czech. Chem. Commun. 38, 2670 (1973).
4. J. Kůta, L. Pospíšil, I. Smoler, G. P. Girina: J. Electroanal. Chem. 65, 661 (1975).
5. J. G. Gaudiello, D. Larkin, J. D. Rawn, J. J. Sosnowski, E. E. Bancroft, H. N. Blount: J.
Electroanal. Chem. 131, 203 (1982).
6. J. Volke, M. Naarová: Collect. Czech. Chem. Commun. 37, 3361 (1972).
7. J. Koutecký, V. Hanuš: Collect. Czech. Chem. Commun. 20, 124 (1955).
79
Electrode Coating by Chemical Mediator: The Atomic Force Microscopy Study
of Surface Nanomorphology
Věra Hudská a, b, Pavel Janda a, and Hana Tarábková a
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v. v. i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Abstract
Among many different kinds of electrode surface modification procedures, the surface coating
by vaporized mediator solution is still used as a simple and effective method for preparation
of sensing electrode. Surface of glassy carbon (GC) is often used as a supporting collector,
but it requires polishing, rinsing and sonication prior to mediator deposition. In this paper, we
present common methods of modification of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG)
and GC surface, respectively, from the point of surface nanomorphology investigated by
atomic force microscopy (AFM).
Key Words: Atomic Force Microscopy, Carbon electrode, Surface modification.
Introduction
Glassy carbon (GC) is still popular among electrode carbon materials due to its relative
mechanical and chemical resistance and simple cleaning by polishing. The preparation of GC
electrode mounted in Teflon includes polishing with emery paper and alumina, respectively,
followed by ultrasonic cleaning in purified water before each experiment.
Subsequently, there are two, most frequent methods of surface modification:
1) Placing drop of solution containing studied compound on the GC surface 1. Next step may
include drying in air 2, drying under an infrared lamp 3 or in the oven 4.
2) Surface of the electrode is modified by electrodeposition from solution containing studied
compound and the electrolyte. The deposition is carried out by applying repetitive potential
sweeps at certain rate in specific potential range 5.
Scanning probe microscopy (SPM) techniques are successfully employed to characterize
the structure of electrode surfaces 6. In contrary to atomically flat basal plane of highly
oriented pyrolytic graphite (HOPG) glassy carbon has rough and ill-defined surface. We
present here an atomic force microscopy (AFM) study characterizing morphology changes
upon modification of GC and HOPG electrodes, respectively. We demonstrate changes of GC
and HOPG surfaces induced by chemical modification and influences of preparative
procedure on GC surface morphology.
Experimental section
Reagents
Cobalt tetraneopentoxy phthalocyanine (CoTNPc) (Fig. 1) was synthesized in the laboratory
of Tohoku University, Japan, by Kobayashi’s group. Tetrabutylammonium perchlorate
(TBAP, electrochemical grade, > 98%, Fluka) and nonaqueous solvent 1,2-dichlorobenzene
(o-DCB, 99%, Aldrich) were used as received. Purified water (Milli-Q system Gradient,
Millipore, resistivity 18.2 MΩcm) was used for preparation of aqueous electrolytes.
80
OCH2C(CH3)3
(H3C)3CH2CO
N
N
N
Co
N
N
N
N
N
OCH2C(CH3)3
(H3C)3CH2CO
Fig. 1. Structure of the used cobalt tertaneopentoxy phthalocyanine.
Electrode preparation and electrochemical measurements
GC (Union Carbide) electrodes were prepared by polishing with diamond paste (Winter
diaplast) on microcloth. The polished GC was sonicated in nanopure water for 5 min. One
drop of 1 mM CoTNPc solution in o-DCB was placed on the electrode and dried at room
temperature. Basal plane pf highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) 12 mm×12 mm×2 mm
(SPI Supplies, USA) was pealed off with an adhesive tape before each experiment. The fresh
surface of HOPG was treated by two ways:
1)One drop of 1 mM CoTNPc in o-DCB was placed on HOPG and dried at room temperature
2) Cyclic voltammetry of 1 mM CoTNPc in o-DCB mixed with 0.1 M TBAP in o-DCB was
performed on the electrode at a scan rate of 100mV/s. All voltammetric measurements were
performed using potentiostat/galvanostat Wenking POS 2 (Bank Elektronik, Germany)
controlled by the CPC-DA software (Bank Elektronik, Germany). A three-electrode system
was used for all measurements with a saturated calomel reference electrode (SCE) and a silver
wire (Ag) as a quasi-reference electrode, respectively. Platinum wire served as an auxiliary
electrode. All experiments were performed at room temperature in solution deoxygenated
by bubbling with argon for five minutes. Stock solutions were kept in glass vessels in dark
at laboratory temperature.
AFM conditions
Surface topography was characterized by AFM (Multimode Nanoscope IIIa, Veeco, USA)
in tapping and contact mode, respectively. The electrode surface was analysed by commercial
nanoscope III Particle and bearing Analysis Software (Nanoscope Reference Manual, version
5.12r5). The Si cantilever was oscillated at ca. 300 kHz. The surface imaging was performed
with the rate 0.5 and 1.0 Hz, respectively. Images presented here are representative of images
taken at different locations on each sample.
The following sections describe our TM-AFM investigations of modified GC and HOPG
surfaces, respectively. The influence of all steps of the procedure was examined by acquiring
surface topography after polishing, washing and sonication. It was necessary to compare
surfaces after polishing without and with sonicating step to resolve the residua of diamond
paste. Fig. 2 shows 10 x 10 µm topographic image of GC surface after polishing and rinsing
with water (Fig. 2a, 2b) and after polishing and sonicating in water (Fig. 2c, 2d), respectively.
The whole surface after simple washing is covered by diamond media, although the producer
declared that the diamond paste will be washed out by water. Only result after sonication was
satisfactory.
81
A
B
C
D
Fig. 2. AFM characterization of surface roughness of GC. 10×10 µm2 topographic
(z scale = 200 nm) 3D image (A) and top view image (B) after polishing with diamond paste
and rinsing with water. 3D topography (C) and top view image (D) after polishing
with diamond paste and sonicating in water.
We have also employed rinsing with methanol as described in some works 2, where
the methanol or other alcohols 3 were used for rinsing after sonication. We cannot recommend
this step due to contamination of GC by solvent impurity residua.
When the GC surface was covered by thin layer o-DCB and air dried for 12 hours, we were
not able to acquire AFM images in tapping mode due to presence of thin layer solvent even
after 20 hours of drying. We have employed dynamic force analysis in contact mode
for determination the magnitude of deflection hysteresis. Fig. 3 shows low values for freshly
prepared clean native surface and high values for surface with drop of pure o-DCB after 12
hours drying due to adhesion (capillary) forces of solvent layer. The best way to eliminate the
layer of solution was sonication in water and result was the same as in case Fig. 2c.
82
160
120
120
80
80
40
40
Force [nN]
Force [nN]
160
0
-40
0
-40
-80
-80
-120
-120
-160
0
20
40
-160
60
Distance [nm]
0
20
40
60
Distance [nm]
A
B
Fig. 3. Dynamic force vs. distance curves before (A) and after (B) drop of pure o-DCB was
placed on GC surface and dried for 12 hours.
CoTNPc was used as a model compound for modification of surfaces. AFM measurements
have revealed that drop deposition of CoTNPc (Fig. 4a) is characterized by irregular clusters
with variable height (Fig. 4b). This observing is in the contrast to electrodeposition which
allows preparing compact layer of CoTNPc about 25 nm thick (Fig. 4d). This observation
indicates that electrodeposition exhibits progressive stacking and nucleation (Fig. 4c). In case
of drop deposition less compact surface were formed.
A
B
C
D
2
Fig. 4. TM-AFM images of 5×5 µm HOPG surface after modification by drop of 1 mM
CoTNPc dissolved in o-DCB and dried in air (A), corresponding line analysis (B). After
cyclic voltammetry in 1 mM CoTNPc and 0.1M TBAClO4 dissolved in o-DCB and dried (C),
corresponding line analysis (D).
83
The next measurements have been performed to study the influence of rinsing electrode by
o-DCB after electrodeposition. The line analysis indicates that layers of phthalocyanine
deposited and rinsed by o-DCB are thinner than without rinsing surface (Fig. 4c, 4d). Fig. 5b
indicates that phthalocyanine is electrodeposited preferably on HOPG steps.
A
B
Fig. 5. TM-AFM images of 5×5 µm2 HOPG surface after cyclic voltammetry in 1 mM
CoTNPc and 0.1M TBAClO4 dissolved in o-DCB. Electrode was dried after rinsing by pure
o-DCB - top view image (A) and line analysis (B).
Conclusion
We have shown that AFM can provide valuable information on the surface nanomorphology
changes after various treatment procedures. For GC electrodes, AFM indicated that after
polishing and rinsing the surface is covered by abrasive particles from grinding media. Also,
from AFM dynamic force curve measurement follows that o-DCB layer will not evaporate
from the GC surface even after 24 hours. Our experiments have also shown that the best way
for elimination of polishing particles and solvent residua is sonicating in water. This
inconvenience is eliminated at HOPG which surface can be cleaned by peeling off top layers
using adhesive tape.
The HOPG electrode modification by electrodeposition from nonaqueous media opens
pathways for preparation of thin layers of mediator. In comparison with modification by
solution spreading and drying, electrodeposition creates more uniform layer.
Acknowledgements
We are grateful to N. Kobayashi, Tohoku University, Japan for supplying phthalocyanines
used in this work. This financial support of this work by the Grant Agency of Charles
University in Prague (the project SVV 261204), and by the research project
MSM0021620857, the development project RP 14/63 of the Ministry of Education Youth and
Sports of the Czech Republic.
Literature
1. Obirai J. C., Nyokong T.: J. Electroanal. Chem. 600, 251 (2007).
2. Rocha J. R. C., Angnes L., Bertotti M., Araki K., Toma H. E.: Anal. Chim. Acta 452, 23
(2002).
3. Zhu Z., Li N-Q.: Electroanalysis 10, 643 (1998).
4. Maree S., Nyokong T.: J. Electroanal. Chem. 492, 120 (2000).
5. Guan J., Wang Z., Wang Ch., Qu Q., Yang G., Hu X.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 572
(2007).
6. Brülle T., Stimming U.: J. Electroanal. Chem. 636, 10 (2009).
84
The Study of Cadmium – Oxalic Acid Complexes Using DPASV and ESI-MS
(Kombinované studium komplexů Cd s kyselinou šťavelovou pomocí ASV a ESI-MS)
Michal Jakl a, Jana Jaklová Dytrtová b, and Pavel Tlustoš a
a
Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Czech University of
Life Sciences, Kamýcká 129, 165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí
2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, E-mail [email protected]
Abstract
The combination of DPASV with ESI-MS allows a reliable detection of metal complexes
with small organic ligands. The request to exact molecular mass is essential to stoichiometry
design simultaneously with low concentration of the analyte in most of biological matrixes.
By the analysis of model solution consisting of Cd(NO3)2 and oxalic acid (OAH2) these
[Cd(OAH2)(H2O)3]+,
and
structures
were
identified:
[Cd(OAH2)(H2O)2]+,
[Cd(OAH2)(H2O)2(CH3OH)]+. They were also found in soil solution.
Key Words: Electrospray ionization mass spectrometry, Differential pulse anodic stripping
voltammetry, Low-molecular-weight organic acids, Metals.
Úvod
Nízkomolekulární organické kyseliny (LMWOAs; low-molecular-weight organic acids), mezi
které patří zejména kyselina šťavelová, jablečná, fumarová, citronová a další, jsou důležitými
kořenovými exudáty cévnatých rostlin, které se účastní mnoha procesů v půdě spojených
především s úpravou půdního prostředí do mezí vhodnějších pro danou rostlinu 1,2. Konstanty
stability těchto komplexů jsou relativně vysoké 3, stability těchto komplexů však závisí na pH
prostředí. Z tohoto důvodu je třeba jako potenciální ligandy též uvažovat deprotonované
formy (nebo i protonované ve velmi kyselém prostředí). Voltametrie je metoda vysoce citlivá,
avšak není dostatečně selektivní pro speciaci v biologických matricích, proto bylo v této práci
k navržení stechiometrie komplexů využito hmotnostní spektrometrie s ionizací
elektrosprejem (ESI-MS; electrospray ionization mass spectrometry).
Materiál a metody
Půdní roztok
Půdní roztok byl získán z nádobového pokusu, kde byla pěstována vrba Smithova společně
s penízkem modravým v 6 kg půdy z lokality Litavka. V nádobě byla pěstován jeden
exemplář vrby a 3 expemláře penízku. Půdní roztok byl odebírán pomocí nylonových půdních
sond (DI Gottfried Wieshammer, Wien, Austria) po 24 hodinové saturaci deionizovanou
vodou a skladován do analýzy při teplotě 4 °C 4.
Elektrochemické studie
DPASV byla použita v tříelektrodovém zapojení potenciostatu (computer controlled
polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP, Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic),
vybaveným MultiElchem v. 2.1 software (ÚFCHJH, v.v.i., Czech Republic) 5 a POLAR.PRO
software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). Pracovní elektrodou byla visící
rtuťová kapková elektroda (HMDE) (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) referentní byla
Ag/AgCl/KCl(3 mol L-1) (type 10-20+) (ED, Turnov, Czech Republic) a pomocnou Pt-drátek.
Voltamogramy byly pořízeny za konstantní iontové síly s použitím 0,01 mol L-1 NaClO4 jako
základního elektrolytu (Fluka, Suprapur®) 4,6, jehož použití zaručuje zachování původního pH
půdních roztoků. Pro doplňková měření byly použity modelové roztoky sestávající
z Cd(NO3)2 (Analytika, Czech Republic) a kyseliny šťavelové (Merck), jejichž pH bylo
upraveno na hodnotu 5,5 přídavkem NaOH (Fluka, Suprapur®); modelové roztoky byly
85
měřeny za stejných podmínek jako půdní roztoky: potenciál akumulace -900 mV, čas
akumulace 30 s, rozsah -900 to +250 mV, výška pulsu 50 mV, rychlost polarizace 10 mV s-1,
délka pulsu 80 ms, klidový čas 10 s. Před měřením byl z roztoku kyslík odstraněn
probubláváním argonem (10 min).
Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem
ESI-MS byla použita pro ověření stechiometrie komplexů. Kyselina šťavelová byla studována
samostatně s dusičnanem olovnatým, každý o koncentraci 2,5·10-5 mol L-1 v rozpouštědle
metanol/voda (1:1). Tyto roztoky byly studovány pomocí hmotnostního spektrometru s
iontovou pastí spojeným s ionizačním zdrojem (Finnigan LCQ device, ThermoFinnigan, San
Jose, CA, USA) v pozitivním iontovém modu 7. Pro nebulizaci byl použit dusík. Parametry
měření byly: spray voltage 4.5 kV, capillary voltage 3 V, heated capillary temperature 75 –
100 °C, tube lens offset 50 V, sheath gas flow rate and auxiliary gas flow rate 30 arbitrary
units. Vzorek byl dopravován do ESI zdroje přes jehlu rychlostí 5 μL min-1. Hmotnostní
spektra byla nahrána v rozsahu m/z od 50 do 2000.
Kolizně indukovaná disociace (Collision-induced dissociation, CID) hmotnostně vybraného
prekurzoru byla dosažena přes rf-excitaci iontů v atmosféře helia, který působil jako kolizní
partner v iontové pasti. Kolizní energie byla optimalizována pro každé měření a vyjádřena
v hodnotách normalizované kolizní energie (rozsah 0 až 100 %), která koresponduje
s rezonancí exitační energie a kolizního signálu 0 – 2,5 V (zero-to-peak) za sekulární
frekvence zájmového iontu. Tato energie závisí na hodnotě m/z rodičovského iontu, což je
důvod pro její vyjádření v relativních (%) jednotkách a ne v absolutních hodnotách (V).
Výsledky a diskuse
Na voltamogramu půdního roztoku z intercroppingu vrby a penízku (Obr. 1) lze identifikovat
při původním pH, tj. 7,5, pík náležející směsnému komplexu Cd, Pb s kyselinou šťavelovou 4.
Bohužel lze očekávat, že pík „směsného“ komplexu překryl možné píky náležející
komplexům Cd-kyselina šťavelová. Po okyselení na pH 1,5 kyselinou dusičnou došlo k
částečnému rozpadu komplexů přítomných v půdním roztoku. Na voltamogramu (po
okyselení) jsou patrné píky náležející volnému kadmiu a olovu a pík náležející
pravděpodobně komplexu kadmia s kyselinou šťavelovou. Zajímavé je, že na
voltamogramech půdních roztoků odebraných od samotného penízku a samotné vrby se po
okyselení vyskytovalo kadmium a olovo pouze v iotové formě 4. Pro hlubší pochopení příjmu
kadmia (olova) je příhodné získat informace o možných speciích kadmia, které se formují
s kyselinou šťavelovou 8. Protože je půdní roztok velice komplexní matrice, není možné
detegovat specie kadmia explicitně, proto byly modelové roztoky o známém složení testovány
nejdříve.
Pomocí ESI-MS v modelovém roztoku sestávajícím z Cd(NO3)2 a kyseliny šťavelové (OAH2)
byly nalezeny 3 pozitivně nabité komplexy kadmia s kyselinou šťavelovou (Tab. I, Obr. 2).
V roztoku je kadmium přítomno jako dikation a jako dikation tvoří komplexy s kyselinou
šťavelovou. Avšak během ionizačního procesu (vkládané napětí 4,5 kV) redoxní děj způsobil
redukci Cd(II) na Cd(I). Podobné procesy již jsou v literatuře popsány, zejména jedná-li se o
redukci dikationtů v přítomnosti chelatačních látek 9-12. Nalezeným komplexům kadmia
s kyselinou šťavelovou náležejí molekulové hmotnosti 239,9; 257,9 a 271,9 (jedná se o
jedenkrát nabité komplexy). Pro komplex s m/z 240 by mohla existovat i jiné vysvětlení než
je podáno v Tabulce I; mohl by být představován komplexem s tímto složením: [Cd(H2O)7]+,
jehož existence byla vyloučena měřením, kde byla veškerá H2O (Mr = 18) nahrazena D2O (Mr
= 19). První komplex [Cd(OAH2)(H2O)2]+ má m/z poměr 239,9, druhý komplex
86
[Cd(OAH2)(H2O)3]+ obsahuje jednu molekulu vody navíc oproti prvnímu komplexu; tento
komplex byl též popsán v krystalické formě 13. Třetí komplex [Cd(OAH2)(H2O)2(CH3OH)]+
obsahuje místo jedné molekuly vody molekulu methanolu. Vzhledem k těmto výsledkům
můžeme strukturu [Cd(OAH2)(H2O)2]+ považovat za základní strukturu. Při vyšších
hodnotách poměru m/z bylo pozorováno několik di- a trinukleárních klastrů výše popsaných
komplexů.
35
30
25
"Cd-OAH2"
Cd
i/nA
20
Pb
15
10
Cd-OAH 2-Pb
pH 7,5
pH 1,5
5
0
-700
-600
-500
-400
-300
-200
-100
0
E/mV
Obr. 1. Voltamogram půdního roztoku. DPASV, rozsah -900 až +250 mV, Ea = -900 mV, ta =
120 s, výška pulsu = 50 mV, rychlost polarizace = 10 mV s-1, délka pulsu = 80 ms, klidový
čas = 10 s.
Tabulka I.
Komplexy kadmia (Cd(NO3)2) s kyselinou šťavelovou (OAH2) ve směsi methanol/voda (1:1).
Cd(NO3)2
Molekulová hmotnost
Navržený vzorec
Označení
+
+
[239.9]
114 + 90 + 2·18 = 240
[Cd(OAH2)(H2O)2]
1
[257.9]+
240 + 18 = 258
[Cd(OAH2)(H2O)3]+
2
+
+
240 + 32 = 272
[Cd(OAH2)(H2O)2(CH3OH)]
3
[271.9]
20000
12000
Cd(NO3)2 + (COOH)2
3
16000
12000
intensity, cps
intensity, cps
24000
1
8000
2
4000
0
230
235
240
245
250
255
260
265
270
275
m/z
MS/MS rodièovského iontu m/z = 271.9
nce = 20%
izolacni sirka = ± 5
10000
8000
3
6000
4000
1
2000
0
230
2
235
240
245
250
255
260
265
270
275
280
m/z
Obr. 2. ESI-MS spektra (positivní-ion mód) Cd(NO3)2 a kyseliny šťavelové (2,5·10-5 mol L-1)
v methanol/voda (1:1). Legenda je v Tabulce I, nce = normalizovaná kolizní energie.
Ve spektru půdního roztoku odebraného od vrby (Obr. 3) byly nalezeny píky odpovídající
komplexům detekovaným a identifikovaným v modelovém roztoku.
87
intensity, cps
14000
12000
vrba, 1. odber
positivni mod
10000
8000
1
6000
3
2
4000
2000
0
230
235
240
245
250
255
260
265
270
275
280
m/z
Obr. 3. ESI-MS spektrum půdního roztoku, přídavek methanolu jako v modelovém roztoku; 1
– [Cd(OAH2)(H2O)2]+, 2 – [Cd(OAH2)(H2O)3]+, 3 – [Cd(OAH2)(H2O)2(CH3OH)]+.
Interpretace hmotnostních spekter u půdních roztoků je komplikovaná kvůli nízkým
koncentracím jednotlivých komponent a přítomnosti řady neidentifikovaných organických
látek.
Závěr
Ve všech zkoumaných půdních roztocích byl pomocí DPASV indikován „směsný“ komplex
Cd, Pb s kyselinou šťavelovou, který znemožňoval (překryv píků) identifikaci komplexů Cd
s kyselinou šťavelovou. Pro navržení struktur komplexů byla v modelových roztocích
aplikována ESI-MS a byly identifikovány 3 komplexy (a jejich klastry), pro které byly
[Cd(OAH2)(H2O)3]+
a
navrženy
tyto
sumární
vzorce:
[Cd(OAH2)(H2O)2]+,
+
[Cd(OAH2)(H2O)2(CH3OH)] . Analogické komplexy byly identifikovány též v půdních
roztocích.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou mezifakultních projektů ČZU v Praze (CIGA 20092004).
Literatura
1. Strobel B. W.: Geoderma 99, 169 (2001).
2. Jakl M., Dytrtova J. J., Miholova D., Kolihova D., Szakova J., Tlustos P.: Chem.
Speciation Bioavail. 21, 111 (2009).
3. Pohlman A. A., Mccoll J. G.: J. Environ. Qual. 15, 86 (1986).
4. Dytrtova J. J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
5. Dytrtova J. J., Sestakova I., Jakl M., Szakova J., Miholova D., Tlustos P.: Cent. Eur. J.
Chem. 6, 71 (2008).
6. Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009).
7. Tintaru A., Roithova J., Schroder D., Charles L., Jusinski I., Glasovac Z., Eckert-Maksic
M.: J. Phys. Chem. A 112, 12097 (2008).
8. van Hees P. A. W., Jones D. L., Godbold D. L.: Soil Biol. Biochem. 34, 1261 (2002).
9. Tsierkezos N. G., Buchta M., Holy P., Schroder D.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 23,
1550 (2009).
10. Tintaru A., Charles L., Milko P., Roithova J., Schroder D.: J. Phys. Org. Chem. 22, 229
(2009).
11. Weddell J. K., Allred A. L., Meyerstein D., Mulac W. A.: J. Inorg. Nucl. Chem. 42, 219
(1980).
12. McCusker L. B., Seff K.: J. Am. Chem. Soc. 101, 5235 (1979).
13. Huang S. H., Wang R. J., Mak T. C. W.: J. Crystallogr. Spectrosc. Res. 20, 99 (1990).
88
Electrochemistry with Mass spectrometry as a Tool of Metal Complexes with Organic
Ligand Studies
Jana Jaklová Dytrtová a, Michal Jakl b, and Detlef Schröder a
a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí
2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, [email protected]
b
Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Czech University of
Life Sciences, Kamýcká 129, 165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic
Abstract
Electrochemical and mass spectrometric approaches for the detection of metals species with
organic ligands are compared. Advantages of the connection of electrochemistry with mass
spectrometry are discussed.
Key Words: ESI-MS, DPASV, LMWOAs.
Introduction
The detection of metal complexes with organic ligands, the determination of their
stoichiometries, and the elucidation of their thermodynamic and kinetic properties are a
research topic of great concern for more than 30 years. Different chemical approaches can
achieve these aims with different level of success. Nowadays, the speciation of metals (i.e. the
distribution of the metals in different chemical species) is an important topic with regard to
biological matrixes, which bear a high level of complexity at meanwhile low concentrations
of the analytes. Insight into metal speciation can be achieved by a combination of different
techniques, e.g. electrochemistry and mass spectrometry in off-line or even on-line
connection.
Electrochemical detection of metal complexes
Electrochemical methods are very promising for the determination of metal complexes with
low-molecular-weight organic ligands. Particularly differential pulse anodic stripping
voltammetry (DPASV) is widely used in speciation studies and the assessment of stability
constants in model systems as well as in real biological samples 1. The DPASV results for
different accumulation potentials can be also used for construction of a pseudopolarogram
(Fig. 1A). Alternatively, the set of curves can serve as a “fingerprint” of the sample (Fig. 2B).
The basis of pseudopolarography was laid approximately 35 years ago 2. Pseudopolarography
allows the determination of the standard rate constant of the reduction reaction from the
difference between pseudopolarographic half-wave potentials (Eps1/2) for reduction of free
metal ion and the metal in complexed form 3.
Spectrometric detection of metal complexes
In order to gain complementary insight into the nature of the complexes formed, electrospray
ionization mass spectrometry (ESI-MS) is used to assess the types of metal complexes formed
with low-molecular-weight organic ligands. ESI-MS has been shown to be particularly useful
to gain information about non-covalent complexes in the gas phase 4-8. In many cases, ESIMS data show good correlations with solution phase studies 9-12, and ESI-MS conditions are
often considered to mimic biological environments 5-8, 13-14. The stoichiometry of the metal
complexes can be derived from the spectra by the mass to charge ratios (m/z) in conjunction
with the characteristic isotope patterns.
89
800
i/nA
600
400
-1200 mV
Edep
200
-600 mV
0
-900
-60 0
-300
0
E/mV
Fig. 1 A. „Fingerprint“ of the sample consisted of Cd(NO3)2, Pb(NO3)2, and oxalic acid in
0.01 mol·L-1 NaClO4 as a base electrolyte; pH adjusted to 4.7 by NaOH. B. Pseudopolarogram
for the reduction of cadmium-oxalic acid complexes. DPASV, range -1200 to -600 mV,
accumulation time 10 s, pulse height 50 mV, polarization rate 10 mV s-1, pulse duration 80
ms, step size 25 mV, rest time 10 s.
intensity, cps
8000
4
6000
3
4000
6
2000
0
2
220
230
240
250
270
380
390
m/z
5000
intensity, cps
260
4000
6
3000
5
7
2000
1000
0
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
m/z
Fig. 2. ESI-MS spectra (negative-ion mode) of a solution of CdCl2 (2.5·10-4 mol L-1) and
oxalic acid (10-2 mol L-1) in methanol/water (1:1); 1 – [CdCl3]− (m/z(114Cd, 35Cl) = 220.5),
2 – [Cd(OA)(CH3OH)(H2O)]− (m/z = 252.8), 3 – [CdCl2(OAH)]− (m/z = 272.8),
4 – [Cd(OAH)3)]− (m/z = 380.7), 5 – [Cd2Cl3(OAH)(H2O)3(CH3OH)]− (m/z = 509.4, 35Cl),
6 – [Cd2Cl3(OAH)(OAH2)(H2O)(CH3OH)]− (m/z = 562.4),
7 – [Cd2Cl3(OAH)(OAH2)(H2O)2(CH3OH)2]− (m/z = 615.4).
The hyphenation of electrochemistry with mass spectrometry
Consideration of electrochemistry can provide additional data for spectrometry and vice
versa, it seems to be desirable to connect on-line these two approaches. Several couplings of
electrochemical cell (EC) prior to mass spectrometers were proposed to study electrode
90
reactions. The hyphenation of EC with ESI-MS allows the investigation of electrochemical
properties of the complexes from the kinetic point of view.
Several papers deal with the on-line tandem connection of electrochemical flow cells prior to
an ESI-MS 15-17. Upon reduction during electrolysis in an electrochemical cell placed
upstream of the ESI-MS, the neutral molecules in the sample may become charged, and thus
detectable by ESI-MS. Also the oxidative electrolysis of some metals (copper, nickel, and
cobalt) in complexes with organic ligands can be applied to coupling bulk electrolysis with
ESI-MS to obtain positively charged complexes 18. However the required presence of
supporting electrolytes can cause interferences of the complexes of interest with more
abundant ions stemming from the supporting electrolytes. This interference can be avoided
using a volatile electrolyte, such as ammonium acetate or electrolytes which do not form
complexes overlapping with the m/z ratios of the metal complexes under study (e.g. lithium
hexafluorophosphate or lithium trifluoromethylsulphonate). On the other hand the problem
with interfering complexes including electrolyte can be solved using a very small amount of
the electrolyte 19 or by using a potentiostat (in connection with EC) with higher value of
compliance voltage (about ± 100 V; for a standard potentiostat compliance voltage is usually
± 10 V), which allows to measure solution with lower conductivity (lower concentration of
supported electrolyte) 20.
The electrochemical flow-cell, which will be inserted upstream the ESI-MS is shown in
Fig. 3. It will allow to study the influence of electrode reactions on metal speciation using
cyclic voltammetry.
Fig. 3. The design of voltammetric flow-cell with dimensions in mm.
Conclusion
The studies with electrochemical cell on-line connected upstream the ESI-MS are desirable to
obtain additional information about metal complexes with organic ligands. The main promises
of this hyphenation are to achieve information about electrode reactions, the presence of
intermediates, and kinetic properties.
Acknowledgements
Financial support for these investigations was provided by the European Research Council
(AdG HORIZOMS), by the Grant Agency of the Czech Republic (203/08/1487), by the
Czech Academy of Sciences (Z40550506) and by the Czech University of Life Sciences
Prague (CIGA 20092004).
91
References
1. Dytrtova J. J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
2. Bubić S., Branica M.: Thalassia Jugosl. 9, 47 (1973).
3. Branica G., Lovric M.: Electrochimica Acta 42, 1247 (1997).
4. Nanita S. C., Sokol E., Cooks R. G.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 856 (2007).
5. Koch K. J., Aggerholm T., Nanita S. C., Cooks R.G.: J. Mass Spectrom. 37, 676 (2002).
6. Hofstadler S. A.,. Griffey R. H.: Chem. Rev. 101, 377 (2001).
7. Gatlin C. L., Turecek F., Vaisar T.: Anal. Chem. 66, 3950 (1994).
8. Aggerholm T., Nanita S. C., Koch K. J., Cooks R.G.: J. Mass Spectrom. 38, 87 (2003).
9. Di Marco V. B., Bombi G. G.: Mass Spectrom. Rev. 25, 347 (2006).
10. Walther C., Fuss M., Buchner S.: Radiochim. Acta 96, 411 (2008).
11. Urabe T., Tsugoshi T., Tanakaa W.: J. Mass Spectrom. 44, 193 (2009).
12. Tsierkezos N. G., Roithova J., Schroder D., Oncak M., Slavicek P.: Inorg. Chem. 48 6287
(2009).
13. Daniel J. M., Friess S. D., Rajagopalan S., Wendt S., Zenobi R.: Int. J. Mass Spectrom.
216, 1 (2002).
14. Pramanik B. N., Ganguli A. K, Gross M. L.: Applied electrospray mass spectrometry.
Marcel Dekker, Inc, New York 2002.
15. Ma L., Iezzi M., Kaucher M. S., Lam Y. F., Davis J. T.: J. Am. Chem. Soc. 128, 15269
(2006).
16. Blades A. T., Ikonomou M. G., Kebarle P.: Anal. Chem. 63, 2109 (1991).
17. Arakawa R., Abura T., Fukuo T., Horiguchi H., Matsubayashi G.: B. Chem. Soc. Japan
72, 1519 (1999).
18. Regino M. C. S., BrajterToth A.: Anal. Chem. 69, 5067 (1997).
19. Bond A. M., Colton R., Dagostino A., Downard A. J., Traeger J. C.: Anal. Chem. 67,
1691 (1995).
20. Dytrtová J. J., Jakl M., Schroder D., Navrátil T.: Curr. Org. Chem. Accepted 2010.
92
Voltammetric Determination of 5-Nitroquinoline at a Carbon Film Electrode
Ivan Jiránek, Tereza Rumlová, and Jiří Barek
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, CZ-128 43
Prague 2, Czech Republic; E-mail: [email protected]
Abstract
The nontraditional carbon film electrode was developed as an alternative to carbon screen
printed electrode. Thanks to the wide potential window of carbon material, cathodic reduction
for determination can be used and the electrode can be a nontoxic alternative even to mercury
electrodes. In this contribution, DC and DP voltammetry were used for the determination of
5-nitroquinoline using carbon film electrode. Methods were optimized and repeatability of
measurement was tested. Calibration dependences in the concentration range 2·10–7 – 1·10–4
mol.L–1 were measured and the lowest achieved limit of quantitation was 5·10–7 mol.L–1 using
DPV method.
Key Words: 5-Nitroquinoline, Direct current voltammetry, Differential pulse voltammetry,
Carbon film electrode.
Introduction
In the last decade there have risen legislative obstructions limiting and complicating usage of
mercury in European Union 1-3 and some other states based on basically unsubstantiated fears
of its toxicity. According to this, development of suitable nontoxic electrode materials which
might be an alternative to mercury, undoubtedly the best known electrochemical material
used so forth, is in the centre of attention. In the framework of this research, mainly amalgams
of different metals have been tested 4-6, but also carbon material 7 seems to be a conceivable
option. Both materials are nontoxic and compatible with the concept of “green analytical
chemistry”. From the electrochemical point of view it is mainly wide potential window in
cathodic and anodic potential regions together with a relatively good sensitivity which makes
this material quite advantageous. The carbon film electrode 7 (CFE) is a newly developed
electroanalytical tool basically intended for voltammetric/amperometric analysis. It was
designed as a film containing some conductive particles (carbon ones in this case)
incorporated in insulating matrix of a polymer covering a surface of any solid electrode. Solid
electrode serves here only as a conductor and electrochemical properties of the CFE thus
depends entirely on the character of conductive particles. This concept is mainly profiting
from the possibility of easy renewability of the film - active surface of the electrode.
The character of CFE is principally concordant with the carbon screen printed electrode but
the main difference consists in the design and philosophy of the electrode. While carbon
screen printed electrode is primarily disposable electrode and consumption of the number of
electrodes and cumulating of the waste are not always the best manageable issue even from
the environmental point of view, CFE copes with this problem pretty well. Instead of wasting
the whole electrode, only the film covering a surface of a solid electrode is required to
change/waste when it is needed, e.g. in the case of passivation. The film can be easily
removed by wiping it off by a filter paper and reformed by immersing the electrode's surface
into the carbon ink created from a carbon powder homogenously mixed with some polymer
dissolved in a solvent in an exact ratio. Renewing the film is a way how to eliminate the
influence of the electrode's history completely; however, electrochemical regeneration of the
film is also applicable to receive better repeatability of measurement. Regarding the
preparation of the carbon ink, the density of carbon material is relatively low and just
appropriate in order to create a homogenous mixture (heavier particles would sediment).
93
For testing the electrode, a well reducible heterocyclic substance earlier studied in our
laboratory, 5-nitroquinoline (5-NQ), was chosen 8, 9. 5-NQ belongs among substances with
genotoxic and mutagenic effect 10 and has also been tested as a possible anticancer agent 11, 12.
Experimental
Reagents: The stock solution of 5-nitroquinoline (99%, Aldrich Chem. Co.) in deionized
water (c = 1.10–3 mol·L–1) was prepared by dissolving 0.01742 g of the substance in 100 mL
of deionized water. More diluted solutions were prepared by exact dilution of the stock
solution with deionized water. All solutions were kept in the dark, at laboratory temperature
and in glass vessels. Other chemicals (boric acid, glacial acetic acid, phosphoric acid, sodium
hydroxide, potassium chloride, all p.a. purity) were supplied by Lachema Brno, Czech
republic. Deionized water from Millipore, USA, was used. The conductive carbon ink
solution was prepared by mixing 0.01 g of polystyrene, 0.09 g of carbon powder (crystalline
graphite 2 μm, CR 2, Maziva Týn, Czech Republic) and 0.5 mL of dichlorethane. The mixture
was thoroughly homogenized by intensive agitation for 3 minutes.
Apparatus: All voltammetric measurements were carried out using Eco-Tribo Polarograph
driven by software PolarPro version 5.1 (both Polaro-Sensors, Prague). The software worked
under the operational system Microsoft Windows XP (Microsoft Corp.). All measurements
were carried out in a three-electrode system. Platinum wire as an auxiliary electrode,
silver/silver chloride reference electrode RAE 113 (1 mol·L–1 KCl, Monokrystaly Turnov,
Czech republic) and CFE (AgSAE, disk diameter 0.36 mm, covered by carbon film) as a
working electrode were used. Unless stated otherwise, the scan rate 20 mV·s–1, the pulse
amplitude –50 mV and pulse width 100 ms were used. Better reproducibility of voltammetric
measurements at CFE was assured by a suitable electrochemical regeneration of CFE.
Optimal results were obtained by an electrochemical pretreatment based on the application of
constant applied potential of 0 mV for 15 s. CFE was prepared by covering AgSAE's surface
with a carbon film. The film is formed after immersing electrode's surface in the conductive
ink (the active part of the electrode just touches the surface of the ink). Two minutes after
immersing, dichlorethane evaporates and the film, resp. CFE is ready to use. When it is
necessary to renew the old film (for example because of passivation), it can be easily removed
by wiping it off with a filter paper. New film is created by procedure described above.
Procedures: In the case of voltammetric measurements appropriate amount of 5-NQ stock
solution or more diluted solution (0.02 – 1 mL) was measured into a voltammetric vessel and
filled up to 10 mL with Britton-Robinson (BR) buffer of appropriate pH. All curves were
measured 3 times at least. The parameters of calibration curves (e.g. slope, intercept etc.) were
calculated using statistic software Adstat. The limits of quantitation (LQ) were calculated as
the analyte's concentration corresponding to the tenfold standard deviation of the analyte's
response from ten consecutive determinations at the lowest measurable concentration 13.
At first, several regeneration potentials were tested using DPV and regeneration potentials
Ein = 0 V, Efin = 0 V were chosen as optimal, i.e. the electrode was kept for 15 s at a constant
applied potential f 0 mV. Regeneration potentials were chosen in order to cover gradually the
whole available potential window of the electrode focusing on the cathodic region. Influence
of choosing regeneration potentials before and after the analyte's peak potential was tested.
Afterwards, a test of repeatability of measurement under chosen regeneration conditions using
DPV was accomplished. Repeatability of measurement on single carbon films (variability on
94
Ip [nA]
a particular film) and repeatability of measurement between several different films (variability
of renewing the film) was investigated. For this purpose, average and relative standard
deviation (RSD) of ten consecutive determinations of 5-NQ (c = 1·10–5 mol.L–1) obtained
from measurement on individual films and also average and RSD obtained from measurement
on ten different films were evaluated. After placing the results into the regulation diagram
(see Fig. 1), it was found that only the result of measurement on film N = 5 exceeded the
warning limit, results of measurement on other films remained within the borders of warning
limits of the diagram. Therefore, the repeatability of measurement was considered sufficient
in general. RSDs for measurements on individual films were about 3% and did not exceed
6%. RSD for renewing the film was approximately 10%.
500
x+3σ
x+2σ
400
x
300
x-2σ
x-3σ
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
14
N
Fig. 1. Regulation diagram of ten series of ten consecutive DPV determinations of 5-NQ
(c = 1·10–5 mol.L–1) measured on different carbon films (N). White dots correspond to the
average of Ip of the determinations measured on individual films and corresponding error bars
refer to the relative standard deviations of ten consecutive determinations on the current film.
Black dot on the right side of the diagram represents average from white dots, corresponding
error bars represent standard deviation between white dots and is equal to σ. Regulation limits
are showed, x ± 2σ (warning limit) and x ± 3σ (critical limit).
For determination of 5-NQ, differential pulse voltammetry (DPV) and direct current
voltammetry (DCV) were used. First step was investigation of electrochemical behavior of
5-NQ in dependence on pH value. pH region of 2 – 12 using BR buffer was investigated.
Substance is reduced in the whole pH region providing one peak/wave. Supposed mechanism
of electrochemical process of the substance regarding to the investigated electrochemical
mechanism on mercury and amalgam electrodes 9, 14 is four electron reduction of the nitro to
the hydroxyamino group. The highest and the best developed peak/wave was obtained for pH
11 for both DCV and DPV. In this medium (BR buffer, pH 11), calibration dependences in
the concentration range of 2·10–7 to 1·10–4 mol.L–1 were measured in the case of both
methods. Parameters and limits of quantitation are summarized in Table I and for the sake of
illustration a record of DP voltammograms in the lowest concentration range
(2 – 10)·10–7 mol.L–1 is depicted in Fig. 2. DPV performed better with the limit of quantitation
of 5·10–7 mol.L–1 while the limit of quantitation of DCV was 1·10–6 mol.L–1.
95
I [nA]
-900
-800
6
5
4
3
2
1
-700
-500
-600
-700
-800
-900
E [mV]
Fig. 2. DP voltammograms of 5-NQ corresponding to the concentrations: 0 (1), 2·10–7 (2),
4·10–7 (3), 6·10–7 (4), 8·10–7 (5), and 10·10–7 (6) mol.L–1.
Table I.
Parameters of determination of 5-NQ using CFE.
Method
Linear dynamic Slope
[nA·moL–1·L]
range [mol·L–1]
DCV
6·10–7 – 4·10–5
–2.32·107
DPV
4·10–7 – 4·10–5
–2.04·107
Intercept
[nA]
3.04
Correlation
Coefficient
0.9846
LQ
[mol·L–1]
1·10–6
0.99
0.9952
5·10–7
Conclusion
DCV and DPV methods for determination of 5-NQ using nontraditional CFE were developed.
DPV was a more sensitive method (ca twice) with the limit of quantitation 5·10–7 mol.L–1,
limit of quantitation of DCV was 1·10–6 mol.L–1. In the framework of the work, optimal
regeneration potentials (Ein = 0 V, Efin = 0 V) were found and a test of repeatability of
measurements using DPV was worked out. Average RSD for the determination of an
individual film was approximately 3% and RSD between ten different films (the case of
renewing the film) was ca 10%.
Acknowledgement
This work was financially supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the
Czech Republic (projects LC 06035, MSM 0021620857 and RP 14/63), and the Grant
Agency of the Charles University in Prague (SVV 261204).
References
1. http://eur-ex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2002L0095:
20080524:EN:PDF, accessed 1. 10. 2010.
2. http://www.europarl.europa.eu/meetdocs/2004_2009/documents/pr/585/585664/585664e
n.pdf, accessed 1. 10. 2010.
96
3. http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:304:0075:0079:EN:PDF,
accessed 1. 10. 2010.
4. Novotny L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000).
5. Yosypchuk B., Novotny L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002).
7. Yosypchuk B., Barek J., Fojta M.: Electroanalysis 18, 1126 (2006).
2003 (2007).
9. Jiranek I., Peckova K., Kralova Z., Moreira J. C., Barek J.: Electrochim. Acta 54, 1939
(2009).
10. http://chemicalland21.com/lifescience/phar/5-nitroquinoline.htm, accesed 23. 10. 2008.
11. Siim B. G., Denny W. A., Wilson W.R.: Int. J. Rad. Oncol., Biol., Phys. 29, 311 (1994).
12. Siim B. G., Atwell G. J., Wilson W.R.: British J. Canc. 70, 596 (1994).
13. Eckschlager K.: Chemometrie. Karolinum. Praha 1991.
14. Tachibana M., Shoei S., Kawazoe Y.: Chem. Pharm. Bull. 15, 1112 (1967).
97
Detection of Proteins Using Electrochemical Immunosensors in Combination with
Magnetic Particles
(Průkaz proteinů s využitím elektrochemických imunosenzorů v kombinaci s
magnetickými částicemi)
a
Lucie Korecká , Lenka Moravcová a, Zuzana Bílková a, and Radovan Metelka b
a
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Biological and
Biochemical Sciences, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
b
Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
Abstract
An electrochemical immunosensor for protein detection is described in this contribution.
Bioaffinity principle based on formation of specific immunocomplex is employed. Rabbit
anti-ovalbumin IgG (primary antibody), protein ovalbumin (determined antigen) and
secondary anti-ovalbumin IgG labeled with horseradish peroxidise comprise the model
system. The current decrease of hydrogen peroxide oxidation signal was electrochemically
monitored by LSV technique with utilization of screen-printed three-electrode sensors
comprising of the reference Ag/AgCl electrode and platinum auxiliary and working
electrodes. Superparamagnetic beads were used for antibody immobilization which brings an
elegant solution how to make all steps in one tube with minimal sample consumption.
Key Words: Electrochemical immunosensor, Screen-printed electrodes, Voltammetric
detection, Bioaffinity, Magnetic particles, antibody, Immobilization, Ovalbumin, Horseradish
peroxidase, Hydrogen peroxide.
Úvod
Biosenzory jsou perspektivní bioanalytické systémy tvořené biochemickým rekogničním
elementem imobilizovaným na povrchu vhodného fyzikálně-chemického převodníku.
V případě imunosenzorů jsou rozpoznávacím elementem protilátky schopné specificky
rozeznávat a vázat jiné molekuly (antigeny), přítomné v biologických vzorcích.
Elektrochemické imunosenzory jsou obvykle nepřímé a jsou nejčastěji založeny na sledování
imunochemických reakcí pomocí sekundární protilátky značené enzymem, který přeměňuje
vhodný substrát na elektroaktivní produkt, podléhající redoxní přeměně na povrchu pracovní
elektrody. Interakce protilátky s antigenem obvykle probíhá na povrchu elektrody, nejčastěji
uhlíkové, na jejíž povrch snadno sorbují molekuly proteinů (např. protilátek) 1-3.
Nedostatkem takových biosenzorů je regenerace protilátek sorbovaných na povrchu pracovní
elektrody. To může být vyřešeno použitím magnetických částic, které jsou využity pro
imobilizaci protilátek. Magnetické pole slouží jako síla zachytávající částice v blízkosti či na
povrchu pracovní elektrody, přičemž neovlivňuje požadovanou citlivost elektroanalýzy
(Obr. 1) 4-6. Mezi hlavní výhody magnetických částic patří vysoká účinnost, jednoduchost a
rychlá separace v průběhu imobilizačního postupu a šetrná manipulace se vzorkem. Díky
snadnému zacházení odpadají problémy, jako je mechanické poškození cílové biomolekuly,
nežádoucí zředění sledovaného proteinu či ztráty nosiče během promývacích postupů 7.
Magnetické částice se obvykle skládají ze superparamagnetického jádra obklopeného
polymerním obalem chránícím bioaktivní látku od kontaktu s oxidy železa. Výhodou obalení
magnetických částic polymerní vrstvou je možnost funkcionalizace povrchu a následné
imobilizace cílové biomolekuly. Imobilizační chemie závisí na typu nosiče, aktivační metodě
a spojovacím činidle. Volba vhodného nosiče (chemické a magnetické vlastnosti, velikost
98
partikulí, distribuce, porozita) je pak klíčovým faktorem ovlivňujícím možnosti využití
magnetických partikulí 8.
S
A
A
E
E
A
A
A
MČ
MČ
MČ
P
P
P*
e-
M
Obr. 1. Schéma imunomagnetického biosenzoru s elektrochemickou detekcí.
Imobilizace protilátek (antigenu) na magnetické částice
1 mg magnetických částic byl 3x promyt pomocí magnetického separátoru pufrem.
K promytým částicím bylo následně přidáno 10 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
karbodiimid hydrochloridu (EDAC) rozpuštěného v 500 μl pufru. Po inkubaci 10 minut při
laboratorní teplotě za mírného otáčení bylo k částicím přidáno 100 µg protilátek (3 mg
antigenu) v 500 μl pufru. Po imobilizaci 3 hodiny při laboratorní teplotě za mírného otáčení
byly částice 10x promyty pufrem.
Elektrochemická detekce
K měření byl použit elektrochemický analyzátor PalmSens (Palm Instruments BV,
Nizozemsko) a tříelektrodové tištěné senzory s platinovou pracovní a pomocnou elektrodou a
referentní chloridostříbrnou (typ AC1.W2.R1, BVT Technologies, Česká republika). Objem
roztoku, v němž probíhalo měření, byl 800 μl. Celá reakce a následná elektrochemická
detekce byla prováděna v mikrozkumavce o objemu 1,5 ml. Jako detekční metoda byla
použita lineární voltametrie se zvolenými parametry: rozsah potenciálu 0 – 1 V, krok
potenciálu 0,005 V, rychlost skenu 0,1 V s–1 a čas klidu 4 s. Pro účely vyhodnocení byla
odečítána plocha píku nebo proud oxidace peroxidu vodíku při potenciálu 0,5 V.
Výsledky a diskuse
Hlavním cílem této práce je příprava imunoafinitního biosenzoru s elektrochemickou detekcí
jako inovativního analytického zařízení pro jednoduché, citlivé a rychlé stanovení proteinů
(např. biochemických markerů) v biologických vzorcích. Z oblasti proteomiky jsou zde
využity techniky založené na principu bioafinitní izolace a enzymových imunoanalýz a
moderní imobilizační postupy pro přípravu specifických imunosorbentů. Celá analýza od
specifického vychytání sledovaného proteinu až po detekci probíhá v jediné mikrozkumavce.
enzym
byl zvolen systém králičí
Jako modelový systém protilátka/antigen/protilátka
anti-ovalbuminové IgG/ovalbumin/králičí anti-ovalbuminové IgGHRP. Pro přípravu účinného
imunosenzoru je třeba optimalizovat veškeré kroky tvorby imunokomplexu, stejně jako
vytipovat vhodný nosič a metodu pro imobilizaci protilátek.
Z několika voltametrických technik byla po předběžných testech jako nejvhodnější pro
detekci peroxidu vodíku vybrána lineární voltametrie, kdy obdržené záznamy byly na
platinové pracovní elektrodě dobře opakovatelné. Dále bylo nutné ověřit potenciálovou
stabilitu pseudoreferentní tištěné elektrody v řadě pufru používaných pro afinitní izolace
antigenů pomocí protilátek. Pro další práci byl poté vybrán 0,1 M fosforečnanový pufr o
pH 7,2 s 0,15 M NaCl. Imobilizace protilátek byla zkoušena na několika typech magnetických
99
částic. Při použití magnetické makroporézní perlové celulózy (ÚMCH, AV ČR) docházelo
k prudkému a nereprodukovatelnému nárůstu proudu oxidace, pravděpodobně v důsledku
elektrokatalytického působení nedostatečně uzavřeného jádra částice. Dalším testovaným
typem byly silikagelové magnetitové částice (Chemicell, Německo), avšak kvůli jejich
relativně malé velikosti (1 µm) trvala separace příliš dlouho. Jako nejvhodnější se osvědčily
hypersíťované sulfonované magnetické částice (ÚMCH, AV ČR) s velikostí 5 µm. Na
částicích s imobilizovanou křenovou peroxidázou byla následně testována stabilita
tříelektrodových senzorů v čase (minimálně 30 min) po přidání peroxidu vodíku jako
substrátu, 4 min inkubace a 1 min separace magnetických částic. Bylo zjištěno, že jeho
koncentrace nesmí překročit 20 mg l–1, jinak dochází k nevratnému poškození tištěných vrstev
senzoru a není možné provádět opakovaná měření. Kalibrace H2O2 byla lineární v rozmezí
0,1 – 20 mg l–1 s horší reprodukovatelností měření mezi jednotlivými čidly. Dále bylo
optimalizováno ředění konjugátu; výrobcem je doporučované ředění konjugátu 1:500 –
1:25000 pro metodu ELISA a i při ředění konjugátu 1:20000 a koncentraci peroxidu 15 mg l–1
bylo možné sledovat pokles jeho signálu. Vzhledem k ceně konjugátu bylo proto pro další
měření zvoleno výše uvedené ředění.
Následně bylo provedeno celé imunostanovení. Primární protilátky byly imobilizovány na
magnetické částice a k systému byl poté přidán antigen (vazba 1 hod při pokojové teplotě)
v odpovídajícím molárním poměru vzhledem k množství protilátek (dvě vazebná místa, tudíž
dvojnásobek antigenu). Po promytí nespecificky navázaných molekul antigenu byl přidán
konjugát, který se vázal 1 h při 37 °C. Po promytí nenavázaného konjugátu a přidání substrátu
(peroxid vodíku o koncentraci 15 mg l–1) byl v čase měřen úbytek substrátu lineární
voltametrií s odečítáním proudu při 0,5 V. Současně prošel stejným procesem i slepý vzorek,
který tvořily pouze prázdné částice. Z výsledku je patrné, že systém funguje, došlo k vyvázání
antigenu specifickými protilátkami, ten byl rozpoznán konjugátem a v čase byl sledován
úbytek substrátu. U slepého vzorku k poklesu nedocházelo.
Závěr
V příspěvku byl demonstrován jednoduchý imunosenzor pro průkaz proteinu ovalbuminu,
využívající imobilizaci vhodných protilátek na magnetické částice, konjugátu enzymu a
protilátky a elektrochemické sledování úbytku substrátu. Získané poznatky budou aplikovány
pro vývoj elektrochemických imunosenzorů k detekci dalších proteinů. Předpokládá se
využití heterogenních uhlíkových elektrod modifikovaných vhodnými mediátory pro citlivější
detekci peroxidu vodíku.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů MSM0021627502, LC06035 a GA203/08/1536.
Literatura
1. Skládal P.: Biosensory. Masarykova univerzita, Brno 1999.
2. D’Orazio P.: Clin. Chim. Acta 334, 41 (2003).
3. Lazcka O., Del Campo F. J., Munoz F. X.: Biosens. Bioelectron. 22, 1205 (2007).
4. Jaffrezie–Renault N., Martelet C., Chevelot Y., Cloarec J.–P.: Sensors 7, 589 (2007).
5. Thomas J. H., Kim S. K., Hesketh P. J., Halsall H. B., Heineman W. R.: Anal. Biochem.
328, 113 (2004).
6. Yu D. H., Blankert B., Bodoki E., Bollo S., Vire J. C., Sandulescu R., Nomura A.,
Kauffmann J. M.: Sensor Actuat B-Chem 113, 749 (2006).
7. Korecka L., Jezova J., Bilkova Z., Benes M., Horak D., Hradcova O., Slovakova M.,
Viovy J. L.: J. Magn. Magn. Mater. 293, 349 (2005).
8. Yang H.H., Zhang S. Q., Chen X. L., Zhuang Z. X., Xu J. G., Wang X. R.: Anal. Chem. 76,
1316 (2004).
100
A Comparison of Variously Modified Carbon Paste Electrodes for Determination of
Rutin
(Srovnání různě modifikovaných uhlíkových pastových elektrod pro stanovení rutinu)
Pavla Macíková and Jana Skopalová
Palacký University in Olomouc, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
tř. 17. listopadu 1192/12, 771 46 Olomouc, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Carbon paste electrodes (CPEs) modified by iron phthalocyanine (IP/CPE) and a ionic liquid
1-hexyl-3-methylimidazolium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide (IL/CPE) and an unmodified
CPE were investigated and compared in rutin solution by voltammetric techniques. IL/CPE
had the widest usable potential window 2.5 V and the highest current response. IP/CPE had
the lowest limit of detection (LOD) 80 nmol/L by differential pulse voltammetry. IL/CPE had
the lowest LOD 5 nmol/L by differential pulse adsorptive stripping voltammetry. Rutin was
detected and quantified in boiling water extract and Soxhleth extract of buckwheat seeds
using all three electrodes.
Key Words: Ionic liquid, Methylimidazolium, Bis(trifluoromethylsulfonyl)imide, Iron
phthalocyanine, Carbon paste electrode, Rutin, Voltammetry, Electrochemistry, Buckwheat.
Úvod
Uhlíkové pastové elektrody (CPEs) nacházejí uplatnění v elektrochemii již od druhé poloviny
dvacátého století 1 a jejich modifikacemi se otevřely nové možnosti použití uhlíkových past.
Vhodným výběrem modifikátoru lze dosáhnout zvýšení selektivity a citlivosti CPEs 2. Často
používanými modifikátory bývají kovy a jejich sloučeniny např. bismut 3,4, zlato 5, sloučeniny
železa 6-8. Novým a stále více používaným modifikátorem se stávají iontové kapaliny
(ILs) 9-12, látky se specifickými fyzikálně chemickými vlastnostmi. Vynikají velmi dobrou
vodivostí, chemickou i tepelnou stabilitou.
Rutin (Obr. 1), flavonoid z podskupiny flavonolů běžně se vyskytující v mnoha rostlinách
především v pohance seté a v různých druzích ovoce, vykazuje značné antioxidační vlastnosti.
Elektrochemické chování rutinu je charakterizováno dvěma oxidačními signály, z nichž první
je reverzibilní a druhý ireverzibilní. První anodický signál odpovídá oxidaci hydroxylových
skupin v kruhu B v polohách 3´ a 4´, druhý oxidaci –OH skupin v kruhu A v polohách 5 a 7
13
.
OH
3'
2'
1
8
HO
A
5
OH
3
4
5'
2
C
6
B
1'
O
7
OH
4'
6'
O
O
O
H2C
OH
H3C
HO
OH
O O
OH
OH
OH
Obr. 1. Chemická struktura rutinu.
V literatuře je pro stanovení rutinu popsáno využití CPEs s různými modifikátory 14,15 včetně
některých iontových kapalin 16-18. V této práci byly použity dvě CPEs modifikované
ftalocyaninem železnatým (IP/CPE) a iontovou kapalinou 1-hexyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imidem (HMI-PF6, IL/CPE) (Obr. 2) a jejich vlastnosti byly
101
srovnány s nemodifikovanou CPE. Elektrody byly charakterizovány cyklickou (CV)
a diferenční pulzní voltametrií (DPV) v roztoku rutinu. Všechny elektrody byly aplikovány
pro stanovení rutinu v různých extraktech ze semen pohanky seté (Fagopyrum esculentum
Moench). Byly testovány čtyři různé extrakční postupy: extrakce varem (BWE), Soxhletova
extrakce (SE), tlaková extrakce rozpouštědlem (PSE) a superkritická fluidní extrakce (SFE).
F
+
N
N
F
O
C
S
F
O
-
N
O
F
S
C
O
F
F
Obr. 2. Iontová kapalina 1-hexyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl)imid
(HMI-PF6).
CPE byla připravena homogenizací 200 mg vločkového grafitu (Sigma-Aldrich) s 80 µL
parafínového oleje. Pro přípravu IP/CPE bylo k této směsi přimícháno 25 mg ftalocyaninu
železnatého (Fluka). Třetí pasta byla připravena z 500 mg vločkového grafitu a 250 μL HMIPF6 (Merck).
Všechna voltametrická měření byla prováděna na přístroji Eco-Tribo-Polarograf (PolaroSensors, Praha) vybaveného softwarem Polar 4. Základním elektrolytem byl octanový pufr
o pH 4,0. Zásobní roztok rutinu (Sigma-Aldrich) o koncentraci 1 mmol/L byl připraven
v methanolu. Další ředění roztoků rutinu bylo prováděno redestilovanou vodou. Rutin byl
extrahován z loupaných krup pohanky seté (PRO-BIO s. r. o., Staré Město pod Sněžníkem)
nadkritickým fluidním extraktorem SEKO-K (SEKO-K s.r.o., Brno), přístrojem pro tlakovou
extrakci rozpouštědlem one PSE (Applied Separations, Allentown, USA). Jako rozpouštědlo
byl použit aceton (p.a., Penta, Chrudim). Dalšími dvěma extrakčními postupy byla Soxhletova
extrakce methanolem a extrakce varem ve vodě.
Pro voltametrická měření bylo použito tříelektrodové zapojení s pracovní CPE, IL/CPE, nebo
IP/CPE, argentchloridovou referentní elektrodou (Ag/AgCl/1M-KCl) a platinovou pomocnou
elektrodou. Celkový objem měřeného roztoku byl 10 ml. Povrch pracovních elektrod byl
obnovován vytlačením části pasty z těla elektrody a následným vyhlazením povrchu
na hladkém tvrdém papíře.
Výsledky a diskuse
Metodou cyklické voltametrie (CV) byly zjištěny využitelné potenciálové rozsahy
jednotlivých elektrod. Nejširší potenciálové okno bylo zaznamenáno u IL/CPE (2,5 V), dále
pak CPE (1,5 V) a IP/CPE (1,3 V). Nejvyšší proudovou odezvu v roztoku rutinu
(0,1 mmol/L) poskytovala IL/CPE (asi 20 µA), která ale současně vykazovala i nejvyšší
proudové pozadí (Obr. 3, křivka a), což je v souladu s literaturou 19. Proudové signály rutinu
naměřené CPE a IP/CPE byly vzájemně srovnatelné (kolem 2 µA, Obr. 3, křiky b, c).
Diferenčně pulzní voltamogram rutinu na IL/CPE ukazuje opět přibližně desetinásobně vyšší
proudový pík než na CPE a IP/CPE (Obr. 4), který je lépe definovaný a výhodnější pro
kvantifikaci než CV-pík. Opakovatelnost přípravy povrchu pracovních elektrod měřená
v roztoku rutinu koncentrace 0,1 mmol/L byla 14,4% (CPE), 13,0% (IP/CPE) a 15,8%
(IL/CPE).
102
Obr. 3. Cyclický voltamogram rutinu (0,1 mmol/L) na IL/CPE (a), CPE (b) a IP/CPE (c)
při rychlosti scanu 100 mV/s.
Obr. 4. Diferenční pulzní voltamogram rutinu (8 µmol/L) na IL/CPE (a), CPE (b) a IP/CPE
(c) při rychlosti scanu 20 mV/s, modulační amplitudě 50 mV a šířce pulzu 80 ms.
Metodou diferenční adsorpční rozpouštěcí voltametrie (DPAdSV) byla studována adsorpce
rutinu na povrchu připravených pracovních elektrod v závislosti na době a potenciálu
akumulace. Nejvyšší nárůst proudu píku byl zaznamenán při potenciálu akumulace 100 mV
a době akumulace 25 s v roztoku rutinu o koncentraci 0,5 µmol/L.
Metodami DPV a DPAdSV byly s použitím studovaných elektrod naměřeny kalibrační
závislosti rutinu, které jsou lineární pouze v určitých koncentračních mezích. Při vyšších
koncentracích dochází k pokrytí elektrodového povrchu adsorbovaným rutinem a tím
k zakřivení kalibrační závislosti. Jednotlivé elektrody se lišily šířkou lineárního
koncentračního rozsahu, směrnicemi a mezemi detekce, které byly určeny experimentálně
jako koncentrace rutinu, jejíž odezva byla trojnásobkem proudového šumu voltametrického
záznamu (Tabulka I a II). Kalibrační závislosti naměřené metodou DPAdSV měly užší
lineární koncentrační rozsahy a vyšší hodnoty směrnic. Nejnižší mez detekce byla
zaznamenána u IL/CPE metodou DPAdSV 5 nmol/L.
103
Tabulka I.
Charakteristiky kalibračních závislostí rutinu měřených metodou DPV.
CPE
IL/CPE
0,2 - 8
0,6 - 6
Lineární koncentrační rozsah, μmol/L
8
8
y
=
2·10
x
41,90
y
=
3·10
x + 41,88
Regresní rovnice y = ax + b
Hodnota spolehlivosti R
0,9911
0,9944
0,20
0,60
Mez detekce, μmol/L
IP/CPE
0,08 – 6
y = 2·108x - 9,64
0,9955
0,08
Tabulka II.
Charakteristiky kalibračních závislostí rutinu měřených metodou DPAdSV (25 s akumulace,
100 mV potenciál akumulace).
CPE
IL/CPE
IP/CPE
0,01
–
0,1
0,005
–
0,08
0,02 – 0,6
Lineární koncentrační rozsah, μmol/L
8
9
Regresní rovnice y = ax + b
y = 5·10 x – 2,15 y = 5·10 x + 171,95 y = 8·108x – 13,75
Hodnota spolehlivosti R
0,9784
0,9852
0,9935
0,010
0,005
0,020
Mez detekce, μmol/L
Pro analýzu rutinu v extraktech z drcených krup pohanky seté byly vyzkoušeny čtyři typy
extrakčních postupů: BWE, SE, PSE a SFE. Obsah rutinu byl stanoven metodou DPV
(Obr. 6). Ve vzorku vodného vývaru byl stanoven rutin v množství 19,1 mg/100 g. V SE
extraktu byl stanoven průměrný obsah rutinu 15,7 mg/100 g. V PSE a SFE extraktech nebyla
prokázána přítomnost rutinu. U PSE extraktu byl zaznamenán pík s nižším potenciálem než
odpovídá oxidaci rutinu, který byl identifikován jako signál quercetinu (aglykon rutinu) na
základě nárůstu proudu píku po přídavku standardu této látky. Přítomnost quercetinu lze
vysvětlit buď hydrolýzou rutinu během extrakce, nebo menší polaritou použitého rozpouštěla,
které lépe extrahuje méně polární quercetin.
Obr. 6. DP voltamogramy extraktu z vařených krup pohanky (a) zaznamenané na IP/CPE
s pěti přídavky standardu rutinu o koncentraci 1 mmol/L: 5 µL (b), 10 µL (c), 15 µL (d),
20 µL (e), 25 µL (f).
Závěr
Modifikované uhlíkové pastové elektrody byly využity pro voltametrické stanovení rutinu.
Metodami CV a DPV byly měřeny charakteristiky jednotlivých elektrod. Nejširší využitelný
104
potenciálový rozsah měla elektroda IL/CPE, kde iontová kapalina plně nahrazuje úlohu
pojiva. Tato elektroda také vykazovala nejvyšší proudové odezvy. Byly nalezeny vhodné
podmínky pro stanovení rutinu metodou DPAdSV. Jednotlivé elektrody byly použity pro
stanovení rutinu v různých extraktech ze semen pohanky seté.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu MŠMT č. MSM6198959216 a projektu Univerzity
Palackého v Olomouci č. PRF_2010_028.
Literatura
1. Adams R. N.: Anal. Chem. 30, 1576 (1958).
2. Kalcher K.: Electroanalysis 2, 419 (1990).
3. Dejmková H., Zima J., Barek J.: Sensing in Electroanalysis (Vytřas K., Kalcher K.,
Švancara I., ed.), vol. 3, str. 83. University of Pardubice 2008.
4. Švancara I., Baldrianová L., Tesařová E., Vlček M., Vytřas K., Sotiropoulos S.: Sensing
in Electroanalysis (Vytřas K., Kalcher K., ed.), vol. 2, str. 35. University of Pardubice
2007.
5. Švancara I., Vytřas K., Bobrowski A., Kalcher K.: Talanta 58, 45 (2002).
6. Hrbáč J., Halouzka V., Zbořil R., Papadopoulos K., Triantis T.: Electroanalysis 19, 1850
(2007).
7. Karyakin A. A., Gitelmacher O. V., Karyakina E. E.: Anal. Lett. 27, 2869 (1994).
8. Shahrokhian S., Ghalkhani M., Amini M. K.: Sens. Actuators, B: Chemical 137, 669
(2009).
9. Zhang Y., Zheng J. B.: Electrochim. Acta 52, 7210 (2007).
10. Maleki N., Safavi A., Tajabadi F.: Electroanalysis 19, 2247 (2007).
11. Sun W., Yang M., Jiao K.: Anal. Bioanal. Chem. 389, 1283 (2007).
12. Wei D., Ivaska A.: Anal. Chim. Acta 607, 126 (2008).
13. Ghica M. E., Brett A. M. O.: Electroanalysis 17, 313 (2004).
14. Šulc M., Šestáková I.: XXVII. Moderní elektrochemické metody, Jetřichovice, 21.-24.
května 2007, Sborník přednášek (Barek J., Navrátil T., ed.), str. 159, Česká společnost
chemická, Praha 2007.
15. Franzoi A. G., Spinelli A., Vieira I. C.: J. Pharm. Biomed. Anal. 47, 973 (2008).
16. Francoi A. C., Migowski P., Dupont J., Cruy Vieira I.: Anal. Chim. Acta 639, 90 (2009).
17. Zhang Y., Zheng J.: Talanta 77, 325 (2008).
18. Sun W., Yang M., Li Y., Jiang Q., Liu S., Jiao K.: J. Pharm. Biomed. Anal. 48, 1326
(2008).
19. Musameh M., Wang J.: Anal. Chim. Acta 606, 45 (2008).
105
Amperometric Detection of Aminobiphenyls in HPLC Using Microcrystalline BoronDoped Diamond Film Electrode in "Wall-Jet" and "Thin-Layer" Arrangement
Lucie Maixnerová, Jiří Barek, and Karolina Pecková
Abstract
The study compares HPLC determination of 2-aminobiphenyl, 3-aminobiphenyl, and
4-aminobiphenyl using amperometric detection at a microcrystalline boron-doped diamond
film electrode in thin-layer and wall-jet arrangement. Satisfactory separation of studied
analytes was achieved at a ChiraDex column (Merck) with chemically bonded β-cyclodextrin
in mobile phase consisting of 0.01 mol L–1 acetate buffer, pH 5 : acetonitrile : methanol
(40:30:30; v/v/v) with total analysis time of six minutes. The repeatabilities of the detector
responses are satisfactory. Slightly wider linear dynamic range of calibration dependencies
and lower detection limits in the 10–8 mol L–1 concentration range were achieved for the walljet arrangement.
Key Words: Boron-doped diamond film electrode, HPLC, Amperometric detection, Thinlayer arrangement, Wall-jet arrangement, Aminobiphenyls.
Introduction
Amino derivatives of biphenyl are potential or proven (4-aminobiphenyl, 4-AB) carcinogenic
agents. They are used as raw material or intermediates in the manufacturing of pesticides,
dyestuffs, polymers and other industrial chemicals 1. Therefore, aminobiphenyls are widely
monitored in various environmental, industrial, food and biological matrices.
Electrochemical detection using advanced electrode materials such as boron-doped diamond
films (BDDF) offers sensitive and relatively selective tool for their determination. BDD
gained deserved popularity as an electrode material in scientific and commercial sphere
during the last two decades, because it possesses several excellent electrochemical properties:
Low and stable background current over a wide potential range, corrosion and fouling
resistance, high thermal conductivity, structural stability at extreme cathodic and anodic
potentials, and high current densities. A number of batch voltammetric or liquid flow methods
using BDDF electrodes has been developed for analysis of various organic compounds 2-4.
Basic studies on electrochemistry of aromatic amines using BDDF electrodes were performed
with aniline by Mitadera et al. 5. Their results on the cyclic voltammetric experiments
indicated that, excepting strong alkaline media, the electrochemical oxidation of aniline at
potentials lower than +2.0 V results in fouling of the electrodes, probably due to the
adsorption of polymeric oxidation products. Nevertheless, our group reported repeatable
results with limits of determination (LQs) in the 10–7 mol L–1 concentration range for
differential pulse voltammetric (DPV) determination of 2-aminofluoranthene 6, and
2-aminobiphenyl (2-AB), 3-aminobiphenyl (3-AB), and 4-AB 7, when stirring the solutions
between the measurements. Further, a method for HPLC amperometric determination of these
analytes was developed using BDD electrode in thin-layer arrangement 8. The actual study
connects on these studies and compares the performance of BDDF electrode in the thin-layer
and wall-jet detection cell with respect to optimum conditions for detection, signal
repeatability and parameters of calibration dependencies.
106
Experimental
The 1·10-4 mol L–1 stock solutions of 2-AB, 4-AB (both Sigma – Aldrich, 97 %), and 3-AB
(synthesized at the Department of Organic Chemistry, Charles University in Prague) were
prepared by dissolving 4.23 mg of the substance in 250 mL of deionized water (Milli-Qplus
system, Millipore, USA). More diluted solutions were prepared by exact dilution of the stock
solutions with mobile phase. All the solutions were stored in the dark. Methanol and
acetonitrile (both Merck, Prague, CZ) of gradient grade purity were used for mobile phase
preparation. All other chemical were of gradient grade purity (Lach-Ner, Neratovice, CZ).
HPLC system consisted of a high-pressure pump LaChrom-7100, UV spectrophotometric
detector L-7400, autosampler L-7200 with interface D-7000 (all Merck-Hitachi), and software
HPLC System Manager v. 4.0 (Hitachi) working under WinNT (Microsoft Corp.). The
column LichroCART ChiraDex® with chemically bonded β-cyclodextrin (250 × 4 mm, 5 μm)
and pre-column LichroCART ChiraDex® (4 × 4 mm, 5 μm, all Merck, Germany) were used.
20 μL of the sample were injected, the flow rate FM was 1 mL min–1. The measurements were
carried out at laboratory temperature. The mobile phase was degassed by ultrasonication
using PS 02000A ultrasonic bath (Powersonic, USA) followed by passing helium for 5 min.
The amperometric detection was realized in three electrode arrangement in the thin-layer flow
cell and in wall-jet arrangement with BDDF working electrode governed by potentiostat
ADLC 2 (Laboratorní přístroje, Prague, CZ). The wall-jet arrangement was realized using
laboratory-made disk electrode 6 of an active surface of 12.6 mm2 (Fig. 1A), saturated calomel
reference electrode (SCE) and platinum indicator electrode (both Monokrystaly, Turnov, CZ).
The thin layer detection cell is depicted at Fig. 1B; it was described in detail earlier 9. Our
arrangement differed in the Ag/AgCl/ 3 mol L–1 KCl reference electrode (SSCE) of the type
66-EE009 (Cypress Systems, Chelmsword, MA, USA). Further, a 0.1 cm thick Viton®
(fluoropolymer elastomer, Güschu, CZ) gasket separated the surface of the working electrode
from the top piece of the cell. An ellipsoid groove (a = 3.2 mm, b = 1.3 mm) was cut in the
gasket and defined the flow channel. Assuming a 25% compression of the gasket when the
two pieces of the cell were clamped together, the cell volume was estimated to be ~ 10 μL.
The microcrystalline BDDF electrode deposited on silica wafers was prepared and
characterized by procedures described earlier 10 at Michigan State University, East Lansing,
MI, USA. The surface of BDDF electrodes was oxidized in 0.1 mol L–1 H2SO4 by applying
the potential of +2.4 V for 60 min prior the first usage.
All calibration curves were measured in triplicate. The statistical parameters (e.g., linear
dynamic range, slope, intercept) were calculated using statistic software ADSTAT ver. 2.0
(Trilobyte, Czech Republic) 11. The same software was used to test the significance of
intercepts of linear calibration dependences (α = 0.05), the statistically non-significant
intercepts are omitted in Table I summarizing parameters of calibration dependences. The
limits of detection (LDs) were calculated as the analytes' concentration giving response
corresponding to the threefold of the noise of measurement.
For the separation of 2-AB, 3-AB, and 4-AB a silica based ChiraDex® column with
chemically bonded β-cyclodextrin was used, because it is difficult to achieve sufficient
resolution of these compounds at classical reversed phases 12 due to the proximity of their pKa
values (3.82, 4.24, and 4.22 for 2-AB, 3-AB, and 4-AB, respectively). The inner diameter of
the hydrophobic cavity (0.78 nm) of β-cyclodextrin roughly corresponds to the dimension of
biphenyl skeleton. The retention is based on the hydrophobic interaction of the nonpolar
107
biphenyl skeleton with the inner part of cavity, eventually on interactions of the amino group
with polar hydroxyl groups infringing in its entrance part. The position of the amino group
influences the overall shape of the amino derivative and thus the strength of its interaction
with β-cyclodextrin. Therefore, the retention mechanism is rather different from that using
reverse phase and it is pH-independent, as we demonstrated in ref. 8. Baseline separation of
2-AB, 3-AB, and 4-AB within 6 min characterized by capacity factors of 0.36, 0.81, and
1.28, respectively was achieved using 1·10–2 mol L–1 acetate buffer, pH 5.0 / acetonitrile /
methanol (40/30/30; v/v/v) mobile phase. The pH 5.0 is optimal when considering the
increasing peak heights and areas with increasing pH of the aqueous part of the mobile
phase 8 and the DC and DP voltammetric response of studied analytes at boron-doped
diamond film electrode as described in our previous paper 7. Optimal voltammetric signals
were observed even at higher pH values (BR buffer pH 7.0, 8.0, and 9.0 for 2-AB, 3-AB, and
4-AB, respectively). However, these conditions are not applicable in described HPLC-ED
setup due to the silica-based HPLC column.
Fig. 1. (A) The detailed scheme of BDDF disk electrode used in wall-jet arrangement:
electrode body made of Teflon (1), stainless steel (2), screw attachment made of Teflon (3),
small metal spring (4), brassy sheet (5), boron-doped diamond thin film electrode on silica
support (6), Viton® gasket (7) and access for solution (8). (B) Amperometric thin-layer
detection cell: screw clamp (1), Kel-F body, bottom piece (2), copper contact (3), borondoped diamond thin film electrode on silica support, cell volume ~ 10 μl (4), Kel-F body, top
piece (5), counter electrode (6), reference electrode (7), Viton® gasket with an ellipsoid
groove defining the flow channel (8).
The influence of the Edet imposed on BDDF electrode on electrochemical signal
(hydrodynamic voltammogram) was investigated in both arrangements in the range from
+500 mV to +1400 mV, simultaneously the absolute value of the background current and
peak-to-peak noise were recorded. A gradually increase of peak currents is notable from +600
mV, until the maximum is reached. For thin-layer arrangement, these maxima lay at +900 mV
for 4-AB and +1100 mV for 2-AB and 3-AB (vs. SCE), for the wall-jet arrangement at +1100
mV for 4-AB, +1200 mV for 2-AB and 3-AB (vs. SCE). The decrease of peak currents at
more positive potentials than the potential of maxima is caused by substantial background
current increase due to the electrolytic decomposition of the mobile phase. Further
measurements were performed at detection potentials Edet = +1200 mV (vs. SSCE) and Edet =
+1000 mV (vs. SCE) for the thin-layer and wall-jet arrangement, respectively, based on the
highest signal-to-noise ratio.
108
Table I.
Parameters of calibrations straight lines for the determination of 2-AB, 3-AB, and 4-AB using
HPLC-ED with amperometric detection cell with indicator BDDF electrode in (A) thin-layer
arrangement (Edet = + 1.2 V vs. SCCE) and, (B) wall-jet arrangement (Edet = + 1.0 V
vs. SCE). Mobile phase: 0.01 mol L–1 acetate buffer pH 5.0 / acetonitrile / methanol
(40/30/30; v/v/v), FM = 1 mL min–1, injection volume 20 μL.
Slope
Correlation
Limit of detection
Linear dynamic
Analyte
–1
–1
[nA mol L]
coefficient
[mol L–1]
range [mol L ]
(A) Thin-layer arrangement
–7
2-AB
(4–100)·10
(1.35 ± 0.07)·107
0.9911
2.0·10–7
3-AB
(2–100)·10–7
(8.56 ± 0.08)·106
0.9904
3.2·10–7
–7
6
(5.28 ± 0.04)·10
0.9925
5.1·10–7
4-AB
(2–100)·10
(B) Wall-jet arrangement
–8
2-AB
(6–10000).10
(3.12 ± 0.03)·106
0.9990
6.7·10–8
(2.69 ± 0.02)·106
0.9996
7.8·10–8
3-AB
(6–8000).10–8
–8
6
(3.33 ± 0.02)·10
0.9995
6.3·10–8
4-AB
(6–10000).10
Parameters of calibration straight lines measured under optimized conditions are listed in
Table I. The linear dynamic range is notably wider for the wall-jet arrangement – more than
three orders of magnitude for all studied analytes reaching the upper limit at the concentration
of ca 1·10–4 mol L–1. For thin-layer arrangement at concentrations higher than c = 1·10–5
mol L–1 obvious saturation of calibration dependencies was observed, the tenfold increase of
analytes' concentration to c = 1·10–4 mol L–1 leads only to the three-fold increase of peak
heights and areas. This feature is probably related to the fouling tendencies of
aminobiphenyls. As for other amino aromatics, their electrooxidation is initiated by the loss of
one electron forming a radical cation at the nitrogen atom, which gives rise to dimeric
products and polymeric films by rapid follow-up reactions passivating the electrode
surface 5,13,14. These products can be more easily removed in the wall-jet arrangement, where
the BDD electrode is immersed in the bulk solution, than in the very tight thin-layer cell. The
relative standard deviation of peak heights at the concentration of 1·10–5 mol L–1, where high
concentration of passivating reaction products is be expected, was < 1.3 % (< 1.0 %) for peak
heights and < 2.9 % (< 2.1 %) for peak areas for the thin-layer (wall-jet) arrangement (seven
consecutive injections of all analytes).
The concentration LDs are in the 10–7 mol L–1 and 10–8 mol L–1 concentration range for the
thin-layer and wall-jet arrangement, respectively (Table I). This difference is given rather by
the lower peak-to-peak noise using the latter arrangement than differences in the slopes of the
linear calibration dependences. The values of LDs are comparable with quantitation and
detection limits using other electroanalytical methods: In our previous study using DPV at
BDD electrode, LQs of 1.2·10–7 mol L–1, 1.3·10–7 mol L–1, and 2.5·10–7 mol L–1 for 2-AB,
3-AB, and 4-AB, respectively, were achieved 7. Using HPLC, amperometric detection with
platinum tubular detector resulted in LDs of 2.4·10–8 mol L–1 and 2.7·10–8 mol L–1 for 2-AB
and 4-AB, respectively 12 and thin layer arrangement using glassy carbon electrode and BDD
electrode resulted in LDs of 8.2·10–7 mol L–1 and 1.2·10–7 mol L–1 for 2-AB, respectively 15.
Nevertheless, most of the solid electrodes require regular mechanical or electrochemical
maintenance to assure reproducible results and thus the use of BDD electrode is the more
user-friendly alternative.
109
Conclusions
We have demonstrated the utility and advantages of amperometric detectors in thin-layer and
wall-jet arrangement with BDD indicator electrode for HPLC-ED determination of 2-AB,
3-AB, and 4-AB. Their separation was achieved in six minutes. Using the latter arrangement,
wider linear dynamic range and lower LQs in the 10–8 mol L–1 concentration range were
achieved for all analytes compared to the thin-layer arrangement. In both cases, the BDDF
electrode exhibited good electroanalytical performance with a low peak-to-peak noise, stable
background current and sensitive, reproducible and stable responses for all tested
aminobiphenyls without electrode fouling during extended use. Moreover, no pretreatment
was required for electrode activation. Therefore, it can be concluded that HPLC coupled to
amperometric detectors with BDDF indicator electrode in both arrangements fulfill the
requirements on reliable, fast, sensitive, and relatively inexpensive determination of studied
aminobiphenyls.
Acknowledgements
The project was supported by the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects
LC 06035, MSM 0021620857, and RP 14/63). KP and LM thank to the Grant Agency of the
Charles University in Prague for financial support (project GAUK 92010).
References
1. IARC: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Overall
Evaluations of Carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs. Volumes 1 to 42.
Supplement 7. IARC, Geneva 1987.
2. Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond Electrochemistry. Elsevier,
Amsterdam 2005.
2003 (2007).
4. Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009).
5. Mitadera M., Spataru N., Fujishima A.: J. Appl. Electrochem. 34, 249 (2004).
6. Cizek K., Barek J., Fischer J., Peckova K., Zima J.: Electroanalysis 19, 1295 (2007).
7. Barek J., Jandova K., Peckova K., Zima J.: Talanta 74, 421 (2007).
8. Peckova K., Jandova K., Maixnerova L., Swain G. M., Barek J.: Electroanalysis 21, 316
(2009).
9. Jolley S., Koppang M., Jackson T., Swain G. M.: Anal. Chem. 69, 4099 (1997).
10. Fischer A. E., Lowe M. A., Swain G. M.: J. Electrochem. Soc. 154, K61 (2007).
11. Meloun M., Militký J., Forina M.: Chemometrics for Analytical Chemistry. Ellis
Horwood, Chichester, 1992.
12. Zima J., Vaingatova S., Barek J., Brichac J.: Chem. Anal. (Warsaw) 48, 805 (2003).
13. Adams R. N.: Electrochemistry at Solid Electrodes. Marcel Dekker, New York 1969.
14. Dinh H. N., Vanysek P., Birss V. J.: J. Electrochem. Soc. 146, 3324 (1999).
15. Cvacka J., Swain G. M., Barek J., Zima J.: Chem. Listy 96, 33 (2002).
110
Carbon Nanotubes - Material for Carbon Paste Electrodes, Possibilities of Preparation
and Characterization
(Uhlíkové Nanotrubičky – materiál pro uhlíkové pastové elektrody, možnosti přípravy a
charakterizace)
a
Tomáš Mikysek , Matěj Stočes a, Ivan Švancara a, and Jiří Ludvík b
a
Chemistry, Studentská 573, 53210 Pardubice,Czech Republic.
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Czech Republic
Abstract
In this article, some new approaches to characterize the carbon paste mixtures and the
respective carbon nanotube paste electrodes (CNTPEs) are presented, discussed. Particular
attention has been paid to the changes of the ohmic resistance, relative to the dependence on
composition of the CNTPE, the materials used, the time. Four types of carbon nanotube
pastes were examined, and for the interpretation of experimental data. Some problems
connected with homogeneity and stability of carbon pastes, their storage, or eventual aging
effects are also discussed.
Key Words: Carbon, Paste electrode, Nanotubes, Silicone oil, Paraffin oil, Characterization.
Úvod
Téma uhlíkových pastových elektrod (CPE) je v popředí zájmu i v novém miléniu. První
práce byla publikována v roce 1958 R. N. Adamsem 1, od tohoto data uběhlo více než 50 let a
za tuto dobu vyšla celá řada publikací a přehledových prací 2.
Heterogenní charakter tohoto elektrodového materiálu, specifický vliv přítomného kapalného
pojiva a především variabilita používaného složení činí z charakterizace v případě CPE takřka
nevyhnutelný krok k důkladnějšímu poznání jejich vlastností a chování a tudíž i úspěšnému
používání v praktických měřeních 3. O nezbytnosti základní charakterizace prostřednictvím
příslušných měření a vhodně volených srovnávacích testů se přesvědčil již samotný objevitel
uhlíkové pasty, R.N. Adams, se svými spolupracovníky a v charakterizaci uhlíkových past
pak pokračovali i další 4,5.
S postupem času a s příchodem nových materiálů je charakterizace stále aktuálním tématem.
Objev uhlíkových nanotrubiček 6 se také podepsal na uhlíkových pastách a uhlíkové
nanotrubičky se tak staly dalším z alternativních materiálů používaných v elektrochemii a
elektroanalýze s uhlíkovými pastovými elektrodami. První práce věnovaná tomuto tématu je
ze skupiny Palleschiho 3 následovali ji i další přínosné příspěvky od skupin Rivale 7 a
Wanga 8, kteří se spíše zabývali využitím uhlíkových nanotrubiček v elektroanalýze a
charakterizaci nových typů (bio)senzorů. Co se týče samotné charakterizace významný je
především odborný článek F. Valentini 9, která se věnuje: i) čistotě uhlíkových nanotrubiček
ii) optimálnímu složení uhlíkové pasty a iii) elektrochemické reaktivitě směrem k aplikacím
v oblasti biosenzorů. Další práce srovnává pastové elektrody z uhlíkových nanotrubiček
s ostatními elektrodovými materiály, jako jsou: skelný uhlík a platina, jde jak o základní
srovnání významných fyzikálně-chemických parametrů tak i o srovnání elektrochemických
vlastností v různých redox systémech (např. hexakyanoželezitan, ferrocen-monokarboxylová
kyselina, dopamin) 10. Uhlíkové nanotrubičky se uplatňují nejen v elektrochemii, ale i
v jiných oblastech analytických věd, to dokládá přehledová práce Arbena Merkociho 11.
111
Chemikálie
Hexakyanoželezitan draselný K3[Fe(CN)6] (p.a. kvalita), chlorid draselný, KCl (Suprapur)
obojí dodáno firmou Merck. Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody
pomocí systému Milli-Q od firmy MIllipore.
Přístrojové vybavení
Všechna elektrochemická měření byla prováděna na přístroji AUTOLAB (model “PGSTAT
30”; Ecochemie, Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena měřicí cela s tříelektrodovým systémem obsahujícím pracovní elektrodu (CNTPE viz. níže), referentní
elektrodu Ag | AgCl | 3 M KCl a pomocnou elektrodu (Pt).
Uhlíkové pastové elektrody
Směsi uhlíkových past byly připravovány smísením určitého množství nanotrubiček
s pastovou kapalinou a následnou homogenizací v třecí misce. Během experimentu byly
používány nanotrubičky: a) jednovrstvé (typ: L.SWNTs, s průměrem < 2 nm; Shenzhen
Nanotech Port Co. Ltd., Čína); b) vícevrstvé (typ: L.MWNTs-1030 s průměrem 10-30 nm od
stejné firmy jako v případě jednovrstvých). Pastovou kapalinou byl buď i) silikonový olej
(SO, Lukooil MV 8000, Lučební závody Kolín) nebo ii) parafínový olej (PO, Merck). Po
homogenizaci byla směs naplněna do teflonového pouzdra s otvorem o průměru 2 mm. V této
práci byly připraveny pasty (elektrody) z jednotlivých typů uhlíkových nanotrubiček ve směsi
buď se silikonovým, nebo s parafínovým olejem. Procentuální zastoupení pastové kapaliny ve
směsi se pohybovalo v rozmezí od 0 do 70% (m/m). U čerstvě připravené série elektrod byl
změřen ohmický odpor a následně bylo provedeno obnovení povrchu otřením o filtrační papír.
Postupy
Měření ohmického odporu. Ve všech případech tělo elektrody bylo umístěno vertikálně tak,
aby se elektrodový povrch dotýkal vodivé podložky. Kovový píst (součást elektrodového těla)
byl druhým kontaktem připojeným na multimetr (Model Voltcraft; Conrad Electronics,
Německo).
Cyclická Voltametrie (CV). Tyto experimenty byly prováděny v roztoku 0,1 M KCl
obsahujícího 5 mM K3Fe(CN)6. U většiny experimentů počáteční potenciál byl 0 V vs
Ag/AgCl a sken probíhal v katodickém směru a následně pak v anodickém při rychlosti
změny polarizačního napětí 50 mV/s, 3 skeny. Před každým měřením byl roztok důkladně
probublán argonem a čerstvě obnoven povrch elektrody.
Výsledky a diskuse
Tato práce navazuje na předchozí charakterizaci 11, která byla prováděna s tradičními
uhlíkovými pastovými elektrodami. Svým způsobem se jednalo o „zásadní“ práci, která
objasňuje vodivost tohoto elektrodového materiálu, a zároveň poukazuje na některé nové
praktické aspekty, které je zapotřebí brát v úvahu při jejich přípravě. Je tak vhodným
návodem pro ty, co přicházejí do styku s pastami vůbec poprvé.
Z experimentů bylo zjištěno, že měrný odpor, vzrůstal se zvyšujícím se množstvím pojiva,
přičemž zároveň klesala vodivost elektrodového materiálu. Ta samá skutečnost se objevila i u
past připravených ze dvou typů nanotrubiček avšak perkolační práh je u tohoto elektrodového
materiálu posunut k vyšším hodnotám. Jinými slovy hodnota měrného odporu se nijak
dramaticky němění se zvyšujícím se množstvím pojiva až do určité „mezní“ hodnoty, kde
dochází k prudkému zvýšení měrného odporu (viz. obr.1).
112
Obr. 1. Závislost měrného odporu uhlíkové pasty typu SWNT/PO na množství použitého
pojiva – parafínový olej (v % hm.).
Jak je patrno z obrázku, přibližně kolem hodnoty 60% dochází k výraznému nárůstu měrného
odporu, což je způsobeno tím, že se částice dostanou z pozice nejtěsnějšího možného
uspořádání a dojde ke snížení vodivosti. U běžných uhlíkových past (směsi grafitu a
minerálního oleje) byl tento jev také pozorován, a „zlom“ se vyskytuje přibližně u hodnoty
30%. Tento rozdíl je způsoben různým specifickým povrchem, který je v případě uhlíkových
nanotrubiček několikrát větší nehledě na různé poruchy v jejich struktuře. Co se týče srovnání
jednotlivých připravených směsí (SWNT/SO, SWNT/PO, MWNT/SO, MWNT/PO), nebyly
zjištěny velké rozdíly a zlom byl pozorován u již zmiňovaných 60%.
Na základě měření odporu a vodivosti bylo možno rovněž ověřit, zda nedochází ke změnám
složení a porušení homogenity elektrodového materiálu (např. ztráta pastové kapaliny) CNTP.
U past s vyšším obsahem pojiva (60 hm.% a více) po určité době dochází ke „krvácení“
elektrody. Naopak u past s minimem pastové kapaliny docházelo vysypání elektrodového
materiálu z těla elektrody, plnění a vlastní příprava byla obtížná. Fyzikálně-chemické
vlastnosti jsou jakýmsi prvním vodítkem k volbě a následné přípravě past z uhlíkových
nanotrubiček, které mají svá specifika a jejich příprava není snadná.
Z pohledu elektrochemické charakterizace se další část práce zabývala sledováním specifické
reakční kinetiky na uhlíkových pastových elektrodách. K těmto účelům bylo využíváno
tradiční cyklické voltametrie (CV) s lineární změnou potenciálu a standardního elektrodového
systému [Fe(CN)6]4− / [Fe(CN)6]3− (5 mM v 1 M KCl), jehož chování na běžných elektrodách
je takřka ideálně reverzibilní (tj. rozdíl potenciálů anodického a katodického píku,
ΔEP = 59 mV vs. SKE), zatímco na površích uhlíkových past vykazuje menší či větší míru
ireverzibility, kdy příslušná hodnota ΔEP dosahuje 150 mV anebo i více. V případě past
113
připravených z uhlíkových nanotrubiček je tato hodnota o něco nižší a reverzibilita
elektrodového děje se zlepšila. Věrně to dokumentují i vybrané údaje v tabulce I, a to včetně
známé skutečnosti, že míra reverzibility klesá s rostoucím obsahem pastové kapaliny; u směsi
s obsahem pojiva nad 60 % lze dokonce říci, že sledovaný redox-systém se chová již zcela
ireverzibilně. Srovnáme-li však jednotlivé směsi, je patrné, že míra reverzibility je lepší u
směsi jednovrstvých nanotrubiček se silikonovým olejem (SWNTP/SO), to poukazuje na fakt,
že nejen samotné nanotrubičky mají vliv na reverzibilitu, ale i vhodná pastová kapalina může
zde sehrát svou roli.
Tabulka I.
Míra reverzibility na CNTPE typu SWNTP/PO a SWNTP/SO u systému FeII/FeIII.
SWNTP/PO
SWNTP/SO
ΔEp po 5-ti
ΔEp po 5-ti
Obsah pojiva
ΔEp
ΔEp
dnech
dnech
(v % hm.)
[mV]
[mV]
[mV]
[mV]
20,5
102
124
81
87
35,0
145
108
79
81
43,0
150
160
94
95
51,5
230
329
112
93
64,0
404
522
120
103
71,5
901
810
205
203
Pomocí cyklické voltametrie bylo také možno sledovat stabilitu elektrodového materiálu.
Elektrochemické chování jednotlivých elektrod v systému FeII/FeIII bylo zkoumáno ihned po
jejich přípravě a poté se elektrody nechaly 5 dnů ve vertikální poloze za laboratorní teploty na
vzduchu a následně pak byla zkoumána jejich elektrochemická aktivita v tomtéž sytému.
Výsledky ukázaly, že u elektrod s výrazně vyšším obsahem pastové kapaliny (60% a výše)
dochází k postupnému vytékání pojiva z elektrody, čímž se mění poměr uhlíkových
nanotrubiček a parafínového (silikonového) oleje. U směsí MWNT/SO, MWNT/PO se míra
reverzibility pohybuje na přibližně na stejné úrovni jako klasických uhlíkových past (směsí
grafitu a pojiva).
Závěr
Z výše diskutovaných experimentů lze tedy konstatovat, že některá nově koncipovaná
charakterizační měření, mohou napomoci k dalšímu upřesnění dosavadních výkladů o
chování past z uhlíkových nanotrubiček jakožto elektrodového materiálu, společně s jejich
využitím jako hodnotných informací pro přípravu CNTPE s konkrétně zamýšleným využitím.
Příprava kvalitních uhlíkových past je záležitostí jisté praxe avšak pomocí těchto
jednoduchých měření si každý může provést charakterizaci vlastní směsi elektrodového
materiálu. Na základě měření odporu lze vyčíst některé fyzikálně-chemické vlastnosti a
následně pomocí měření cyklické voltametrie ve známém redox systému lze zjistit
elektrochemické vlastnosti zkoumané elektrody. Z porovnávaných směsí se ukázala
nejideálnější směs jednovrstvých nanotrubiček a silikonového oleje. Poměr jednotlivých
komponent by měl být přibližně 50% uhlíkových nanotrubiček a 50% pojiva. Při vyšším
množství pojiva dochází k nárůstu měrného odporu a klesá reverzibilita, naopak u malého
množství je elektrodový materiál příliš tuhý a homogenizace je náročná – materiál se může i
rozpadat. Kromě výše uvedených experimentů by bylo zajímavé prozkoumat i velikost
elektrodové plochy.
114
Poděkování
Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České
Republiky projektu MSM0021627502 a Výzkumného centra LC510.
Literatura
1. Adams R.N.: Anal. Chem. 30, 1576 (1958).
2. Kalcher K., Švancara I., Metelka R., Vytřas K., Walcarius A.: The Encyclopedia of
Sensors, (Grimes C.A., Dickey E.C., Pishko M.V., eds.) Vol. 4, p. 283-430. ASP –
American Scientific Publishers, Stevenson Ranch (FL, USA) 2006.
3. Švancara I., Walcarius A., Kalcher K., Vytřas K.: Cent. Eur. J. Chem. 7(4), 598 (2009).
4. Lindquist J.: J. Electroanal. Chem. 52, 37 (1974).
5. Švancara I., Schachl K.: Chem. Listy 93, 490 (1999).
6. Iijima S: Nature 354, 56 (1991).
7. Rivas G. A., Rubianes M. D., Pedano M. L.,Ferreyra N. F., Luque G. L., Rodriguez M.
C., Miscoria S. A.: Electroanalysis 19, 823 (2007).
8. Lawrence N. S., Deo R. P., Wang J.: Talanta 63 443 (2004).
9. Valentini F., Amine A., Orlanducci S., Terranova M. L., Palleschi G.: Anal. Chem. 75,
5415 (2003).
10. Antiochia R., Lavagnini I., Magno F., Valentini F., Palleschi G.: Electroanalysis 16, 1451
(2004).
11. Merkoci A.: Microchim Acta 152, 157 (2006).
12. Mikysek T., Švancara I., Bartoš M., Kalcher K., Vytřas K., Ludvik J.: Analytical
Chemistry 81, 6327 (2009).
115
Determination of Nitrophenols by Flow Injection Analysis with Amperometric Detection
on Boron Doped Diamond Film Electrode
Jana Musilová, Jiří Barek, and Karolina Pecková
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, 128 43 Prague 2,
Abstract
Boron doped diamond film electrode (BDDFE) was employed in amperometric detection cell
in “wall jet” arrangement for determination of 2-nitrophenol (2NP), 4-nitrophenol (4NP) and
2,4-dinitrophenol (DNP) in flow injection analysis. Under optimized conditions (run buffer
0.01 mol.L−1 sodium hydroxide; flow rate 4 mL.min−1; detection potential 1 V; injection
volume 20 µL), the limits of quantitation of 2×10−6 mol.L−1 were achieved. The repeatability
of the detector response is satisfactory (relative standard deviation around 2 % for c(2NP,
4NP and DNP) = 1×10−4 mol L−1) even without any BDDFE treatment.
Key Words: Boron-doped diamond film electrode, Nitrophenols, Flow injection analysis.
Introduction
Boron doped diamond (BDD) is versatile electrode material, which have gained popularity in
a variety of electrochemical applications 1-8. BDD film electrodes (BDDFE) possess excellent
electrochemical properties, such as extreme hardness, low and stable background current over
a wide potential range, microstructural stability at extreme cathodic and anodic potentials,
extreme electrochemical stability in both alkaline and acidic media, high current densities,
good responsiveness for many redox analytes without pretreatment, and resistance to
electrode fouling 9. Because of the wide potential window in cathodic and anodic potentials,
BDDFE can be used to determine a wide variety of inorganic and organic compounds using
electrochemical reduction and oxidation. BDDFE also poses mechanical robustness that allow
their application in flow liquid systems (flow injection analysis (FIA) or HPLC) as working
electrodes of electrochemical detectors.
Nitrophenols coming from pesticide degradation, car exhausts, and industrial wastes 10 are
listed as priority pollutants by the US Environmental Protection Agency (US EPA). Pesticides
based on simple nitrophenols are used as growth stimulators in agriculture 11. US EPA has
restricted the concentration of 2-nitrophenol (2NP), 4-nitrophenol (4NP) and
2,4-dinitrophenol (DNP) in natural water to be less than 10 μg.L-1, that is 5×10-8 mol.L-1 for
DNP and 7×10-8 mol.L-1 for 2NP and 4NP 12. Voltammetric determination of nitrophenols at
BDDFE has been already described using electrochemical reduction and oxidation 13.
Experimental
Stock solution of 2NP, 4NP (1×10-3 mol.L-1, 98%, Sigma-Aldrich, Germany) and DNP
(1×10-3 mol.L-1, 97%, Reachim, Russia) were prepared by dissolving an accurately weighed
amount of the pure substance in 100 ml of deionized water using sonication. Solutions of
lower concentrations were prepared by dilution of stock solution with run buffer. Sodium
hydroxide (p.a. purity) was obtained from Lachema Brno (Czech Republic). All solutions
were kept in glass vessels in dark at laboratory temperature. Deionized water was produced
by Milli-Qplus system (Millipore, USA).
The FIA system consisted of gradient pump BETA 10 (Ecom, Prague) and electrochemical
and spectrophotometric detector. Electrochemical detector in “wall jet” geometry described
earlier 14 with three electrode system - platinum wire electrode (Monokrystaly, Czech
116
Republic) as auxiliary electrode, Ag/AgCl reference electrode (type RAE 113, 3 mol.L-1 KCl,
Monokrystaly, Czech Republic) and working BDDFE (3 mm diameter, Windsor Scientific,
UK) - was used. Electrode system was driven by ADLC 2 (Laboratorní přístroje, Prague)
potentiostat. Samples were injected using six-way valve D (ECOM, Prague). The treatment or
activation of electrode's surface was not necessary.
signal/noise
The optimum pH for the voltammetric determination of nitrophenols at BDDFE using
electrochemical oxidation was pH 10 – 11 13. Therefore, 0.01 mol.L-1 sodium hydroxide was
used as a run buffer. The optimization of conditions consisted in optimization of detection
potential (Edet), flow rate (Fm) of the run buffer and injection volume (Vinj). Firstly, the
influences of the Edet imposed on BDDFE on electrochemical signal (hydrodynamic
voltammogram) were investigated (see Fig. 1). The best signal/noise ratio for all analytes was
obtained at Edet 1V, that was chosen as optimum potential for further measurements. For
higher potentials, peaks were higher, but the noise and background current was also higher.
The optimum flow rate was set at 4 mL.min−1 and the injected sample volume was set at
20 µL.
2NP
4NP
DNP
500
400
300
200
100
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
E, V
Fig.1. Hydrodynamic voltammograms of 2NP, 4NP and DNP (c = 1.10-4 mol.L-1) at BDDFE
in "wall jet" arrangement. Run buffer 0.01 mol.L-1 sodium hydroxide, Fm = 4 mL.min-1,
injected sample volume 20 µL.
The repeatability of measurements was tested at previously found optimal conditions. For 20
repeated injections of 2NP, 4NP and DNP ( c = 1×10−4 mol.L−1) no statistically significant
change of the peak heights were observable (RSD around 2%), even without any BDDFE
treatment. In voltammetric measurements using electrochemical oxidation, RSD was higher
(4-8 % for 4NP and DNP) and for 2NP it was not suitable method because of evident
passivation of electrode's surface (RSD 16 %).
Calibration dependences were measured under optimized conditions in the range from 2×10−6
to 1×10−4 mol L−1 and limits of quantification were around 2×10−6 mol L−1.
117
Conclusion
The use of boron doped diamond film electrode as an amperometric detector in "wall jet"
arrangement for determination of 2-nitrophenol, 4-nitrophenol and 2,4-dinitrophenol was
developed in flow injection analysis. The repeatability of the detector response is satisfactory
even without any BDDFE treatment.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the
Czech Republic (projects LC06035, MSM 0021620857 and RP 14/63), the Grant Agency of
the Charles University in Prague (project SVV 261204) and by the NATO grant
CBP.EAP.CLG.982972.
References
1. Kraft A.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 355 (2007).
2. Chailapakul O., Siangproh W., Tryk D. A.: Sens. Lett. 4, 99 (2006).
3. Pleskov Y. V.: Russ. J. Electrochem. 38, 1275 (2002).
4. Compton R. G., Foord J. S., Marken F.: Electroanalysis 15, 1349 (2003).
5. Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond electrochemistry, Elsevier,
Amsterdam 2005.
6. Musilova J., Barek J., Peckova K.: Chem. Listy 103, 469 (2009).
7. Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009).
8. Pecková K., Musilová J., Barek J., Zima J.: Voltammetric and Amperometric
Determination of Organic Pollutants in Drinking Water Using Boron Doped Diamond
Film Electrodes. In Progress on Drinking Water Research (Le Febvre M. H., Roux M.
M, ed.). Nova Publishers, New York 2008.
9. Xu J. S., Chen Q. Y., Swain G. M.: Anal. Chem. 70, 3146 (1998).
10. Harrison M. A. J., Barra S., Borghesi D., Vione D., Arsene C., Olariu R. L.: Atmos.
Environ. 39, 231 (2005).
11. SRS: List of the Registered Plant Protection Products, The state phytosanitary
administration, Brno 2006.
12. Jinadasa K., Mun C. H., Aziz M. A., Ng W. J.: Water Sci. and Technol. 50, 119 (2004).
13. Musilová J., Barek J., Drašar P. and Pecková K.: Sensing in Electroanalysis 4 (Vytras K.,
Kalcher K., Svancara I., Eds.), University of Pardubice, Pardubice 2009.
2003 (2007).
118
Transport of Cadmium Ions across Model Supported Phospholipid Membranes
Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, Vladimír Mareček, and Karel Štulík
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague,
Abstract
These results report on experiments focused on the formation of supported model
phospholipid membranes, formed from phosphatidyl choline in the micrometric pores of
hydrophilic polycarbonate supports, their characterization using voltammetry and
electrochemical impedance spectrometry (EIS). Attention was paid to the transport of heavy
metal ions (ions of cadmium, etc.) across these membranes in the presence or absence of
ionophores (valinomycin and calcimycin) or in the presence of oxalic acid. The impact of
some parameters on these systems and processes was investigated.
Key Words: Membranes, Phospholipids, Heavy metals, Cadmium, Lead, Transport across
the membrane, Voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy.
Introduction
The air, waters and soils are contaminated with increasing levels of various metals, inorganic
or organic compounds (partly products of human activities). To secure normal functioning of
the living (plant or animal) cells, it is necessary to realize transport of various inorganic and
organic compounds (nutrients, etc.), across the cell membrane into or out of the cells or
various sub-cellular structures. Not only the useful and usual metabolic compounds are
transported into the cells across the membranes; unfortunately, the above mentioned
undesired ions, compounds and particles, which are connected with the pollution of the
environment, also participate in the transporting processes 1,2. The principles, on which the
transports are based, have been studied for many years in a lot of laboratories allover the
world. Their elucidation presents the first step of influencing these processes (e.g., of
increasing or decreasing the amount of some ion in the cell by phytoremediation 3 ). They are
based on many principles, such as passive diffusion, facilitated diffusion, ion pumps and
channels (e.g., in cases of Ca2+, K+, Na+), or endocytosis and exocytosis (e.g., with larger
objects and particles, such as bacteria, viruses) 4). In spite of a certain progress in this field of
research, the transport of some elements or particles (e.g., heavy metals) is still poorly
understood and there are many unanswered questions.
Real lipid bilayers are thin, relatively flat membranes consisting of two layers of lipid
molecules (phospholipid bilayers (PLB)), with their hydrophobic parts, usually fatty acid tails,
directed toward the centre of the membrane, and with two hydrophilic parts 5. Because the
real cell membranes are very complicated, we have started to study the above mentioned
processes using model membranes, more precisely, model supported phospholipid (SPL)
membranes (or bilayers), which should represent, in the first approximation, the real
protoplast membrane 1,2,6.
Various techniques have been applied to the study of the membrane formation and of the
transporting processes, e.g., fluorescence microscopy 7, fluorescence lifetime correlation
spectroscopy combined with lifetime tuning 8, combinations of fluorescence spectroscopy
with ab initio calculations 9, solvent relaxation technique 10, or confocal fluorescence
correlation spectroscopy 11. Because our laboratories concentrate on the electrochemical
methods, we have applied these methods (electrochemical impedance spectroscopy (EIS),
voltammetry, conductometry etc.) to these studies.
119
Under current knowledge 1,2,12, metals in environmental systems do not exist as ions, but
mostly as complexes with, e.g., low molecular weight organic acids (LMWOAs). The Cd and
Pb complexes with oxalic (OA) and citric acid (CA) were detected in model and soil solutions
using cyclic and stripping voltammetry 13. Therefore, it is highly important to elucidate the
transport of such complexes (or, more precisely, the transport of these metals in the presence
of LMWOAs) across the biological membranes.
Experimental
Apparatus
For quantification of the electrochemical impedances, silver/silver chloride electrodes (silver
wire, diameter 1 mm, electroplated with silver chloride) were used. Platinum wire, diameter
1 mm, served as the auxiliary electrode. These measurements were realized using a CHI 650C
Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI v. 8.1 (IJ Cambrija Scientific, Carms,
UK).
The voltammetric determinations of cadmium ions were carried out using a PC - controlled
voltammetric analyzer ECO-TRIBO polarograph (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic),
equipped with MultiElchem v. 2.1 software 14 (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry
of AS CR, v.v.i., Prague, Czech Republic) and with POLAR.PRO software v. 5.1. A pen-type
electrode HMDE 15 was used as the working electrode, an Ag/AgCl/KCl (3 mol.L-1) as the
reference electrode to which all the potentials are referred to, and a platinum wire served as
the counter electrode (both Elektrochemicke Detektory, Turnov, Czech Republic). To
determine cadmium ions, the sample was acidified with HNO3, Suprapur (Merck, Prague,
Czech Republic) to pH 1.0 and analyzed using anodic stripping differential pulse voltammetry
(AS DPV) under the following conditions: Accumulation potential (Eacc) = -850 mV,
accumulation time (tacc) = 180-360 s, initial potential (Ein) = -700 mV, final potential (Efin) = 200 mV, scan rate, 10 mV.s-1, pulse amplitude, 50 mV, pulse duration, 100 ms, the measuring
periods over the last 20 ms before the pulse onset and over the last 20 ms of the pulse
duration, sample volume, 10 mL. A new drop was used for each recording and all the
measurements were performed under the nitrogen atmosphere. The pH was measured by a
digital pH/mV meter MPH 61 with a combined electrode TYPE 01-29 (all from
Monokrystaly, Turnov, Czech Republic).
Reagents and Materials
The 0.1 M KCl base electrolyte solutions were prepared from KCl Suprapur, purchased from
Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents were obtained from Penta-Švec, Prague,
Czech Republic. All the other chemicals used were of the analytical grade. For all the
measurements, deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic
(conductivity < 0.05 µS.cm-1) was used. The AAS standard solution of Cd2+ or Pb2+ (1000
mg.L-1 in 2% HNO3) was purchased from Analytica, Prague, Czech Republic.
Two types of pure phospholipids were used for the preparation of PLBs on porous
membranes: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lecithin, DPPC, GPCho
(16:0/16:0), CAS No. 63-89-8) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA), and 1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE, GPEtn(16:0/16:0), CAS No. 923-61-5) (SigmaAldrich, Prague, Czech Republic). The PLBs were formed by self-assembling in the holes of
the Isopore™ Membrane Filters (Millipore, USA) polycarbonate, hydrophilic 8.0 µm, and the
supporting membrane thickness amounted to 7-22 μm. The area of one pore amounted to 50
μm2, the experimentally found porosity of the membranes was about 25-45 %. To investigate
the transport processes, the ionophores valinomycin or calcimycin were added to the solution
120
of the phospholipids before their application to the support. The ionophores were purchased
from Sigma-Aldrich, valinomycin was > 90% (HPLC), and Calcimycin (Calcium Ionophore,
Antibiotic A23187) was > 98% (TLC).
Cell Designs for EIS Measurements
The very important role of both the types of electrochemical cells used were already described
in ref. 16 in the Proceedings of this conference one year ago. They are depicted in Fig. 1.
Work
A
B
1
A
u
x
2
R
e
f
Fig. 1. Electrochemical cells with electrodes A) glass “Insert” with electrodes – 1 –
“electrolyte 1”; 2 – “electrolyte 2”; Full line – Polycarbonate membrane glued on a plastic
cup; Dotted line – walls of the electrochemical polypropylene cell; B) polythene tube “Ucell”.
Preparation of Supported Phospholipid Bilayers
The way of the PLB preparation was described in detail in ref. 6. A volume of 10 µL of a
phospholipid solution (20 mg.mL-l, in n-heptane) was applied to one side of the polycarbonate
membrane, the solvent was evaporated, and then another volume of 10 µL was applied to the
other side of the membrane and the solvent evaporated. When using the “U-Cell” (Fig. 2B),
the membrane support with the SPLBs formed was inserted into the hole (0.2 cm2) between
the two compartments of the glass electrochemical cell. In the arrangement of “Insert”, the
polycarbonate membrane was glued (epoxy resin (UHU, Bühl, Germany)) onto the plastic cup
with a small hole in the centre (0.16 cm2), prior to the application of the phospholipid
solution. This cup subsequently formed the bottom of the upper part of the polypropylene
electrochemical cell. Such arrangement proved as more convenient, due to the same areas
provided for the bilayer formation. To prevent contamination in the experiments with
calcimycin and cadmium ions, all the parts (cup, upper and lower part) were exchanged for
the new ones prior to each experiment.
Solutions of the ionophores were added to the lipid solutions before their application to the
polycarbonate membrane. Valinomycin was dissolved in ethanol, calcimycin in methanol (the
concentration of the ionophores in the lipid solutions was 2.10-7 mol.L-1). Both sides of the
membrane were exposed to the aqueous electrolyte after a break of 30 min., following the
application of the lipid solution to the support.
Electric equivalent circuits
Two types of equivalent circuits, which were described in detail in 1,6, were used for
characterization of SPLBs. The simpler one was applicable to characterization of the free
polycarbonate membranes, where RS represents the resistance of the electrolyte, capacitor C
121
corresponds to the parasitic capacitance of the polycarbonate membrane and Rp to the
resistance of the free membrane. The other one was more suitable for characterization of
SPLBs formed on the polycarbonate membrane. This circuit includes components similar to
those in the simpler one, moreover, the parallel combination of capacitor C2 and resistor R2
describes the electrical properties of the SPL membrane.
Results
After successful experiments, in which reproducible SPLBs were formed, as described in the
chapter “Preparation of Supported Phospholipid Bilayers” 16, our attention turned to
investigation of the transport of divalent cadmium cations across the SPBLs, formed from
DPPC and DPPE with an addition of two ionophores: valinomycin and calcimycin (A23187
ionophore). Valinomycin enables transport of univalent cations. Therefore, transport of heavy
metals, Cd2+ or Pb2+, was prohibited. Enhanced transport of cadmium ions across the SPLBs,
formed from DPPC with calcimycin added, has been observed in the presence of Ca2+ 1,2,6. In
our simple system, involving no other metal ions or pump systems, there is a possibility of
different effects of 1:1 and 1:2 complexes (CdA+ and CdA2), similar to the cadmium ion
transport through a phospholipid bilayer containing a crown ether 17 (Table I).
In the following experiments, we concentrated on the transport of heavy metals across the
SPLBs in the presence of LMWOAs, in this case oxalic acid (OA), in the absence of any
ionophore. The effect of the pH was investigated. The results of our experiments are
summarized in Table I. It can be concluded that OA substantially influences the transport of
the cadmium and lead ions across the model membrane, independently of the pH. The electric
equivalent circuits described above were utilized for characterization of these processes,
finding that the trends in changing some of their parameters can characterize the transporting
processes qualitatively.
Table I.
Transport of Cd2+ ions across the lecithin (DPPC) SPLB. Total amount of Cd2+ in Electrolyte
1 (100 %) was 20 μg, E=-0.1 V.
pH of
Conditions
Cd2+(10 µg.mL-1)
Ellyte 2
Fraction of
Ellyte 1
Ellyte 1
transported
[V]
Cd2+ [%]
Free membrane
0.1 M KCl
5.7
0.1M KCl
28.73
DPPC
0.1 M KCl
5.7
0.1M KCl
0.00
DPPC + Calcimycin
0.1 M KCl
5.7
0.1M KCl
0.01
5.7
0.1 M CaCl2
0.35
DPPC + Calcimycin
0.1 M CaCl2
7.5
0.1M KCl
0.22
DPPC
0.1 M KCl+3·10-5 M OA
-5
7.5
0.1M KCl
0.17
DPPC
0.1 M KCl+3·10 M OA
0.76*
Pb2+(10 µg.mL-1)
DPPC
0.1 M KCl
7.5
0.1M KCl
0.00
*The value describes the transport of Pb2+ ions
Conclusions
In general, pronounced suitability of electrochemical approaches to the study of the formation
and properties of PLBs is demonstrated.
It has been proven that EIS measurements permit reliable monitoring of these processes.
Voltammetric techniques are suitable for monitoring the effects of electric fields on the PLB
character and for studies of charge transport across it.
122
The starting experiments realized with supported phospholipid bilayers have helped to
improve the ways of their preparation and to find the possibilities of their characterization.
Suitable measuring techniques have been developed and the measuring analytical cells for
these purposes have been constructed. It can be concluded that successful incorporation of the
valinomycin and calcimycin ionophores permits the transport of metals across the SPLBs.
The stability of SPBLs allowed the study of the influence of the DC voltage applied and the
quantification of the Cd2+ transport across SPBLs with incorporated calcimycin. An enhanced
transport of cadmium ions in the presence of Ca2+ has been observed. The presence of OA
affects the transport of Cd2+ ions and this process can be characterized by evaluation of the
parameters of the electric equivalent circuits, obtained by EIS measurements.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge financial support by the GA AV CR, project
No. IAA400400806.
References
1. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Transactions
on Environment and Development 6, 208 (2010).
2. Navratil T., Sestakova I., Dytrtova J. J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS International
Conference on Environment, Ecosystems and Development, Study of Charged Particles
Transport across Model and Real Phospholipid Bilayers, Puerto de la Cruz, SPAIN, Dec
14-16, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.), p. 212,
World Scientific and Engineering Acad and Soc, Puerto de la Cruz 2009.
3. Jakl M., Jaklova Dytrtova J., Miholova D., Kolihova D., Szakova J., Tlustos P.: Chem.
Speciation Bioavailability 21, 111 (2009).
4. Murray R. K., Granner K. D., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harper's Biochemistry
Appleton and Lange, Stamford 1996.
5. Tien H. T., Salamon Z., Guo D. L., Ottovaleitmannova A.: Active Materials and Adaptive
Structures (Knowles G. J., ed.), Iop Publishing Ltd, Bristol, 1992.
6. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis, Accepted (2010).
7. Hoffmannova H., Hof M., Krtil P.: J. Electroanal. Chem. 588, 296 (2006).
8. Benda A., Fagul'ova V., Deyneka A., Enderlein J., Hof M.: Langmuir 22, 9580 (2006).
9. Sykora J., Slavicek P., Jungwirth P., Barucha J., Hof M.: J. Phys. Chem. B 111, 5869
(2007).
10. Rieber K., Sykora J., Olzynska A., Jelinek R., Cevc G., Hof M.: BBA-Biomembranes
1768, 1050 (2007).
11. Benda A., Benes M., Marecek V., Lhotsky A., Hermens W. T., Hof M.: Langmuir 19,
4120 (2003).
12. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Szakova J., Miholova D., Tlustos P.: Cent. Eur.
J. Chem. 6, 71 (2008).
13. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
14. Yosypchuk B., Navratil T., Lukina A. N., Peckova K., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw)
52, 897 (2007).
15. Novotny L.: Electroanalysis 2, 257 (1990).
16. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXIX,
Electrochemical Impedance Spectroscopy of Lecithin Bilayers Supported on Porous
Membranes, Jetrichovice, 25.-29.5.2009, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST Servis, p.
74.
17. Hamidinia S. A., Steinbaugh G. E., Erdahl W. L., Taylor R. W., Pfeiffer D. R.: J. Inorg.
Biochem. 100, 403 (2006).
123
Determination of Natural Antioxidants at a Carbon Paste Electrode
(Stanovení přírodních antioxidantů na uhlíkových pastových elektrodách)
Lenka Němcová, Barbora Fähnrichová, Romana Jarošová, Jiří Zima, and Jiří Barek
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8,
128 40 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected], [email protected],
[email protected]
Abstract
Antioxidants have become one of the most important issues in human nutrition. In this work,
electrochemical methods with a carbon paste electrodes containing glassy carbon microbeads
powder and mineral oil as a pasting liquid were used as working electrodes for the
determination of three natural antioxidants. Differential pulse voltammetry and cyclic
voltammetry were used for the determination of phloretin, flow injection analysis with
amperometric and spectrophotometric detection was used for the determination of vanillin
and HPLC with amperometric and spectrophotometric detection was used for the
determination of resveratrol.
Key Words: Antioxidants, Carbon paste electrode, Phenolic compounds, Vanillin, Phloretin,
Resveratrol.
Úvod
Klinické a epidemiologické studie zjistily inverzní korelaci mezi příjmem ovoce a zeleniny a
výskytem chorob, jako jsou zánětlivá onemocnění, kardiovaskulární choroby a rakoviny 1.
Předpokládá se, že je to díky vysokému obsahu antioxidantů. Mezi účinné přírodní
antioxidanty, které jsou součástí naší potravy, patří β-karoten, vitamin C, vitamin E a velká
skupina látek označovaných jako polyfenoly. Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin
podílející se na obraně proti ultrafialovému záření nebo agresi patogeny. Prvním sledovaným
antioxidantem v této práci je phloretin [2',4',6'-trihydroxy-3-(4-hydroxyfenyl)propiofenon]
(obr. 1. A), chovající se jako poměrně silný antioxidant při vychytávání peroxinitrátů a
inhibici lipidové peroxidace. Phloretin vykazuje také antibakteriální aktivitu a jeho největším
zdrojem jsou jablka 2,3. Dalším sledovaným je přírodní antioxidant vanilin (4-hydroxy-3methoxybenzaldehyd) (obr. 1. B), u kterého byly prokázány mimo antioxidačních i
antimikrobiální a antimutagenní vlastnosti. Jeho přírodním zdrojem je lusk orchideje (Vanila
planifolia) 4,5,6. Posledními sledovanými látkami jsou dva izomery resveratrolu (3,5,4'trihydroxystilben) (obr. 1. C, D), které se vyskytují se v mnoha rostlinných druzích, např.
vinných hroznech, arašídech, červené řepě, zelí, brokolici, borůvkách, brusinkách a mnoha
dalších. Trans-resveratrol působením UV záření přechází samovolně na cis-resveratrol. V
současné době řada pracovišť testuje biologické vlastnosti resveratrolu, a to od antioxidačních
vlastností a vlivu na aterosklerózu a kardiovaskulární choroby až po antimutagenní efekt a
chemoprevenci nádorových onemocnění. V řadě případů bylo dosaženo pozoruhodných
výsledků 7-10.
Stanovení všech zmíněných přírodních antioxidantů je převážně uskutečňováno pomocí
HPLC s UV/VIS, MS a elektrochemickou detekcí, GC/MS nebo elektroforézou s odpovídající
detekcí. V této práci je věnována pozornost stanovení vybraných antioxidantů na uhlíkových
pastových elektrodách (CPE). Uhlíkové pastové elektrody tvořené směsí uhlíkového prášku a
vhodného pojiva byly uvedeny do chemické praxe se záměrem nalézt elektrodu s
obnovitelným povrchem, která by byla využitelná pro anodické oxidace. Od doby svého
zavedení prošly mnoha etapami svého vývoje a i v dnešní době stále poutají pozornost mnoha
124
výzkumníků a jsou využívány jako pracovní elektrody ve voltametrických metodách a rovněž
jako součást amperometrických detektorů 11-14.
B
A
O
OH
HO
H
OH
O
OH
OH
O
C
OH
HO
D
CH3
HO
OH
OH
OH
Obr.1 Strukturní vzorce vanilinu (A), phloretinu (B), trans-resveratrolu (C) a cis-resveratrolu
(D).
Materiál
Zásobní roztoky (1 × 10-3 mol l-1) phloretinu, vanilinu a trans-resveratrolu (Sigma-Aldrich,
USA) byly připraveny rozpuštěním těchto látek v methanolu p.a. (Lach-Ner, ČR),
uchovávány byly ve tmě při 4 °C. Zásobní roztok cis-resveratrolu byl připraven z roztoku 1 ×
10-4 mol l-1 trans-resveratrolu expozicí 48 hodin na denním světle. Roztoky o nižších
koncentracích byly připraveny přesným ředěním zásobních roztoků. Brittonův-Robinsonův
(BR) pufr byl připraven smícháním fosforečné, octové a borité kyseliny (všechny
0,04 mol l-1) a úpravou 0,2 M hydroxidem sodným na potřebnou hodnotu pH. Pro extrakci
resveratrolu z reálných vzorků pohanky byl použit ethanol. Všechny použité chemikálie byly
čistoty p. a. (Lachema, ČR). Vzorky pohanky poskytl Výzkumný ústav rostlinné výroby
(Drnovská 507, Praha 6 – Ruzyně, ČR). Mobilní fáze pro metody FIA a HPLC obsahovaly
methanol (Lach-Ner, ČR) a acetonitril (Merk, Německo). Uhlíkové pastové elektrody byly
připraveny z 250 mg mikrokuliček ze skelného uhlíku o průměru 0,4 – 12 μm (Alpha Aesar,
USA) a 90 μl minerálního oleje (Fluka Biochemika, Švýcarsko). Pro přípravu roztoků a
mobilních fází byla použita deionizovaná voda (MilliQ Plus System, USA).
Aparatura
Phloretin byl voltametricky stanovován na přístroji Eco Tribo polarograf s programem Polar
Pro 4 (Polaro-Sensors, ČR). Jako základní elekrolyt byl použit BR pufr o příslušném pH
s methanolem v poměru 1:1. Vanilin byl stanovován průtokovou injekční analýzou (FIA) na
systému složeném z vysokotlaké pumpy Beta 10, odplyňovacího zařízení DG 3014,
dávkovacího ventilu D se smyčkou 100 μl, UV/VIS detektoru Sapphire 800 (vše Ecom, ČR) a
amperometrického detektoru ADLC 2 (Laboratorní přístroje, ČR). Jako nosný roztok byl
použit BR pufr o příslušném pH a methanol v poměru 1:1. Resveratrol byl analyzován
pomocí HPLC systému sestávajícího z vysokotlaké pístové pumpy HPP 5001 (Laboratorní
přístroje, ČR), ventilu D s 20μl smyčkou, kolony Kromasil C-18 (7 μm), 125 × 4 mm
(Prochrome, Indie), předkolonky Gemini C-18, 4 × 3 mm (Phenomenex, USA), UV/VIS
detektoru Sapphire 800 (Ecom, ČR) s programem Clarity 2.3.0 (DataApex, ČR) a
125
elektrochemického detektoru CHI 802B s programem CHI 6.26 (CH Instruments, USA). Jako
mobilní fáze byl použit 10krát zředěný BR pufr o příslušném pH a acetonitril v poměru 1:1 a
pro reálné vzorky pohanek v poměru 7:3 (v/v). U všech třech stanovení antioxidantů byla
použita uhlíková pastová elektroda jako pracovní elektroda, referentní argentchloridová
elektroda s 3 M KCl (RAE 113, Monokrystaly, ČR) a platinová drátková elektroda jako
pomocná elektroda. Všechna stanovení byla provedena za laboratorní teploty.
Pracovní postupy – extrakce resveratrolu z reálných vzorků
Nažky pohanek byly nejdříve odděleny od slupek (kromě vzorků pohanek tatarských, kde
oddělení není technicky možné), následovalo rozemletí na prášek pomocí kuchyňského
robotu, k 12 g takto upraveného vzorku bylo do destilační baňky přidáno 300 ml ethanolu a
extrahovalo se 2 h pod zpětným chladičem. Extrakt byl zfiltrován přes filtrační papír (FN 1,
Filtrak, Německo), zakoncentrován na vakuové odparce Buchi B-480, R-114 (Švýcarsko) na
5 ml a před samotnou analýzou zfiltrován přes mikrofiltr ProFill Plus PVDF/0,45 μm (Fischer
Scientific, ČR).
Výsledky a diskuse
Nejdříve byly hledány optimální podmínky pro stanovení studovaných antioxidantů. U
voltametrického stanovení phloretinu byly v rozmezí pH 2 až 12 změřeny diferenční pulzní
voltamogramy (DPV) uvedené na obr. 1. a rovněž cyklické voltamogramy (CV) phloretinu.
Dále byla pro CV proměřena závislost výšky píku phloretinu na rychlosti polarizace (5 až
1000 mV s-1), ze které bylo zjištěno, že oxidace phloretinu na CPE je kontrolována difuzí i
adsorpcí zároveň. Za optimálních podmínek, které jsou uvedeny v tabulce I, byly metodou
DPV a CV na CPE proměřeny kalibrační závislosti phloretinu v koncentračním rozmezí
6 × 10-7 – 1 × 10-4 mol l-1a zjištěny limity detekce.
Pro zjištění optimálních podmínek stanovení vanilinu metodou FIA byl postupně proměřen
vliv smyčkou dávkovaného objemu (5 až 1000 μl) vzorku, pH vodné složky mobilní fáze,
potenciálu elektrochemického detektoru (Obr. 2) a průtokové rychlosti mobilní fáze (1 až 9
ml min-1). Za optimálních podmínek (Tabulka I) byly proměřeny kalibrační závislosti
v koncentračním rozmezí 2 × 10-7 – 1 × 10-4 mol l-1 a zjištěny limity detekce.
Při hledání optimálních podmínek HPLC stanovení resveratrolu s jeho amperometrickou
detekcí byly proměřeny hydrodynamické voltamogramy, na jejichž základě bylo zvoleno
optimální pH BR pufru a pracovní potenciál pro detekci. Následovalo proměření kalibračních
závislostí a zjištění mezí detekce (Tabulka I). Následně bylo provedeno stanovení resveratrolu
v reálných vzorcích pohanky obecné a tatarské, kde bylo oproti podmínkám optimální detekce
nutné snížit obsah acetonitrilu na 30 %, aby bylo možné identifikovat a stanovit transresveratrol ve směsi s dalšími složkami vzorku. Nalezená množství trans-resveratrolu jsou
uvedena v tabulce II. Druhý izomer cis-resveratrol nebyl identifikován v žádném vzorku
pohanek.
126
1200
5
I, nA
8
800
7 6
4
3
2
9
12
11
10
400
1
0
0
400
800
E, mV
1200
Obr. 1. DP voltamogramy 1 × 10-4 mol l-1 phloretinu na CPE v prostředí BR pufru o pH
odpovídajícímu označení křivky (2 až 12, křivka 1 pouze základní elektrolyt o pH 2) a
methanolu (1:1), rychlost polarizace 20 mV s-1.
8000
I p, nA
6000
pH 2
ph 4
pH 6
pH 8
pH 10
4000
pH 12
2000
0
200
600
1000
-4
E, mV 1400
-1
Obr. 2. Závislosti výšek píků (Ip) 1 × 10 mol l vanilinu na vloženém potenciálu, měřeno
metodou FIA-ED v mobilní fázi BR pufr o příslušném pH a methanol (1:1), dávkováno 100
μl roztoku, F = 1 ml min-1.
Tabulka I.
Optimální podmínky a meze detekce nových metod stanovení vybraných antioxidantů pomocí
uhlíkových pastových elektrod.
Analyt
Phloretin
Vanilin
Transresveratrol
Cisresveratrol
Metoda
stanovení
DPV
CV
FIA-UV/VIS
FIA-ED
HPLC-UV/VIS
HPLC-ED
HPLC-UV/VIS
HPLC-ED
Optimální podmínky
BR pufr o pH 5 s methanolem v poměru 1:1
BR pufr o pH 6 s methanolem (1:1), λ = 230 nm,
E = +1,1 V, dávkovací smyčka 100 μl, F = 1 ml min-1
BR pufr o pH 7 s acetonitrilem (1:1), λ = 306 nm,
BR pufr o pH 7 s acetonitrilem (1:1), λ = 286 nm,
127
LD
(mol l-1)
7,3 × 10-7
10,0 × 10-7
1,7 × 10-7
1,7 × 10-7
3,2 × 10-8
3,5 × 10-8
6,5 × 10-8
1,8 × 10-8
Tabulka II.
Obsah trans-resveratrolu v nažkách pohanky tatarské (NS: 1, 2) a obecné (NS: 3 až 7)
stanovené metodou HPLC se spektrofotometrickou (306 nm) a amperometrickou (E = +1.2
V) detekcí na CPE, vyhodnoceno metodou standardního přídavku z výšek píků, mobilní fáze
BR pufr o pH 7 s acetonitrilem (7:3).
HPLC-ED
HPLC-UV/VIS
NS
ECN
Jméno
Původ
m (mg kg-1)
m (mg kg-1)
1 01Z5100007
Není
Bhutan
3.43 ± 0.35
3.47 ± 0.46
2 01Z5100014
Není
USA
3.47 ± 0.40
3.50 ± 0.45
3 01Z5000070
Špačínska 1
Slovensko
1.68 ± 0.24
1.64 ± 0.17
4 01Z5000076 Zelenocvetkovaya 90
Ukrajina
1.05 ± 0.18
1.07 ± 0.24
5 01Z5000111
Emka
Polsko
1.31 ± 0.12
1.35 ± 0.28
6 01Z5000123
Kara-Dag
Ukrajina
1.02 ± 0.10
0.98 ± 0.23
7 01Z5000134
Rubra
Ruská federace
1.23 ± 0.11
1.23 ± 0.32
NS číslo vzorku; ECN Národní evidenční číslo; průměr (ze tří měření) ± směrodatná odchylka
(SD)
Závěr
Výsledky této práce ukazují, že elektrochemická stanovení na uhlíkových pastových
elektrodách jsou vhodnými metodami analýzy studovaných přírodních antioxidantů
(phloretin, vanilin, resveratrol).
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky
(projekt LC 06035, MSM 0021620857 a RP 14/63) a Grantové agentury Univerzity Karlovy
(projekt SVV 261204).
Literatura
1. Blasco A. J., Crevillén A. G., González M. C., Escarpa A.: Electroanalysis 19, 2275
(2007).
2. Rezk B. M., Haenen G. R. M. M., Vijgh W. J. F., Bast A., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 295, 9 (2002).
3. Zhang S., Morris M. E.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 364, 1258 (2003).
4. Walton N. J, Mayer M. J., Narbad A.: Phytochem. 63, 505 (2003).
5. King A. A., Shaughnessy D. T., Mure K., Leszczynska J., Ward W. O., Umbach D. M.,
Xu Z., Ducharme D., Taylor J. A., DeMarini D. M., Klein C. B.: Mutat. Res. 616, 60
(2007).
6. Cookeas E. G., Efstathiou C. E.: Analyst 117, 1329 (1992).
7. Pirola L., Frojdo S., Life 60, 323 (2008).
8. Harikumar B. A., Aggarwal B. B., Cell Cycle 7, 1020 (2008).
9. Šmidrkal J., Filip V., Melzoch K., Hanzlíková I., Buckiová D., Křísa B., Chem. Listy 95,
602 (2001).
10. Qian J. Y., Mayer D., Kuhn M.: Dtsch. Lebensm. Rundsch. 95, 343 (1999).
11. Švancara I., Vytřas K., Zima, J. Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 311 (2001).
12. Barek J., Muck A., Wang J., Zima J.: Sensors 4, 47 (2004).
13. Zima J., Švancara I., Barek J., Vytřas K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009).
14. Zima J., Švancara I., Pecková K., Barek J.: Progress on Drinking Water Research
(Lefebvre M.H., Roux M.M., ed.), kap. 1, str. 1–53, Nova Science Publishers, Inc., New
York 2008.
128
Selected Possibilities of Utilization of Physico-chemical Findings as to Design of the
Electrode or Related Systems
(Vybrané možnosti kombinace fyzikálně-chemických poznatků s konstrukcemi a režimy
elektrodových a příbuzných systémů)
Ladislav Novotný
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
Abstract
The contribution describes selected possibilities of utilization of physico-chemical findings as
to design of the electrode or related systems. The effects connected especially with interfacial
interactions, a diffusion flux of depolarizers to the electrode boundary, a miniaturization of
the electrode size, an improvement of electroanalytical parameters are discussed.
Key Words: Miniaturized electrodes, Voltammetry/Polarography, Portable Systems.
Úvod
V kontextu se zaměřením tohoto příspěvku a s 30. výročím konání čs. elektroanalytických
seminářů zaslouží si úvodem zmínku témata, související s komponentami sestavy
počítačového Eco-Tribo Polarografu PC-ETP, příslušnými elektrodovými systémy a
příslušenstvím. Do historie se systém PC-ETP zapsal jako první československý počítačový
(PC-řízený) polarografický analyzátor s novými typy elektrod a příslušenství. Jeho původní
prototypy (vyvinuté s ohledem na okolnosti soukromě) vycházeli z originálních (i v zahraničí
chráněných) čs. patentů a užitných vzorů. Komerčně byl PC-ETP (jako nová generace
polarografu) uveden na trh v roce 1991 firmou Polaro-Sensors, postupně pak byl v dílčích
etapách „upgradován“ např. v rámci sdružení POLARO a poté firmy ECO-TREND PLUS
s.r.o., mj. ve vazbě na dispoziční práva k HW a SW, provedenou certifikaci apod. Navazoval
na předchozí generace originálních elektrodových systémů a analogových měřících zařízení,
rovněž vesměs publikovaných a patentovaných. Přímá linie příslušných postupně získávaných
předcházejících poznatků sahá až do poloviny 70. let, jak je zřejmé ze shrnutí obsažených
např. v 1-3,8. Po celou dobu provází tuto linii studium efektů a fyzikálně-chemických poznatků,
s využitím navržených řešení systémů, senzorů a jejich příslušenství. O některých byla
zmínka dříve, jiné jsou předmětem tohoto sdělení.
Referované výsledky byly získány zejména s využitím sestav nebo jejich částí polarografu
PA4 (Laboratorní přístroje LP, Praha), PC-ETP 8 (Polaro-Sensors nebo ECO-TREND PLUS
s.r.o. Praha), statické rtuťové elektrody SMDE-1 (LP), dále elektrod, elektrodových systémů a
kapilár vlastní konstrukce (skelněných, plastových, s plastovými nástavci, s pulzním
generátorem, s vytláčením pístem, jehlou, drátkem aj., v přetlakovým i podtlakovým režimem
resp. s režimem kompresně-expanzním), na bázi rtuti 3, amalgamů 4, kompozitních,
hybridních či porézních amalgamů 5-7 apod., v režimech obvyklých velikostí, mini-,
semimikro, mikro- a v objemech aktivní fáze od mini- do nanolitrů. Voltametrická a případně
i elektrokapilární měření byla prováděna ve vodných roztocích, s využitím chemikálií čistoty
p.a.; podle potřeby byly měřené roztoky probublány dusíkem.
Výsledky a diskuse
Komponentní a miniaturizované systémy umožnily minimalizaci důsledků vibrací rezonancí,
časových zpoždění reakce pohybových mechanizmů, setrvačnosti pohybových komponent
atp. Příklad použitých uspořádání elektrod 3,5-7 se skleněným nebo plastovým (podle potřeby
129
odnímatelným) ústím, s pístovým, jehlovým nebo drátkovým uzávěrem, v režimu expanzněkompresním je schematicky znázorněn na obr. 1. Je doprovázen digramem plocha elektrody
vs. čas (A-t). V případě generování miniaturizovaných odklepávaných elektrod byla použita
opakovaná sekvence pulzů tak, jak naznačuje diagram aktivační napětí U vs. čas (U-t),
v krocích vyznačujících aktivaci ventilu při nárůstu obvyklé velikosti elektrody (V1), klepátka
(K) a ventilu při nárůstu obvyklé velikosti elektrody (V2). Tato sekvence umožnila přípravu
velmi stabilních miniaturizovaných elektrod při definovaném výchozím stavu pro jejich
vytvoření.
A
U
t
V1
K
V2
t
Obr. 1. Schéma uspořádání elektrod se skleněným nebo plastovým ústím, s pístovým,
jehlovým nebo drátkovým uzávěrem; příklady změn průběhu signálu při změně velikosti
elektrody; diagram A-t charakterizující příklady typů změn velikosti povrchu elektrody
s časem; U-t diagram ilustrující sekvenci generovaných pulzů při automatizovaném vytváření
miniaturizovaných elektrod.
Provedená měření potvrdila např. závislost průběhu signálu sledovaných povrchově aktivních
látek (4,4´-bipyridylu BP, charakteru oligoetheru atd.), urychlení stabilizace povrchových
filmů ap. na velikosti miniaturizovaných elektrod. V případě BP byla též zaznamenána
130
koncentrační závislost signálu diferenční pulzní voltametrie DPV v roztoku 0,1 M Na2SO4
s přídavkem 0,01 M NaOH a následně sledovány změny výšky DPV-píků BP s přídavky
chloridů. Opakovatelnost měření byla lepší než cca ± 2 %.
Jiným příkladem bylo chování hybridních amalgamových elektrod 5-7 vhodného složení
C/Ag/Hg pokrytých meniskem nebo filmem z hlediska omezení difúzního znečištění
elektrodového materiálu u povrchu elektrody, popř. omezení difúze produktů depolarizace
dovnitř elektrodového materiálu. Připravit bylo možno i porézní elektrody složení
korespondujícího s volbou směsného materiálu hybridního či kompozitního amalgamu.
Pro monitorování olejů a amoniových iontů ve vodě byly zkoušeny speciální sondy
s příslušenstvím tak, aby umožňovaly dálkový (event. mobi-) přenos signálu. Zkoušeny byly
též prvky umožňující snížení provozní energetické náročnosti polarografu PC-ETP
v souvislosti s žádoucím zlepšením jeho přenosnosti, v kombinaci s běžnými notebooky apod.
Závěr
Získané výsledky dokumentují příznivé přínosy sepětí studia fyzikálně-chemických vlivů a
podmínek s vhodnými konstrukcemi a režimy čidel, elektrodových systémů a příbuzných
měřících zařízení či uspořádání.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů č. MSMT CR č. LC06035 a VZ 0021627502-UPa.
Literatura
1. Novotný L.: Electrochemistry for Environmantal Protection (Štulík K., Kalvoda R., ed.),
UNESCO ROSTE, Venice 1996.
2. Novotný L.: DrSc.-dizertační práce, AV ČR, Praha 2002.
3. Novotný L.: Chem. Listy 102, 701 (2008).
5. Novotný L.: Čs. patent PV 2001-1.
6. Novotný L.: Čs. patent PUV 2007-19501.
7. Novotný L.: Čs. patent PUV 2009-22130.
8. ECO-TREND PLUS s.r.o.: Informační materiály k počítačovému polarografu PC-ETP.
131
Detection of Changes in Protein Structure Studied by Constant Current
Chronopotentiometry
(Detekce změn v proteinové struktuře sledována pomocí chronopotenciometrie s
konstantním proudem)
Veronika Ostatná
Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Královopolská
135, 612 65 Brno; Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Parkinson disease is associated with the formation and deposition of amyloid fibrils of the
protein α-synuclein. We investigated α-synuclein by constant current chronopotentiometric
stripping and a.c impedance measurements using the hanging mercury drop electrode. On the
ground of our results we tentatively attribute the very early changes in the interfacial behavior
of the protein after the first few hours of incubation to the protein destabilization.
Key Words: α-Synuclein, Parkinson disease, Electrochemical detection, Aggregation.
Introduction
Native structure of protein, critical for its biological role, can be disrupted by physical or
chemical changes of surrounding environment, resulting in denaturation, misfolding or
aggregation 1-3. Many human diseases are associated with improper folding of proteins, which
often leads to malfunctioning of cellular machinery 4,5. One group of these protein-related
diseases, including Parkinson’s, Alzheimer’s or Creutzfeldt-Jakob’s diseases, is associated
with formation of insoluble fibrils from native soluble protein monomers. These fibrils,
known as amyloids, accumulate in organs such as liver, spleen or brain, forming aggregates.
Recently we have shown that practically all proteins produce a chronopotentiometric stripping
peak H at hanging mercury drop electrodes (HMDE) in the nanomolar and subnanomolar
range 6-9. This peak, which is due to the ability of proteins to catalyze hydrogen evolution at
mercury electrodes 10, is sensitive to changes in protein structure 7 such as denaturation 6,11-14,
aggregation 9,12, as well as to those related to changes in the redox state of proteins 12. In this
work we studied the interfacial properties of in vitro treated wild type α-synuclein involved in
Parkinson disease by means of constant current stripping chronopotentiometric (CPS)
analysis, square wave voltammetry and a.c. impedance measurements with carbon or HMDE
in addition to the fluorescence of thioflavin T, circular and dynamic light scattering known to
reflect fibril formation.
Experimental
Recombinant human wild-type AS and β-synuclein were expressed and purified in Dr. T.
Jovin’s lab (Max Plank Institute for Biophysics, Göttingen, Germany) as described earlier 15.
Aggregation was performed by incubating 100 µM AS solutions in 0.1 M NaCl, 25 mM TrisHCl, pH 7.3, at 37 °C (thermobox Heraeus, Kendro – Laboratory products, Germany) with
constant stirring at 300 rpm with a magnetic bar Variomag Telesystem 15.40 (H+P
Labortechnik AG, Germany) in 1.5 ml vials. Aliquots were removed at different time
intervals and diluted for fluorescence of Thioflavin-T binding, dynamic light scattering and
electrochemical measurements. Electrochemical measurements were performed with an
AUTOLAB analyzer (EcoChemie, The Netherlands) connected to a VA-Stand 663 (Metrohm,
Herisau, Switzerland) and using a standard three-electrode cell. The working electrode was a
hanging mercury drop electrode (HMDE) or a carbon paste electrode. An Ag/AgCl/3M KCl
electrode was used as the reference electrode and a platinum wire electrode as the auxiliary
electrode. All experiments were carried out at 25±1 °C under air.
132
The primary sequence of the human 14 kDa AS comprises 140 amino acids and at first sight
this protein does not seem suitable for the electrochemical analysis, lacking cystine or
cysteine residues capable of producing signals at mercury electrodes or a redox active center
for fast reversible electrochemistry. AS contains only 4 Tyr and no Trp (out of 140 amino
acids), both necessary for oxidation of proteins at carbon electrodes. We also measured a.c.
voltammetry and the CPS peak H of AS. This peak reflects the ability of proteins to catalyze
hydrogen evolution at mercury electrodes 7,10. Oxidation of tyrosines at carbon electrode as
well as catalysis of the hydrogen evolution (peak H) and the adsorbability of the fibrils at
mercury electrodes were decreased due to formation of fibrils (Fig. 1).
Recently, it has been pointed out that this early aggregation stage, characterized by formation
of soluble oligomers, is more toxic than mature fibril formation 16,17. Early stages of amyloid
formation, when optical methods were insufficient to detect any changes, were accompanied
by about 40% increase of peak H and its simultaneous potential shift to more positive values,
followed by a continuous decrease of the peak height and a shift back to more negative
potentials. We obtained excellent correlation between the adsorption/desorption behavior of
AS by a.c. voltametry and changes in the ability of alpha synuclein to catalyze the hydrogen
evolution on the mercury electrode. We suggested that these changes in AS interfacial
behavior were due to protein destabilization and a loss of long-range interactions, preceding
the outset of oligomerization. Investigating interfacial behavior of AS at different
experimental conditions could help us to gain better insight the aggregation mechanism.
Fig. 1 Time course of aggregation of AS. (A) Dependence of peak H height of AS on
incubation time.
Conclusion
The numbers of methods for studying of early stages of aggregation appear to be limited 17.
Mercury electrodes in combination with CPSA and impedance measurements were
particularly sensitive to pre-aggregation changes of AS treated in vitro at 37 °C. These results
show new potentialities of electrochemical studies of AS molecules in PD.
133
Acknowledgment
We are grateful to prof. Paleček for critical reading and to Dr. Jovin for supplying us with AS.
This work was supported by grants from the Academy of Sciences of the Czech Republic:
KJB100040901, M20004090, MEYS CR (Research Centre LC06035) and institutional
research plans Nos. AV0Z50040507 and AV0Z50040702.
References
1. Branden C., Tooze J.: Introduction to Protein Structure Garland Publishing, New York
1999.
2. Fersht A.: Structure and Mechanism in Protein Science, 1 ed.; W. H. Freeman, New York
1999.
3. Pace C. N., Grimsley G. R., Scholtz J. M.: Protein Folding Handbook (Buchner J.,
Kiefhaber T., Eds.), Wiley - VCH, Weinheim 2005.
4. Dobson C. M.: Trends Biochem. Sci. 24, 329 (1999).
5. Thomas P. J., Qu B. H., Pedersen P. L.: Trends Biochem. Sci. 20, 456 (1995).
6. Ostatna V., Dogan B., Uslu B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172
(2006).
7. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007).
8. Tomschik M., Havran L., Palecek E., Heyrovsky M.: Electroanalysis 12, 274 (2000).
9. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C. W., Jovin T. M.: Analyst 133, 76
(2008).
10. Heyrovsky M.: Electroanalysis 16, 1067 (2004).
11. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008).
12. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008).
13. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Comm., 1685 (2009).
14. Palecek E., Ostatna V.: Analyst 134, 2076 (2009).
15. Antony T., Hoyer W., Cherny D., Heim G., Jovin T. M., Subramaniam V.: J. Biol. Chem.
278, 3235 (2003).
16. Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J. S., Taddei N.,
Ramponi G., Dobson C. M., Stefani M.: Nature 416, 507 (2002).
17. Uversky V. N.: J. Neurochem. 103, 17 (2007).
134
Thiourea Derivatives as Corrosion Inhibitor for Mild Steel in 1 N HCl
Niketan S. Patel, Smita Jauhari and Girishkumar N. Mehta
Applied Chemistry Department, S V National Institute of Technology, Surat-395007, Gujarat,
India. Tel. /fax: +91 261 2201655. E-mail address: [email protected]
Abstract
The inhibition effect of 1,3,5-triazinyl urea and thiourea derivatives against mild steel
corrosion in 1M HCl solutions were evaluated using conventional weight loss,
potentiodynamic polarization, linear polarization and electrochemical impedance
spectroscopy. The weight loss results showed that both are excellent corrosion inhibitors,
electrochemical polarizations data revealed the mixed mode of inhibition and the results of
electrochemical impedance spectroscopy have shown that the change in the impedance
parameters with the change in concentration of the inhibitor is due to the adsorption of the
molecule on the surface of mild steel.
Key Words: Triazinyl urea, Acid corrosion inhibitor, Mild steel, Electrochemical impedance
spectroscopy.
Introduction
The corrosion of iron and mild steel (MS) is a fundamental academic and industrial concern
that has received a considerable amount of attention 1. A study of the mechanism of the action
of corrosion inhibitors has relevance both from the point of view of the search for new
inhibitors and also for their effective use 2. Inhibitors are generally used in the industry to
control metal dissolution 3 and, during past decade many organic inhibitors have been studied
in different media 4-7. The mechanism of their action can be different, depending on the metal,
the medium and the structure of the inhibitor. Many N-heterocyclic compounds with polar
groups and/or π-electrons are efficient inhibitors of the corrosion of steel and iron in acidic
media 8-11. This kind of organic molecules can adsorb on the metal surface because it can
form a bond between the N electron pair and/or the π-electron cloud and the metal thereby
reducing the corrosive attack on metals in acidic media.
The present work reports the use of 1,3,5-triazinyl urea and thiourea derivatives 4-CADT and
4-CCADT as corrosion inhibitor in 1 N HCl medium. The electrochemical behavior of MS in
HCl media in the absence and presence of both the inhibitor has been studied by weight loss
method, potentiodynamic polarization, linear polarization and electrochemical impedance
spectroscopy (EIS).
Experimental
Inhibitor Preparation
Both the 1, 3, 5-triazinyl urea and thiourea derivatives were synthesized according to
previously reported an experimental procedure 12. The molecular formulas are given below for
4-CADT (a) and 4-CCADT (b).
a
O
O
b
HN
N
NH
N
N
CH3
O
NH
O
O
NH
135
HN
N
NH
N
N
Cl
O
NH
NH
Weight loss method
The polished and pre-weighed MS specimens were suspended in 100 ml test solutions, with
and without the inhibitor of different concentrations, for a fix period of time and were
washed, dried and weighed. From the weight loss data, percent inhibition efficiency was
calculated.
Electrochemical and impedance measurements
The electrolytes used were acidic solutions maintained at 30oC. The AC impedance
measurements are shown as Nyquist plots and polarization data as Tafel plots. Polarization
resistance measurements were carried out with a scan rate of 0.01 V/s at −10mV to +10mV
vs. corrosion potential (Ecorr) of the working electrode measured against SCE. Polarization
curves obtained again with the scan rate of 0.01 V/s in the range of −250mV to +250mV vs.
Ecorr. Impedance measurements were carried out at the Ecorr; 60 min after the electrode had
been immersed in the test solution.
Based on the weight loss measurements, the corrosion rates (Wcorr) and the values of
inhibition efficiency (Ew%) for various concentrations of 4-CADT and 4-CCADT after 2 h of
immersion obtained are given in Table I.
From table I, it is clear that the value of Ew% increases with the increase in the concentration
of the inhibitor, suggesting that the number of molecules adsorbed were increased over the
MS surface, blocking the active sites of acid attack and thereby protecting the metal from
corrosion. The potentiodynamic polarization data of various concentrations of 4-CADT and 4CCADT are shown as the Tafel plots for MS in 1 N HCl in Fig. 1. The corrosion kinetic
parameters such as corrosion potential (Ecorr), corrosion current density (Icorr), anodic and
cathodic Tafel slopes (ba and bc) were derived from these curves and are given in Table II.
Table I.
Inhibition Efficiency of MS in 1 N HCl in the presence and absence of different
concentrations of 4-CADT and 4-CCADT (Weight loss method)
Inhibition Efficiency
Inhibitor
Concentration of inhibitor
W
2
EW%
(ppm)
(µg/cm h)
0
19.71
4-CADT
25
11.57
41.30
50
8.39
57.43
100
7.09
64.03
200
3.13
84.12
500
1.90
90.36
1000
1.31
93.35
0
19.71
4-CCADT
25
11.43
42.01
50
8.27
58.04
100
6.87
65.14
200
2.90
85.29
500
1.75
90.94
1000
1.17
94.06
136
a
b
Fig. 1. Tafel plots showing effect of (a) 4-CADT and (b) 4-CCADT on corrosion of MS in
HCl medium.
Table II.
Effect of the additives on MS in 1N HCl media (Electrochemical polarizations studies).
Rp
Inhibitor
Concentratio Ecorr Tafel Constant
EI %
Icorr
n of inhibitor
V
(mV/decade) (mA/cm2)
(ohm
(ppm)
ba
bc
cm2)
0
0.490
96
121
2.130
15
4-CADT
25
0.467
97
105
0.225
99
89.44
50
0.451
91
104
0.172
114
91.92
100
0.463
93
105
0.148
153
93.05
200
0.453
98
107
0.131
173
93.85
500
0.454
99
109
0.092
274
95.68
1000
0.454 100
110
0.078
330
96.34
0
0.490
96
121
2.130
15
4-CCADT
25
0.465
98
105
0.211
104
90.09
50
0.452
92
104
0.150
124
92.96
100
0.467
99
106
0.148
171
93.05
200
0.458
98
107
0.108
224
94.93
500
0.453
99
108
0.078
335
96.34
1000
0.433
93
114
0.053
417
97.51
ERp%
84.85
86.84
90.20
91.33
94.53
95.45
85.58
87.90
91.23
93.30
95.52
96.40
The Rp values of MS in 1 N HCl in the absence and presence of different concentrations of
the tested inhibitors are also given in Table II. From the results, Rp values gradually increased
with increase in the concentration of inhibitors. The values of inhibition efficiency of 4CADT and 4-CCADT obtained by electrochemical methods are in good agreement.
The corrosion behavior of MS in 1N HCl, in absence and the presence of various
concentrations of 4-CADT and 4-CCADT were also investigated by EIS technique. The
resultant Nyquist plots are shown in Fig. 2.
137
a
b
Fig. 2. Nyquist plots showing effect of (a) 4-CADT and (b) 4-CCADT on corrosion of MS in
HCl medium.
The existence of a single semicircle in Nyquist plot shows that there was only single charge
transfer process during the anodic dissolution of MS and remained unaffected in the presence
of 4-CADT and 4-CCADT added in the acid. An isolated Nyquist plot for the blank system is
shown in the window in Fig.2 and the value of real impedance (Z’) was only 11 Ohms which
indicated that there was least charge transfer resistance (Rt) of the corrosion reactions. There
was gradual increase in the diameter of each semicircle of the Nyquist plot when the
concentration was raised from 25 to 1000 ppm. This increase of the diameters clearly
reflected that the Rt values also increased at highest concentration of 1000 ppm due to
formation and gradual improvement of the barrier layer of the inhibitive molecules, and as a
result the acid corrosion rate of MS gradually decreased.
Table III embodies various parameters such as Rt and Cdl. There was a gradual decrease in
values of Cdl with increase in the concentration of 4-CADT and 4-CCADT. Inhibition
efficiency is found to increase with 4-CADT and 4-CCADT concentration. And the results
obtained from EIS show the similar trend as those obtained from electrochemical
polarisations and weight loss measurements. Analysis of the electrochemical data show that
the inhibiting properties increase with inhibitor concentration. The inhibition efficiency
increases in accordance to the order: 4-CCADT > 4-CADT for all concentrations. The
presence the electron donating groups on the structure (such as Cl and CH3) increases the
electron density on the nitrogen atom, resulting high inhibition efficiency. Among the two
compounds investigated in the present study, 4-CCADT has been found to give the best
performance as corrosion inhibitor. This can be explained on the basis of the presence of
chloride group on the benzene ring.
Conclusions
• The protection efficiency of these inhibitors increases with the increase of the inhibitor
concentration; 4-CCADT is better inhibitor than 4-CADT.
• Polarization curves showed that both 4-CADT and 4-CCADT are mixed type
inhibitors.
• The results of the weight loss, electrochemical polarizations and EIS were all in very
good agreement to support the above conclusions.
138
Table III.
Data from electrochemical impedance measurements of mild steel in 1 N HCl for various
concentrations of 4-CADT and 4-CCADT.
Inhibitor Concentration of inhibitor
Rt
Cdl
Inhibition Efficiency
(ppm)
Ohm.cm2 µF/cm2
ER(%)
0
11
168
4-CADT
25
116
142
90.52
50
129
128
91.47
100
185
122
94.05
200
237
98
95.36
500
377
50
97.08
1000
453
43
97.57
0
11
168
4-CCADT
25
136
124
91.91
50
177
114
93.79
100
197
99
94.42
200
298
63
96.31
500
443
43
97.52
1000
728
14
98.49
References
1. Uhlig H. H., Revie R.W.: Corrosion and Corrosion Control, Wiley, New York 1985.
2. Trabanelli G.: Corrosion 47, 410 (1991).
3. Schmitt G.: Br. Corros. J. 19, 165 (1984).
4. Tebbji K., Bouabdellah I., Aouniti A., Hammouti B., Oudda H., Benkaddour M.,
Ramdani A.: Mat. Lett. 61, 799 (2007).
5. Bentiss F., Gassama F., Barbry D., Gengembre L., Vezin H., Lagrenee M., Traisnel M.:
App. Surf. Sci. 252, 2684 (2006).
6. Prabhu R. A., Shanbhag A. V., Venkatesha T. V.: J. Appl. Electrochem. 37, 491 (2007).
7. Avci G.: Colloids Surf. A-Physicochem. Eng. Aspects 317, 730 (2008).
8. Trabanelli G.: In Chemical Industries: Corrosion Mechanism (Mansfeld F.) p.120,
Marcel Dekker, New York 1987.
9. Muralidharan S., Charasekar R., Iyer S.V.K.: Proc. Indian Acad. Sci., Chem. Sci. 112,
127 (2000).
10. Bentiss F., Traisnel M., Lagrenée M.: Corros. Sci. 42, 127 (2000).
11. Yan Y., Li W., Cai L., Hou B. Electrochim. Acta 53, 5953 (2008).
12. Chikhalia K. H., Patel M. J.: J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 11, 81 (2009).
13. Riggs O.L. Jr.: in Corrosion Inhibitors (Ed. Nathan C. C., Ed.), p. 7, NACE, USA,
1973.
139
Potentiometric Study of Physiologically Important Derivatives of Adenine
(Potenciometrická studie fyziologicky významných derivátů adeninu)
Iveta Pilařová, Sylvie Holubová, Marta Farková, Přemysl Lubal, and Libuše Trnková
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Chemistry, Kotlářská 2, 611 37 Brno,
Czech Republic, E–mail: [email protected]
Abstract
The aim of this work is the thermodynamic study of protonisation of adenine, 6benzylaminopurine and its methoxy and chlorine derivatives. Acid-base potentiometric
titration allows determining the equilibrium constants of protonisation (pKa) and determining
the impact of substituent and its position on the benzyl. pKa dependence on temperature (1537 °C) and ionic strength (0.1 M) are the basis for the thermodynamic evaluation of changes
in enthalpy and entropy of the protonisation process. All potentiometric analysis of purine
derivatives were carried out in an environment of 10% (v/v) CH3OH in water due to better
solubility of molecules of interest.
Key Words: 6–benzylaminopurine, protonation constant, 6–(2´-methoxybenzylamino)purine,
6–(3´-methoxybenzylamino)purine, 6–(4´-methoxybenzylamino)purine,
6–(2´-chlorbenzylamino)purine, 6–(3´-chlorbenzylamino)purine,
6–(4´-chlorbenzylamino)purine, potenciometry.
Úvod
V současné době jsou intenzivně studovány deriváty adeninu, tzv. cytokininy, což jsou
fytohormony, které podporují růst rostlin, utváření pupenů a větvení stonků. Podle struktury
postranního řetězce se dělí na aromatické deriváty (N6-benzylaminopurin, topoliny) a
isoprenoidní deriváty (N6-isopentenyladenin, trans-zeatin, cis-zeatin). Důležité deriváty
cytokininů – olomoucin, roskovitin, bohemin působí jako inhibitory cyklin – dependentních
kináz, čímž zabraňují buněčnému dělení, a z tohoto hlediska se jeví jako potenciální
cytostatika 1. Cílem práce bylo termodynamické studium protonizace adeninu,
6-benzylaminopurinu a jeho methoxy a chlor derivátů. Acidobazická potenciometrická titrace
dovoluje stanovení rovnovážných konstant protonizace pKa a určení vlivu substituentu a jeho
polohy na benzylu. Závislosti pKa na teplotě a na iontové síle jsou základem pro
termodynamické vyhodnocení změn entalpie a entropie při procesu protonizace.
Potenciometrická stanovení jsou prováděna pomocí automatického titrátoru Titrando 835
firmy Metrohm AG ve spojení se softwarem Tiamo 1.2 a iontově – selektivní kombinovanou
skleněnou elektrodou LL Ecotrode plus. Referenčním elektrolytem je 3 M KCl. Elektroda je
určena k acidobazickým titracím ve vodném prostředí, ale lze ji využít i pro měření ve
směsném rozpouštědle s nízkým obsahem organické složky. Měření se prováděla
v temperované nádobce o objemu 50 ml v inertní argonové atmosféře. Byl použit termostat
Julabo F25 – EH, na němž byla nastavena teplota v rozsahu 15 °C – 37 °C. Iontová síla byla
nastavena pomocí NaCl (Sigma Aldrich) na hodnotu 0,1 M. Titrace byly prováděny
z kyselého do alkalického prostředí odměrným roztokem 0,1 M NaOH (Sigma Aldrich), jehož
přesná koncentrace byla stanovena standardizací na primární standard C8H5O4K (Sigma
Aldrich). Jako vzorky byly použity adenin, 6 – BAP (Lachema N.P. Brno) a deriváty BAPu
(Katedra Anorganické chemie, PřF, Univerzita Palackého, Olomouc) o koncentraci 0,001 M.
Před každou titrací byla provedena kalibrace elektrody, zároveň s ní byla provedena
standardizace 0,1 M HCl (Penta Chrudim) na sekundární standard 0,1 M NaOH. Byly
stanoveny hodnoty protonačních konstant pKa1 a pKa2 adeninu, 6–benzylaminopurinu a jeho
derivátů. Vzhledem k velmi špatné rozpustnosti ve vodě byly uvedené látky rozpuštěny ve
140
100% CH3OH. Měření byla provedena v prostředí 10% (v/v). Protonační konstanty byly
vypočteny pomocí programu MS Excel, a to dle vzorců:
⎛ z ⎞
⎛1− z ⎞
pKa1 = − log H + + log ⎜
pKa 2 = − log H + + log ⎜
⎟
⎟
⎝1− z ⎠
⎝ z ⎠
[ ]
[ ]
Výsledky a diskuse
Byly stanoveny hodnoty protonačních konstant pKa1 a pKa2 derivátů adeninu, a to 6 – BAPu
a jeho methoxy a chlorderivátů. Studoval se vliv benzylové skupiny navázané na N6 adeninu
na hodnoty pKa, dále se studoval i vliv substituentu navázaného na benzylové skupině
molekuly 6 – BAP na hodnoty protonizačních konstant a sledoval se i vliv polohy
substituentu navázaného na benzylové skupině v polohách 2´, 3á 4´. K potenciometrickému
stanovení byly využity tyto deriváty 6 – BAPu (je-li methoxy skupina nahrazena chlorem,
jedná se o Cl - deriváty):
O CH3
O CH3
O CH3
HN
HN
N
N
N
N
H
HN
N
N
N
N
N
N
H
N
N
H
Obr. 1. 6–(X-methoxybenzylamino)purin, X = poloha 2´, 3´, 4´.
Pro chlor-deriváty BAPu byly stanoveny protonační konstanty pouze při teplotě 25°C
(Tabulka I.).
Tabulka I.
Protonační konstanty adeninu, BAPu a jeho Cl - derivátů.
Teplota [°C]
Iontová síla [M]
Ligand
adenin
BAP
2´- Cl BAP
25
0,1
3´- Cl BAP
4´- Cl BAP
pKa1
4,14±0,04
3,91±0,06
3,81±0,02
3,56±0,05
3,35±0,05
pKa2
9,49±0,09
9,39±0,09
9,60±0,09
9,55±0,09
9,54±0,09
Substitucí atomu vodíku v NH2 skupině v poloze 6 molekuly adeninu benzylovou skupinou,
dochází k výraznému poklesu protonačních konstant v kyselé oblasti. S navázáním
substituentu na benzylovou skupinu v molekule BAPu, zaznamenáváme rovněž výrazný
pokles pKa1, u pKa2 je pokles mírný. Hodnota pKa2 chloroderivátů BAPu je vyšší než pro
nesubstituovaný BAP. Vliv na hodnoty pKa má i poloha substituentu, s rostoucí vzdáleností
mezi atomem chloru a funkční skupinou, klesá vliv substituentu na polaritu chemické vazby a
v důsledku toho se snižuje protonační konstanta zmíněných derivátů.
Protonační konstanty, 0,001 M 6 – BAPu (t = 15 – 37°C, Tabulka II) a jeho methoxy –
derivátu (t = 10 – 25°C, Tabulka IV.) o stejné koncentraci, byly stanoveny pro různé teploty.
S rostoucí teplotou klesají hodnoty protonačních konstant BAPu v kyselé i bazické oblasti.
S využitím získaných protonačních hodnot a termodynamické teploty byly stanoveny
termodynamické parametry, ΔH = -16,409 kJ.mol-1 a ΔS = 19,739 J.K-1.mol-1.
Termodynamickou rovnováhu můžeme zjistit z Gibbsovy volné energie dle rovnic:
141
ΔG 0 = ΔH 0 − ΔS 0
ΔG = − RT ln( 10 ) ⋅ log K p
0
Tabulka II.
Protonační konstanty BAPu pro různé teploty.
Teplota [°C]
pKa1
15
4,01±0,05
20
3,95±0,01
25
3,91±0,06
30
3,85±0,04
37
3,80±0,03
a
I = 0,075 M, t = 25°C, CH3OH.
BAP 15°C
BAP 20°C
pKa12
3,91a
-
pKa2
9,86±0,09
9,50±0,08
9,39±0,09
9,23±0,09
9,10±0,09
BAP 25°C
BAP 30°C
BAP 37°C
12
11
10
9
-log [H+]
8
7
6
5
4
3
2
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
z
Obr. 2. Normalizované titrační křivky BAPu pro různé teploty v prostředí 10% (v/v) CH3OH
(cNaOH = 0,1 M; cHCl = 1.10-3 M; cBAP = 1.10-4 M; I = 0,1 M NaCl).
Byly stanoveny protonační konstanty methoxy – derivátů BAPu při teplotě 25°C a iontové
síle I = 0,1 M (NaCl), v prostředí 10% (v/v) CH3OH (Tabulka III.).
Tabulka III.
Protonační konstanty adeninu, BAPu a jeho methoxy - derivátů.
Teplota [°C]
Iontová síla [M]
Ligand
pKa1
adenin
4,14±0,04
BAP
3,91±0,06
3,51±0,07
2´- OCH3BAP
25
0,1
3,75±0,02
3´- OCH3BAP
4´- OCH3BAP
3,89±0,02
pKa2
9,49±0,09
9,39±0,09
9,75±0,07
9,68±0,07
9,63±0,06
Srovnáním protonačních konstant nesubstiovaného BAPu s protonačními konstantami jeho
methoxy – derivátů lze pozorovat prudší pokles pKa1 pro 2´- methoxy derivát v kyselé
oblasti, ale s rostoucí vzdáleností methoxy skupiny od funkční skupiny pozorujeme mírné
zvýšení pKa1.V bazické oblasti nejdříve substituent způsobil prudší vzrůst pKa2, ale s jeho
vzdáleností od funkční skupiny došlo k mírnému poklesu pKa2.
142
Tabulka IV.
Protonační konstanty 2´- methoxy BAPu pro různé teploty.
Teplota [°C]
pKa1
10
3,90±0,03
15
3,77±0,04
20
3,63±0,06
25
3,51±0,07
pKa2
10,07±0,09
9,91±0,09
9,87±0,07
9,75±0,07
Získané hodnoty protonačních konstant se vzrůstající teplotou roztoku lineárně klesají. Pokles
zaznamenáváme i v kyselé i v bazické oblasti. Stejně jako pro 6 – BAP byly stanoveny
hodnoty entalpie a entropie i pro 2´-methoxy BAP. entalpie ΔH = -42,346 kJ.mol-1 a entropie
ΔS = -74,869 J.K-1.mol-1.
10°C
15°C
20°C
25°C
10
9
-log [H+]
8
7
6
5
4
3
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
z
Obr. 3, Normalizované titrační křivky 2´-methoxy BAPu pro různé teploty v prostředí 10%
(v/v) CH3OH (cNaOH = 0,1 M; cHCl = 1.10-3 M; cL = 1.10-4 M; I = 0,1 M NaCl).
Závěr
Substituce benzylové skupiny způsobila pokles protonační konstanty pKa1 nesubstituovaného
BAPu a jeho derivátů. Je-li substituent v poloze 2´, vidíme, že v případě Cl BAPu je pokles
pKa1 mírnější oproti methoxy BAPu. Znamená to tedy, že pKa1 2´- Cl BAPu je vyšší než u
2´- methoxy BAPu. Srovnáním Cl BAPu a methoxy BAPu se substituentem navázaným
v polohách 3á 4´zaznamenáme opačný jev. Protonační konstanty pro methoxy deriváty jsou
vyšší. Další rozdíl je patrný s rostoucí vzdáleností substituentu od funkční skupiny. V případě
chloroderivátů se s rostoucí vzdáleností chloru od funkční skupiny hodnota pKa1 snižuje,
naopak v případě methoxyderivátů se s rostoucí vzdáleností methoxy skupiny od funkční
skupiny protonační konstanta zvyšuje. Srovnáním termodynamických parametrů, tedy
entalpie a entropie nesubstituovaného BAPu a methoxy- derivátu BAPu, je patrné, že
methoxy skupina způsobila pokles entalpie i entropie.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu č. MSM 0021622412 (INCHEMBIOL) a MŠMT ČR
BIO-ANAL-MED č. LC06035. Poděkování patří Katedře Anorganické chemie, PřF,
Univerzity Palackého v Olomouci, která poskytla vzorky chloro - a methoxy - derivátů BAPu.
Literatura
Tarkowski P.; Doležal K.; Strnad M.: Chem. Listy 98. 834 (2004).
1.
Bartak P., Pechova D., Tarkowski P., Bednar P., Kotoucek M., Stransky Z., Vespalec
2.
R.: Anal. Chim. Acta 421, 221 (2000).
143
Calculation of Linear Regression Model
(Tvorba lineárního regresního modelu)
Petr Pořický
The Dukovany Nuclear Power Station, ČEZ, a. s., 675 50 Dukovany, Czech Republic,
Abstract
The present contribution deals with calculation of a linear regression model with application
of the last square method. The quadratic polynomial model was found as optimal in the case
of the regression of analytical results gained by anodic adsorptive voltammetric determination
of sodium dodecyl sulfonate.
Key Words: Linear regression model, Calculation, Linear model, Sodium dodecyl sulfonate.
Úvod
Při budování regresních modelů se běžně užívá metody nejmenších čtverců. Metoda
nejmenších čtverců poskytuje postačující odhady parametrů jenom při splnění předpokladů o
datech a o regresním modelu. Pokud tyto předpoklady nejsou splněny, ztrácí výsledky
metodou nejmenších čtverců své vlastnosti. Lineární regresní analýza se používá v těchto
případech1-3:
1. Popis empirických dat. Hledá se vztah, lineární regresní model, který sumarizuje vazby
mezi sloupci v datech.
2.Určení parametrů. Běžným cílem regresní analýzy je vyčíslení odhadů neznámých
parametrů regresního modelu.
3. Predikce. Cílem regresní analýzy je často predikce, tj. vyčíslení hodnot závisle proměnných
pro zadané kombinace vstupních parametrů.
4. Řízení. Regresní modely lze využít také k monitoringu a řízení systémů, například ke
kalibraci měřícího systému.
5. Výběr důležitých proměnných. Výběr proměnných se provádí s ohledem na nezávisle
proměnné, které vysvětlují významný podíl proměnlivosti závisle proměnné.
Základní předpoklady metody nejmenších čtverců
I.
Regresní parametry β mohou nabývat libovolných hodnot.
II.
Regresní model je lineární v parametrech a platí aditivní model měření.
III. Matice nenáhodných, nastavovaných hodnot vysvětlujících proměnných X má hodnost
rovnou právě m. To znamená, že žádné její dva sloupce xj, xk nejsou kolineární, tj.
rovnoběžné vektory. Tomu odpovídá i formulace, že matice XT X je symetrická regulární
matice, ke které existuje inverzní matice a jejíž determinant je větší než nula.
IV.
Náhodné chyby εi mají nulovou střední hodnotu E(εi) = 0. To musí u korelačních
modelů platit vždy.
V.
Náhodné chyby εi mají konstantní a konečný rozptyl E(εi2) = σ2. Také podmíněný
rozptyl D(y/x) = σ2 je konstantní a jde o homoskedastický případ.
VI. Náhodné chyby εi jsou vzájemně nekorelované a platí cov(εi,εj) = E(εi,εj) = 0. Pokud mají
chyby normální rozdělení a jsou nekorelované a jsou zároveň nezávislé. tento požadavek
odpovídá požadavku nezávislosti měřených veličin y.
VII. Chyby εi mají normální rozdělení N(0,σ2). Vektor y má pak vícerozměrné normální
rozdělení se střední hodnotou Xβ a kovarianční matici σ2E, kde E je jednotková matice.
Postup výstavby lineárního regresního modelu
1. Návrh modelu
2. Předběžná analýza dat
144
3. Odhadování parametrů
4. Regresní diagnostika
5. Konstrukce zpřesněného modelu
a) metody vážených nejmenších čtverců (MVNČ) při nekonstantnosti rozptylů
b) metody zobecněných nejmenších čtverců (MZNČ) při autokorelaci
c) metody podmínkových nejmenších čtverců (MPNČ) při omezeních, kladených na parametry
d) metody racionálních hodností GPRC u multikolinearity
e) metody rozšířených nejmenších čtverců(MRNČ) pro případ, že všechny proměnné jsou
zatížené náhodnými chybami
f) robustní metody, kdy jsou parametry zpřesněného modelu jsou odhadovány pro jiná
rozdělení dat než normální a data s vybočujícími hodnotami a extrémy
6. Zhodnocení kvality modelu. Provádí se využitím klasických testů, postupů regresní
diagnostiky a doplňkových informací o modelované soustavě posouzení kvality navrženého
lineárního regresního modelu.
Aplikaci lineárního regresního modelu a postup jeho tvorby lze ukázat na příkladu
polarografického stanovení povrchově aktivních látek (PAL), konkrétně dodecyl disulfonan
sodný (DDSNa) se sleduje závislost koncentrace DDSNa na velikosti proudu. Cílem je určení
typu závislosti dat dle Tabulky I.
Tabulka I.
Výsledky voltametrického stanovení dodecyl disulfonanu sodného (DDSNa)
c [mg/l]
0,00
1,98
3,92
5,83
7,69
9,52
I [nA]
2,23 63,53 92,50 108,20 140,30 138,30
K výpočtu byl použit software QCExpert v. 3.1 (TriloByte Statistical Software, Pardubice Staré Hradiště, Česká republika)
Výsledky a diskuse
Výsledky získané při lineárním, kvadratickém a kubickém polynomu jsou uvedeny
v Tabulce II.
Tabulka II.
Statistické charakteristiky regrese.
Vícenásobný korelační koeficient, R:
Koeficient determinace D [%]:
Predikovaný korelační koeficient, Rp2:
Střední kvadratická chyba predikce, MEP:
Akaikeho informační kritérium, AIC:
Přímka
Polynom m=2
0,953
0,991
90,90
98,29
82,80
95,99
712,6
178,2
35,98
27,95
Polynom m=3
0,993
98,52
62,12
1392,0
29,08
Grafická analýza je zobrazena na Obr. 1 včetně 95%ního konfidenčního pásu. Pro jednotlivé
zvolené polynomy byla provedena analýza reziduí.
Z tabulky I je zřejmé, že nejnižší hodnoty MEP a AIC odpovídají polynomu o stupni 2. Proto
byla provedena podrobnější analýza modelu polynomu m = 2. Klasickou metodou nejmenších
čtverců (NMČ) byly nalezeny odhady tří parametrů, β0 až β2. Studentův t-test ukázal, že
parametr β0 je statisticky nevýznamný a parametry β1 a β2 jsou statisticky významné, když
t0.95(6-3) = 3,182.
145
Polohu a proměnlivost proměnné x charakterizuje průměr a směrodatná odchylka hodnot
každé proměnné.
Pearsonův párový korelační koeficient všech párů závislosti y na x, y na x2 ukazuje dosti
vysokou korelaci. Velká korelace je indikována i mezi jednotlivými nezávisle proměnnými,
což je charakteristickým rysem polynomů, protože mezi xj a xk je zřejmá vazba. Byla
vyčíslena multiolinearita pomocí vlastních čísle korelační matice λ[j], podmíněnosti kappa
K[j], a VI faktor VIF[j] a vícenásobných korelací. Maximální číslo podmíněnosti K = 48,934
nepřevyšuje hodnotu 1000, a proto je indikována slabá multikolinearita.
A
B
C
Obr. 1: Graf těsnosti proložení naměření pomocí A) lineárního, B) kvadratického a C)
kubického modelu.
Střední kvadratická chyba predikce MEP a Akaikovo informační kriterium AIC se užívají k
rozlišení mezi několika navrženými modely, zde stupni polynomu m. Pro nejlepší stupeň
polynomu dosahují obě kriteria svých minimálních hodnot.
Dalším nutným krokem je provedení regresní diagnostiky (regresního tripletu).
1. Kritika dat
Skládá se z analýzy několika druhů grafických diagnostik tabulek různých druhů reziduí.
a) Analýza klasických reziduí
není příliš spolehlivá, protože klasická rezidua jsou korelovaná, s nekonstantním rozptylem,
jeví se normálnější než náhodné chyby (efekt supernormality) a nemusí indikovat silně
odlehlé hodnoty. Obr. 1 A)-C) indikuje vhodnost modelu. Pomocí závislosti reziduí e na yp, se
indikují podezřelé body, trend a nekonstantnost rozptylu, tzv. heteroskedasticitu. Míry polohy
a rozptýlení klasických reziduí by měly dosahovat hodnot blízkých experimentálnímu šumu.
Odhad směrodatné odchylky s(e) by se měl blížit svou velikostí experimentální chybě, kterou
je zatížena závisle proměnná. Odhady šikmosti a špičatosti by měly dokazovat normální
rozdělení reziduí, normalitu.
b) Analýza ostatních reziduí
Jackknife rezidua indikují odlehlé body, diagonální prvky Hii od projekční matice H a
diagonální prvky H*ii od zobecněné projekční matice Hm, pouze extrémy. Ostatní druhy
reziduí a kriteria pak obojí. Jackknife rezidua eJ,i ukazují, že žádný bod není odlehlý.
Atkinsova vzdálenost indikuje jako vlivné body body č. 1 a 4. Věrohodnostní vzdálenosti LD
(b) neukazují na žádný bod, LD (s) neukazuje na žádný bod a LD (b, s) ukazují na body č. 1 a
4. Diagonální prvky Hii projekční matice H ukazují, že nejsou extrémy, a diagonální prvky
Hmi,i, zobecněné projekční matice Hm také ukazují, že nejsou extrémy.
146
c) Grafy vlivných bodů
Grafy vlivných bodů jsou schopny indikovat a současně i testovat, dokazovat přítomnost
odlehlých hodnot a extrémů. Graf predikovaných reziduí neindikují žádný odlehlý bod, ale
extrém č. 1. Pregibonův graf, Williamsův graf a McCullohův-Meeterův graf neukazuje na
žádný vlivný bod. Graf LR ukazuje na dva extrémy č. 1 a 4. Lze říci, že žádný bod není
většinou diagnostik prokázán za odlehlý.
d) Indexové grafy
Upozorňují pouze na podezřelé body, nejsou schopny testovat odlehlé body a extrémy.
Andrewsův indexový graf ukazuje na podezřelé body č. 1 a 4. Indexový graf prvků projekční
matice H ukazuje na podezřelé extrémy č. 1 a 6.
e) Rankitové grafy
Ukazují vedle normality rozdělení dotyčných reziduí i na vlivné body. Andrewsův graf
ukazuje na odlehlý bod č. 1, graf jackknife reziduí ukazuje na body č. 2 a 4, rankitový graf
předikovaných reziduí ukazuje na bod č. 1 a rankitový graf normalizovaných reziduí ukazuje
na bod č. 4.
2. Model
Parciální regresní grafy a parciální reziduální grafy ukazují na lineární závislost všech
nezávisle proměnných. Navržený model je formulován ve tvaru
y = β0 + β1x + β2x2
3. Metoda
Provedeme vyšetření splnění základních předpokladů metody nejmenších čtverců (MNČ), za
kterých by měla metoda vést k nejlepším nestranným odhadům lineárních regresních
parametrů.
Testování regresního tripletu (data + model + metoda):
Fisherův- Snedecorův test významnosti regrese potvrdil, že navržený model je přijat jako
významný. Scottovo kriterium multikolinearity ukazuje, že navržený model vykazuje
multikolinearitu. Cookův-Weisbergův test heteroskedasticity dokazuje, že rezidua vykazují
heeskedasticitu (nekonstantnost rozptylu). Jarqueův – Berraův test reziduí ukazuje, že
klasická rezidua vykazují Gaussovo rozdělení. Waldův test autokorelace ukazuje, že klasická
rezidua nejsou autokorelována. Durbin - Watsonův test autokorelace dokazuje, že negativní
autokorelace reziduí není prokázána. Znaménkový test prokazuje, že znaménko klasických
reziduí se dostatečně střídá, a proto rezidua nevykazují žádný trend.
Graf autokorelace vykazuje náhodný mrak bodů reziduí. Graf heteroskedasticity vykazuje
klín, což odpovídá heteroskedasticitě, nekonstantnosti rozptylu.
Konstrukce zpřesněného modelu
Užitím statistické váhy (wi = 1/yi) se kompenzuje heteroskedasticitu v datech. Získáme nové
správnější odhady parametů. Opravený model má tvar (v závorce je uveden odhad směrodatné
odchylky parametru)
y = 2,2343 (0,2302) + 30,7213 (2,7603) x -1,7663 (0,3722)x2
je doložen statistickými charakteristikami (Tabulka III):
147
Tabulka III.
Statistické charakteristiky regrese.
Polynom m=2
Vícenásobný korelační koeficient, R:
Koeficient determinace D [%]:
Predikovaný korelační koeficient, Rp2:
Střední kvadratická chyba predikce, MEP:
Akaikeho informační kritérium, AIC:
0,9998
99,97
0,79
248,78
4,86
Po aplikaci metody
racionálních
hodností
0,9998
99,96
0,82
215,20
4,45
Jelikož došlo ke snížení rozhodujících kriterií, střední kvadratické chyby predikce MEP a
Akaikova informačního kritéria AIC, lze považovat tyto odhady za lepší než předešlé.
Protože data vykazují multikolinearitu je nutno použít metodu racionálních hodností (Tabulka
III). Jelikož došlo ke snížení rozhodujících kriterií, střední kvadratické chyby predikce MEP a
Akaikova informačního kritéria AIC, lze považovat tyto odhady za lepší než předešlé.
Závěr
Vztah mezi koncentraci a proudem při polarografickém stanovení DDSNa popisuje
následující model:
y = 2,2304 (0,2384) + 32,0050 (2,9177) x - 1,9304 (0,3926)x2
Předkládané řešení tvorby lineárního regresního modelu představuje korektní a správný
přístup při zpracování analytických dat
Literatura
1. Meloun M., Militky J.: Statistická analýza experimentálních dat. Academia, Praha 2004.
2. Meloun M., Militky J.: Statistická analýza experimentálních dat. Academia, Praha 2006.
3. Meloun M., Militky J., Forina M.: Chemometrics for Analytical Chemistry, Volume 1:
PC-Aided Statistical Data Analysis, Volume 2: PC-Aided Regression and Related
Methods Ellis Horwood, Chichester 1992.
148
Electrochemical Behavior of Antidiabetics Repaglinide and Rosiglitazone and their
Determination by Liquid Chromatography with Electrochemical Detection
(Elektrochemické chování antidiabetik repaglinidu a rosiglitazonu a jejich stanovení
kapalinovou chromatografií s elektrochemickou detekcí)
Jana Skopalová, David Jirovský, Zdenka Bartošová, and Vítězslav Maier
Palacký University in Olomouc, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, tř.
17. listopadu 1192/12, 771 46 Olomouc, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
A voltammetric behavior of two antidiabetic drugs repaglinide and rosiglitazone was
investigated on glassy carbon electrode using cyclic and differential pulse voltammetry.
Oxidation of the both drugs occurred in the entire tested pH range of 2-9 giving well defined
anodic current responses. Suitable conditions for coulometric detection of the drugs at porouscarbon electrode were found on the basis of voltammetric experiments. A simple and highly
sensitive reverse-phase liquid chromatography method with coulometric detection was
developed and applied to the determination of nanomolar concentractions of the drugs in
spiked human plasma.
Key Words: Repaglinide, Rosiglitazone, Voltammetry, Oxidation, Liquid chromatography,
Coulometric detection, Spiked human plasma.
Úvod
Diabetes mellitus 2. typu je nejčastější metabolické onemocnění, jehož výskyt ve vyspělých
zemích neustále narůstá 1. Vyznačuje se sníženou sekrecí inzulínu a současně zvýšenou
rezistencí tkání vůči jeho působení. Důsledkem je zvýšená hladina glukózy v krvi
(hyperglykémie), která je hlavní příčinou vzniku chronických komplikací.
Léčba perorálními antidiabetiky je nedílnou součástí komplexní léčby diabetu 2. typu 2.
V současnosti je věnována velká pozornost vývoji a zavádění nových, účinnějších typů těchto
léčiv. Patří k nim tzv. meglitinidy a thiazolidindiony (glitazony), které se vzájemně liší
mechanismem účinku. Repaglinid (Obr. 1), představitel skupiny meglitinidů, zvyšuje sekreci
inzulínu uzavíráním ATP-dependentních draslíkových kanálů v membráně beta-buněk
pankreatu, které následně indukuje otevření vápníkových kanálků provázené sekrecí inzulínu.
Rosiglitazon (Obr. 1) ze skupiny glitazonů ovlivňuje expresi genů odpovědných za aktivaci
inzulínových receptorů a tím snižuje inzulínovou rezistenci 2.
Obr. 1. Chemická struktura studovaných perorálních antidiabetik.
Terapeutické dávky repaglinidu a rosiglitazonu jsou velmi nízké (řádově jednotky mg/den)
v porovnání s jinými perorálními antidiabetiky. Obě látky se velmi rychle vstřebávají
v trávicím ústrojí a jejich maximální koncentrace v séru je dosaženo po 1 – 2 hodinách 3,4.
Jejich silná vazba na plazmatický albumin 3,4 (> 98 %) je příčinou velmi nízkých koncentrací
149
volné formy léčiva v plazmě, které jsou pod limitem detekce většiny analytických metod. Pro
spolehlivé stanovení je proto nezbytná úprava vzorku plazmy zahrnující uvolnění vazeb na
proteiny a použití velmi citlivých analytických technik.
Stanovení perorálních antidiabetik v plazmě se nejčastěji provádí kapalinovou chromatografií
na reverzních fázích s fluorescenční 5-9 nebo hmotnostně spektrometrickou detekcí 10, 11.
Z elektroanalytických metod byla použita diferenční pulzní voltametrie se rtuťovou
elektrodou ke stanovení rosiglitazonu v plazmě a farmaceutických přípravcích 12. Toutéž
metodou s elektrodou ze skelného uhlíku a uhlíkovou pastovou elektrodou byl stanoven i
repaglinid v krevním séru 13.
Elektrochemická oxidace rosiglitazonu nebyla dosud v literatuře popsána. Proto je tato práce
věnována studiu voltmetrického chování rosiglitazonu a repaglinidu v anodické oblasti
potenciálů. Cílem studie bylo nalézt vhodné podmínky pro stanovení velmi nízkých
koncentrací obou antidiabetik v plazmě metodou kapalinové chromatografie s coulometrickou
detekcí.
Standardní roztoky repaglinidu (Sigma-Aldrich) a rosiglitazonu (Alexis Biochemicals,
Lausen, Švýcarsko) byly připraveny v koncentraci 1 mmol·l-1 v methanolu. Jako základní
elektrolyt byly použity jednak Britton-Robinsonovy tlumivé roztoky o pH 2–11, jednak
směsné prostředí vodného roztoku hydrogenfosforečnanu disodného (0,05 mol·l-1) s
acetonitrilem (60/40, v/v), jehož acidita byla upravena na požadovanou hodnotu pH v rozmezí
2–9 přídavkem 85 % kyseliny fosforečné. Všechny chemikálie použité pro přípravu
základních elektrolytů byly čistoty p.a., ultračistá voda byla získána ze systému ELGA.
Voltmetrická měření byla realizována na počítačem řízeném Eco-Tribo polarografu (PolaroSensors, Praha), vybaveném softwarem Polar.Pro verze 4. Tříelektrodový článek tvořila
pracovní elektroda ze skelného uhlíku (Bioanalytical Systems, USA), referentní nasycená
kalomelová (SCE) a pomocná platinová elektroda. Povrch pracovní elektrody byl před
každým měřením vyleštěn vodnou suspenzí oxidu hlinitého (velikost částic < 50 nm, SigmaAldrich), zbaven zbytků suspenze 15 s sonikací v destilované vodě a důkladně opláchnut
redestilovanou vodou. Cyklické voltamogramy byly pořízeny při rychlosti polarizace
100 mV·s-1, diferenčně pulzní záznamy při polarizační rychlosti 20 mV·s-1, amplitudě pulzu
50 mV a šířce pulzu 80 ms.
HPLC systém byl tvořen isokratickým čerpadlem (model 582, ESA, Chelmsford, MA, USA),
manuálním injektorem (Rheodyne, Cotati, CA, USA) s 20 μL smyčkou a coulometrickým
detektorem Coulochem III s duální elektrodovou celou (Model 5010A, vše ESA, Chelmsford,
MA, USA). K separacím byla použita HPLC kolona Polaris 3 μm C18-A 150 × 3.2 mm I.D.,
(Varian, Palo Alto, CA, USA). Mobilní fázi tvořil roztok hydrogenfosforečnanu disodného
(0,05 mol·l-1)/acetonitril (60/40, v/v), jehož hodnota pH 7,5 byla nastavena přídavkem 85 %
kyseliny fosforečné. Průtoková rychlost byla 0,4 ml·min-1. Potenciál první pracovní elektrody
byl nastaven na +750 mV, druhé elektrody v sérii na -380 mV (vs. Pd/H2).
Vzorky krevní plazmy byly před analýzou zpracovány následujícím postupem: 550 μl octanu
ethylnatého bylo přidáno k 250 μl krevní plazmy s přidanými perorálními antidiabetiky,
pečlivě třepáno a následně centrifugováno. Objem 500 μl organické fáze byl přenesen do
vialky a odpařen proudem dusíku do sucha. Odparek byl rekonstituován 50 μl mobilní fáze a
podíl 20 μl roztoku byl odebrán k HPLC analýze.
150
Výsledky a diskuse
Oxidace repaglinidu na elektrodě ze skelného uhlíku studovaná cyklickou a diferenčně pulzní
voltametrií se projevila dvěma dobře definovanými anodickými proudovými píky (Obr. 2,
křivka 2) v celé sledované aciditní oblasti (pH 2 až 11). V obráceném směru polarizace nebyl
zaznamenán žádný katodický proudový signál, což ukazuje na ireverzibilní charakter
elektrodové reakce.
Elektrochemická oxidace rosiglitazonu je rovněž ireverzibilní a projevuje se jedním dobře
vyvinutým proudovým píkem (Obr. 2, křivka 3) v aciditním rozsahu pH 2-11. Výška CV i
DPV píku rosiglitazonu je poloviční v porovnání s píkem repaglinidu stejné koncentrace,
z čehož lze usuzovat na poloviční počet elektronů vyměňovaných při oxidaci rosiglitazonu.
Obr. 2. Cyklické voltamogramy repaglinidu (2) a rosiglitazonu (3) (c = 0,2 mmol·l-1).
Základní elektrolyt (1): fosfátový pufr/acetonitril (60/40, v/v), pH 7,5. Rychlost polarizace
100 mV/s.
Potenciály i proudy píků obou látek závisí na pH. Aciditní závislost potenciálů DPV píků
repaglinidu (Obr. 3A) měřené ve směsném prostředí fosfátového pufru s acetonitrilem
vykazuje lineární úseky se zlomy při pH 4,5 a 6,3 odpovídajícími hodnotám pK1 a pK2
publikovaným v literatuře 13, 14. Podobně zlom pH-závislosti potenciálu píku rosiglitazonu
(Obr. 3B) při pH 6,4 odpovídá pK této látky v souladu s literaturou 15. Směrnice lineárních
úseků v kyselém prostředí blízká hodnotě 60 mV/pH svědčí o stejném počtu elektronů a
protonů účastnících se elektrodové reakce.
Repaglinid se v kyselém prostředí adsorbuje na povrchu elektrody ze skelného uhlíku. Proud
prvního píku měřený ve vodných roztocích Britton-Robinsonových pufrů dosahuje v rozmezí
pH 2 až 3 téměř o třetinu vyšších hodnot než při pH 5 až 8. Závislost proudu prvního píku
repaglinidu na pH měřená ve směsném prostředí se 40 % (v/v) acetonitrilu vykazuje
maximum prvního píku při pH 5,5 až 7,5. Podobně i rosiglitazon poskytuje nejvyšší DPV pík
ve směsném elektrolytu při pH 6 až8. Proto byla neutrální aciditní oblast vybrána jako vhodná
pro analýzu obou antidiabetik v systému HPLC s coulometrickou detekcí.
151
Obr. 3. Závislosti potenciálu DPV píků repaglinidu (A) a rosiglitazonu (B) na pH ve vodněacetonitrilových fosfátových pufrech (40 % v/v acetonitrilu).
Hydrodynamické voltamogramy repaglinidu a rosiglitazonu měřené v mobilní fázi o pH 7,5
(fosfátový pufr/acetonitril, 60:40, v/v) ukazovaly maximální proudovou odezvu porézní
uhlíkové elektrody při potenciálu kolem +800 mV (vs. Pd/H2). Byla testována i možnost
využití duální coulometrické detekce. Při potenciálu druhé elektrody -350 mV byl
zaznamenán katodický pík redukce oxidačního produktu repaglinidu, který vznikl oxidací na
první elektrodě při +750 mV. Relativní plocha katodického píku byla pouze 2,8 %.
Pro dosažení dostatečného rozlišení a zároveň přijatelných retenčních časů studovaných
antidiabetik bylo optimalizováno složení mobilní fáze (organický modifikátor a poměr vodné
a organické složky). Acetonitril v mobilní fázi poskytoval mnohem užší a symetričtější píky
než methanol a současně i proudové odezvy obou analytů byly výrazně vyšší.
Dále byla testována výtěžnost extrakce léčiv z plazmy do octanu ethylnatého. Nalezené
hodnoty výtěžnosti byly velmi vysoké a srovnatelné pro repaglinid (104±4 %) i rosiglitazon
(98±5%). Srovnatelná účinnost extrakčního postupu umožňuje použít pro kvantifikaci
antidiabetik metodu vnitřního standardu, kterým může být rosiglitazon pro stanovení
repaglinidu a opačně. V terapii diabetu 2. typu se tato dvě antidiabetika neaplikují současně,
takže volba jedné látky jako vnitřního standardu pro stanovení druhého léčiva je vhodná pro
reálné klinické analýzy. Obr. 4 ukazuje typický chromatogram plazmy obohacené
repaglinidem a rosiglitazonem po extrakci octanem ethylnatým. Kalibrační závislost
repaglinidu extrahovaného z modelových vzorků lidské krevní plazmy měřená s použitím
rosiglitazonu jako vnitřního standardu byla lineární s detekčním limitem 2,8 nmol·l-1 a mezí
stanovitelnosti 8,5 nmol·l-1. Terapeutické koncentrace repaglinidu v plazmě dosahují za dvě
hodiny po požití minimální dávky léčiva hodnot kolem 11 nmol·l-1. Znamená to, že vyvinutá
metoda splňuje požadavky na stanovení repaglinidu v reálných klinických podmínkách.
152
Obr. 4. Chromatogram rekonstituovaného extraktu z plazmy s přidaným (1) repaglinidem
(3·10-8 mol·l-1) a (2) rosiglitazonem (1·10-7 mol·l-1). Podmínky separace a detekce: mobilní
fáze - fosfátový pufr/acetonitril (40/60, v/v), pH = 7,5; kolona Polaris 3 μm C18-A 150 × 3.2
mm I.D.; coulometrický detektor při +750 mV, citlivost 500 nA/V, nástřik 20 μl.
Závěr
Repaglinid i rosiglitazon se elektrochemicky oxidují na uhlíkových elektrodách při
potenciálech závislých na pH prostředí. Elektroaktivita umožňuje stanovit tyto látky
v nanomolárních koncentracích metodou kapalinové chromatografie s coulometrickou
detekcí. Vyvinutý postup izolace a analýzy je použitelný pro monitorování terapeutických
koncentrací obou antidiabetik v krevní plazmě.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu MŠMT ČR č. MSM 6198959216 a projektu
Univerzity Palackého v Olomouci č. PRF_2010_028.
Literatura
1. IDF Diabetes Atlas, 4th edition. International Diabetes Federation, 2009.
http://www.diabetesatlas.org, staženo 20. 4. 2010.
2. Sechser T.: Interní med. 2003, 115. http://www.internimedicina.cz, staženo 20. 4. 2010.
3. Hatorp V.: Clin. Pharmacokinet. 41, 471 (2002).
4. Pelikánová T.: Interní med. 2001, 575. http://www.internimedicina.cz, staženo 20. 4.
2010.
5. Kang X., Wang F., Xie Z. H., Li H. D.: J. Chromatogr. B 877, 645 (2009).
6. Pedersen R. S., Brosen K., Nielsen F.: Chromatographia 62, 197 (2005).
7. Kim K. A., Park J. Y.: Biomed. Chromatogr. 18, 613 (2004).
8. Hruska M.W., Frye R.F.: J.Chromatogr. B 803, 317 (2004).
9. Mamidi R. N. V. S., Benjamin B., Ramesh M., Srinivas N. R.: Biomed. Chromatogr. 17,
417 (2003).
10. Ho E. N. M., Yiu K. C. H., Wan T. S. M., Stewart B. D., Watkins K. L.: J. Chromatogr. B
811, 65 (2004).
11. Lin Z. P. J., Desai-Krieger D., Shum L.: J. Chromatogr. B 801, 265 (2004).
12. El-Sherbiny D., El-Enany N., Belal F.: Anal. Lett. 41, 806 (2008).
13. El-Ries M. A. N., Mohamed G. G., Attia A. K.: Yakugaku Zasshi 128, 171 (2008).
14. Mandic Z., Gabelica V.: J. Pharmaceut. Biomed. 41, 866 (2006).
15. Giaginis C., Theocharis S., Tsantili-Kakoulidou A.: J. Chromatogr. B 857, 181 (2007).
153
The Electrochemistry of Halogenated Benzonitriles
Romana Sokolová a, Lubomír Pospíšil a, Magdaléna Hromadová a, Jiří Ludvík a,
Miroslav Gál a, and Stefania Giannarelli b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, v.v.i., ASCR, Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
b
Department of Chemistry and Industrial Chemistry, University of Pisa,
Via Risorgimento 35, 56100 Pisa, Italy
Abstract
Autoprotonation in reduction mechanism of 3,5-dihalogeno-4-hydroxy-benzonitriles was
studied in dimethylsulfoxide by electrochemical methods. The overall one electron reduction
process was found. Aryl radical formed by the cleavage of halogenide undergoes further
electron transfer in EC type reaction. The anion is protonated by parent molecule resulting in
total consumption of two electrons per two starting molecules. Addition of stronger proton
donor increases the height of reduction wave up to two electrons per molecule. The addition
of potassium hydroxide causes the decrease of the reduction wave. The reduction products
were identified by GC/MS analysis in the absence and presence of strong proton donor.
Key Words: Autoprotonation, Reduction, Electron transfer, Carbon-halogen bond,
Benzonitriles herbicides.
Úvod
V Evropě a U.S.A. je běžně v zemědělství a průmyslu používáno několik stovek pesticidů
různé chemické povahy 1. Zjištění způsobu degradace pesticidů a charakterizace jejich
degradačních produktů je významný celosvětový problém. Mnohé degradační produkty těchto
látek jsou toxičtější než původní molekuly. Při biologické aktivitě některých pesticidů hrají
podstatnou úlohu reakce přenosu elektronu. Ioxynil (3,5-diiodo-4-hydroxy-benzonitril),
bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxy-benzonitril) a chloroxynil (3,5-dichloro-4-hydroxybenzonitril) jsou široce používané herbicidy. Tyto benzonitrilové herbicidy patří do skupiny
herbicidů, jejichž účinek spočívá v inhibici elektronového přenosu ve Fotosystému II
zelených rostlin 2. Pomocí GC-MS identifikace produktů po úplné elektrolýze při konstantním
potenciálu a analýzou cyklických voltamogramů bez a za přítomnosti halogenidů v roztoku
bylo prokázáno, že při redukci těchto halogenovaných látek dochází k rozštěpení vazby
C - halogen. Spotřeba jednoho elektronu při redukci byla potvrzena coulometricky 3.
Redukční dehalogenaci ioxynilu a bromoxynilu pomocí Desulfitobacterium chlororespirans
popsal také Cupples a kol. 4. Počet elektronů spotřebován během redukčního odštěpení
halogenidu není v literatuře jednotný 5-9. Celý proces je ovlivněn povahou substituentů
navázaných na aromatickém jádře, typem rozpouštědla a přítomností dalších látek, které
mohou sloužit jako donory protonů. Příkladem vlivu rozpouštědla na celkový mechanismus
redukce je jednoelektronová redukce 1-chloro-10-methyltribenzotrichinacenu v acetonitrilu a
dimethylformamidu 7. Stejná látka podléhá dvouelektronové redukci v prostředí benzonitrilu.
Chemické reakce spřažené s elektronovým přenosem často zahrnují protonaci. Zdrojem
protonů může být rozpouštědlo, přidaná kyselina nebo sama redukovaná molekula, případně
její radikál anion nebo arylanion 10,11. V naší nedávné práci jsme zjistili významný vliv
přítomnosti silné kyseliny na redukci ioxynilu 12. Cílem této studie je objasnění vlivu
bazického prostředí na mechanismus redukce. Mechanismus autoprotonace halogenovaných
hydroxybenzonitrilů je řešen.
Pro elektrochemická měření byl použit rychlý potenciostat s elektrochemickou celou v
tříelektrodovém zapojení. Spojení s počítačem bylo realizováno pomocí IEEE-interface karty
154
PcLab Model 748 (AdvanTech Co., U.S.A.). Jako pracovní elektroda byla použita stacionární
rtuťová kapková elektroda SMDE 2 (Laboratorní přístroje, Praha) s plochou pracovní
elektrody 1,1⋅10-2 cm2, doba kapky 2 s. Pro DC polarografii byla použita rtuťová kapková
elektroda DME s mechanickým regulátorem doby kapky, průtoková rychlost rtuti 0,65 mg⋅s-1.
Referentní argentchloridová elektroda Ag/AgCl/1M LiCl byla oddělena od roztoku
elektrolytu solným můstkem. Jako pomocná elektroda byl použit platinový drátek.
Elektrolýza a coulometrie při konstantním potenciálu byla prováděna na potenciostatu
Autolab PGStat 30. Pro rychlou voltametrii byly použity zlaté mikroelektrody 60 – 500 μm.
Výsledky a diskuse
Ioxynil poskytuje v 0,1 M TBAPF6 v prostředí dimethylsulfoxidu dvě polarografické vlny.
První jednoelektronová vlna se objevuje při –0,83 V a druhá při –1,25 V (křivka a, Obr. 1).
Druhá polarografická vlna ioxynilu odpovídá redukci 3-iodo-4-hydroxy-benzonitrilu,
produktu redukce na první polarografické vlně. Pro studium vlivu přítomnosti kyseliny na
výšku redukční vlny zkoumané látky je nutné vybrat látku, která splňuje několik podmínek: 1)
je ve vztahu ke studované látce kyselinou, 2) není elektrochemicky aktivní v oblasti
potenciálů, kde se zkoumaná látka redukuje. Za přítomnosti kyseliny se redukční vlna
ioxynilu zvýší a její půlvlnný potenciál se posune k nižším hodnotám (křivka b, Obr.1). Při
poměru koncentrací kyseliny a ioxynilu 2:1 se již polarografická vlna dále nezvyšuje.
Coulometrie provedená za těchto podmínek potvrzuje, že proces redukčního odštěpení
halogenidu vyžaduje celkem dva elektrony.
Obr. 1. DC polarogram 0,4 mmol·dm–3 ioxynilu v 0,1 M TBAPF6 v prostředí
dimethylsulfoxidu při různých koncentracích tetraoxalátu draselného: 0 (a); 0,8 (b); 1,2
mol·dm–3 (c). Doba kapky 2 s.
V případě, že v roztoku není přítomna látka, která by byla silnější kyselinou, než látka
studovaná, je pravděpodobné, že jako proton donor slouží hydroxylová skupina původní
molekuly.
155
Schéma 1
Coulometrie při konstantním potenciálu odpovídajícímu limitnímu proudu polarografické
vlny potvrdila, že první redukční vlna je jednoelektronová pro všechny studované
benzonitrilové herbicidy. Půlvlnný potenciál první polarografické vlny se posouvá směrem
k záporným hodnotám v pořadí I > Br > Cl. Tento fakt je významný pro zjištění celkového
mechanismu redukce. Vznik radikál anionu po přijetí elektronu (rovnice 1, Schéma 1) je
následován odštěpením halogenidu (rovnice 2, Schéma 1). Tato chemická reakce je rychlost
určující reakce celého procesu. Aryl radikál, který vznikne po odštěpení halogenidu podléhá
ihned dalšímu elektronovému přenosu (rovnice 3). Vznikající aryl anion přijme proton, který
poskytne hydroxylová skupina původní molekuly (rovnice 4). Při celém redukčním procesu se
spotřebují dva elektrony na dvě molekuly redukované látky (rovnice 5). Tomuto procesu
může konkurovat přenos atomu vodíku (hydrogen atom transfer, HAT) znázorněný rovnicemi
(6) – (9). Stechiometrie tohoto děje je totožná s rovnicí (5). Mechanismus HAT je
upřednostňován pro pomalejší rychlosti odštěpení halogenidu. Vzhledem k tomu, že již na
polarogramech ioxynilu, bromoxynilu a chloroxynilu se nacházejí redukční vlny jejich
produktů, musí být vzhledem k časovým možnostem polarografie rychlost odštěpení
halogenidu velmi vysoká. Studované látky podléhají tudíž ECEC mechanismu znázorněnému
rovnicemi (1) – (5).
Schéma 2
Celkový mechanismus redukce shrnuje Schéma 2. Potlačíme-li možnost autoprotonace
přídavkem hydroxidu draselného (Obr. 2), dojde ke snížení až vymizení první redukční vlny
ioxynilu. Při procesu je nutné vysušovat elektrochemickou celu molekulárním sítem.
Uvedený experiment dokazuje, že při potenciálu první redukční vlny ioxynilu nedochází
k redukci vznikajícího fenolátu. Redukce vznikajícího fenolátu nebyla nalezena v rozmezí
studovaných potenciálů.
156
0.4
- i / μA
a
0.2
b
c
d
0.0
-0.5
e
-1.0
-1.5
E/V
Obr. 2. DC polarogram 0,3 mmol·dm–3 ioxynilu v 0,1 M TBAPF6 v prostředí
dimethylsulfoxidu bez přítomnosti KOH (a) a za přítomnosti zvyšujících se ekvivalentních
podílů KOH (b – e). Molekulární síto v elektrochemické cele. Doba kapky 2 s.
Závěr
Byl řešen mechanismus redukce halogenovaných benzonitrilových pesticidů v nevodném
prostředí. Celkový mechanismus zahrnuje autoprotonaci a účast dvou elektronů na dvě
molekuly redukované látky. V přítomnosti kyseliny se mechanismus redukce změní a proces
vyžaduje dvou elektronů na jednu molekulu studované látky. V přítomnosti zásady za
současného vysoušení roztoku je redukce potlačena. Vliv autoprotonace vysvětluje neshody
v literatuře týkající se počtu elektronů při redukčním štěpení vazby uhlík – halogen.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou GA ČR (projektů č. 203/09/1607 a 203/08/1157).
Literatura
1. Worthing C. R., Phil D.: The Pesticide Manual. British Crop Protection Council. London
1987.
2. Sokolová R., Hromadová M., Pospíšil L.: Heterogeneous Electron Transfer of Pesticides.
Current Trends and Applications. In: New Trends in Analytical, Environmental and
Cultural Heritage Chemistry. (Eds. Colombini M.P., Tassi, L.), p. 43. Research Signpost,
Kerala 2008.
3. Sokolová R., Hromadová M., Fiedler J., Pospíšil L., Giannarelli S., Valášek M.:
J. Electroanal. Chem. 622, 211 (2008).
4. Cupples A. M., Sanford R.A., Sims G.K.: Appl. Environ. Microbiol. 71, 3741 (2005).
5. Prasad M. A., Sangaranarayanan M.V.: Chem. Phys. Lett. 414, 55 (2005).
6. Houser K. J., Bartak D.E., Hawley M.D.: J. Am. Chem. Soc. 95, 6033 (1973).
7. Jaworski J.S., Cembor M., Stepien B., Hafelinger G.: Electrochimica Acta 51, 2322 (2006).
8. M’Halla F., Pinson J., Savéant J.-M.: J. Am. Chem. Soc. 102, 4120 (1980).
9. Ji C., Peters D. G., Davidson E. R.: J. Electroanal. Chem. 500, 3 (2001).
10. Amatore C., Capobianco G., Farnia G., Sandona G., Savéant J.-M., Severin, M.G.,
Vianello E.: J. Am. Chem. Soc. 107, 1815 (1985).
11. Isse A.A., Abdurahman A.M., Vianello E.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 597 (1996).
12. Sokolová R., Hromadová M., Ludvík J., Pospíšil L., Giannarelli S.: Electrochimica Acta
(2010), doi. 10.1016/j.electacta.2010.01.094.
157
Electrochemical Synthesis of Polyaniline Films at a Screen-printed Carbon Electrode
and their Potential Applicability in Biosensing
(Elektrochemická příprava polyanilinového filmu na uhlíkové tištěné elektrodě a jeho
možné využití při přípravě biosenzorů)
Matěj Stočes a, Kurt Kalcher b, Ivan Švancara a, and Karel Vytřas a
a
Chemistry, Studentská 573 (HB/C), 532 10 Pardubice, Czech Republic
b
Institute of Chemistry-Analytical Chemistry, Karl-Franzens University, A-8010, Graz,
Austria
Abstract
Polyaniline (PANI) was electrochemically synthesized via cyclic voltammetry at a screen
printed carbon electrode (SPE) from acidic aqueous solution containing 1 M HCl and 0.25 M
aniline. Glucose oxidase (GOD) was electrostatically immobilized onto the surface of
SPE/PANI from 0.1 M phosphate buffer containing 0.75 mg/mL GOD. Optimal conditions of
GOD immobilization were investigated. The biosensor prepared in this way was tested in
sensing of glucose with optimization of experimental conditions for glucose determination.
Preliminary tests and characterization of SPE / PANI / GOD electrode have shown some
promise for development of a new type of biosensors.
Key Words: Screen printed electrode, Glucose determination, Glucose oxidase
Electropolymeration, Polyaniline, Conducting polymer.
Úvod
Vodivé polymery jsou v posledních letech v mnoha oborech středem zájmu. Jednou
z významných oblastí jejich využití je příprava (bio)senzorů 1. Mezi nejvíce studované patří
polyanilin (PANI) – výjimečný vodivý polymer s atraktivními elektrochemickými a
optickými vlastnostmi 2. Využití nachází v již zmíněných elektrochemických biosensorech 3-8,
plynových senzorech 9, bateriích 10 tak i jakožto protikorozivní materiál 11,12.
Příprava PANI polymerizací anilinu elektrochemickou nebo čistě chemickou cestou je
jednoduchá a finančně nenáročná. Elektrochemická polymerizace může být prováděna
galvanostaticky 13, potenciostatický 14 či nejčastěji technikami s měnícím se potenciálem 15,16.
Největší výhodou přípravy PANI elektrochemickými technikami je vylučování polymeru
přímo na povrchu pracovní elektrody a to, že jeho tloušťka a vlastnosti mohou být
kontrolovány množstvím prošlého náboje během elektropolymerizace 17. Mimo to PANI
poskytuje vhodné prostředí pro imobilizaci enzymů.
Enzymatické biosenzory mají rychlou odezvou a vysokou selektivitu díky charakteristickým
vlastnostem enzymů rozpoznávat cílovou molekulu i ve velmi složitém systému. Jedním
z nejvíce studovaných enzymů, jež si využívají pro přípravu biosenzorů, je glukóz oxidáza
(GOD). Stanovení glukózy je důležité pro monitorování její hladiny v krvi lidí trpících
diabetes mellitus, česky řečeno „cukrovkářů“. Stanovení obsahu glukózy vyžaduje ale i
například potravinářský průmysl, zemědělství a biotechnologický průmysl. Neméně
podstatným důvodem, proč je při studiu enzymatických senzorů volena právě GOD, je její
dostupnost a v porovnání s ostatními enzymy i relativně nízká cena.
V tomto příspěvku prezentujeme přípravu a charakterizaci PANI biosenzoru s imobilizovanou
GOD pro detekci a stanovení glukózy.
158
Chemikálie
Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. Glukózooxidáza a anilin byly zakoupeny od
firmy Aldrich. HCl (32%m/m); NaH2PO4·2H2O; Na2HPO4·12H2O a D(+) glukóza od firmy
Merck. Pro všechny použité roztoky byla použitá dvakrát neionizovaná voda z čistící
jednotky NanoPure (NanoPure, Barnstead).
Instrumentace
Uhlíková pastová elektroda (CPE) byla připravena důkladným smícháním 0,5 g uhlíkového
prášku (RW-B, Ringsdorff) s 0,3 mL vysoce viskózního silikonového oleje (SO, typ LUKOIL
MV 8000; Lučební závody Kolín). Vzniklá pasta byla vpravena do elektrodových pouzder
vlastní konstrukce 18. Uhlíková tištěná elektroda (SPE) byla připravena tištěním uhlíkového
inkoustu (Gwent C2050517D1) skrz šablonu na povrch keramické destičky (113x166x0.635
mm No. CLS 641000396R, Coors Ceramics) pomocí stěrky tiskařského stroje.
Elektropolymerizace anilinu byla prováděna na pracovní stanici BAS100B s odpovídajícím
softwarem. (Hydro)amperometrická měření byla prováděna na zařízení PalmSens.
Elektropolymerizace anilinu
Elektrody byly ponořeny do roztoku 0.2 M anilinu v 1 M HCl. Cyklickou voltametrií byl
potenciál měněn od -400 mV do +1200 mV (scan rate 100mV·s-1; 10 cyklů). Po vyloučení
PANI byla elektroda opatrně opláchnuta destilovanou vodou a umístěna do roztoku
fosfátového pufru (0.1 M pH 7.5), kde byl aplikován potenciál -500 mV po dobu 15 minut
z důvodů odstranění všech anionů z PANI filmu. Takto připravená elektroda pracovní
elektroda s PANI filmem byla připravena pro imobilizaci GOD.
Imobilizace glukóz oxidázy
Pracovní elektroda s PANI filmem byla ponořena do roztoku fosfátového pufru (0.1 M pH
7.5) obsahující 0.75 mg/mL GOD. Následně byl vložen potenciál (400 – 1000 mV) po danou
dobu (5 – 60 minut). Po ukončení potenciostatické imobilizace GOD byla pracovní elektroda
opatrně opláchnuta destilovanou vodou. Tímto byla elektroda připravena pro experimenty.
Výsledky a diskuse
Záznam průběhu elektropolymerizace a typické formování PANI je zobrazeno na Obr. 1. Ve
studovaném potenciálovém rozmezí byly pozorovány tři redox páry. S opakovanými skeny
cyklické voltametrie docházelo k oxidaci anilinu při nepatrně vyšších hodnotách potenciálu
z důvodu vyloučeného PANI na povrchu pracovní elektrody. První pík okolo hodnoty
+220 mV přísluší oxidaci leucoemeraldinu na emeraldin. Což odpovídá oxidaci z kompletně
redukované formy PANI na formu částečně oxidovanou. Anodický pík okolo hodnoty
+800 mV přísluší oxidaci emeraldinu na perningranilin; tedy na plně oxidovanou formu
PANI. Mezi těmito hlavními píky jsou patrny vedlejší píky, které mohou být přiřazeny
degradačním produktům 19,20 nebo p-benzochinonu 16,21.
Pro optimální podmínky imobilizace GOD na PANI filmu byl sledován efekt vloženého
napětí v rozmezí +400 mV až +1000 mV. V případě daných experimentálních podmínek byla
nejvhodnější hodnota potenciálu imobilizace GOD +700 mV. Ze závislost délky doby
imobilizace GOD na odezvě proudu v roztoku glukózy (Obr. 2) je patrno, že maximální
účinnosti je dosaženo po 30 minutách. Delší doba aplikace vloženého potenciálu nevedla
k významnému zvýšení odezvy proudu.
159
Z důvodu charakterizace základních vlastností a chování připraveného biosenzoru byl PANI
biosenzor studován pomoci hydrodynamické amperometrie. Klíčovým parametrem byla
hodnota pracovního potenciálu, jež byla studována v rozmezí -600 mV až +500 mV. Odezva
proudu rapidně klesala se zvyšující se hodnotou pracovního potenciálu. Pro hodnoty -100 mV
a vyšší nebyly zaznamenány žádné významné odezvy proudu. Navzdory tomu, že při více
negativním potenciálu byla vyšší proudová odezva, praktická hodnota pracovního potenciálu
leží mezi -200 mV a -400 mV. Při negativnějších hodnotách potenciálu byly hydrodynamické
křivky podstatně méně reprodukovatelné, s vyšším pozadím a zbytkovými proudy. Z těchto
důvodu byla pro další studie zvolena hodnota pracovního potenciálu -400 mV
Obr. 1. Elektropolymerizace PANI. Experimentální podmínky: 0.2 M anilin v 1 M HCl.
Cyklická voltamatrie: Elow = -400 mV; Ehigh = +1200 mV; Estart = +1200 mV; scan rate =
100 mV·s-1; 10 cyklů.
160
Obr. 2. Závislost délky doby imobilizace GOD na odezvě proudu. Experimentální podmínky:
imobilizace GOD: E = +700 mV; t = 0 - 60 min; c (GOD) = 0.75 mg/ml. Testovací roztok: c
(glukóza) = 100 ppm; E = -400 mV; 0.1 M fosfátový pufr pH 7.5.
Obr. 3. Závislost proudu na koncentraci glukózy Experimentální podmínky: imobilizace
GOD: viz Obr. 2. Testovací roztok: c (glukóza) = 0 - 500 ppm; E = = -400 mV; 0.1 M
fosfátový pufr pH 7.5.
161
Závislost proudu na koncentraci glukózy byla studována v rozmezí 0 až 500 ppm (Obr. 3).
Lineární závislost v rozsahu 0 až 200 ppm dokazuje, že se jedná o enzymatickou reakci
prvního řádu. Při vyšší koncentraci glukózy (200 až 400 ppm) docházelo k odklonu od
linearity a při koncentracích glukózy nad 450 ppm byla z důvodu saturace elektrodového
povrchu odezva téměř konstantní.
Největší předností námi připraveného biosenzoru je v porovnání s ostatními glukózovými
senzory jednoduchá a jednostupňová imobilizace enzymu na povrchu pracovní elektrody.
PANI může být použit pro imobilizace nejen glukóz oxidázy, ale i jiných enzymů. Získané
poznatky budou použity při aplikaci a využití biosenzoru v injekční průtokové analýze.
Závěr
Polyanilin byl připraven pomocí cyklické voltametrie (400 až +1200 mV; rychlost polarizace
100 mV·s-1; 10 cyklů) z roztoku 1 M HCl obsahující a 0.25 M anilinu. Potenciostatická
imobilizace (+700 mV; 30 minut) glukózooxidázy (GOD) byla provedena z roztoku 0.1 M
fosfátového pufru obsahující 0.75 mg/mL GOD. Při amperometrickém stanovení glukózy
senzor vykazoval linearitu v rozsahu 0 – 200 ppm. Získané poznatky budou použity při
aplikaci v injekční průtokové analýze.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy č.
MSM0021627505 a projektu LC06035.
Literatura
1. Adhikari B., Majumdar S.: Prog. Polym. Sci. 29, 699 (2004).
2. Mu S., Chen C., Wang J.: Synth. Met. 88, 249 (1997).
3. Zarini M. T., Alocilja E.C., Grooms D.L.: Biosens. Bioelectron. 20, 1690 (2005).
4. Juany Y., Wang A., Kan J.: Sens. Actuators, B 124, 529 (2009).
5. Wang P., Liu M., Kan J.: Sens. Actuators, B 140, 577 (2009).
6. Wang P., Li S., Kan J.: Sens. Actuators, B 137, 662 (2009).
7. Sngh S., Solanki P.R., Pandey M. K., Malhotra B.D.: Sens. Actuators, B 115, 534 (2006).
8. Mathebe N.G.R., Morrin A., Iwuoha E.I.: Talanta 64 115 (2004).
9. Mirmohseni A., Solhjo R.: Europ. Pol. J. 39, 219 (2003).
10. Yan X.B., Han Z.J., Yang Y., Tay B.K.: Sens. Actuators, B 123, 107 (2007).
11. Kraljic M., Mandic Z., Duic L.: Corr. Sci. 45,181 (2003).
12. Bernard M. C., Hugot -Le Goff A., Joiret S., Phong P. V.: Synt. Met. 119, 283 (2001).
13. Genies E.M., Tsintavis C.: J. of Electroanal. Chem. 195, 109 (1985).
14. Yang Y., Mu S.: J. of Electroanal. Chem. 432, 71 (1997).
15. Iwuoha E.I., de Villaverde D. S., Garcia N. P., Smyth M.R., Pingarron J. M.: Biosens.
Bioelectron. 12, 749 (1997).
16. Cooper J. C., Hall E. A. H. Biosens. Bioelectron. 7, 473 (1992).
17. Iwuoha E.I., Smyth M.R.: Electroactive polymer electrochemistry (Lyons M.E.G., ed.), p.
227-325, Plenum Pressm New York 1996.
18. Svancara I., Metelka R., Vytras K.: Sensing in Electroanalysis (Vytras K., Kalcher K.,
eds.), p. 7-18. Univerzita Pardubice, Pardubice 2005.
19. Gospodinova N., Terlemezyan L.: Prog. Polym. Sci. 23, 1443 (1998).
20. Lee J. Y., Ong L. H., Chuah G. K:. J. Appl. Electrochem. 23, 1031 (1993).
21. Prasad K. R., Munichandraiah N.: Synt. Met. 123, 459 (2001).
162
Voltammetric Behavior of Folic Acid Using Silver Solid Amalgam Electrode
(Voltametrické chování kyseliny listové na stříbrné pevné amalgámové elektrodě)
Renáta Šelešovská, Lenka Bandžuchová, and Jaromíra Chýlková
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
Abstract
Voltammetric behavior of folic acid (FA) has been studied using mercury meniscus modified
silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). Folic acid exhibits very sensitive cathodic peak
at potential -390 mV (vs. Ag/AgCl/saturated KCl) in pH 5 acetate buffer solution, resulting
from the reversible reduction of FA. Under the optimized conditions, the peak current
depends on FA concentration linearly in the ranges from 10-9 to 10-6 M using differential
pulse voltammetry, and the detection limit amounts to 4.39×10-10 M. The amalgam electrode
was successfully applied to the determination of folic acid in real samples.
Key Words: Folic acid, Silver solid amalgam electrode, Hanging mercury drop electrode,
Differential pulse voltammetry.
Úvod
Kyselina listová (FA) je ve vodě rozpustný vitamín patřící do skupiny vitamínů B (B9) 1. Jeho
struktura je znázorněna na Obr. 1. Tento vitamín je přijímán z potravy a v největší
koncentraci se vyskytuje v zelené zelenině, ovoci a játrech. Tato látka a její soli (foláty) se v
těle, jako tzv. koenzym F, účastní enzymových reakcí, které katalyzují přenos
jednouhlíkatých zbytků (methyl, formyl apod.) a hrají významnou roli při syntéze purinových
a pyrimidinových bazí. Kyselina listová je v lidském organismu důležitá především pro
obnovu a tvorbu buněk. Její nedostatek se projevuje zejména nedostatkem červených krvinek
(anémií), což může vést až k srdečním problémům nebo mrtvici. Velkým nebezpečím je i
nedostatek této látky během těhotenství, který může způsobit až defekty míchy a mozku
plodu 2.
Obr. 1. Strukturní vzorec kyseliny listové.
Vzhledem k významu kyseliny listové, byla již popsána řada metod jejího stanovení. Byla
využita například vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) 3 nebo kapalinová
chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem (LC/MS) 4, kapilární elektroforéza 5,
či ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) 6. Jako velmi citlivé se při stanovení
kyseliny listové ukázaly některé voltametrické metody, jejichž výhodou je především jejich
jednoduchost, nízká cena a časová nenáročnost jednotlivých analýz. V literatuře byla pro
stanovení FA popsána například metoda cyklické voltametrie s využitím zlaté diskové
elektrody modifikované 2-merkaptobenzothiazolem 7, cyklická a diferenčně pulzní
voltametrie s využitím rtuťových elektrod 1,8,9 nebo CV a DPV s chemicky modifikovanými
uhlíkovými elektrodami např. p-terc-butyl-calix[n]arenem 10 nebo nanočásticemi 11. V této
163
práci bylo studováno voltametrické chování kyseliny listové s využitím stříbrné pevné
amalgámové elektrody (AgSAE) modifikované rtuťovým meniskem 12,13.
Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. Britton-Robinsonův pufr v rozsahu pH 3-12 byl
připravován z alkalické složky 0,2M NaOH (Lachema Brno) a kyselé složky, kterou tvořil
roztok obsahující 0,04M H3PO4, 0,04 H3BO3 a 0,04M CH3COOH (Lachema, Brno). 0,5M
acetátový pufr o pH 5 byl připraven mícháním roztoků kyseliny octové a octanu sodného
(Lachema, Brno). Kyselina listová (Sigma-Aldrich) byla rozpouštěna v 0,01M roztoku NaOH
(Lechama Brno) a poté uchovávána v lednici ve tmě. Používané roztoky byly z 0,01M
standardního roztoku ředěny denně. Všechny roztoky byly připravovány v destilované vodě.
Byly analyzovány vitamínové přípravky GS Mamavit od firmy Green-Swan Pharmaceuticals
a tablety Kyselina listová Super nebo Kyselina listová Forte od firmy Naturvita.
Voltametrická měření probíhala na Eco-Tribo Polarografu (Polaro Sensors, Praha)
vybaveném softwarem POLAR.PRO pro Windows XP verze 5.1. Rtuťovým meniskem
modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda (m-AgSAE) a visící rtuťová kapková
elektroda (HMDE) sloužily jako pracovní elektrody (obě Polaro Sensors, Praha),
argentchloridová elektroda jako referentní a platinový drátek jako pomocná elektroda (obě
Monokrystaly, Turnov). Hodnoty pH byly měřeny s využitím pH metru Hanna 221 a roztoky
tablet obsahujících kyselinu listovou byly připravovány pomocí ultrazvukové lázně Bandelin
Sonorex (obojí Fischer Scientific, Pardubice). K výpočtu statistických parametrů byl použit
program ADSTAT 14.
Příprava stříbrné pevné amalgámové elektrody zahrnuje několik základních kroků 13. Povrch
AgSAE byl nejdříve vyleštěn pomocí leštící sady s aluminou (Elektrochemické detektory,
Turnov). Na takto připravený povrch byl poté vytvořen rtuťový meniskus ponořením
elektrody na několik sekund do kapalné rtuti. Při každodenním měření bylo třeba meniskus
jednou týdně obnovovat. Před začátkem měření nebo po přestávce delší než jedna hodina byla
elektroda aktivována v prostředí 0,2M KCl při -2200 mV po dobu 300 s. Regenerace povrchu
elektrody byla prováděna elektrochemicky přímo v analyzovaném roztoku zařazením 30
cyklů potenciálových skoků mezi hodnotami 0 a -1200 mV.
Pro studium chování kyseliny listové na obou pracovních elektrodách v závislosti na pH a
rychlosti polarizace byla použita DC voltametrie s lineárním skenem. Diferenční pulzní
voltametrie s šířkou pulzu 80 mV, výškou pulzu -50 mV a rychlostí polarizace 20 mV s-1 byla
testována pro stanovení kyseliny listové. Byly nalezeny optimální podmínky, při kterých
proběhla většina následujících měření: počáteční potenciál (Ein) -200 mV, konečný potenciál
(Efin) -1000 mV a potenciál akumulace (Eacc). Doba akumulace (tacc) byla vždy volena podle
aktuální koncentrace FA. Pro měření na HMDE bylo nejlepších výsledků dosaženo v
prostředí BR pufru o pH 8, zatímco pro m-AgSAE byl nejlepší 0,05M acetátový pufr o pH 5.
Všechna měření byla prováděna při laboratorní teplotě a přítomný kyslík byl odstraňován
probubláváním analyzovaného roztoku dusíkem. Pro vysvětlení rozdílů v chování kyseliny
listové na rtuťové a amalgámové elektrodě byla aplikována eliminační voltametrie s lineárním
skenem (EVLS) 15,16. Tato metoda přispívá k objasnění elektrodových procesů a umožňuje
zvýšení citlivosti. EVLS je založena na předpokladu, že měřený proud je součtem
jednotlivých dílčích proudů jako jsou kapacitní, difúzní, kinetický nebo tzv. ireverzibilní
proud. Jednotlivé proudy pak lze matematicky eliminovat s využitím voltametrických křivek
získaných při různých rychlostech polarizace. Podle tvaru získaných eliminačních
164
voltamogramů pro různé parciální proudy lze usuzovat na charakter probíhající elektrodové
reakce.
Jako reálný vzorek pro stanovení kyseliny listové byly použity různé vitamínové přípravky ve
formě tablet. Vždy 1 tableta byla rozetřena ve třecí misce, celé množství vzorku bylo
převedeno do 100ml odměrné baňky a rozpuštěno v 0,01M NaOH při působení ultrazvuku.
Poté byl vzorek zfiltrován a filtrát analyzován při výše uvedených podmínkách. Obsah
kyseliny listové byl stanoven metodou standardního přídavku.
Výsledky a diskuse
Nejdříve byly proměřeny závislosti voltametrického signálu kyseliny listové na hodnotě pH
(3-12) prostředí pro HMDE i m-AgSAE. Na obou pracovních elektrodách byly (v souladu s
výsledky publikovanými pro HMDE 1) v kyselém prostředí pozorovány 3 píky, z nichž první
odpovídá reverzibilní dvouelektrodové redukci kyseliny listové na dihydrolistovou, druhý pík
přísluší ireverzibilnímu rozštěpení molekuly FA elektroredukcí vazby C9-N10 a třetí pík
odpovídá opět dvouelektrodové ireverzibilní redukci odštěpeného dihydropteridinového jádra
na tetrahydropteridinový derivát 1. S rostoucí hodnotou pH se píky posouvají
k negativnějšímu potenciálu. V alkalickém prostředí je již na HMDE pozorován pouze první
pík a vzhledem k jeho výšce a tvaru bylo jako optimální pro stanovení kyseliny listové
zvoleno pH 8. Na amalgámové elektrodě nebyl při dané koncentraci (1.10-6M) v alkalickém
prostředí pozorován žádný signál odpovídající redukci kyseliny listové a jako optimální byla
pro další analýzy zvolena hodnota pH 5. Navíc se ukázalo, že v prostředí acetátového pufru
poskytuje elektroda lepší signál než v BR pufru při daném pH. Závislosti výšky píků na
rychlosti polarizace pro HMDE při pH 8 i pro m-AgSAE při pH 5 jsou lineární, takže se jedná
v obou případech o adsorpčně řízený děj. Z výsledků eliminační voltametrie vyplývá, že
zatímco na HMDE dochází jak při pH 8 tak při pH 5 k adsorpčně řízené reakci s velmi silnou
adsorpcí, na amalgámové elektrodě je tomu jinak. V prostředí o pH 8 na m-AgSAE nedochází
k adsorpci na povrch a jedná se výhradně o difúzně řízený děj, což odpovídá velice malé
citlivosti. Při pH 5 potvrdila eliminační voltametrie adsorpčně řízený děj, přestože adsorpce je
výrazně slabší než u HMDE.
Byly rovněž nalezeny optimální podmínky stanovení kyseliny listové metodou diferenčně
pulzní voltametrie, zejména pak potenciál akumulace, který byl pro obě pracovní elektrody
shodně -200 mV. Doba akumulace byla volena podle aktuální koncentrace analytu a výška
píku rostla v závislosti na tacc lineárně. Z řady měření se standardními roztoky FA při
navržených optimálních podmínkách na HMDE byly vypočteny následující statistické
parametry: relativní směrodatná odchylka z jedenácti opakovaných měření (RSDM) při
koncentraci 1.10-8 M byla 2,3 %, relativní směrodatná odchylka opakovaného stanovení FA
(RSDS, n = 5) pro koncentraci 5.10-9 M byla 2,64 % a detekční limit 3,21.10-11 M při tacc 20 s.
Stejné parametry byly vypočteny i pro stanovení FA s využitím m-AgSAE v prostředí 0,05M
acetátového pufru: RSDM 1,18%, RSDS (n = 5) rovněž pro koncentraci 5.10-9 M 3,23 % a
detekční limit 4,39.10-10 M opět při tacc 20 s. Dosažené výsledky svědčí o velice dobré
reprodukovatelnosti měření i stanovení na obou elektrodách a také o vysoké citlivosti.
Rtuťová elektroda je sice citlivější než m-AgSAE, přesto ale nízký detekční limit i ostatní
parametry umožňují aplikaci amalgámové elektrody při stanovení kyseliny listové v reálných
vzorcích.
Jako reálné vzorky byly zvoleny různé vitamínové přípravky běžně dostupné v lékárnách.
V první řadě se jednalo o tablety Kyselina listová Super (200 mg FA/tableta) a Kyselina
listová Forte (400 mg FA/tableta), které obsahují pouze kyselinu listovou, a dále o
165
multivitamínový přípravek GS Mamavit (400mg FA/tableta) obsahující celou řadu dalších
složek. V tabulce I jsou uvedeny výsledky stanovení FA s využitím obou testovaných
pracovních elektrod včetně relativních směrodatných odchylek vypočtených vždy z 5
opakovaných stanovení pro každou tabletu. Hodnoty stanovené s využitím m-AgSAE i
HMDE se velice blíží hodnotám deklarovaným výrobci preparátů a RSDS nepřekročila
v žádném případě 4 %. Na obr. 1 je uveden příklad stanovení FA metodou standardního
přídavku v tabletě Kyselina listová Forte.
-35
I [nA]
I [nA]
Tabulka I.
Stanovení kyseliny listové ve vybraných vitamínových přípravcích na HMDE a m-AgSAE
HMDE
m-AgSAE
stanoveno*
RSDS*
stanoveno*
RSDS*
[μg/tableta]
[%]
[μg/tableta]
[%]
GS Mamavit
399,48
2,33
398,8
3,88
Kyselina listová Super
400,46
2,36
398
1,81
Kyselina listová Forte
199,68
1,93
200,14
2,32
*
z 5-ti opakovaných stanovení
A
-100
-28
-80
-21
-60
-14
-40
-7
-20
0
0
-250
B
-300
-350
-400
-450
-450
-500
E [mV]
-500
-550
-600
-650
-700
E [mV]
Obr. 2. Příklad voltametrického stanovení FA v přípravku Kyselina listová Forte metodou
standardního přídavku s využitím m-AgSAE (A) a HMDE (B).
Závěr
V této práci bylo testováno voltametrické chování kyseliny listové s využitím rtuťovým
meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody ve srovnání s HMDE. Bylo
zjištěno, že stejně jako na HMDE poskytuje FA na amalgámové elektrodě v kyselém prostředí
3 redukční píky. V alkalickém prostředí ale na rozdíl od rtuťové elektrody nadává pík žádný,
protože zde nedochází k adsorpci. Na standardních roztocích byly navrženy optimální
podmínky pro stanovení kyseliny listové na m-AgSAE a vypočteny některé statistické
parametry, zejména pak detekční limit 4,39.10-10 M.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou Výzkumného záměru MSM 0021627502 a Výzkumného
centra LC06035.
Literatura
1. Le Gall A.C., van den Berg C.M.G.: Anal. Chim. Acta 282, 459 (1993).
2. Hampl F., Paleček J.: Farmakochemie. Vysoká škola chemicko-technologická, Praha
2002.
166
Rodriguesz-Bernaldo de Quiros A., Astro de Ron C., Polez-Hernandez J., Lage-Yusty
M.A.: J. Chromatogr. A 1032, 135 (2004).
4. Koufopantelis P., Georgakakou S., Kazanis M., Giaginis C., Margeli A., Papargiri S.,
Panderi I.: J. Chromatogr. B 877, 3850 (2009).
5. Rodriguez-Flores J., Castaneda-Penalvo G., Espinosa-Mensilla A., Rodriguez-Gomez
M.J.: J. Chromatogr. B 819, 141 (2005).
6. Hoegger D., Morier P., Vollet C., Heini D., Reymond F., Rossier J.S.: Anal. Bioanal.
Chem. 387, 267 (2007).
7. Wan Q., Yang N.: J. Electroanal. Chem. 527, 131 (2002).
8. Villamil M.J.F., Ordieres A.J.M., Garcia A.C., Blanco T.T.: Anal. Chim. Acta 273, 377
(1993).
9. Pavsic M.: Environ. Inter. 30, 761 (2004).
10. Vaze V.D., Srivastava A.K.: Electrochim. Acta 53, 1713 (2007).
11. Xiao F., Ruan C., Liu L., Yan R., Zhao F., Zeng B.: Senzore Actuators B 134, 895
(2008).
12. Novotný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000).
14. Meloun M., Militky J., Forina M.: Linear Regression Models. Chemometrics for
Analytical Chemistry. PC-Aided Regression and Related Methods. Ellis Horwod,
Chichester, 1992.
15. Dračka O.: Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
16. Trnková L.: Chem Listy 9, 518 (2001).
3.
167
Strange Redox Behavior of 1,1-Diamino-2,2-dinitroethene
(Zvláštní redox chování 1,1-diamin-2,2-dinitroethenu)
Ludmila Šimková, Jiří Ludvík, and Jiří Klíma
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Abstract
The expected product of polarographic reduction of 1,1-diamino-2,2-dinitroethene (FOX-7) in
aqueous buffered solutions is ethan-1,2-diamine. But exhaustive electrolysis did not show this
product. The main products are gases. Due to combination of electrochemistry and GC and
with MS analysis were found following gaseous products: N2, NO, N2O, H2O. However, no
carbon containing gaseous product was found. A part of products remains probably in the
water solution as inorganic ions. The degradation process accompanying the exhaustive
electrolysis seems to be analogous to the reactions during explosion, but under very low
concentration, cooled and slowed down by the solvent.
Key Words: 1,1-diamino-2,2-dinitroethene, FOX-7, Reduction, Polarography, Electrolysis,
degradation, Mechanism.
Úvod
Mezi významné organické molekuly s více redox centry, jejichž vzájemné interakce hrají
klíčovou roli v jejich vlastnostech, jsou výbušniny. Moderní výbušniny jsou zpravidla
molekuly, které nesou silně oxidativní a současně silně reduktivní centra. Aby mohly pracovat
za nepřístupu kyslíku, jejich žádanou reakcí není hoření, ale intramolekulární redox děj, kdy
je molekula sama sebou zoxidována, resp. zredukována za vzniku plynných produktů. Mezi
takovéto výbušniny můžeme zařadit i 1,1-diamino-2,2-dinitroethen (FOX-7) 1, 2, akronymem
DADNE případně DANE. Tato látka byla poprvé syntetizována v roce 1998. Jedná se
o energetický materiál s nízkou citlivostí a vysokým výkonem. Struktura této molekuly je
pozoruhodná především kombinací dvou geminálních snadno redukovatelných nitroskupin
v sousedství dvou silně elektrondonorních aminů. V molekule této látky dochází tak ke
stabilizaci elektronovou „push-pull“ delokalizací. Redoxní chování FOX-7 nebylo doposud
zkoumáno. První naše experimenty týkající se oxidace této látky ani v kapalném SO2
neukázaly žádné výsledky. Naopak redukce FOX-7 vykazuje zvláštní chování. Redoxní
chování látky FOX-7 jsme zkoumali pomocí elektrochemických technik. Byla provedena
polarografie na kapající i statické rtuťové kapkové elektrodě, coulometrická měření
a preparativní elektrolýzy jednak ve vodných pufrovaných roztocích tak i v nevodných,
aprotických roztocích (DMF, acetonitril). Vedle těchto technik byly k osvětlení mechanismu
redukce použity i plynová chromatografie, hmotnostní spektrometrie a spektrofotometrie.
H2N
NO2
H2N
NO2
1,1-diamino-2,2-dinitroethen
(FOX-7; DADNE; DANE)
Při polarografických a voltametrických experimentech bylo použito tříelektrodové zapojení:
pracovní elektroda – kapající příp. statická rtuťová elektroda, pomocná elektroda – platinový
plíšek a referentní elektroda – nasycená kalomelová elektroda. K měření sloužil Polarographic
analyzer PA 4 s xy-zapisovačem (Laboratorní přístroje Praha). Jako základní elektrolyty
168
sloužily vodné roztoky kyseliny sírové, pufry fosfátové (oblast pH 2–3, 5–8 a 10–11),
borátové (pH 8–10) a acetátové (pH 4–5), roztok hydroxidu sodného a 0,1 M roztok
hexafluorofosforečnanu
tetrabutylamonia
(TBATFP)
v
nevodných
roztocích
dimethylformamidu (DMF) případně acetonitrilu (AN). Měření probíhala v nedělené nádobce
o objemu 10 ml. Pro měření byl používán 0,01 M zásobní roztok FOX-7 v DMF, denně
čerstvý.
Elektrolýzy na velkoploché rtuťové elektrodě byly prováděny v nádobce typu H s odděleným
anodovým a katodovým prostorem. Koncentrace FOX-7 při měřeních na velkoploché
elektrodě nepřesahovala 0,05 mol/l. Vzhledem k omezené rozpustnosti FOX-7 ve vodě
elektrolyzovaný roztok v počáteční fázi elektrolýzy obsahoval nerozpuštěnou látku. Měření
byla provedena za potenciostatického režimu ve vodných roztocích kyseliny sírové
a v nevodných rozpouštědlech.
Při reduktivních elektrolýzách byly produkty analyzovány "on-line" pomocí kombinace GC
a MS. Propojení elektrolyzéru s plynovým chromatografem a hmotnostním spektrometrem
pomocí plastových hadiček bylo jak z prostoru u pracovní elektrody, tak i u pomocné
elektrody. V plynovém chromatografu vybaveném kolonou PLOT-Q byla využita jak metoda
TCD tak i FID.
Spektroskopická měření byla provedena na UV/VIS spektrofotometru Shimadzu UV1800.
Pro všechny experimenty byl používán denně čerstvý zásobní roztok FOX-7 v DMF
o koncentraci 0,01 mol/l.
Výsledky a diskuse
Redukce FOX-7 probíhá poměrně snadno. Její průběh je závislý na pH prostředí a na
koncentraci roztoku FOX-7. Redukce ve vodném prostředí probíhá až v osmi různých
redukčních ireverzibilních dějích, jejichž výskyt je ovlivněn pH prostředí, v němž redukce
probíhá. Součet limitních proudů jednotlivých redukčních vln odpovídá 18 elektronům. Lze
tedy předpokládat redukci až na ethan-1,2-diamin. Tento produkt se podařilo kvalitativně
prokázat jako produkt chemické redukce FOX-7 zinkem v kyselině chlorovodíkové.
V zásaditém prostředí bylo pozorováno zvláštní chování. Některé redukční děje vykazují
nelineární závislost na koncentraci FOX-7. Z porovnání průběhu polarografické redukce
FOX-7 s polarografickou redukcí podobných látek, obsahující strukturní motiv FOX-7, lze
konstatovat rozdílný průběh redukce v závislosti na pH, který je způsoben výskytem
molekuly FOX-7 v různých tautomerních formách v závislosti na pH.
H2N
NO2
OH- / - H 2O
H2N
NO2
H
+
HN
NO2
HN
NO2
H2N
NO2
H2N
NO2
kyselé pH
zásadité pH
Zatímco polarografická redukce FOX-7 ve vodném prostředí ukazuje na osmnáctielektronový
děj s ethan-1,2-diaminem jako hlavním produktem, výsledky reduktivní elektrolýzy na
velkoploché elektrodě tomu naprosto neodpovídají: spotřeba elektronů za těchto podmínek je
výrazně menší než při polarografické redukci (mezi 4 – 6 elektrony na molekulu). Překvapivá
je i nezávislost průběhu preparativní elektrolýzy roztoku FOX-7 v kyselém prostředí na volbě
potenciálu. Během elektrolýzy dojde vždy k úplnému rozkladu FOX-7, což bylo
elektrochemicky prokázáno klesáním proudu – úbytkem výchozí látky, a současně nárůstem
169
redukční vlny jednoho z produktů, kterým byl dusitanový anion (Obr. 1). V roztoku zbylém
po preparativní elektrolýze se ale nepodařilo identifikovat žádný organický produkt. Proto
byly pomocí kombinace elektrochemie/GC/MS analyzovány plynné produkty. Byly
prokázány následující plynné produkty: N2, NO, N2O, H2O (Obr. 2). Nepřítomnost NO2 mezi
plynnými produkty lze vysvětlit jednak tvorbou dusitanového aniontu, jednak zápornou
kyslíkovou bilancí (nedostatek kyslíku v molekule) látky FOX-7. Plynné produkty obsahující
uhlík, jako například CO, CO2, ani další těkavé produkty se pomocí zmíněné techniky
nepodařilo prokázat. Uhlíkaté produkty zřejmě zůstávají v roztoku jako anorganické ionty,
které nejsou těkavé a ani nejdou vytřepat do organických rozpouštědel.
Závislost limitních proudů na náboji
i [µA]
8
i1
i2
i6
i9
galvanostatický režim
(nerozpuštěná látka)
6
4
2
0
0
-50
-100
-150
-200
-250
-300 Q [C]
Obr. 1. Graf závislosti limitních proudů jednotlivých redukčních vln na prošlém náboji.
Elektrolýza FOX-7 v 0,5 M kyselině sírové.
250
NO2
N2O
O2
N2
NO
plocha píku
200
150
100
50
0
1
2
3 4
5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 cyklus
Obr. 2. Graf znázorňuje průběh vývoje plynů vznikajících během elektrolýzy FOX-7
v 0,1 M kys. sírové. Šipky v grafu ukazují, kdy byla spuštěna a kdy vypnuta elektrolýza.
Roztok získaný po elektrolýze byl dále podroben kvalitativní analýze na některé specifické
ionty. Pomocí Griessova-Lungova činidla 3 byla přítomnost dusitanových iontů dokázána.
Dále pak pomocí Nesslerova činidla byla prokázána i přítomnost amonných iontů.
V průběhu reduktivní elektrolýzy na velkoploché elektrodě v nevodném prostředí (DMF, AN)
dochází k barevným změnám. Tyto změny jsou zapříčiněny přítomností různých radikálových
meziproduktů, které v průběhu elektrolýzy FOX-7 vznikají a které jsou v aprotických
roztocích stálejší. Pozorované barevné změny se různí v závislosti na použitém rozpouštědle
(DMF, AN). Tento fakt podporuje i výsledek UV spektrometrie, která ukazuje rozdílnou
absorpci v daných rozpouštědlech (Obr. 3). Barevné změny se taktéž liší v závislosti na
potenciálu reduktivní elektrolýzy.
170
0,8
DMF
AN
0,7
0,6
Abs.
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
500
480
460
440
420
400
380
360
340
320
300
280
260
0
λ [nm]
Obr. 3. UV spektra roztoku FOX-7 o koncentraci 8x10-5 mol/l v acetonitrilu (AN) a v DMF.
Reduktivní elektrolýza na velkoploché elektrodě v aprotickém prostředí vykazuje ještě menší
spotřebu elektrionů na úplnou degradaci výchozí látky: 2 - 3 elektrony na molekulu. Tento
proces zřejmě probíhá přes řadu intramolekulárních redox reakcí za vzniku převážně
plynných produktů. Zde se nabízí podobnost tohoto samovolného elektrochemicky
iniciovaného děje vedoucího k úplnému rozložení látky FOX-7 s procesem exploze. Na
detailním objasnění mechanismu a na oprávněnosti tohoto porovnání se dále pracuje.
Závěr
Nová explozivní látka FOX-7 byla elektrochemicky zkoumána ve vodném i v nevodném
prostředí. Zatímco elektrochemická oxidace neprobíhá za experimentálních podmínek, které
byly k dispozici, elektrochemická redukce probíhá poměrně snadno. Byla zjištěna významná
nesrovnalost výsledků elektroanalytických experimentů (polarografie) s výsledky preparativní
elektrolýzy. Jak ve vodném, tak i v nevodném prostředí preparativní redukce sloučeniny
FOX-7 vedoucí k úplnému rozložení výchozí látky vykázala překvapivě malou spotřebu
elektronů a současně vznik různých plynných produktů, které byly jednotlivě prokázány. Toto
vše ukazuje na situaci, kdy primární příjem elektronu molekulou je startovacím mechanismem
řady následných intramolekulárních redox dějů, které vlastně mohou představovat analogii
k procesu exploze, která je zpomalená díky tomu, že probíhá ve zředěném roztoku.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou grantu KONTAKT (MŠMT) č. ME 09 002. Poděkování patří
Ing. Zdeňku Jalovému z Ústavu energetických materiálů FCHT Univerzity Pardubice, který
syntetizoval zkoumanou látku, a Ing. Petru Sazamovi, Ph.D. z Ústavu Fyzikální chemie
J. Heyrovského AV ČR z oddělení Struktury a dynamiky v katalýze za spolupráci při práci
s GC a MS.
Literatura
1. Latypov N. V., Bergman J., Langlet A., Wellmar U., Bemm U.: Tetrahedron 54, 11525
(1998).
2. Cibulka R.: Výzkumná zpráva k práci podle smlouvy č. 4621/2004/VÚPCH mezi
Explosia, a.s. a VŠCHT Praha, VŠCHT, Praha 2005.
3. Jander G., Blasius E.: Lehrbuch der analytischen und präparativen anorganischen
Chemie. S. Hirzel Verlag. Leipzig 1979.
171
A Study of Calixarene Self-assembled Monolayers on Gold Metal Surfaces
Barbora Šustrová a,b, Vladimír Mareček a, and Karel Štulík a,b
a
J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic; E-mail: [email protected]
b
Abstract
Substituted calix[4]arene molecules were self-assembled on the gold disk electrode surface
and the structure of the monolayer formed and the electrochemical behavior of the modified
electrode were studied. The formation of the calixarene self-assembled monolayer (SAM)
conformed to a Langmuir-type adsorption isotherm. The atomic force microscopy
measurement results indicated that the calixarene molecules form a stable monolayer on the
Au(111) surface and confirmed the cyclic voltammetry results concerning the SAM structure
dependence on the solvent used. Impedance measurements demonstrate that the capacity of
the modified electrode varies in the presence of ions, depending on their size and shape.
Key Words: Calix[4]arene; Self-assembled monolayer (SAM); Gold electrode; Ion transport;
Cyclic voltammetry (CV); Atomic force microscopy (AFM); Impedance measurement.
Introduction
Electrode modification is widely utilized to optimize many electrochemical analyses or to
design ion-selective electrodes (ISE). The main aim of the modification process is directed to
creating well defined, sufficiently stable and reproducible model systems, permitting
electrochemical measurements on the basis of which it is possible to lower the detection limits
and improve the selectivity of ISEs 1,2.
One of the ways of a surface modification is self-assembly. Self-assembled monolayers
(SAMs) are highly organized monomolecular layers that are spontaneously formed as
a consequence of immersing a solid surface into a solution consisting of amphiphilic
molecules 3. The rigidity of the SAMs depends on the strength of the chemical interactions
between the substrate (the surface of an electrode) and the adsorbate (mainly thiol-containing
compounds), as well as on the intermolecular interactions among the adsorbed molecules,
which hold the assembled layer together.
Calixarenes form one interesting group of synthetic macrocyclic molecules, which play an
important role in a wide variety of areas, such as host-guest chemistry, separation chemistry,
selective ion transport and sensing 4-8. The chalice shape of calixarene molecules, depending
on the number of aromatic parts or on the presence of heteroatoms in the molecule, makes
them convenient for incorporating into membranes as channels and involving them in
transport mechanisms. Accordingly, the modification of electrode surfaces with thiolated
calixarenes seems to be suitable for developing ion selective sensors and for studies of ion
transport across phase boundaries.
The calixarene molecule used in this study (Fig.1) contains four phenol groups, which are
substituted by mercaptopropyl groups at all the four –OH groups. The calixarene molecule
was covalently bonded to the gold electrode surface via these thiol groups and a compact
monolayer was formed on the electrode surface. The structure of the calixarene SAM was
analyzed by the atomic force microscopy (AFM) method and the changes in the electrode
properties were monitored by cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance
spectroscopy (EIS).
172
O O
HS
HS
O O
SH
SH
Fig. 1. The structure of the calix[4]arene molecule substituted by four –SH functional groups
on the lower rim.
Experimental
The gold electrode was mechanically polished with suspensions of 1.00 µm and then 0.05 µm
alumina particles and finally electrochemically activated by potential cycling in 0.1 M H2SO4
within an interval from -0.6 V to +1.4 V (scan rate, 0.5 V s-1), prior to each adsorption
process.
The SAM of thiol substituted calixarenes on the gold disk electrode was prepared without any
applied potential, by placing a cleaned, activated electrode into a calixarene solution (5 mM in
DMF) for 5 min.
The electrochemical cell consisted of a gold disk working electrode (1 mm in diameter), a
reference saturated calomel electrode (both purchased from Elektrochemické Detektory, s.r.o.,
Turnov, Czech Republic) and of a platinum wire auxiliary electrode. The electrochemical
measurements were performed using an Electrochemical Workstation CHI660C (IJ Cambria
Scientific, UK) with a CHI660C software. The properties of the bare and modified gold
electrode were determined using CV, in the supporting electrolytes of 0.1 M NaOH, 0.1 M
H2SO4, 0.1 M tetrabutylammonium chloride (TBACl) and 0.1 M NaCl aqueous solutions. The
conditions of the CV measurements: Each cyclic voltammogram was recorded after 10 min of
continuous stirring and degassing with nitrogen; the stirring was stopped during the
measurement. The scan-rates equaled 0.1 V.s-1 in all the supporting electrolytes. The scan
initial potential (Ein) was -0.4 or -0.8 V, vs. SCE, the scan reversal potential (EH) amounted to
1.5 or 1.2 V.
The selectivity for ions was estimated using EIS measurements in 0.1 M aqueous solutions of
NaCl and TBACl. The conditions of the EIS measurements: A sine-wave signal with a 5 mV
perturbation was applied within the 1-1000 Hz frequency range with 5 points per decade.
The calixarene SAM on the gold platelet Gold arrandeeTM / Au(111) (12 x 12 mm, Dr. Dirc
Schroer, Germany) was imaged by atomic force microscopy (Nanoscope IIIa, Veeco, USA) in
the tapping mode, using cantilevers OTESPA (Veeco, USA) with a resonant frequency of
~300 kHz to minimize the tip interaction with the surface examined. The gold-coated glass
platelets for AFM imaging were thermally annealed to form surface areas with prevailing 111
orientation prior to the calixarene adsorption. The calixarene SAM on the gold platelet was
prepared by dropping 10 µl of the calixarene solution (5 mM in DMF or 5 mM in chloroform)
onto the middle of the platelet; the adsorption time was 30 s. The platelet was then washed
173
with the clear solvent (DMF or chloroform), rinsed with deionized water and dried for 1 hour
in the air under laboratory temperature 9.
Our previous study dealt with the calixarene adsorption process 9. It has been concluded that
the self-assembly process is very fast and in good agreement with a Langmuir-type adsorption
isotherm. The comparison of two ways of the electrode modification has indicated that
adsorption without any applied potential from the calixarene DMF solution is the best to be
used.
The AFM images have shown the topography of the calixarene SAM on Au(111). The
calixarene molecules form globular aggregates, which are mono-disperse and their formation
is affected by the solvent used. The results of the section line analysis were in a good
agreement with the calculated molecular volume of 1.023 nm3 and with the literature 10,
where the molecular areas of calixarene derivatives were determined.
The electrochemistry at polycrystalline gold electrodes was described in the past 11,12. In our
work, we try to describe the electrochemical behavior of a calixarene modified gold electrode
and compare it with that of the bare electrode. The typical peak of gold oxides was formed in
an acidic solution of 0.1 M H2SO4 from 0.9 V (vs. SCE) and these oxides were reduced in the
potential range from 1.0 V to 0.4 V (vs. SCE) (Fig. 2). In comparison with the bare electrode
(not shown), there were small differences in the shape and size, the reduction peak was
smaller on the modified electrode in the first cycling scan, but in the following scans it
became to be similar. This behavior was also observed in the basic solution. During the
reduction scan, two separate peaks were observed (Fig. 2), corresponding to the reduction of
the oxide monolayer (Ep -0.07 V vs. SCE) and the subsequent reduction of hydrous oxides (Ep
-0.4 V vs. SCE).
I / μA
140
0.1 M NaOH
0.1 M H2SO4
80
20
-40
-100
-0.9
-0.5
-0.1
0.3
0.7
1.1
1.5
E / V (vs. SCE)
Fig 2. The cyclic voltammograms of oxide formation on the calixarene modified gold
electrode in acidic 0.1 M H2SO4 (thick line) and basic 0.1 M NaOH (thin line) solution
(Ein -0.8 V, -0.4 V respectively; EH 1.2 V, 1.5 V; scan rate 0.1 V·s-1).
174
A different behavior was observed with pH neutral electrolytes of salts (Fig. 3A and B). The
transport of the large TBA+ ions to the electrode surface was blocked by the calixarene SAM
in 0.1 M TBACl, causing a rapid decrease in the oxidation and reduction peak sizes (Fig. 3A),
which did not increase with increasing number of scans. In the first cyclic voltammetric scan
on the modified electrode, a reduction peak (Ep -0.03V vs. SCE) was observed, which
corresponded to the second reduction peak on the bare electrode, but did not appear in the
following scans. In the 0.1 M NaCl solution, the behavior was the same as that in acidic and
basic solutions (Fig. 3B), small differences between the bare and the modified electrode were
observed.
350
bare electrode
19
calixarene SAM - 1sc
I / μA
I / μA
30
A
calixarene SAM - 2sc
bare electrode
calixarene SAM
B
-0.5
0.3
250
8
150
-3
50
-14
-25
-0.9
-0.5
-0.1
0.3
0.7
1.1
1.5
E / V (vs. SCE)
-50
-0.9
-0.1
0.7
1.1
1.5
E / V (vs. SCE)
Fig. 3. The cyclic voltammograms of oxide formation and reduction on the bare gold
electrode (thick line) and on the calixarene modified gold electrode (the first scan in thin line
and the second scan in dashed line) in A) 0.1 M TBACl solution and B) in 0.1 M NaCl
solution (Ein -0.8 V; EH 1.5 V; scan rate 0.1 V·s-1).
The electrochemical impedance measurements indicated that the properties of the calixarene
SAM modified electrode will be affected by the presence of ions of various sizes, shapes and
charges. The calixarene used is not particularly selective for various ions, but its SAM on a
redox electrode should differentiate among ions from the point of view of their effect on the
properties of the electrode double layer. Smaller ions should enter the ligand cavity more
easily and thus affect the double-layer structure and capacity more than large ions which
cannot come close to the electrode surface. See Fig. 4 for the electrode double-layer capacity
dependence on the potential for TBA+ and Na+ ions, the electrode capacity in the presence of
the larger TBA+ ion is significantly lower, by 6.4 x 10-7 F at a potential of zero volt, than that
obtained in the presence of small Na+ ions 9.
Conclusions
The earlier measurements presented the conditions for the calixarene SAM formation and the
AFM images of the SAM structure. In this work, we tried to define the electrochemical
behavior of the calixarene modified electrode. In comparison with the bare electrode, there
were small differences in cyclic voltammograms, the shape and size of the oxidation and
reduction peaks, in acidic and basic supporting electrolytes. A different behavior was
observed with pH neutral electrolytes of salts, in which the transport of the large TBA+ ions to
the electrode surface was blocked by the calixarene SAM, as demonstrated by cyclic
voltammetry and electrochemical impedance measurements.
175
Cdl / μF
0.25
0.20
0.15
0.10
TBACl
0.05
0.00
-0.8
NaCl
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
E / V vs SCE
Fig. 4. A double-layer capacity dependence of the calixarene modified Au electrode on the
potential in 0.1 M NaCl and TBACl aqueous solutions 9.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Prof. Ing. Pavel Lhoták, CSc., of the Department of
Organic Chemistry, Institute of Chemical Technology (Czech Republic) for the calixarene
preparation and Ing. Pavel Janda, Csc., of the Department of Electrochemical Materials, J.
Heyrovsky Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i. (Czech Republic) for the AFM
measurement. Grant Agency of the Academy of Sciences, project No. IAA400400806, Grant
Agency of Charles University, project SVV 261204, and the Ministry of Education, Youth
and Sports of the Czech Republic, project No. MSM0021620857. are thanked for financial
support.
References
1. Malon A., Radu A., Qin W., Qin Y., Ceresa A., Maj-Zurawska M., Bakker E., Pretsch E.:
Anal. Chem. 75, 3865 (2003).
2. Qin W., Zwickl T., Pretsch E.: Anal. Chem. 72, 3236 (2000).
3. Mandler D., Turyan I.: Electroanalysis 8, 207 (1996).
4. Belhamel K., Nguyen T. K. D., Benamor M., Ludwig R.: Eur. J. Inorg. Chem. 4110
(2003).
5. Bocchinfuso G., Mazzuca C., Saracini C., Venanzi M., Micheli L., Palleschi G., Palleschi
A.: Microchim. Acta 163, 195 (2008).
6. Ding C., Qu K., Li Y., Hu K., Liu H., Ye B., Wu Y., Zhang S.: J. Chromatogr., A 1170,
73 (2007).
7. Komura T., Yamaguchi T., Kura K., Tanabe J.: J. Electroanal. Chem. 523, 126 (2002).
8. Ludwig R.: Microchim. Acta 152, 1 (2005).
9. Šustrová B., Štulík K., Mareček V., Janda P.: Electroanalysis, accepted (2010).
10. Yagi K., Khoo S. B., Sugawara M., Sakaki T., Shinkai S., Odashima K., Umezawa Y.: J.
Electroanal. Chem. 401, 65 (1996).
11. Burke L. D., Nugent P. F.: Gold Bull. 30 (1997).
12. Burke L. D., Nugent P. F.: J. Electroanal. Chem. 444, 19 (1998).
176
A 10-Years Anniversary of Bismuth Electrodes in Modern Instrumental Analysis
and Its Reflection within Electroanalytical Group at the University of Pardubice
(Desetileté výročí bismutových elektrod v moderní instrumentální analýze
a jeho reflexe u elektroanalytické skupiny Univerzity Pardubice)
Ivan Švancara, Lucie Baldrianová, Eva Tesařová, Radovan Metelka, and Karel Vytřas
Abstract
In this contribution, a retrospective overview (with 25 refs.) about bismuth electrodes is given
focused on the research activities of an electroanalytical group at the University of Pardubice
and its scientific collaboration with similarly oriented teams in the Middle Europe. Of interest
is the genesis of the individual periods covering the initial investigations, later advances, and
the respective achievements within the field, celebrating nowadays the 10-years anniversary.
Key Words: Bismuth electrodes, Environmentally friendly analysis, Retrospective overview.
Úvod aneb Ohlédnutí za průkopnickými roky
Začátkem letošních prázdnin tomu bude přesně deset let, co tehdy doktorand Samo Hočevar
ze slovinské Lublaně prezentoval na fóru mladých elektroanalytických chemiků ve Štýrském
Hradci sdělení s poněkud polemickým názvem „Může bismut nahradit rtuť v rozpouštěcí
voltametrii při měřeních stopových koncentrací těžkých kovů?“ 1, které ⎯ aniž by to tenkrát
někdo tušil ⎯ bylo vlastně prvopočátkem vzniku zcela nového oboru moderní elektroanalýzy.
Příslušné sdělení pro širší mezinárodní fórum pak vyšlo pár měsíců poté v prestižním
odborném časopise 2 a již dnes můžeme tuto původní práci zařadit mezi klasické příspěvky
moderní elektroanalýzy, neboť stála za vznikem dalších, cca dvou stovek tématicky
podobných příspěvků, a sama o sobě zaznamenala na 250 citačních ohlasů 3.
S odstupem času lze pocítit něco jako zadostiučinění, ale i hrdost, že právě elektroanalytická
skupina byla mezi prvními, kdo tenkrát vycítili potenciál bismutových elektrod, které byly pro
elektroanalytiku vlastně znovu objeveny. Své v tomto sehrála i skutečnost, že pracoviště
spoluobjevitele bismutových elektrod pro moderní elektroanalýzu, konkrétně Elektrochemická laboratoř na Národním ústavu chemie Lublaň - tehdy i dnes vedená Dr. B.
Ogorevcem - již tenkrát patřila k našim nejvýznamnějším vědecko-výzkumným partnerům.
Ale byla v tom také předvídavost vedoucího pardubické elektroanalytické skupiny, prof. Ing.
K. Vytřase, DrSc., který novou myšlenku vehementně propagoval a posléze i prosadil jako
nové nosné téma do jednoho z tehdejších vědecko-výzkumných programů, jež jsme na
přelomu tisíciletí sdíleli s obdobně orientovanými badateli z polského Krakova a již
zmíněného Štýrského Hradce. Již v průběhu roku 2001, a to víceméně paralelně na dvou
pracovištích Univerzity Pardubice a Karl-Franzens-Universität Graz, začaly laboratorní
deníky plnit první výsledky z měření na elektrodách modifikovaných povlaky bismutu, popř.
sloučeninami bismutu. V obou případech se jednalo o kvalitativně nové typy elektrod na bázi
bismutu, protože jakožto podpůrný elektrodový materiál byly na obou místech použity
oblíbené heterogenní uhlíkaté materiály – uhlíkové pasty a uhlíkové inkousty pro tištěné
elektrody. Pardubičtí ve spolupráci s polskou skupinou prof. Bobrowského a později i za
účasti řady diplomantů, včetně dvou kuvajtských studentů, preferovali spíše pasty, na které
bismutové povlaky vylučovali buď in situ, nebo ze speciálních pokovovacích roztoků 4-8. To
skupina prof. Kalchera v součinnosti s dvojicí litevských elektrochemiků věnovala pozornost
zejména objemově modifikovaným uhlíkovým inkoustům 9,10. Přes určitou dvoukolejnost
177
prováděných výzkumů však obě skupiny své postupy navzájem konzultovaly a koordinovaly,
přičemž série příslušných sdělení na sebe nenechala dlouho čekat 11-13.
Je potěšitelné, že i tyto příspěvky se postupně zařadily k pilířům nově vznikajícího oboru a
v současnosti patří mezi nejčastěji citované původní práce 3.
Další léta nového tisíciletí elektroanalýzy s bismutovými elektrodami v Pardubicích
Návazné práce vznikaly jak uvnitř pardubické skupiny (viz např. sdělení 14, které těžilo
z předchozích zkušeností s počítačem řízenou rozpouštěcí potenciometrií a studia podmínek
chemické oxidace), tak i v rámci pokračující spolupráce jak s domácími pracovišti (jmenovitě
první systematická studie mikroskopické struktury bismutových povlaků 15), tak i s již
vzpomínaným týmem ze Slovinska, kdy jsme společně navrhli nový druh elektrody na bázi
dispergovaného kovového prachu v uhlíkové pastě 16. První „pětiletka“ bismutových elektrod
na Univerzitě Pardubice byla završena referátem, který byl připraven pro českého čtenáře 17.
Obr. 1. Autentický záznam jednoho z úspěšnějších průkopnických experimentů s elektrodami
na bázi uhlíkové pasty s povlakem bismutu (podle 4).
Léta druhé poloviny prvního desetiletí nového milénia byla ve znamení prolínání stávající
spolupráce s kolegy ve Střední Evropě, ale i nově navázaných kontaktů s řeckými elektrochemiky z Aristotelovy univerzity v Soluni 18-22, či se skupinou ze španělského Burgasu 23.
V posledních letech se naše elektroanalytická skupina věnuje vedle bismutových elektrod i
podobným konfiguracím z kovového antimonu, kdy první příspěvky tohoto zaměření vznikly
opět ve spolupráci se slovinskými partnery 24,25. Paradoxně i toto „odbočení“ je dalším
důkazem významu elektroanalýzy s bismutovými elektrodami, neboť vedle svého největšího
přínosu ⎯ tzn., prosazování zásad „zelené instrumentální analýzy“ (měření za podmínek a
s výbavou šetřící životní prostředí) ⎯ je celý obor rovněž pobídkou pro nové aktivity typu
vývoje a testování elektrod s povlaky, vrstvami či disperzemi i z jiných kovů.
Závěr aneb Možné výhledy a směrování oboru v budoucnosti
Naznačený trend jakési inspirace je v současnosti nepřehlédnutelný, neboť vedle nových prací
o bismutových elektrodách se objevují stále častěji alternativní, popř. i konkurenční návrhy
dosud neznámých elektrod, senzorů a detektorů 3. Vedle antimonových elektrod (již kolem 15
publikací) jsou tu i olověné, cínové či kobaltové analogie a nejnověji i filmy z nekovových
prvků, jako např. selen. Lze tedy předpokládat, že toto speciální odvětví elektroanalýzy
s nertuťovými elektrodami budoucnost má, ať již se bude ubírat jakýmkoli směrem.
178
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR (projekt č.
MSM0021627502 a Výzkumné centrum, LC 06035). Poděkování rovněž patří všem, kteří
svým dílem přispěli k experimentální náplni uvedené přednášky.
Literatura
1. Hocevar S. B., Ogorevc B., Wang J.: YISAC’00: 7th Young Investigators’ Seminar on
Analytical Chemistry, Book of Abstracts, str. 19. UNI Graz, Graz (Rakousko) 2000.
2. Wang J., Lu J.-M., Hočevar S. B., Farias P. A. M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218
(2000).
3. Švancara I., Prior C., Hočevar S. B., Wang J.: Electroanalysis, 22 (2010), v tisku.
4. Švancara I., Metelka R., Jansová G., Vytřas K.: Moderní elektroanalytické metody XXI.,
Nedvědice, 24.- 26. duben 2001. Sborník přednášek, str. 18-19, ČSCH, Praha 2001.
5. Vytřas K., Švancara I., Metelka R.: Monitorování cizorodých látek v životním prostředí –
IV, Podivice, 27.-28. březen 2002. Sborník přednášek (Vytřas K., Kellner J., Fischer, J.;
Eds.), str. 159-170, Univerzita Pardubice, Pardubice 2002.
6. Švancara I., Metelka R., Seidlová J., Jansová G., Stibůrková M., Vytřas K., Pihlar B.: Sci.
Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 8, 19 (2002).
7. Fairouz M.: Diploma Thesis. University of Pardubice, Pardubice 2003.
8. Ismail Kh.: Diploma Thesis. University of Pardubice, Pardubice 2003.
9. Pauliukaite R., Kalcher K.: YISAC’01: 8th Young Investigators’ Seminar on Analytical
Chemistry, Book of Abstracts, str. 10-11. University of Pardubice, Pardubice 2001.
10. Pauliukaite R., Kalcher K.: US-CZ Workshop on Electrochemical Sensors Prague 2001
Book of Abstracts (Barek J., Drašar J., Eds.), str. 30-31, ČSCH, Praha, 2001.
11. Królicka A., Pauliukaitė R., Švancara I., Metelka R., Norkus E., Bobrowski A., Kalcher
K., Vytřas K.: Electrochem. Commun. 4, 193 (2002).
12. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Vytřas K., Norkus
E., Kalcher K.: Anal. Bioanal. Chem. 374, 1155 (2002).
13. Królicka A., Bobrowski A., Kalcher K., Mocák J., Švancara I., Vytřas K.: Electroanalysis 15, 1859 (2003).
14. Vytřas K., Švancara I., Metelka R.: Electroanalysis 14, 1359 (2002).
15. Švancara I., Baldrianová L., Vlček M., Metelka R., Vytřas K.: Electroanalysis 17, 120
(2005).
16. Hočevar S. B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Electrochim. Acta 51, 706 (2005).
17. Švancara I., Vytřas K.: Chem. Listy 100, 90 (2006).
18. Švancara I., Baldrianová L., Tesařová E., Hočevar S. B., Elsuccary S. A. A., Economou
A., Sotiropoulos S., Ogorevc B., Vytřas K.: Electroanalysis 18, 177 (2006).
19. Baldrianová L., Švancara I., Economou A., Sotiropoulos S.: Anal. Chim. Acta 580, 24
(2006).
20. Baldrianová L., Švancara I., Vlček M., Economou A., Sotiropoulos S.: Electrochim.
Acta, 52, 481 (2006).
21. Baldrianová L., Švancara I., Sotiropoulos S.: Anal. Chim. Acta 599, 249 (2007).
22. Baldrianová L., Agrafiotou P., Švancara I., Vytřas K., Sotiropoulos S.: Electrochem.
Commun. 10, 918 (2008).
23. Tesařová E., Heras A., Colina Á., Ruiz V., Švancara I., Vytřas K., López-Palacios J.:
Anal. Chim. Acta 608, 140 (2008).
24. Hočevar S. B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Anal. Chem. 79, 8639 (2007).
25. Švancara I., Hočevar S. B., Baldrianová L., Tesařová E., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ.
Pardubice, Ser. A 13, 5 (2007).
179
Non-mercury Film Electrodes in the Present day's Electrochemistry
(Nertuťové filmové elektrody v současné elektrochemii)
Eva Tesařová, Ivan Švancara, and Karel Vytřas
Abstract
At present, metal film electrodes are frequently used and popular electrochemical sensors.
Their characteristics differ from metal to metal, depending also on the target application. The
choice of a particular metal for the film preparation is nowadays quite wide and, except
mercury being rather controversial due to the toxicity of its compounds, one can select from
more than ten other metals potentially applicable in the film configuration. Among them,
gold, platinum, copper, and bismuth film electrodes belong to the most proved. Recently, also
lead and antimony film electrodes have been shown to offer some special employment in
electrochemical stripping analysis.
Key Words: Mercury-free electrodes and sensors, Metal films, Antimony film electrode,
Electrochemical stripping analysis.
Úvod
Moderní elektroanalýza byla dlouhou dobu spjata hlavně se rtuťovou kapkovou elektrodou
nebo dalšími pevnými převážně kovovými elektrodami. Vedle používání klasických
diskových elektrod, které v některých oblastech elektrochemie vydrželo dodnes, se již přes
padesát let setkáváme i s použitím filmových elektrod 1. Jedná se zejména o elektrody
s filmem rtuti (MFE), které se začaly používat jako náhražka za elektrody na bázi kapalné
rtuti. Jejich zavedení a dalšímu používání nahrával fakt, že k jejich vytvoření stačí jen malé
množství rtuťnaté soli a tudíž je zamezeno komplikované manipulaci s kapalnou rtutí, od
jejíhož používání se díky vysoké toxicitě stále více upouští.
Snaha co nejvíce vytěsnit používání rtuti však vedla ke zkoumání a testování dalších možných
čidel včetně dalších kovových filmových elektrod. Mezi oblíbené senzory dnes patří filmové
elektrody z ušlechtilých a zejména drahých kovů. Objevují se i práce, které používají filmové
elektrody z kovů méně tradičních, většinou používaných jako analyty, např. olovo, cín nebo
kobalt. V posledních letech se rozšiřuje i používání antimonových filmových elektrod, které
se díky možnosti měření v kyselých roztocích staly vhodným doplňkem k velmi populárním
bismutovým filmovým elektrodám, které již celé desetiletí nahrazují rtuťové elektrody při
mnoha aplikacích.
Elektroanalýza s nertuťovými filmovými elektrodami
Přehled kovových nertuťových filmových elektrod používaných v současné elektrochemii
můžeme začít například u filmů drahých kovů, z nichž nejběžnější jsou zlaté filmové elektrody
používané nejvíce pro stanovení elektropozitivnějších prvků jako jsou Bi, Sb, Sn, Cu, Se, As
a především Hg 2,3. Zlaté filmy se obvykle vytváří elektrodepozicí na substráty z uhlíkatých
materiálů (skelný uhlík, uhlíková pasta, nebo tištěné uhlíkové elektrody), ale i
neelektrolytické způsoby tvorby filmů jsou v případě zlata velmi časté. Stříbrné filmové
elektrody se v elektrochemii využívají pouze výjimečně 4, širší uplatnění našly v moderní
infračervené spektroskopii 5.
Platinové filmové elektrody se nejčastěji používají jako biosenzory 6,7. Na rozdíl od ostatních
filmových elektrod se k jejich tvorbě jen výjimečně používá elektrodepozice, daleko častější
180
je naprašování, vakuové napařování, nebo chemická depozice par na uhlíkové materiály;
popř. různé polymerní materiály. Stejné uplatnění jako platinové filmové elektrody, tedy jako
biosenzory, mají i elektrody modifikované filmy rhodia 7,8. Kromě tradičních analytů, jako
jsou glukóza nebo peroxid vodíku, se pomocí těchto elektrod stanovuje například
hydrochinon, pyrokatechol, adrenalin nebo dopamin 9. Filmy rhodia se vylučují elektrolyticky
převážně na uhlíkové substráty.
Dalším zástupcem filmových elektrod z ušlechtilých kovů jsou měděné filmové elektrody.
Tyto elektrody se též používají jako biosenzory 10 a to zejména v průtokových systémech, kde
je měděný film vytvářen ex situ na tištěných uhlíkových elektrodách. In situ vytvářené
měděné filmy na poli diamantových mikroelektrod byly použity jako senzory pro stanovení
dusičnanů 11. Současná depozice mědi a olova byla použita k vytvoření směsné filmové
elektrody ke stanovení kobaltu v přítomnosti dimethylglyoximu (DMG) 12. Stejným
mechanismem stanovení Co, popř. společně s Ni, se zabývají ještě další práce, ale tentokrát už
pouze na elektrodě s filmem olova, který je vyloučen na různých substrátech 13. Díky
dostatečné stabilitě olova v alkalických roztocích je možné vylučovat film in situ, což
urychluje a usnadňuje měření např. v průtokových systémech. Tato elektroda byla použita i
pro stanovení dalších kovů 14 a některých organických látek 15. Množství aplikací této
elektrody v poslední době stále roste, i když její použití je propagováno hlavně jednou
pracovní skupinou z Polska.
Kromě olova patří mezi netradiční zástupce kovů pro filmové elektrody i cín, kobalt nebo
gallium. V případě těchto elektrod se však jedná o ojedinělé aplikace. Cínová filmová
elektroda vyloučená in situ na skelném uhlíku sloužila k anodickému stripping stanovení Cr a
Cd 16. K použití cínu jako pracovní elektrody vedlo autory pouze blízké postavení Sn a Bi
v periodické tabulce. Kobaltová filmová elektroda vytvořená ex situ depozicí byla použita ke
stanovení dusitanů ve vodách 17 nebo ke stanovení fosfátů 18. Autoři v prvním případě
předpokládají podobný katalytický vliv kobaltu na stanovení dusitanů jako u komplexů
kobaltu s porfyrinem nebo ftalocyaninem při stanovení na uhlíkových elektrodách. Elektroda
s filmem gallia vyloučeným ex situ na substrátu ze skelného uhlíku byla použita pro stanovení
zinku v přítomnosti mědi 19. Tato práce využívá předešlých zkušeností jak lze přídavkem Ga
eliminovat interference mědi při stanovení Zn. (Gallium přednostně reaguje s mědí a tím
zabraňuje tvorbě intermetalické sloučeniny Zn-Cu, která jinak stanovení zinku ruší.)
V nedávné době rozšířila řadu kovových filmových elektrod i selenová filmová elektroda,
která byla využita ke stanovení mědi 20. Hnací silou při prekoncentračním kroku, který
zvyšuje citlivost stanovení, je údajně tvorba selenidu měďnatého.
Kromě všech kovových filmových elektrod vyjmenovaných výše jsou velice oblíbené a často
používané bismutové filmové elektrody (BiFE). Právě BiFE se staly vhodnou alternativou
k elektrodám rtuťovým, hlavně tedy rtuťové filmové elektrodě. Jejich úspěch je založen na
podobném mechanismu nahromadění stanovovaných kovů v podobě slitin (obdoba tvorby
amalgámů). Bismutové filmové elektrody letos slaví deset let od jejich prvního použití ve
stripping voltametrii 21, proto je jim věnována speciální pozornost v samostatném článku.
Velice podobné vlastnosti s bismutem má i další kov – antimon. Na této podobnosti bylo
založeno i jeho první testování, které bylo nakonec úspěšné a v roce 2007 byla poprvé
představena také antimonová filmová elektroda (SbFE) vyloučená in situ na skelném uhlíku
ke stanovení těžkých kovů v silně kyselých roztocích 22. Od té doby se testování SbFE věnuje
stále více autorů, o čemž svědčí rostoucí publikační aktivita. Kromě in situ vytvářených filmů
antimonu 23 se již objevily i práce s ex situ vytvořenými 24, naprašovanými 25 nebo makro-
181
porézními filmy 26. Prozatím je použití SbFE omezeno pouze na detekci kovů, ale jiné
aplikace na ni jistě ještě čekají.
Poděkování
Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České
Republiky (projekty MSM 0021627502 a LC 06035).
Literatura
1. Economou A. Fielden P. R.: Analyst (UK) 128, 205 (2003).
2. Švancara I., Kalcher K., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 3, 207 (1997).
3. Švancara I., Vytřas K., Bobrowski A., Kalcher K.: Talanta 58, 45 (2002).
4. Suturović Z.J., Marjanović N.J., Dokić P.P.: Electroanalysis 9, 572 (1997).
5. Delgado J.M., Orts J.M., Rodes A.: Electrochim. Acta 52, 4605 (2007).
6. Aschauer E., Fasching R., Urban G., Nicolussi G., Husinsky W.: J. Electroanal. Chem.
381, 143 (1995).
7. Wang J., Chen Q.: Anal. Chem. 66, 1007 (1994).
8. Miscoria S.A., Barrera G.D., Rivas G.A.: Sens. Actuators B 115, 205 (2006).
9. Shaidarova L.G., Gedmina A.V., Chelnokova I.A., Budnikov G.K.: J. Anal. Chem. 59,
1025 (2004).
10. Senthil Kumar A., Zen J.-M.: Electroanalysis 14, 671 (2002).
11. Ward-Jones S., Banks C.E., Simm A.O., Jiang L., Compton R.G.: Electroanalysis 17,
1806 (2005).
12. Grabarczyk M., Tyszczuk K., Korolczuk M.: Electroanalysis 18, 70 (2006).
13. Tyszczuk K., Korolczuk M.: Electroanalysis 19, 1539 (2007).
14. Korolczuk M., Tyszczuk K., Grabarczyk M.: Talanta 72, 957 (2007).
15. Tyszczuk K.: J. Pharm. Biomed. Anal. 49, 558 (2009).
16. Zhu W.W., Li N.B., Luo H.Q.: Talanta 72, 1733 (2007).
17. Soropogui K., Sigaud M., Vittori O.: Electroanalysis 19, 2559 (2007).
18. Lee J.-H., Lee W.H., Bishop P.L., Papautsky I.: J. Micromech. Microeng. 19, 025022
(2009).
19. Tyszczuk K., Korolczuk M., Grabarczyk M.: Talanta 71, 2098 (2007).
20. Nagaosa Y., Zong P., Kamio A.: Microchim. Acta 167, 241 (2009).
21. Wang J., Lu J., Hočevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000).
22. Hočevar S.B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Anal. Chem. 79, 8639 (2007).
23. Tesařová E., Baldrianová L., Hočevar S.B., Švancara I., Vytřas K., Ogorevc B.:
Electrochim. Acta 54, 1506 (2009).
24. Jovanovski V., Hočevar S.B., Ogorevc B.: Electroanalysis 21, 2321 (2009).
25. Kokkinos C., Economou A., Raptis I., Speliotis T.: Electrochem. Commun. 11, 250
(2009).
26. Urbanová V., Vytřas K., Kuhn A.: Electrochem. Commun. 12, 114 (2010).
182
Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection as Effective Tool for
the Monitoring of Biochemical and Physiological Processes
(Kapilární elektroforéza s bezkontaktní vodivostní detekcí jako účinný nástroj pro
monitorování rychlých biochemických a fyziologických procesů)
Petr Tůma and Eva Samcová
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology, Ruska 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic
Abstract
Capillary electrophoresis in combination with microdialysis was used to monitor fast
processes in living organisms. The biologically active compounds are detected by the
contactless conductivity detection. This approach enables to monitor free glycerol levels in
adipose tissue during a sporting activity. In another study the submicromolar concentration of
glycine in the central nervous system was measured.
Key Words: Capillary electrophoresis, Contactless conductivity detection, Microdialysis,
Glycerol, Glycine, Adipose tissue, Periaqueductal grey matter.
Úvod
Pro monitorování fyziologických a biochemických procesů probíhajících přímo v živých
organismech je vzorek odebírán pomocí mikrodialýzy 1. Princip této techniky je jednoduchý:
Dialyzační sonda opatřená membránou je zavedena do příslušného orgánu nebo tkáně.
V přesně lokalizovaném místě v organismu difundují sledované metabolity přes selektivní
membránu z okolní tkáně do fyziologického roztoku, který kontinuálně protéká
mikrodialyzační sondou. Pro zajištění vysoké účinnosti mikrodialýzy protéká fyziologický
roztok sondou nízkou rychlostí (0,1 – 1,0 µl.min-1) a pro následná chromatografická nebo
enzymatická stanovení je potřeba mikrodialyzát shromažďovat po dobu minimálně 5 –
15 min. Toto časové rozlišení je příliš hrubé pro monitorování rychlých chemických procesů.
Schopnost reprodukovatelně pracovat s velmi malým množstvím vzorku je typická pro
kapilární elektroforézu (CE) 2. Dávkované množství vzorku do separační kapiláry se v CE
pohybuje na úrovni několika desítek maximálně stovek nanolitrů. Tato skutečnost činí z CE
jednu z nejvýznamnějších metod používaných v neurovědách, protože umožňuje mapovat
prostorovou distribuci neurotransmiteru v CNS s rozlišením cca. 100 µm, popřípadě sledovat
časové změny v koncentraci neurotransmiteru v 10 s intervalech 3. V tomto příspěvku je
popsáno použití CE s bezkontaktní vodivostní detekcí při monitorování intenzity lipolýzy
v tukové tkáni v průběhu sportovního výkonu a při sledování uvolňování neurotransmiteru
bolesti v CNS jako odpovědi na lokální zánět.
Veškerá elektroforetická měření byla provedena na přístroji HP3DCE system (Agilent
Technologies, Waldbronn, Německo). Pro detekci sledovaných metabolitů byl použit
laboratorně vyvinutý bezkontaktně vodivostní detektor (CCD). CCD je tvořen dvěma
dvoumilimetrovými tubulárními elektrodami oddělenými jednomilimetrovou mezerou. CCD
pracuje při střídavém budícím signálu o frekvenci 1,25 MHz a amplitudě 50 V 4. Všechny
elektroforetické separace byly provedeny v nepokrytých křemenných kapilárách o vnějším
průměru 363 μm (Composite Metal Services, UK). Podrobné experimentální podmínky jsou
uvedeny v popisku jednotlivých obrázků. Všechny použité chemikálie dosahovaly
analytického stupně čistoty a pro přípravu separačních elektrolytů a zásobních roztoků
standardů byla použita deionizovaná voda (Millipore, Bedford, USA).
183
Výsledky a diskuse
a) Monitorování glycerolu v mikrodialyzátu tukové tkáně v průběhu jízdy na rotopedu
V průběhu sportovního výkonu dochází v tukové tkáni ke štěpení zásobních triacylglyceridů
na mastné kyseliny a glycerol. Ve vodě dobře rozpustný glycerol lze kontinuálně odebírat
pomocí mikrodialyzační sondy zavedené do břišní tukové tkáně a tímto způsobem
monitorovat míru lipolýzy 5. Pro stanovení glycerolu v mikrodialyzátu byla vyvinuta metoda
CE s CCD 6. Za optimalizovaných separačních podmínek (viz. obr. 1) dochází k úplnému
oddělení glycerolu od zóny elektroneutrálních látek v krátkém čase 3.0 min. Limit detekce
stanovení je 0,5 µmol.l-1, opakovatelnost metody pro deset po sobě následujících stanovení
glycerolu v mikrodialyzátu je 0,5 % pro migrační čas a 3,2 % pro plochu píku.
Obr. 1. CE/CCD elektroferogram mikrodialyzátu tukové tkáně: A – celý záznam, B – detail
zóny glycerolu. Identifikace píků: 1 – Na+, 2 – zóna elektroneutrálních látek, 3 – glycerol.
Experimentální podmínky: separační pufr, 60 mM H3BO3 + 30 mM LiOH (pH 6.1); kapilára,
vnitřní průměr 50 µm, celková délka 40 cm, délka k CCD 27 cm; úprava vzorku, 2,5 µl
mikrodialyzátu smícháno s 7,5 µl acetonitrilu; hydrodynamické dávkování tlakem 50 mbar po
dobu 6 s, separační napětí +10 kV.
Během fyziologické studie je testovaný jedinec nejprve v klidu (0 -100) min a poté jede na
rotopedu (100 – 160) min. Obsah glycerolu, který indikuje míru lipolýzy se v klidu udržuje na
konstantní bazální hladině 170 µmol.l-1. Po započetí fyzické námahy ve 100. min začne
hladina glycerolu postupně stoupat až na cca 340 µmol.l-1 po hodině jízdy na rotopedu, což
představuje dvojnásobek bazální hladiny (viz. sonda I v obr. 2). Lipolýzu lze účinně
akcelerovat lokálním podáním adrenalinu, který difunduje z mikrodialyzační sondy II do
okolní tukové tkáně v čase mezi (40 – 100) min experimentu. Od počátku podávání
adrenalinu v 60. minutě začíná lipolýza prudce stoupat z bazální klidové hladiny a tento trend
pokračuje i během následné jízdy na rotopedu, kdy již není adrenalin podáván (viz. sonda II v
obr. 2). Kombinace podání adrenalinu a jízda na rotopedu se projeví zvýšením hladiny
glycerolu až na 800 µmol.l-1, což je cca 5tinásobek bazální hladiny.
184
Obr. 2. Obsah glycerolu v mikrodialyzátu v průběhu jízdy na rotopedu: mikrodialyzační
sonda I = jízda na rotopedu (■); mikrodialyzační sonda II = jízda na rotopedu + lokální
aplikace adrenalinu (○).
b) Monitorování neurotransmiteru glycinu v periaqueduktální šedé hmotě v průběhu zánětu
Periaqueduktální šedá hmota (PAG) je oblast středního mozku, která reprezentuje jedno
z hlavních kontrolních center vnímání bolesti 7. Na zpracování bolestivé odpovědi v PAG se
vedle široce rozšířených neurotransmiterů (glutamát a kyselina γ-aminomáselná) významnou
mírou podílí i glycin. Glycin je důležitým inhibičním neurotransmiterem v míše a mozkovém
kmenu a z posledních studií vyplývá, že hraje velmi významnou roli při modulaci bolestivého
vjemu v PAG. Pro stanovení glycinu v mikrodialyzátu PAG byla vyvinuta metoda CE s CCD
s limitem detekce 0,2 µmol.l-1, když k analýze bylo použito pouhých 2,5 µL vzorku
mikrodialyzátu 8. Kromě glycinu lze v mikrodialyzátu sledovat další aminokyseliny: lysin,
histidin, arginin, alanin, leucin a glutamát (viz. obr. 3).
Obr. 3. CE/CCD elektroferogram mikrodialyzátu PAG. Identifikace píků: 1 – Na+, 2 – lysin, 3
– histidin, 4 – arginin, 5 – glycin, 6 – alanin, 7 – leucin, 8 - glutamát. Experimentální
podmínky: separační pufr, 1,7 M kyselina octová + 2 % polyethylenglykol (pH 2.1); kapilára,
vnitřní průměr 75 µm, celková délka 43 cm, délka k CCD 30 cm; úprava vzorku, 2,5 µL
mikrodialyzátu smícháno s 7,5 µL acetonitrilu; hydrodynamické dávkování tlakem 50 mbar
po dobu 60 s, separační napětí +20 kV.
Aplikace 1 % roztoku karagenanu do chodidla vyvolá v místě vpichu lokální zánět. Tento
bolestivý podnět se na neurochemické úrovni projeví zvýšenou hladinou glycinu v PAG. Po
185
aplikaci karagenanu je koncentrace glycinu v PAG 7krát vyšší v porovnání s kontrolní
skupinou (obr. 4). U potkanů s indukovaným zánětem se po perorálním podání paracetamolu
hladina glycinu snížila na polovinu původní koncentrace s tím, že tento pokles je statisticky
významný. Z této pilotní studie vyplývá, že lokální zánět a s ním spojený bolestivý vjem
vyvolá zvýšenou sekreci glycinu v CNS. Bolest lze účinně tlumit podáním paracetamolu,
který snižuje sekreci glycinu v CNS.
Obr. 4. Koncentrace glycinu v mikrodialyzátu PAG u jednotlivých skupin potkanů: kontrola
(■), zánět indukovaný karagenanem (●), karagenan + podání paracetamolu (○).
Závěr
Pomocí CE lze stanovovat biologicky aktivní látky v mikrolitrových objemech tělních tekutin,
čehož lze využít pro sledování rychlých biochemických a fyziologických procesů
probíhajících živých organismů. Použití CCD umožňuje provádět citlivou detekci na
submikromolární úrovni bez nutnosti derivatizace vzorku, což významně přispěje k rychlosti
celého stanovení. CE s CCD se tak stává velmi účinným nástrojem pro klinický výzkum.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekt
P206/10/1231).
Literatura
1. Dawson L. A.: J. Chromatogr. B 697, 89 (1997).
2. Lauer H. H., Rozing G. P.: High Performance Capillary Electrophoresis – A Primer.
Copyright Agilent Technologies, Germany 2009.
3. Bowser T. B., Kennedy R. T.: Electrophoresis 22, 3668 (2001).
4. Gaš B., Zuska J., Coufal P., van de Goor T.: Electrophoresis 23, 3520 (2002).
5. Arner P., Bolinder J., Eliasson A., Lundin A., Ungerstend U.: Am. J. Physiol. Endocrinol.
Metab. 255, E737 (1988).
6. Tůma P., Málková K., Weddelová Z., Samcová E., Štulík K.: Electrophoresis 31, in press
(2010).
7. Maione S., Marabese I., Sca Rossi F., Berrino L., Palazzo E., Trabace L., Rossi F.:
Neuroscience 97, 311 (2000).
8. Tůma P., Soukupová M., Samcová E., Štulík K.: Electrophoresis 30, 3436 (2009).
186
Monitoring DNA Modification by Platinum Complexes at Mercury electrodes
(Studium DNA modifikované komplexy platiny na rtuťových elektrodách)
Pavlína Vidláková a, Petra Horáková a,b, Lucie Těsnohlídková a,c, Luděk Havran a, Hana
Pivoňková a, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Královopolská 135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic,
b
Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
c
Česko-anglické gymnázium (The Anglo-Czech High School CAG) Třebízského 1010,
CZ-370 05 České Budějovice 6, Czech Republic
Abstract
Covalently attached metal-containing groups usually render the DNA well-pronounced
electrochemical activity related to redox processes of the metal moieties, which can in some
cases be coupled to catalytic hydrogen evolution at mercury electrodes. We used voltammetry
at the mercury electrodes for the monitoring of DNA modification with
cis-diamminedichloroplatinum (cisplatin), [(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioatoO,O')platinum(II)
(oxaliplatin)
and
cis-diammine(cyclobutane-1,1-dicarboxylateO,O')platinum(II) (carboplatin). In square-wave voltammetry, during anodic polarization after
pre-reduction of the platinated DNA, a well developed signal (peak P) was obtained. Intensity
of the peak P responded to the extent of DNA modification at rb = 0.01 – 0.10, where rb is the
number of platinum atoms bound per DNA nucleotide.
Key Words: Electrochemical analysis, Cisplatin, Oxaliplatin, Carboplatin, Antitumor drugs,
DNA.
Úvod
Elektroanalytické metody jsou využívány ke studiu přirozených i modifikovaných molekul
DNA 1-5 pro jejich relativně snadné provedení a nízké náklady. Při elektrochemickém studiu
struktury a reakcí nukleových kyselin jsou často používány elektrochemické značky
obsahující ve své struktuře organokovové sloučeniny 6-10. Kovalentně vázané molekuly
obsahující atomy kovů podléhají redoxním reakcím a přispívají tím k elektrochemické
aktivitě DNA. Reverzibilní redoxní odezva ferrocenových derivátů 11,12, osmiových a dalších
kovových komplexů 13-16, připravených chemickou syntézou oligonukleotidů 12, s využitím
modifikovaných nuleosidtrifosfátů 11,16,17 a DNA polymerázy nebo modifikací přirozené
DNA 7,13-15, mohou být měřeny na různých pracovních elektrodách. Při elektrochemické
redukci komplexních sloučenin platiny na rtuťových elektrodách dochází ke katalytickému
vylučování vodíku. Tento proces je možné využít pro citlivé stanovení modifikací DNA.
cis-diamminedichloroplatinum,
oxaliplatina
[(1R,2R)-cyclohexane-1,2Cisplatina
diamine](ethanedioato-O,O')platinum(II) a carboplatina cis-diammine(cyclobutane-1,1dicarboxylate-O,O')platinum(II) jsou v současná době jediné tři deriváty platiny, která se
používají v klinické praxi jako cytostatika pro léčbu různých druhů nádorů 22-24. Tyto látky se
mohou kovalentně vázat na molekuly nukleových kyselin a vytvářet různé adukty 24,25.
Nejčastějším vazebným místem platinových derivátů je guanin. Modifikace guaninu je možné
elektrochemicky studovat na rtuťových a uhlíkových elektrodách 3,4.
V naší práci byla použita voltametrická analýza na rtuťových elektrodách pro studium DNA
modifikované cisplatinou, carboplatinou a oxaliplatinou s využitím katalytického vylučování
vodíku doprovázející redoxní jevy u těchto aduktů.
187
Materiál a chemikálie
Superhelikální (sc) pBSK(-) DNA připravená dle popisu 25, cisplatina, carboplatina a
oxaliplatina od firmy Sigma, syntetické oligonukleotidy od firmy VBC Biotech, restrictikční
endonucleasa Msp I a T4 polynucleotid kinasa od firmy NEB, γ-32P-ATP firmy ICN.
Dynabeads® Oligo(dT)25 (DBT) a magnetický koncentrátor od firmy Invitrogen.
Modifikace DNA komplexy platiny
DNA byla inkubována s cisplatinou (carboplatinou nebo oxaliplatinou) v 0.1 M NaClO4 při
37 °C přes noc (obvykle jednořetězcová DNA z telecího brzlíku) ve tmě. Koncentrace DNA v
reakční směsi byla 20 μg ml-1; koncentrace cisplatiny (carboplatiny, oxaliplatiny) odpovídala
hodnotě rb (poměr cisplatina – nukleotid) 0,02 - 0,08.
Magnetoseparační proces
Alikvoty 20 μl DBT byly třikrát promyty 50 μl vazebným pufrem (0.3 M NaCl + 10 mM Tris,
pH 7.4), 40 μl vzorky obsahujících platinu byly následně inkubovány ve vazebném pufru v
termomixéru při 20 °C po 30 min, následovala vazba ODN na DBT. Poté byly kuličky
čtyřikrát promyty 50 μl vazebného pufru a přemístěny do 10 μl deionizované vody. ODN byly
z DBT uvolněny zahřátím na 85 °C po dobu 2 min. K ODN byl přidán 0,2 M NaCl a
následovala elektrochemická analýza.
Voltametrická měření
Voltametrická měření probíhala metodou adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie
AdTS 2,5 . Všechna měření byla prováděna na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The
Netherlands) spojeným s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém
zapojení (Ag/AgCl/3 M KCl jako referenční elektroda, platinový drátek jako pomocná
elektroda, inertní atmosféra argonu. Jako pracovní elektroda byla používána visící rtuťová
kapková elektroda HDME. Elektroda byla umístěna do 4 μl vzorku na dobu 60 s. Po
akumulaci byla opláchnuta destilovanou vodou a umístěna do měřící nádobky se základním
elektrolytem. Cyklická voltametrie - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0.0 V, potenciál obratu -1.85 V, scan rate 1
Vs1. Square wave voltametrie – základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál -1,85 V, konečný potenciál 0,0 V, frekvence
200 Hz, amplituda 50 mV, potential step 5 mV.
Výsledky a diskuse
Ke studiu modifikace DNA komplexy platiny byla používána square wave voltametrie a
cyklická voltametrie. V případě CV byly měřeny voltamogramy nemodifikované a silně
platinované DNA. V případě cyklického voltamogramu nemodifikované DNA byly naměřeny
dva signály příslušejí elektrochemickým reakcím bází DNA. Jedná se o katodický pík CA v
oblasti -1,5 V příslušející ireverzibilní redukci cytosinu a adeninu a pík G příslušející oxidaci
7,8-dihydrogenguaninu generovaného redukcí guaninu při potenciálech menších než
-1,6 V 2,5. V případě DNA modifikované cisplatinou dojde ve voltamogramu k viditelným
změnám. V katodické části dochází k růstu proudu v oblasti kolem -1,2 V. Negativní proud
dosahuje maxima v -1,75 V a tvoří široký pík. V anodické části voltamogramu jsou patrné tři
vlny (okolo -1.75, -1.45 a -1.3 V), v oblasti mezi -1,53 až -1,18 V má anodická část
voltamogramu stejnou polaritu jako katodická část. Toto chování souvisí s katalytickým
vyvíjením vodíku při s elektrochemických reakcích platinované složky DNA.
188
Pro podrobnější studii signálů příslušejících platinované DNA byla použita square wave
voltametrie. Byly naměřeny voltamogramy nemodifikované DNA a DNA modifikované
cisplatinou, oxaliplatinou a carboplatinou. Byla použita denaturovaná DNA z telecího brzlíku
platinovaná do různých rb (0,02, 0,04 a 0,08) (obr. 2-4). Ve voltamogramu DNA
modifikované platinovými komplexy jsou patrné dva signály, pík G v oblasti -0,26 V, který
koresponduje se signálem ve voltamogramu nemodifikované DNA a pík P v oblasti -1,25 V,
který je charakteristický pro platinou modifikovanou DNA. Intenzita tohoto píku
koresponduje se stupněm modifikace.
Obr. 1. Komplexní sloučeniny platiny používané jako cytostatika – cisplatina (A), oxaliplatina
(B) a carboplatina (C).
Obr. 2. Adsorptivní rozpouštěcí přenosové square wave voltamogramy DNA modifikované
cisplatinou. Délka akumulace 60 s, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál -1,85 V, konečný potenciál 0,0 V, frekvence
200 Hz, amplituda 50 mV, potential step 5 mV.
carboplatinou. Podmínky měření viz obr. 2.
189
oxaliplatinou. Podmínky měření viz obr. 2.
Závěr
V naší práci byla pomocí elektrochemických metod studována modifikace DNA komplexy
cisplatinou, oxaliplatinou a carboplatinou. Byla prokázána možnost analytického využití
katalytických proudů souvisejících s redoxními procesy platinované složky DNA v průběhu
anodické polarizace následující po pre-redukci platinou modifikované DNA na HMDE. Z této
studie vyplývá, že při modifikaci DNA cisplatinou je možné voltametricky stanovit i
modifikace do nízkého stupně (rb 0,01). U carboplatiny a oxaliplatiny je stanovení takto
nízkých stupňů modifikace obtížné.
Poděkování
Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA AVČR (IAA400040903, IAA500040701),
MŠMT ČR (LC06035), GAČR (203/07/1195) a ústavním výzkumným plánům Nos.
AV0Z50040507 a AV0Z50040702.
Literatura
1. Brabec V., Vetterl V., Vrana O.: In Experimental Techniques in Bioelectrochemistry
(Brabec V., Walz D., Milazzo G. ed.) Vol. 3, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland 1996.
2. Fojta M.: Collect Czech. Chem. Commun. 69, 715 (2004).
3. Palecek E., Scheller F., Wang J., (Eds): Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins
Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics. Elsevier, Amsterdam
2005.
4. Fojta M, Jelen F., Havran L., Palecek E.: Curr. Anal. Chem. 4, 250 (2008).
5. Palecek E., Jelen F.: In Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins Towards
Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang,
J., ed.), pp. 74-174, Elsevier, Amsterdam 2005.
6. Bernstein E. M. (Ed): Bioelectrochemistry Research Developments. Nova Publishers,
New York 2008.
7. Havran L., Vacek J., Cahova K., Fojta M.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 1751 (2008).
8. Labuda J., Fojta M., Jelen F., Palecek E.: In Encyclopedia of Sensors. (Grimes C. A.,
Dickey E. C., Pishko M. V., Eds.) Vol. 3 E-F, pp 201-228; American Scientific Publisher,
Stevenson Ranch 2006.
9. Wilner I., Katz E. (Eds): Bioelectronics. Wiley VCH, Weinheim 2005.
10. Palecek E., Fojta M.: Talanta 74, 276 (2007).
190
11. Brazdilova P., Vrabel M., Pohl R., Pivonkova H., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem.
Eur. J. 13, 9527 (2007).
12. Fan C., Plaxco K. W., Heeger A. J.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100, 9134 (2003).
13. Flechsig G. U.,Reske T.: Anal. Chem. 79, 2125 (2007).
14. Fojta M., Havran L., Kizek R., Billova S., Palecek E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985
(2004).
15. Fojta M., Kostecka P., Trefulka M., Havran L., Palecek E.: Anal. Chem. 79, 1022 (2007).
Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem. Eur. J. 15, 1144 (2009).
17. Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 6, 2233 (2008).
18. Trefulka M., Ferreyra N., Ostatna V., Fojta M., Rivas G., Palecek E.: Electroanalysis 19,
1334 (2007).
19. Reske T., Surkus A. E., Duwensee H., Flechsig G. U.: Microchim. Acta 166, 197 (2009).
20. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovsky M., Palecek E.: Electroanalysis 18, 186
(2006).
21. Palecek E., Trefulka M., Fojta M.: Electrochem. Commun. 11, 359 (2009).
22. Jelen F., Karlovsky P., Pecinka P., Makaturova, E., Palecek, E.: Gen. Physiol. Biophys.
10, 461 (1991).
23. Palecek E: In Methods in Enzymology (Abelson J. N., Simon M. I., Eds), Vol. 212, pp.
139-155, Academic Press, New York 1992.
24. Kasparkova J., Fojta M., Farrell N., Brabec V.: Nucleic Acids Res. 32, 5546 (2004).
25. Fojta M., Palecek E.: Anal. Chim. Acta, 342, 1 (1997).
191
Voltammetric Determination of Selected Biologically Active Nitro Compounds at a
Polished Silver Solid Amalgam Composite Electrode
Vlastimil Vyskočil, Jan Dědík, Zuzana Krejčová, Lucie Škvorová, Aleš Daňhel,
and Jiří Barek
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, CZ-12843
Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Polished silver solid amalgam composite electrode was tested as an electroanalytical sensor
for voltammetric determination of selected biologically active nitro compounds using
2-nitrofluorene, 5-nitrobenzimidazole, picric acid, and metronidazole as model compounds.
The optimum conditions have been investigated in aqueous or methanolic-aqueous media
containing Britton-Robinson buffer. It was found that this electrode can be used for direct
current voltammetric and differential pulse voltammetric determination of micromolar
concentrations of 2-nitrofluorene, picric acid and metronidazole, whereas an attempt to
determine 5-nitrobezimidazole reproducibly was not successful. Limit of quantification and
other figures of merits are dependent on the substance to be determined.
Key Words: Polished silver solid amalgam composite electrode, Direct current voltammetry,
Differential pulse voltammetry, Nitro compounds, 2-Nitrofluorene, 5-Nitrobenzimidazole,
Picric acid, Metronidazole.
Introduction
Voltammetry is among the most frequently used electroanalytical method. It is especially
suitable for large scale environmental monitoring of electrochemically active pollutants in
various types of matrices, because it is inexpensive, extremely sensitive, suitable for
speciation, and it presents an independent alternative to so far prevalent spectrometric and
separation techniques 1. The crucial and fundamental problem in practical application of
voltammetry is the choice of a suitable working electrode. Solid amalgam electrodes represent
a suitable alternative to mercury electrodes 2 due to their similar electrochemical properties
and non-toxicity of the amalgam material 3,4. For example, a polished silver solid amalgam
composite electrode (p-AgSA-CE) 5, 6 (see Fig. 1) represents non-toxic voltammetric sensor
with many advantages such as good mechanical stability, simple handling and regeneration
including an electrochemical pretreatment. This electrode is prepared from silver amalgam
powder and epoxy resin, and represents combination of solid composite electrode and solid
amalgam electrode. The surface of p-AgSA-CE must be adjusted into a suitable form, e.g., by
polishing by emery papers of various granulity and finally with velvet. Similar polishing must
be performed in case of any mechanical surface damage or if it is not possible to remove
some adsorbed compound electrochemically 5, 6.
The p-AgSA-CE was tested as an electroanalytical sensor for DC voltammetric (DCV) and
differential pulse voltammetric (DPV) determination of selected organic biologically active
nitro compounds with different type of carbon skeleton. Genotoxic environmental pollutant
2-nitrofluorene 7, well-known explosive picric acid 8 (2,4,6-trinitrophenol), genotoxic
pollutant and drug precursor 5-nitrobenzimidazole 9, and nitroimidazole antibiotic and
antiprotozoal metronidazole 10 [2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethanol] were used as
tested substances. The attention has been paid primarily to investigation of voltammetric
behavior of studied compounds at p-AgSA-CE and to study of influence of supporting
electrolytes used. Strong acidity, basicity or water/methanol ratio can negatively affect the
electrode surface, since amalgam composite contains an epoxy resin. The linearity in
192
voltammetric response of studied compounds in dependence on their concentration was also
studied.
5
A
B
4
3
2
1
Fig. 1. Scheme of p-AgSA-CE (A) and the detailed photo of polished electrode surface (B).
1 – composite mixture of silver amalgam and epoxy resin; 2 – copper wire; 3 – glass tube; 4 –
plastic fixture to the analyzer; 5 – electronic contact.
Experimental
The stock solution of 5-nitrobenzimidazole (CAS Number: 94-52-0, 98%; Sigma-Aldrich,
Prague, Czech Republic), picric acid (CAS Number: 88-89-1; purity not given; Lachema,
Brno, Czech Republic), and metronidazole (CAS Number: 443-48-1; purity not given; SigmaAldrich), all of concentration 1×10–3 mol L–1, were prepared by dissolving the appropriate
pure substance in 100.0 mL of deionized water. The stock solution of 2-nitrofluorene (CAS
Number: 607-57-8; 98%; Sigma-Aldrich) of concentration 1×10–3 mol L–1 was prepared by
dissolving the appropriate pure substance in 100.0 mL of methanol (99%, p.a. purity;
Lachema). More dilute solutions were prepared by diluting the stock solutions with deionized
water or methanol. The Britton-Robinson (BR) buffers were prepared in a usual way, i.e., by
mixing a solution of 0.04 mol L–1 in phosphoric acid, 0.04 mol L–1 in acetic acid and
0.04 mol L–1 in boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol L–1 sodium hydroxide
solution (all p.a. purity; Lachema, Brno, Czech Republic). The other chemicals (hydrochloric
acid, potassium chloride, all of p.a. purity grade) were supplied by Lachema. Deionized water
was produced by Milli-Qplus system (Millipore, Billerica, USA). All the chemicals were used
without further purification and all the solutions were maintained in glass vessels in dark at
laboratory temperature.
The voltammetric measurements were performed using an Eco-Tribo Polarograph driven by
PolarPro 5.1 software (both Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The software worked
under the operational system Microsoft Windows XP Professional (Microsoft Corporation,
Redmond, USA). The voltammetric measurements were carried out in a three-electrode
193
system – a platinum auxiliary electrode PPE, a RAE 113 (1 mol L–1 KCl) Ag/AgCl reference
electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) and a p-AgSA-CE (the disc diameter,
2.9 mm, and the disc area, 6.6 mm2; EcoTrend Plus, Prague, Czech Republic) as working
electrode. The scan rate, 20 mV s–1, were used; the pulse amplitude, –50 mV, and pulse width,
100 ms, were used in DPV, with current sampling for last 20 ms. The solution pH was
measured by Conductivity & pH meter 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined
glass electrode (type 924 005).
Before starting the work, as well as after electrode passivation or every break in the
voltammetric measurements longer than 1 hour, the electrochemical activation of p-AgSA-CE
was carried out in 0.2 mol L–1 KCl at –2200 mV under stirring for 300 s followed by rinsing
with deionized water. Unless stated otherwise, the general voltammetric procedure was as
follows: An appropriate amount of the stock solution of the tested substance in deionized
water or methanol was placed in a 10.0 mL volumetric flask, the system was diluted to
volume with BR buffer of the required pH and transferred into the voltammetric cell. Oxygen
was removed by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for
5 min and the voltammogram at p-AgSA-CE was recorded. Regeneration of p-AgSA-CE 5, 6
lasting about 30 s preceded each measurement (except for the investigation of p-AgSA-CE
passivation during measurements without regeneration).
The influence of pH on the DC and DP voltammograms of 2-nitrofluorene was investigated at
p-AgSA-CE in BR buffer – methanol (1:1) medium in the BR buffer pH range 2.0 – 13.0.
One well-shaped irreversible cathodic peak of 2-nitrofluorene reduction was observed in
whole pH range and its peak potential shifted towards more negative potentials with
increasing pH. On the basis of similar results of 2-nitrofluorene reduction obtained at a
mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) 11, this peak was
assigned to four-electron reduction of nitro group of 2-nitrofluorene to hydroxyamino group.
The concentration dependences were measured under optimum conditions (identical for both,
DCV and DPV): methanol – BR buffer pH 5.0 (1:1). Limit of quantification (LQ) was
4×10–6 mol L–1 for DCV and 3×10–6 mol L–1 for DPV at p-AgSA-CE. Because of probable
corrosion of epoxy resin at the surface of p-AgSA-CE caused by methanol, as further model
nitro compounds (5-nitrobenzimidazole, picric acid and metronidazole) were selected
substances soluble in water. This corrosion resulted in adsorption of 2-nitrofluorene on
electrode surface, which led to the determination of residual concentrations of 2-nitrofluorene
even in pure supporting electrolyte. It was thus more complicated to evaluate voltammetric
responses of trace amounts of 2-nitrofluorene.
Although 5-nitrobenzimidazole gave significant voltammetric response (from one to four DC
or DP voltammetric peaks) over a whole pH region investigated (BR buffers pH 2.0 – 13.0),
its voltammetric determination in dependence on the analyte concentration was not
successful. The best developed DC and DP peaks were obtained in the BR buffer pH 5.0
medium, which was further used for measuring of calibration curves. However, the
voltammetric response of 5-nitrobenzimidazole was not reproducible in time and the
p-AgSA-CE characteristics were visibly deteriorated during consecutive measurements.
Moreover, thorough polishing of electrode surface led only to temporary improvement of
voltammetric responses. This effect, which will be the subject of our further investigations, is
probably caused by strong complexing capability of 5-nitrobenzimidazole which results in
complexing of silver or mercury from electrode surface and electrode degradation.
194
The variability of DC voltammograms of picric acid at p-AgSA-CE in the pH range of 2.0 –
13.0 in BR buffer (see Fig. 2-A) have shown that clear reduction peaks were obtained for pH
2.0 – 5.0. At neutral to alkaline media (pH 6.0 – 13.0), DC voltammograms took the shape of
sigmoidal waves. The well-defined and regular reduction DP voltammetric peaks were
obtained also in acidic solutions only (pH 2.0 – 5.0). For our further experiments, the
universal BR buffer pH 2.0 and regeneration potentials E1,reg = +200 mV and E2,reg = –950
mV were evaluated as optimum conditions. Under these conditions, the DCV (for illustration,
see Fig. 2-B) and DPV calibration curves were measured over concentration ranges from
1×10–7 to 1×10–4 mol L–1, with LQs 1×10–7 mol L–1 for DCV and 5×10–7 mol L–1 for DPV at
p-AgSA-CE.
Metronidazole yielded one DC and DP voltammetric peak over the whole pH region, similar
to its behavior at mercury electrodes 12. This voltammetric peak corresponds to irreversible
four-electron reduction of the nitro group to the hydroxyamino group 13. The peak potential
values of all thus observed peaks shifted toward more negative potentials with increasing pH.
This shift can be explained by preliminary protonation of the test substances leading to a
decrease in the electron density at the nitrogen atom and resulting in easier electron
acceptance at low pH values. Optimum conditions for both DC and DP voltammetric
determination at p-AgSA-CE were found to be BR buffer pH 10.0 and regeneration potentials
E1,reg = –100 mV and E2,reg = –1500 mV. Under these optimum conditions, reached LQs were
found to be in the 10–6 mol L–1 concentration range.
-1600
-400
A
2
3
-300
Ip, nA
1
-1200
-250
B
7
5
6
I, nA
I, nA
4
-400
-100
0
0
5
-200
-150
-50
6
-800
-200
2
4
6
8 10
-1
c, μmol L
4
3
-100
2
1
0
0
-400
-800
0
200
-1200
E, mV
0
-200
-400
-600
-800
E, mV
Fig. 2. (A) Selected DC voltammograms of picric acid (c = 1×10–4 mol L–1) at p-AgSA-CE in
the BR buffer medium; the BR buffer pH: 2.0 (1), 4.0 (2), 6.0 (3), 8.0 (4), 10.0 (5), and 12.0
(6); polarization rate, 20 mV s–1. (B) DC voltammograms of picric acid at p-AgSA-CE in BR
buffer pH 2.0 medium; concentrations measured: 0 (1), 1 (2), 2 (3), 4 (4), 6 (5) 8 (6), and 10
(7) µmol L–1; polarization rate, 20 mV s–1, regeneration potentials, E1,reg = +200 mV and E2,reg
= –950 mV. The corresponding calibration straight line is in the inset. The confidence bands
are constructed for α = 0.05.
Conclusions
In this contribution, polished silver solid amalgam composite electrode (p-AgSA-CE) has
been tested as an electroanalytical sensor for voltammetric determination of various
biologically active organic compounds containing electrochemically reducible nitro group.
Optimum conditions for voltammetric determination – using direct current voltammetry
195
(DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) – were found to be Britton-Robinson buffer
pH 5.0 – methanol (1:1) (for DCV and DPV of 2-nitrofluorene), Britton-Robinson buffer pH
2.0 (for DCV and DPV of picric acid), and Britton-Robinson buffer pH 10.0 (for DCV and
DPV of metronidazole). Under these conditions, limits of quantification were found to be
mostly in the 10–6 mol L–1 concentration range. Although 5-nitrobenzimidazole gave
significant voltammetric response over a whole pH region investigated, its voltammetric
determination was not successful probably because of strong complexing capability of
5-nitrobenzimidazole, which results in complexing of silver or mercury from electrode
surface and electrode degradation.
Acknowledgements
Financial support of this work, provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of
the Czech Republic (Projects LC 06035, MSM 0021620857, and RP 14/63) and by the Grant
Agency of Charles University in Prague (Projects 89710/2010/B-Ch/PrF and SVV 261204) is
gratefully acknowledged.
References
1. Wang J.: Analytical Electrochemistry. John Wiley & Sons, 3rd ed., Hoboken 2006.
2. Vyskocil V., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 173 (2009).
4. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.:
Electroanalysis 21, 303 (2009).
5. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009).
6. Yosypchuk B., Navratil T., Lukina A. N., Peckova K., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw)
52, 897 (2007).
7. Vyskocil V., Labuda J., Barek J.: Anal. Bioanal. Chem. 397, 233 (2010).
8. Zimmermann Y., Broekaert J. A. C.: Anal. Bioanal. Chem. 383, 998 (2005).
9. Deylova D., Barek J., Vyskocil V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1443 (2009).
10. Jiang X. H., Lin X. Q.: Bioelectrochemistry 68, 206 (2006).
11. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, in press (2010).
12. El-Sayed G. O.: Microchem. J. 55, 110 (1997).
13. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009).
196
Electrochemical Properties of Thiol Monolayer at Surfaces of Different Electrodes
(Elektrochemické vlastnosti thiolové monovrstvy na povrchu různých elektrod)
Bogdan Yosypchuk and Vladimír Mareček
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i.
Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Solid amalgam electrodes covered by a mercury meniscus or by a mercury film (m-AgSAE,
MF-AgSAE, m-CuSAE, m-BiAgSAE and m-CdSAE) are convenient for obtaining thiol films
which are bound to different metals. By choosing an appropriate metal for the amalgam
preparation, a thiol monolayer can be created which is stable in the given potential range.
After a short accumulation time (1−2 min), the area of the reduction peak (charge) practically
does not change if the monolayer is created from 1 mM thiol solution. Statistical results based
on many times repeated formation and desorption of thiol monolayers (RSD = 2−3 %) attest
that the stationary SAEs are convenient tools for study of electrochemical properties of thiol
films.
Key Words: Thiolate monolayer, Reductive desorption, Voltammetry, Amalgam electrodes.
Úvod
Jako podložka pro vytvoření monovrstvy thiolu se tradičně používá rtuť, zlato či stříbro.
Největší výhodou rtuti je její ideálně rovný povrch, který zajišťuje získání monovrstvy
prakticky neobsahující žádné defekty 1. Pevné amalgámy různých kovů se dobře smáčí rtuti, a
proto lze připravit elektrody pokryté meniskem (m-MeSAE) nebo filmem (MF-MeSAE; kde
Me – Ag, Au, Cu, Bi, Cd aj.) nasyceného kapalného amalgámu příslušného kovu 2-5. Afinita
těžkých kovů tvořících amalgám k síře je velká a za určitých podmínek lze navázat thiol na
zvolený kov. Vzhledem k tomu, že vlastnosti monovrstvy jsou ovlivněny vazbou kov-síra,
použití amalgámů různého složení vede k vytvoření monovrstvy thiolu, která je stabilní ve
definovaném rozsahu potenciálů. Elektrochemické studium vlastností thiolových monovrstev
na elektrodách o různém složení bylo hlavním cílem této práce.
Voltametrická měření byla prováděna s využitím počítačového Eco-Tribo Polarografu
PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha) v režimu cyklické voltametrie (CV). Pro řízení analyzátoru a
hodnocení výsledků měření byl použit software MultiElchem v. 2.1 (Ústav fyzikální chemie
J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.). Pracovními elektrodami (WE) byly rtuťovým meniskem a
rtuťovým filmem pokryté pevné amalgámové elektrody: m-AgSAE (plocha A =
0,00604 cm2), MF-AgSAE (A = 0,00358 cm2), m-CuSAE (A = 0,00466 cm2), m-BiAgSAE
(A = 0,00842 cm2) a m-CdSAE (A = 0,00725 cm2). Pro srovnání výsledků měření byla použita
HMDE (A = 0,00618 cm2). Jako referentní sloužila nasycená kalomelová elektroda (SCE),
vůči níž jsou uváděny všechny hodnoty potenciálů. Pomocnou elektrodu tvořil Pt drátek o
průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Vzdušný kyslík byl z roztoků odstraňován probubláváním
dusíkem. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Pro přípravu roztoků byla použita
voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny použité chemikálie byly čistoty p. a.
Výsledky a diskuse
Vytvoření filmů thiolátek na povrchu různých elektrod se často provádí v alkalických
roztocích. Toto prostředí je vhodné i pro srovnání vlastností rtuťových a amalgámových
elektrod, které mají v zásaditých roztocích přibližně stejné přepětí vodíku. Pro testování
různých WE byla zvolena kyselina thioundekanová HS(CH2)10COOH, která je v zásaditém
prostředí disociovaná a při navázání na elektrodu vytváří záporně nabitý povrch. Takto nabité
197
skupiny se budou v kompaktním filmu vzájemně odpuzovat a tím se může zmenšit povrchová
koncentrace thiolu. Na druhou stranu, nabitý povrch by měl zamezit tvorbě vícevrstevných
filmů. Pro zajištění plné rozpustnosti zvolené thiolátky i ve větších koncentracích, byl vodný
roztok 1M NaOH smíchán s ethanolem v poměru 1:1. Reprodukovatelnost elektrochemické
tvorby monovrstev thiolu v takto připraveném elektrolytu byla nejlepší ve srovnání
s kyselými a s méně alkalickými roztoky.
Použité amalgámové elektrody (MF-AgSAE, m-AgSAE, m-BiAgSAE, m-CuSAE,
m-CdSAE) jsou pokryty nasyceným kapalným amalgámem kovů tvořících materiál elektrody.
Za určitých podmínek tyto kovy, podobně jako rtuť, mohou tvořit kovalentní vazby se sírou.
Během následující redukce se každý kov může prokázat „svým“ píkem. Pří vysokých
koncentracích thiolu v roztoku (10-4 – 10-3 mol⋅l-1) se „stříbrný“ pík neprojevuje a stříbrné
amalgámové elektrody jsou velice podobné HMDE. Na Obr. 1 jsou znázorněny typické
cyklické voltamogramy thiolu po jeho elektrochemické akumulaci na povrchu různých WE.
Potenciál desorpčního píku na stříbrných amalgámách je velmi blízký potenciálu na HMDE,
což nasvědčuje tomu, že na těchto elektrodách síra thiolu přednostně tvoří kovalentní vazbu
se rtutí. Podobné, ale ne tak úzké desorpční píky (Ep = −835 mV, šířka píku v polovině výšky
W1/2 = 19,6 mV; není znázorněno) byly získány i na pevném vyleštěném povrchu p-AgSAE.
Jiné chování prokazují m-BiAgSAE, m-CuSAE a m-CdSAE, které na rozdíl od stříbrných
amalgámů obsahují kov elektrochemicky aktivnější než rtuť. Píky redukční desorpce thiolátky
z těchto elektrod se nachází v podstatně negativnější oblasti potenciálů. Posuv desorpčních
píků je vyvolán tím, že síra tvoří kovalentní vazby nikoliv se rtutí, ale s bismutem, mědí nebo
s kadmiem. Kationy těchto kovů se redukují při negativnějších potenciálech, než rtuť.
Uvedené odlišnosti různých amalgámových elektrod určují polohu potenciálového okna, ve
kterém monovrstva thiolátky je stabilní. Různá poloha tohoto potenciálového okna dovoluje
studovat vlastnosti monovrstvy vůči většímu počtu elektrochemicky aktivních látek
nacházejícím se buď v roztoku, nebo na povrchu monovrstvy.
HMDE
E p-cat = -837 mV
m-AgSAE
m-BiAgSAE E p-cat = -1079 mV
m-CuSAE
E p-cat = -1115 mV
E p-cat = -861 mV
m-CdSAE
E p-cat = -1251 mV
120
m-CuSAE
-2
MF-AgSAE E p-cat = -846 mV
m-AgSAE
Q , µC cm
i, μA cm
-2
-9000
m-CdSAE
HMDE
-4000
60
MF-AgSAE
m-BiAgSAE
0
1000
-900
E, mV
-1400
-400
-800
E ac, mV
-1200
Obr. 1. Cyklické voltamogramy HS(CH2)10COOH na různých pracovních elektrodách.
Základní elektrolyt (ZE): 0,5M NaOH, 48 % ethanol; koncentrace HS(CH2)10COOH
c = 1×10-3 mol l-1; potenciál akumulace Eac = −1050 mV pro m-CdSAE, Eac = −750 mV pro
m-BiAgSAE a m-CuSAE, Eac = −350 mV pro jiné elektrody; doba akumulace tac = 60 s;
rychlost scanu v = 1000 mV s-1.
Obr. 2. Závislost náboje píku redukční desorpce thiolu na potenciálu akumulace. Podmínky
jsou stejné jako v popisu Obr. 1.
Potenciál depozice thiolu. Při elektrochemické depozici thiolu na elektrodě je potenciál
198
pracovní elektrody základní parametr, který ovlivňuje nejen rychlost vytvoření monovrstvy,
ale i může určit, s jakým kovem bude vázán thiol. Na Obr. 2 je znázorněna závislost hodnoty
náboje určeného píkem redukční desorpce thiolu na potenciálu depozice. Jak je vidět, na
HMDE a na stříbrných amalgámových elektrodách je přibližně stejný rozsah potenciálů, kde
je možné na jejích povrchu vytvořit thiolový film. Tato skutečnost a blízko rozmístěné
desorpční píky (viz Obr. 1) potvrzují, že je na uvedených elektrodách síra vázaná na rtuť. Pro
HMDE a AgSAE jako optimální byl zvolen potenciál depozici Eac = −350 mV. Podobně se
chovají m-BiAgSAE, m-CuSAE a m-CdSAE, ale s tím rozdílem, že u méně negativních
potenciálů je potenciál depozice thiolu omezen oxidací Bi, Cu a Cd z amalgámu.
Z experimentálních údajů a z Obr. 2 vyplývá, že při Eac = −750...−800 mV, se na HMDE a na
AgSAE thiolový film už praktický netvoří, ale takový potenciál je optimální pro depozici
monovrstvy thiolátky na m-BiAgSAE a na m-CuSAE. Analogicky, při
Eac = −1050 mV se thiolový film bude deponovat jen na m-CdSAE. Většina studovaných
parametrů monovrstevných filmů je závislá nebo ovlivněna vlastnostmi vazby kov–síra. Lze
předpokládat, že amalgámové elektrody jsou vhodným nástrojem pro získání
reprodukovatelných a lehce obnovitelných thiolových filmů vázaných na zvolené kovy.
Koncentrační závislost. Byl studován vliv zvyšujících se koncentrací thiolu na voltametrickou
odezvu HMDE, m-AgSAE, MF-AgSAE a m-CuSAE. Adsorpční isotermy získané na
uvedených pracovních elektrodách jsou podobné. Pro popis těchto závislostí byla použita
Langmuirova rovnice: Bc = Г / (Гs – Г), kde B je adsorpční koeficient, c − koncentrace thiolu
v roztoku, Г − rovnovážná koncentrace thiolu na povrchu elektrody, Гs − maximální
(saturated) koncentrace thiolu na povrchu elektrody. Parametr Г se vypočítával z plochy
(náboje) desorpčního píku na katodické větvi cyklického voltamogramu. Lineární zobrazení
Langmuirovy isotermy může být získáno prokládáním c/Г jako funkci c. Ze směrnice tohoto
grafu lze vypočítat hodnotu Гs a z úseku adsorpční koeficient B. Tyto grafy jsou lineární s
vysokými hodnotami korelačních koeficientů a to pro všechny 4 elektrody (není znázorněno),
čímž se potvrzuje možnost použití Langmuirovy isotermy pro hodnocení získaných
experimentálních údajů. Gibbsova energie adsorpce se vypočítávala z hodnoty B:
ΔG = −RT ln(B) spolu s jinými parametry je uvedená v Tab. I. Hodnoty ΔGads pro HMDE a
amalgámové elektrody jsou velmi podobné. Získané údaje volné energie adsorpce jsou ve
shodě s dříve publikovanými veličinami ΔGads pro SAM (self assembled monolayer)
n-alkanthiolů 6 a pro kyselinu 6-merkaptohexanovou 7 na rtuťové elektrodě ve vodných
roztocích. I když se na měděné amalgámové elektrodě thiol váže na měď, energie adsorpce na
m-CuSAE je prakticky stejná jako na HMDE a AgSAE. V literatuře nebyly nalezeny údaje o
volné energii adsorpce thiolátek na měděných elektrodách.
Hodnoty Гs byly vypočítány z adsorpčních izoterem a jsou uvedené v Tab. I. Maximální
povrchové koncentrace pro různé látky se na rtuťových elektrodách nacházejí v rozmezí od
8,4 do 9,8⋅10-10 mol l-1 (cit. 6-8). To, že se námi získána hodnota Гs thiolu na HMDE nachází u
menších hodnot uvedeného rozsahu muže být způsobeno tím, že se záporně nabité zbytky
karboxylových skupin vzájemně odpuzují. Naopak, toto tvrzení nevysvětluje vysoké
povrchové koncentrace thiolátky na amalgámových elektrodách. Podle našeho názoru,
"nucené" vytvoření monovrstvy pomoci optimálního potenciálu akumulace účinně přispívá
získání na povrchu elektrody velmi hustých filmů thiolátek a elektrochemicky obnovený
povrch amalgamových elektrod bezprostředně před depozicí monovrstvy zajišťuje vytvoření
thiolového filmu s větší povrchovou koncentrací, než je tomu na HMDE. Podle údajů
v Tabulce I lze říci, že se maximální povrchová koncentrace chemisorbované thiolátky na
různých amalgámových elektrodách liší málo a nejvyšší je na stříbrných amalgámech.
199
Tabulka I.
Hodnoty maximálního pokrytí (Гs), adsorpčního koeficientu (B) a Gibbsovy adsorpční energie
(ΔGads) při tvorbě HS(CH2)10COOH–monovrstvy na různých WE. ZE: 0,5M NaOH, 48 %
ethanol; koncentrace thiolu v roztoku od 2×10−6 mol l−1 do 1,07×10−3 mol l−1; Eac = −750 mV
pro m-CuSAE a Eac = −350 mV pro jiné elektrody; tac = 60 s; v = 1000 mV s−1.
Elektroda
Гs (×10−10 mol cm−2)
B (l mol−1)
ΔGads (kJ mol−1)
HMDE
8,5
36179
−26,0
MF-AgSAE
9,8
35239
−26,0
m-AgSAE
9,6
41630
−26,4
m-CuSAE
9,2
39107
−26,2
Rozsah potenciálů stability thiolové monovrstvy. Rozsah potenciálů, ve kterém je monovrstva
na elektrodě stabilní určuje, jaké elektrochemicky aktivní látky lze s takto modifikovanou
elektrodou studovat. V tomto experimentu se po elektrochemickém vytvoření monovrstvy
zaznamenával katodický scan až do úplné desorpce monovrstvy. Začátek desorpčního píku
byl vzat jako první hranice zmíněného rozsahu (viz Tabulka II). Druhá hranice rozsahu se
určovala stejným způsobem, jen se prováděl anodický scan až do začátku elektrolytického
rozpouštění materiálu elektrody a/nebo desorpce monovrstvy. Údaje z Tabulky II jsou dalším
potvrzením podobnosti HMDE a elektrod ze stříbrného amalgámu. Významný rozdíl nastává
u amalgámů obsahujících kov elektrochemicky aktivnější, než rtuť. Vzhledem k tomu, že
redukce vazeb Bi−S, Cu−S a Cd−S probíhá při podstatně negativnějších potenciálech, je
potenciálový rozsah stability thiolových filmů na těchto elektrodách taky posunut
do negativnější oblasti. Použití pro tvorbu thiolové monovrstvy amalgámů obsahujících kov
elektrochemicky aktivnější než rtuť má důležitou výhodu v tom, že vzniká možnost pracovat
s látkami, které jsou elektrochemicky aktivní mimo potenciálové okno stability monovrstvy
na rtuti. Toto se dá využit, například, pro zkoumání (ne)propustnosti monovrstvy (nebo na její
základě dvojvrstvy) pro těžké kovy. Tak na HMDE nebo na AgSAE v alkalickém prostředí
lze studovat propustnost monovrstvy vůči kationům Cu2+, ale elektronegativnější kationy Pb2+
lze zaregistrovat už jen na m-CuSAE. Zvolením vhodného kovu pro přípravu amalgámu lze
vytvořit thiolovou monovrstvu stabilní v určeném potenciálovém rozmezí.
Tabulka II.
Rozsah potenciálů stability thiolové monovrstvy. ZE: 0,5M NaOH, 48 % ethanol; koncentrace
HS(CH2)10COOH c = 1×10−3 mol l−1; Eac = −1050 mV pro m-CdSAE, Eac = −750 mV pro
m-BiAgSAE a m-CuSAE, Eac = −350 mV pro jiné elektrody; tac = 60 s; v = 1000 mV s−1.
Potenciál pracovních elektrod, mV
Směr
HMDE
m-AgSAE MF-AgSAE p-AgSAE m-BiAgSAE m-CuSAE m-CdSAE
scanu
Katodický
−831
−847
−841
−802
−1057
−1110
−1227
Anodický
−190
−197
−190
−229
−479
−541
−978
Reprodukovatelnost měření. Očištění povrchu elektrody od thiolového filmu může být dost
složitým úkolem kvůli velké afinitě rtuti, amalgámů a jiných těžkých kovů k síře. U HMDE
se většinou tento problém řeší jednoduchým odklepnutím staré rtuťové kapky a vytvořením
nové. Na druhou stranu, malá mechanická stabilita HMDE silně komplikuje její použití pro
vytvoření několika vrstevních filmů a/nebo pro přípravu biosenzorů. Pevné elektrody jsou
pohodlné v zacházení, ale při práci s nimi se musí dbát na jejích účinnou regeneraci.
Amalgámové elektrody leštěné nebo pokryté rtuti se dobré regenerují elektrochemickou
cestou, tj. pomocí aplikaci vhodného potenciálu nebo střídavě měnicích se potenciálů. Při
zmenšení účinnosti elektrochemické regenerace povrch elektrody může se jednoduše obnovit
200
vytvořením nového rtuťového menisku nebo filmu. Pro všechny zkoušené elektrody byly
optimalizovány podmínky obnovení jejích povrchu a vlastností. Statistické výsledky
mnohokrátného vytvoření monovrstvy thiolu a její následující desorpci (při měření plochy
desorpčního píku je většinou RSD pod 2 %) potvrzují, že stacionární amalgámové elektrody
jsou vhodným instrumentem pro zkoumání elektrochemických vlastností thiolových filmů.
Srovnání výsledků hodnocení desorpčních píků podle jejich výšky a plochy jednoznačné
ukazuje, že měření plochy (náboje) je podstatně přesnější. Je nutné se zmínit, že při
hodnocení těchto velmi úzkých voltametrických píků (W1/2 ≈ 6−12 mV) nelze používat žádné
vyhlazovací filtry, protože proud píku může se zmenšit i o několik desítek procent. Parametry
reprodukovatelnosti měření na amalgámových elektrodách a na HMDE jsou srovnatelné, což
dovoluje považovat AE jako vhodnou alternativu klasickým rtuťovým elektrodám.
Závěr
Poprvé byly prozkoumány podmínky elektrolytického vytvoření thiolové monovrstvy na
stacionárních elektrodách na základě pevných amalgámů stříbra, mědi, bizmutu a kadmia. Pro
srovnání a návaznost na již opublikované výsledky, paralelně se vždy prováděla měření na
klasické HMDE. Amalgámové elektrody jsou vhodným nástrojem pro získání thiolových
filmů vázaných na vybrané kovy. Zvolením vhodného kovu pro přípravu amalgámu lze
vytvořit thiolovou monovrstvu stabilní v určeném potenciálovém rozsahu. Zjištěné hodnoty
ΔGads byly velmi blízké pro všechny elektrody (−26,0 až −26,4 kJ mol−1). Z adsorpčních
izoterm bylo vypočítáno maximální pokrytí povrchu elektrod thiolem. Nejnižší hodnota Гs
byla pozorována na HMDE (8,5×10−10 mol cm−2) a nejvyšší na MF-AgSAE (9,8×10−10
mol cm−2). V 1 mM roztoku thiolátky a za optimálního potenciálu akumulace se monovrstva
vytváří na všech zkoumaných elektrodách velmi rychle. Po 1−2 min akumulace se plocha
(náboj) redukčního desorpčního píku prakticky nemění. Statistické výsledky
mnohonásobného vytvoření monovrstvy thiolu a její následné desorpce potvrzují, že
stacionární amalgámové elektrody jsou vhodným instrumentem pro zkoumání
elektrochemických vlastností thiolových filmů. Parametry reprodukovatelnosti měření na
amalgámových elektrodách a na HMDE jsou srovnatelné, což dovoluje považovat AE jako
vhodnou alternativu klasickým rtuťovým elektrodám.
Poděkování
Tato práce vznikla s finanční podporou GA AV ČR (projekt čís. IAA 400400806) a MŠMT
(projekt čís. LC 06063).
Literatura
1. Becucci L., Carbone M. V., Biagiotti T., D'Amico M., Olivotto M., Guidelli R.: J. Phys.
Chem. B 112, 1315 (2008).
3. Yosypchuk B., Šestáková I.: Electroanalysis 20, 426 (2008).
4. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003).
5. Navrátil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009).
6. Stevenson K. J., Mitchell M., White H. S.: J. Phys. Chem. B 102, 1235 (1998).
7. Muskal N., Mandler D.: Electrochim. Acta 45, 537 (1999).
8. Muskal N., Turyan I., Mandler D.: J. Electroanal. Chem. 409, 131 (1996).
201
Electrogenerated Hexacyanoferrate(III) Ions as Reagent for Evaluation of Polyphenols
Bioavailability
Guzel Ziyatdinova, Alfiya Nizamova, and Herman Budnikov
Kazan State University, A.M. Butlerov Institute of Chemistry, Department of Analytical
Chemistry, Kremlyevskaya, 18, 420008, Kazan, Russia, E-mail: [email protected]
Abstract
Electrogenerated hexacyanoferrate(III) ions have been proposed as coulometric titrant for the
determination of polyphenols bioavailability. Stoichiometric coefficients of natural flavonoids
(rutin, quercetin and taxifolin) reactions with [Fe(CN)6]3- ions have been found. The number
of electrons involved in oxidation corresponds to number of OH-groups in molecules of
polyphenols. Proteins (casein and bovine serum albumin) interact with polyphenols binding
them in complexes by intermolecular interaction that leads to significant decrease of
polyphenols bioavailability. Effect of milk proteins on bioavailability of tea and coffee
polyphenols through the alteration of antioxidant capacity has been evaluated.
Key Words: Constant-current coulometry, Electrogenerated hexacyanoferrate(III) ions,
Bioavailability of polyphenolic antioxidants, Antioxidant capacity, Milk proteins.
Introduction
Polyphenols are important natural antioxidants widely presented in plants. These compounds
may be classified into different groups as a function of the number of phenol rings that they
contain and of the structural elements that bind these rings to one another. Distinctions are
thus made between the phenolic acids, flavonoids, stilbenes, and lignans. The flavonoids,
have a common structure consisting of 2 aromatic rings (A and B) that are bound together by
3 carbon atoms that form an oxygenated heterocycle (ring C) by intramolecular Michael
reaction (scheme).
OH
B
O
A
B
A
O
O
Polyphenols are abundant micronutrients in our diet, and evidence for their role in the
prevention of degenerative diseases such as cancer and cardiovascular diseases is emerging.
The health effects of polyphenols depend on the amount consumed and on their
bioavailability 1. Despite the growing interest in the health benefits of polyphenols little is
known about whether dietary factors that may interact with polyphenols during digestion,
affect the antioxidant capacity of polyphenols. One dietary factor that interacts with
polyphenols is proteins 2, in particular proline-rich proteins 3.
One of the most widely used drinks in human everyday diet is tea. The way of tea
consumption varies among populations. In the United Kingdom, Ireland, and Canada tea, is
consumed with a substantial amount of milk in it 4. Milk contains various proteins, and
interactions between polyphenols and proteins have been reported 5,6. The question of effect
of such interaction on the antioxidant capacity is of interest. Limited experimental evidence
suggests that milk diminishes the antioxidant properties of tea 6 and dark chocolate 7.
Therefore, evaluation of polyphenols bioavailability plays an important role. The aim of
present work is development of new method for determination of polyphenols bioavailability
202
based on reaction with electrogenerated [Fe(CN)6]3--ions as well as evaluation of milk
proteins effect on antioxidant capacity of teas and coffee.
Experimental
Chemicals
Rutin and quercetin were purchased from Aldrich, Germany, taxifolin – from Fluka,
Germany. Their stock solutions were prepared by dissolving a precisely weighed amount of
the substance in ethanol. Stock solutions of β-casein from bovine milk (BioUltra, Germany)
and bovine serum albumin (Reanal, Hungary) with concentration of 75 mkg⋅mL-1 were
prepared by dissolving a precisely weighed amount of protein in water. Mixtures of
polyphenols with proteins were prepared in volume ratio from standard solutions of
components with equal concentrations. Other chemicals used were of analytical reagent grade
purity and used as received.
Apparatus
Coulometric measurements were carried out using a P-5827 M potentiostat with fourelectrode electrochemical cell. A smooth platinum plate with a surface area of 1 cm2 served as
the working electrode, and a platinum coil separated from the anodic compartment with a
semipermeable diaphragm served as the auxiliary electrode. Two polarized platinum
electrodes were used for detection of the titration end-point.
Procedures
Electrochemical generation of [Fe(CN)6]3- ions was carried out from 0,1 M K4Fe(CN)6 in 2 М
КОН at current density 5 mA/cm2. The titration end-point was detected amperometrically
using two polarized platinum electrodes (ΔE = 200 mV) 8.
Coulometric titration was carried out in a 50.0 mL cell containing 20.0 mL of the supporting
electrolyte. The generating circuit was switched on when a certain value of the indicator
current was attained, an aliquot portion (20 μL) of tested solution was added to the cell, and a
timer was simultaneously started. The titration end-point was detected by the attainment of
the initial value of the indicator current. The timer was stopped, and the generating circuit was
turned off. All experiments were carried out at temperature (25±2 °C).
Constant-current coulometry with electrogenerated [Fe(CN)6]3- ions as titrant opens new
possibilities for the investigation of reactions stoichiometry between polyphenols and oneelectronic carrier from one side and evaluation of polyphenols bioavailability in protein
presence from other side.
Polyphenols - rutin, quercetin and taxifolin - and proteins – casein from bovine milk and
bovine serum albumin (BSA) - have been chosen as model compounds.
Titration of standard solution of natural polyphenols has shown that reactions proceed fast
and quantitatively. The number of electrons involved in oxidation (Table I) corresponds to
number of OH-groups in molecules of polyphenols 9. Proteins under investigation don’t react
with electrogenerated [Fe(CN)6]3- ions that is caused by oxidative strength of titrant and the
structure of proteins in basic media.
Bioavailability of polyphenols has been investigated in model systems polyphenol – protein.
Casein and BSA bind polyphenols under investigation. Content of available polyphenol in
203
mixture decreases with increase of protein portion in mixture (Fig. 1). Quercetin and taxifolin
are bonded stronger than rutin. It’s probably caused by presence of glycoside residue in rutin
structure that complicates the complexes formation.
Table I.
Number of electrons involved in reactions between polyphenols and electrogenerated
[Fe(CN)6]3- ions.
Number of
Compound
Structure
electrons
OH
Rutin
HO
OH
O
4
O Glucose Rhamnose
OH
O
OH
Quercetin
HO
O
OH
5
OH
OH
O
OH
Taxifolin
HO
OH
O
5
OH
OH
O
Fig. 1. Free polyphenols content depending of protein portion in mixture: a – for casein; b –
for BSA.
In general, binding between polyphenols and proteins is mainly resulted from intermolecular
interaction. Different mechanisms of them are possible depending of protein structure. Under
non-oxidizing conditions, non-covalent interactions including hydrogen bonds and
hydrophobic forces stabilize polyphenol-protein complexes. The non-covalent interaction
may occur due to the structure of polyphenols and many different functional groups in the
proteins by hydrogen bonding and by hydrophobic bonding, in some cases ionic bonding may
be possible. Sometimes covalent attachment can occur depending on polarity of polyphenols
as it takes place for tannins. The interaction may occur via multisite interaction (several
phenolic compounds bound to one protein molecule) or multidentate interaction (one phenolic
compound bound to several protein sites or molecules). The type of interaction depends on
the type and the molar ratio of both phenolic compound and protein 10.
204
So, flavonols as well as other polyphenolic compounds interact with proteins (5-76 % of
bonding) that leads to significsnt decrease of polyphenols bioavailability.
Tea and coffee are one of the mail sources of polyphenols. Bioavailability of their
polyphenols have been evaluated in the presence of milk proteins through the alteration of
antioxidant capacity (AOC) of drinks. Mixtures of tea and coffe with pasteurized milk (2.5 %
fat) containing 5, 20, 50 и 70 % of milk have been prepared for the evaluation of polyphenols
bioavailability. Milk has own AOC that was preliminary determined and taken into account in
following calculations of drinks AOC.
Masking effect on AOC of tea and coffee in milk presence has been observed (Fig. 2). This
effect doesn’t depend on tea type and difference in AOC for several teas with milk is the
same. Small amounts of milk don’t masking AOC significantly, excepting the one of
investigated tea which AOC dramatically decreases on 30 % at 5 % of milk in mixture.
Fig. 2. Masking of tea antioxidant capacity with different content of milk.
The main tea polyphenols binding to proteins are epigallocatechin gallate and epicatechin
gallate 11 as well as epicatechin, epigallocatechin and caffeine 12.Tea catechins binding with
milk proteins ic caused by strong hydrophobic interactions between galloil rings of
polyphenols with proline-containing fragments of peptide molecular qith further stabilization
due to formation of hydrogen bonds 13,3.
Similar masking effect of milk was found for the instant coffee (Fig. 3). As for the coffee
beans, AOC of it changes a little till 20 % of milk in mixture and then decrease twice that
corresponds well with literature data 14,15. Maillard reaction products, phenolic acids
(chlorogenic, caffeic, ferulic and p-coumaric) and their ethers interact with milk proteins and
thus effect on AOC of coffee.
Summarizing the results obtained, it should be noted that milk proteins bind drinks
polyphenols and decrease their bioavailability. The main protein is casein that averages 80 %
from total protein content. BSA and β-lactoalbumin gives a less contribution.
205
Conclusions
New approach for the evaluation of bioavailability of polyphenols using electrogenerated
[Fe(CN)6]3- ions as coulometric titrant has been proposed. Masking effect of milk proteins on
antioxidant capacity of tea and coffee that reflects free polyphenol content in system has been
observed. Better knowledge of consumption and bioavailability of dietary polyphenols will be
essential in the future to properly evaluate their role in the prevention of diseases. After the
consumption of a given source of polyphenols or of a given diet, it’s needed to evaluate the
contribution in prevention of oxidative stress with regard to other dietary antioxidants and
matrix components. This should lead to some dietary recommendations for population and to
design of new food products that will satisfy future needs and help to preserve human health.
Fig. 3. Alteration in AOC of coffee in presence of milk.
References
1. Manach C., Scalbert A., Morand C., Rémésy C., Jiménez L.: Am. J. Clin. Nutr. 79, 727
(2004)
2. Zhu M., Phillipson J. D., Greengrass P. M., Bowery N. E., Cai Y.: Phytochemistry 44,
441 (1997).
3. Murray N. J., Williamson M. P., Lilley T. H., Haslam E.: Eur. J. Biochem 219, 923
(1994).
4. Weisburger J. H.: Cancer Lett. 114, 315 (1997).
5. Arts M. J. T. J., Haenen G. R. M. M., Voss H.-P., Bast A.: Food Chem. Toxicol. 39, 43
(2001).
6. Arts M. J., Haenen G. R., Wilms L. C., Beetstra S. A., Heijnen C. G., Voss H. P., Bast
A.: J. Agric. Food Chem. 50, 1184 (2002).
7. Serafini M., Bugianesi R., Maiani G., Valtuena S., De Santis S., Crozier A.: Nature. 424,
1013 (2003).
8. Ziyatdinova G. K., Nizamova A. M., Samigullin A. I., Budnikov H. C.: Uč. zap. Kazan.
gos. univ., Ser. Estestv. nauki. 151, 32 (2009).
9. Ziyatdinova G. K., Nizamova A. M., Budnikov H. C.: J. Anal. Chem. In print.
10. Viljanen K.: Academic dissertation. University of Helsinki, 2005.
11. Catterall F., Kassimi A. I., Clifford M. N., Ioannides C.: Anticancer Res. 23, 3863
(2003).
12. Ferruzzi M. G., Green R. J.: Food Chem. 99, 484 (2006).
13. Baxter N. J., Lilley T. H., Haslam E., Williamson M. P.: Biochemistry. 36, 5566 (1997).
14. Sánchez-González I., Jiménez-Escrig A., Saura-Calixto F.: Food Chem. 90, 133 (2005).
15. Dupas C. J., Marsset-Baglieri A. C., Ordonaud C. S., Ducept F. M. G., Maillard M.-N.: J.
Food Sci. 71, S253 (2006).
206
207
208
209
210
tel.: 266 053 877
tel./fax: 286 890 502
Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol
moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj
PC ECO - TRIBO VOLTAMETRICKÝ/POLAROGRAFICKÝ
ANALYZÁTOR
● vysoká citlivost ● snadná automatizace ● ideální pro speciaci
● stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook)
● verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP
Metody
•
•
•
DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie,
DP a Tast polarografie
Chronopotenciometrie s konstantním proudem
Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele
•
•
•
Miniaturní tužková rtuťová
Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná
Pevné amalgamové: stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová)
Elektrody
Použití
Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii)
ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných
podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace 10-10 až 10-11 mol/l
•
•
•
stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp. většiny
prvků Mendělejevovy tabulky
stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-)
sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů,
insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.).
Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv
v běžných podmínkách, bez demontáže
Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe
vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie,
geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd.
Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven,
průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu;
zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z
asi 80 % atd.
Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme
komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj analytických
metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu, vhodný pro výukové
účely.
211
tel.: 266 053 877
tel./fax: 286 890 502
DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK
AS-DETECTOIL
Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod.
na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika,
čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. – jako
kontrolní a bezpečnostní systém.
POPIS ZAŘÍZENÍ
Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o
rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V – akumulátor, trafo) a z výstupu pro
instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a
jiného systému.
Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím
výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí.
TECHNICKÉ ÚDAJE
připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg
212
Obsah
L. Baldrianová, I. Švancara, K. Vytřas
Electroanalysis with Bismuth-Based Electrodes and their Selected Applications
3
Z. Balcarová, K. Neplechová, L. Trnková
Electrochemical characterization of short oligonucleotides
7
J. Barek, V. Novotný, O. Yosypchuk
Quo Vadis, Electroanalytical Chemistry?
12
J. Bulíčková, M. Gál, M. Hromadová, L. Kavan, L. Pospíšil, R. Sokolová
Fullerene C60 in Aqueous Medium
15
H. Černocká, V. Ostatná
Chronopotentiometry of Native and Denatured BSA
19
A. Daňhel, J. Tvrdíková, J. Barek
Single Crystal Silver Amalgam Electrodes in Voltammetric and Amperometric
Detection
22
H. Dejmková, M. Vysoká, J. Zavázalová, J. Zima, J. Barek
Electrochemical Determination of Propyl Gallate on Carbon Paste Electrode
26
D. Deýlová, J. Barek
Determination of 5-Nitrobenzimidazole Using HMDE and AgSE in Presence of the
Surfactants
30
J. Fischer, A. Daňhel, K. K. Shiu, J. Barek,J. Wang
Voltammetric Determination of Selected Pesticides at a Meniscus Modified Silver
Solid Amalgam Electrodes
35
M. Fojta, L. Havran, P. Horáková, P. Kostečka, H. Pivoňková, E. Šimková, J. Špaček,
Z. Vychodilová,P. Vidláková
Electrochemical Analysis of DNA: When, How and Why to Use Electroactive Labels
and Indicators
40
M. Fojtíková, J. Bartošková, S. Holubová, E. Kaletová, L. Trnková, R. Kizek
Use of Paramagnetic Particles for the Isolation of Oligonucleotides with Different
Sequence and Chain Length
45
M. Fojtová, P. Horáková, H. Pivoňková, Z. Vychodilová, M. Fojta
Utilization of Electrochemical Activity of 7-Deazaguanine in the Monitoring of PCR
Amplification of G-rich DNA Strands
50
M. Gál, J. Híveš, R. Sokolová, M. Hromadová, J. Bulíčková, V. Kolivoška, L. Pospíšil
Electrochemistry of Selected Radiosensitizer-Etanidazole
55
L. Havran, P. Horáková, H. Pivoňková, M. Vrábel, H. Macíčková-Cahová, J. Riedl,
M. Hocek, M. Fojta
What is New in Labeling and Functionalization of DNA for Electrochemical Analysis
60
M. Heyrovský
Development of the Scope of Polarography with Time (Review)
63
S. B. Hocevar, B. Ogorevc:
Ten Years of Bismuth Electrodes in Modern Electroanalysis
66
213
K. Holub, H. Jänchenová, K. Štulík, V. Mareček
Proton Transfer across a Liquid|Liquid Interface Facilitated by Phospholipid
Interfacial Films
70
P. Horáková, Z. Vychodilová, E. Šimková, M. Fojta
Utilization of Biocatalytic Signal Amplification in Electrochemical Analysis of
Nucleotide Sequences
73
M. Hromadová, V. Kolivoška, L. Pospíšil
On the Mechanism of Electrochemical Reduction of Dodecylpyridinium Bromide in
Aprotic media. An Impedance Study.
77
V. Hudská, P. Janda, H. Tarábková
Electrode Coating by Chemical Mediator: The Atomic Force Microscopy Study of
Surface Nanomorphology
80
M. Jakl, J. Jaklová Dytrtová, D. Schröder, P. Tlustoš
The Study of Cadmium – Oxalic Acid Complexes Using DPASV and ESI-MS
85
J. Jaklová Dytrtová, M. Jakl, D. Schröder
Electrochemistry with Mass spectrometry as a Tool of Metal Complexes with Organic
Ligand Studies
89
I. Jiránek, T. Rumlová, J. Barek
Voltammetric Determination of 5-Nitroquinoline at Carbon Film Electrode
93
L. Korecká, L. Moravcová, Z. Bílková, R. Metelka
Detection of Proteins Using Electrochemical Immunosensors in Combination with
Magnetic Particles
98
P. Macíková, J. Skopalová
A Comparison of Variously Modified Carbon Paste Electrodes for Determination of
Rutin
101
L. Maixnerová, J. Barek, K. Pecková
Amperometric Detection of Aminobiphenyls in HPLC Using Microcrystalline BoronDoped Diamond Electrode in "Wall-Jet" and "Thin-Layer" Arrangement
106
T. Mikysek, M. Stočes, I. Švancara, J. Ludvík
Carbon Nanotubes – Material for Carbon Paste Electrodes, Possibilities of
Preparation and Characterization
111
J. Musilová, J. Barek, K. Pecková
Determination of Nitrophenols by Flow Injection Analysis with Amperometric
Detection on Boron Doped Diamond Film Electrode
116
T. Navrátil, I. Šestáková, V. Mareček, K. Štulík
Transport of Cadmium Ions across Model Supported Phospholipid Membranes
119
L. Němcová, B. Fähnrichová, R. Jarošová, J. Zima, J. Barek
Determination of Natural Antioxidants at a Carbon Paste Electrode
124
L. Novotný
Selected Possibilities of Utilization of Physico-chemical Findings as to Design of the
Electrode or Related Systems
129
V. Ostatná
Detection of Changes in Protein Structure Studied by Constant Current
Chronopotentiometry
214
132
N. S. Patel, S. Jauhari, G. N. Mehta
Thiourea Derivatives as Corrosion Inhibitor for Mild Steel in 1 N HCl
135
I. Pilařová, S. Holubová, M. Farková, P. Lubal, L. Trnková
Potentiometric Study of Physiologically Important Derivatives of Adenine
140
P. Pořický
Calculation of Linear Regression Model
144
J. Skopalová, D. Jirovský, Z. Bartošová, V. Maier
Electrochemical Behavior of Antidiabetics Repaglinide and Rosiglitazone and their
Determination by Liquid Chromatography with Electrochemical Detection
149
R. Sokolová, L. Pospíšil, M. Hromadová, J. Ludvík, M. Gál, S. Giannarelli
The Electrochemistry of Halogenated Benzonitriles
154
M. Stočes, K. Kalcher, I. Švancara, K. Vytřas
Electrochemical Synthesis of Polyaniline Films at a Screen-printed Carbon Electrode
and their Potential Applicability in Biosensing
158
R. Šelešovská, L. Bandžuchová, J. Chýlková
Voltammetric Behavior of Folic Acid Using Silver Solid Amalgam Electrode
163
L. Šimková, J. Ludvík, J. Klíma
Strange Redox Behavior of 1,1-Diamino-2,2-dinitroethene
168
B. Šustrová, V. Mareček, K. Štulík
A Study of Calixarene Self-assembled Monolayers on Gold Metal Surfaces
172
I. Švancara, L. Baldrianová, E. Tesařová, R. Metelka, K. Vytřas
A 10-Years Anniversary of Bismuth Electrodes in Modern Instrumental Analysis and
Its Reflection within Electroanalytical Group at the University of Pardubice
177
E. Tesařová, I. Švancara, K. Vytřas
Non-mercury Film Electrodes in the Present day's Electrochemistry
180
P. Tůma, E. Samcová
Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection as Effective Tool
for the Monitoring of Biochemical and Physiological Processes
183
P. Vidláková, P. Horáková, L. Těsnohlídková, L. Havran, H. Pivoňková, M. Fojta
Monitoring DNA Modification by Platinum Complexes at Mercury Electrodes
187
V. Vyskočil, J. Dědík, Z. Krejčová, L. Škvorová, A. Daňhel, J. Barek
Voltammetric Determination of Selected Biologically Active Nitro Compounds at a
Polished Silver Solid Amalgam Composite Electrode
192
B. Yosypchuk, V. Mareček
Electrochemical Properties of a Thiol Monolayer at a Surface of Different Electrodes 197
G. Ziyatdinova, A. Nizamova, H. Budnikov
Electrogenerated Hexacyanoferrate(III) Ions as Reagent for Evaluation of
Polyphenols Bioavailability
215
202
Název:
XXX. Moderní Elektrochemické Metody
Vydal:
BEST servis Ústí nad Labem
Uspořádali: Navrátil Tomáš, Barek Jiří
Autor:
Kolektiv autorů
Počet stran: 216
Náklad:
75
Formát:
A5
ISBN:
978-80-254-6710-7
Jen pro vnitřní potřebu
216
217
© BEST servis, Ústí nad Labem
218

zde - Bestservis.eu

Transkript

Podobné dokumenty

Moderní elektrochemické metody