DISERTAČNÍ PRÁCE Využití kapilární elektroforézy v analýze potravin

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO – TECHNOLOGICKÁ V
PRAZE
Fakulta potravinářské a biochemické technologie
Ústav konzervace potravin a technologie masa
DISERTAČNÍ PRÁCE
Využití kapilární elektroforézy v analýze
potravin
Vypracoval:
Ing. Martin Dušek
Školitel:
Doc. Ing. František Kvasnička, CSc.
Studijní program: Chemie a technologie potravin
Obor:
Technologie potravin
Praha 2004
Práce byla vypracována na Ústavu konzervace potravin a technologie masa
Vysoké škole chemicko – technologické v Praze v období od září 2000 – října 2003.
Prohlašuji, že jsem v předložené disertační práci použil jen pramenů, které cituji a
uvádím v seznamu použité literatury.
Ve Voticích, březen 2004
____________________
Martin Dušek
Na tomto místě bych chtěl vyjádřit vděčnost mému školiteli Doc. Ing. Františku
Kvasničkovi, CSc. za jeho cenné rady a komentáře a za poskytnutí tolik potřebné
motivace k mé práci. Můj velký dík také patří Prof. Dr. Ernstu Kenndlerovi, který mi
umožnil pracovat ve své laboratoři a získat tak mnoho dalších praktických zkušeností.
Dále bych chtěl poděkovat všem svým kolegům, kteří se vždy ochotně podělili o své
zkušenosti a znalosti.
SOUHRN
Tato disertační práce se zabývá využitím kapilárních elektromigračních metod (CE),
zejména kapilární izotachoforézy a kapilární zónové elektroforézy, v analýze potravin. Na
základě legislativy platné v ČR, byly vybrány takové analyty – polyfosfáty, karboxylové
kyseliny, kyselina glutamová – jejichž obsah je v potravinách limitovaný a u kterých bylo
také předpokládáno, že použití CE metod může výrazně zjednodušit jejich stanovení.
Kapilární izotachoforéza (CITP), kapilární zónová elektroforéza (CZE) a jejich „online“ spojení (CITP-CZE) byly optimalizovány pro stanovení polyfosfátů, kdy byla
hledána metoda co nejúčinnějšího stanovení jak v polyfosfátových směsích, tak v masných
výrobcích. Proměřením vzorků čisté svaloviny byl zjištěn poměr mezi volnými přirozeně
přítomnými fosfáty a bílkovinami v mase, který byl použit pro výpočet obsahu přidaných
fosfátů v těchto masných výrobcích. Ve vybraných vzorcích masných výrobků byly
stanoveny přidané fosfáty novou CITP metodou a tyto hodnoty byly srovnány s výsledky
získanými standardní spektrofotometrickou metodou.
Pro stanovení karboxylových kyselin ve vzorcích siláží byla použita kapilární zónová
elektroforéza
a
pro
stanovení
vybraných
organických
kyselin
ve
vejcích
dvoudimenzionální kapilární izotachoforéza. Změny obsahu kyseliny pyrohroznové,
mléčné, jantarové, 3-hydroxymáselné, glutamové, pyroglutamové, octové a citronové byly
sledovány v průběhu 38 dnů skladování vajec při 5, 14 a 30 °C. Během těchto
skladovacích pokusů byl u vajec zjišťován také celkový počet mikroorganizmů (CPM) a
byla hledána závislost mezi CPM a obsahem jednotlivých kyselin. U kyseliny mléčné,
jantarové a 3-hydroxymáselné bylo dále sledováno, zda jejich obsah do 28 dnů překročí
limitní hodnoty, které jsou vyhláškou 200/2003 Sb. považovány za kriteria čerstvosti vajec.
Pro devět vybraných vzorků byl obsah kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné
stanovený CITP porovnán s hodnotami zjištěnými použitím komerčních enzymových setů.
Kyselina glutamová v 15 vzorcích instantních polévek byla stanovena kapilární
izotachoforézou a získané výsledky byly srovnány s hodnotami získanými použitím
vysokoúčinné kapalinovou chromatografie separací derivátů kyseliny glutamové na
reverzní fázi (RP–HPLC).
Všechny výše uvedené aplikace elektromigračních metod je možné úspěšně použít
jako alternativní metody k používaným klasickým či chromatografickým technikám.
SUMMARY
This thesis deals with application of capillary electrophoresis methods (CE), namely
capillary isotachophoresis and capillary zone electrophoresis for food analyses. On the
basis of the Czech food legislation, several compounds were chosen, such as
polyphosphates, carboxylic acids and glutamic acid. Levels of these compounds in food
products are limited and furthermore the use of the capillary electrophoresis method makes
easier their analysis comparing with classical methods.
Capillary isotachophoresis (CITP), capillary zone electrophoresis (CZE) and their
on-line coupling (CITP-CZE) were optimised for the determination of added phosphate
and polyphosphates in food additives and meat products. The ratio between free phosphate
and meat proteins (16,2 mg.g-1) was found on the basis of the analysis of six different kind
of raw meat. The ratio was used for the calculation of the amount of added phosphates in
meat products. The obtained results were compared with routinely used spectrophotometric
method on thirty-five samples of meat products and good accordance was found.
Capillary zone electrophoresis was used for the determination of carboxylic acids in
silage and for the determination of these acids in eggs two-dimensional capillary
isotachophoresis was applied. During 38 days storage of eggs at the temperature 5, 14 and
30 °C the changes of the lactic, acetic, succinic, 3-hydroxybutyric, glutamic, pyroglutamic,
pyruvic and citric acid were observed. Together with the analysis of acids the microbial
contamination was determined. The time and the concentration of these acids
corresponding to trigger microbial contamination of eggs (5.104 of microorganisms/ml)
were determined. Further, the observation whether the concentration of lactic, succinic and
3-hydroxybutyric acids during 28 days storage exceeded limited value was made. The
isotachophoretic determination of these acids was compared with the enzymic ones.
An amount of glutamic acid in fifteen samples of instant soup was determined by the
capillary isotachophoresis. The obtained results were compared with HPLC method
(fluorimetric detection of FMOC derivate of glutamic acid).
It was proved that the electrophoretic methods are suitable alternative to classic or
chromatographic method for the determination of the above-mentioned compounds in
food.
Klíčová slova: kapilární zónová elektroforéza, kapilární izotachoforéza,
vysokoúčinná kapalinová chromatografie, polyfosfáty, přidaný fosfát, karboxylové
kyseliny, kyselina glutamová, masné výrobky, siláž, vejce, instantní polévky
Keywords: capillary zone electrophoresis, capillary isotachophoresis, high
performance liquid chromatography, polyphosphates, added phosphate, carboxylic
acids, glutamic acid, meat products, silage, eggs, instant soups
OBSAH
Seznam originálních publikací...........................................................................5
Seznam použitých symbolů a zkratek...............................................................7
1. Úvod ............................................................................................................10
2. Současný stav řešené problematiky..........................................................11
2.1.
Princip elektromigračních technik .............................................................11
2.1.1. Elektroosmotický tok (EOF)............................................................................13
2.1.2. Instrumentace CE metod..................................................................................14
2.2.
Rozdělení kapilárních elektromigračních technik .............................................15
2.2.1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE).............................................................16
2.2.2. Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie (MEKC) ............16
2.2.3. Kapilární elektrochromatografie (CEC) ..........................................................17
2.2.4. Kapilární izotachoforéza (CITP)......................................................................17
2.2.4.1. Princip kapilární izotachoforézy ................................................................17
2.2.4.2. Způsob detekce a vyhodnocení analytů v CITP.........................................20
2.2.4.3. Volba vedoucích a koncových elektrolytů .................................................21
2.2.4.4. Základní doporučené operační systémy .....................................................22
2.2.5. Kapilární gelová elektroforéza (CGE) .............................................................23
2.2.6. Kapilární izoelektrická fokuzace (CIEF) .........................................................24
2.2.7. Technika spojování separačních kapilár „column-coupling“ ..........................24
2.3.
Využití kapilárních elektromigračních metod v analýze potravin.....................26
2.3.1. Stanovení potravinářských aditiv.....................................................................27
2.4.
Fosfát a polyfosfáty ...........................................................................................28
2.4.1. Přirozený obsah fosforu v mase.......................................................................28
2.4.2. Polyfosfáty v masných výrobcích....................................................................29
2.4.3. Metody stanovení fosfátu a polyfosfátů...........................................................30
2.4.4. Stanovení přidaného fosfátu v masných výrobcích .........................................32
2.5.
Karboxylové kyseliny v silážích........................................................................32
2.5.1. Vznik karboxylových kyselin v silážích ..........................................................32
2.5.2. Hodnocení kvality siláže..................................................................................33
2.5.3. Metody stanovení karboxylových kyselin v siláží...........................................35
2.6.
Karboxylové kyseliny ve vejcích.......................................................................35
1
2.6.1. Obsah karboxylových kyselin ve vejcích ........................................................35
2.6.2. Legislativní požadavky na obsah karboxylových kyselin ve vejcích ..............37
2.6.3. Změny organických kyselin bez vlivu exogenní kontaminace ........................39
2.6.4. Změny karboxylových kyselin způsobené činností mikroorganizmů .............40
2.6.5. Metody stanovení organických kyselin ...........................................................43
2.7.
Kyselina glutamová ...........................................................................................49
2.7.1. Použití glutamátu sodného v potravinách ........................................................49
2.7.1.1. Pravidla pro použití glutamátu sodného v potravinách..............................51
2.7.1.2. Vliv konzumace glutamátu na lidské zdraví ..............................................51
2.7.2. Stanovení přidaného glutamátu v potravinách.................................................53
2.7.2.1. Stanovení kyseliny glutamové HPLC ........................................................53
2.7.2.2. Stanovení kyseliny glutamové CE metodami ............................................54
3. Cíle disertační práce – plán pokusů...........................................................59
4. Použité chemikálie a materiál .....................................................................61
4.1.
Použité chemikálie.............................................................................................61
4.2.
Použité přístroje .................................................................................................62
5. Stanovení fosfátů a polyfosfátů .................................................................64
5.1.
Použité vzorky ...................................................................................................64
5.2.
Stanovení polyfosfátů CE metodami .................................................................65
5.2.1. Příprava vzorku................................................................................................65
5.2.2. Podmínky analýzy............................................................................................65
5.3.
Stanovení celkového fosforu .............................................................................66
5.3.1. Příprava roztoků...............................................................................................66
5.3.2. Spektrofotometrické stanovení celkového fosforu ..........................................67
5.4.
Stanovení celkového dusíku ..............................................................................67
5.5.
Stanovení dusíku a fosforu v čisté bílkovině .....................................................68
5.6.
Získané výsledky a jejích diskuse......................................................................68
5.6.1. Elektroforetické stanovení polyfosfátů ............................................................68
5.6.2. Spektrofotometrické stanovení přidaných fosfátů ...........................................76
5.6.3. Izotachoforetické stanovení přidaných fosfátů ................................................77
5.6.3.1. Poměr mezi volným fosfátem a bílkovinami v mase .................................77
5.6.4. Srovnání metod stanovení přidaných fosfátů...................................................79
2
5.6.5. Závěr ................................................................................................................81
5.6.5.1. Stanovení polyfosfátů kapilárními elekromigračními metodami...............81
5.6.5.2. Stanovení přidaných fosfátů kapilární izotachoforézou.............................82
6. CZE a CITP stanovení karboxylových kyselin v silážích..........................84
6.1.
Vzorky siláží a jejich úprava .............................................................................84
6.2.
Podmínky analýzy..............................................................................................84
6.3.
Výsledky a diskuse ............................................................................................85
6.3.1. CZE ..................................................................................................................85
6.3.2. CITP.................................................................................................................85
6.3.3. Srovnání CZE a CITP ......................................................................................89
6.3.4. Závěr ................................................................................................................92
7. CITP stanovení karboxylových kyselin ve vejcích....................................93
7.1.
Použité vzorky ...................................................................................................93
7.2.
Stanovení sušiny ................................................................................................93
7.3.
Podmínky CITP-CITP analýzy..........................................................................93
7.3.1. Příprava vzorků pro kapilární izotachoforézu..................................................93
7.3.2. CITP-CITP stanovení organických kyselin .....................................................94
7.4.
Postup mikrobiologického stanovení.................................................................95
7.4.1. Příprava médií pro mikrobiologické stanovení................................................95
7.5.
Enzymové metody .............................................................................................95
7.5.1. Příprava vzorku................................................................................................95
7.5.2. Postup měření ..................................................................................................96
7.5.3. Výpočet ............................................................................................................96
7.6.
Získané výsledky a jejich diskuse......................................................................96
7.6.1. Stanovení sušiny ..............................................................................................96
7.6.2. Izotachoforetické stanovení organických kyselin ve vejcích...........................97
7.6.3. Skladovací pokus melanže.............................................................................100
7.6.4. Skladovací pokus skořápkových vajec ..........................................................101
7.6.4.1. Změna obsahu kyseliny pyrohroznové.....................................................102
7.6.4.2. Změna obsahu kyseliny mléčné ...............................................................103
7.6.4.3. Změna obsahu kyseliny glutamové a octové............................................105
7.6.4.4. Změna obsahu ostatních kyselin ..............................................................107
3
7.6.4.5. Srovnání čerstvých vajec a jejich skladovaných melanží ........................108
7.6.4.6. Srovnání CITP-CITP a enzymové metody ..............................................111
7.6.5. Závěr ..............................................................................................................113
8. Stanovení kyseliny glutamové..................................................................116
8.1.
Příprava vzorků................................................................................................116
8.2.
Izotachoforetické stanovení glutamové kyseliny.............................................117
8.3.
Stanovení glutamové kyseliny metodou HPLC...............................................117
8.3.1. Derivatizace ...................................................................................................117
8.3.2. HPLC stanovení .............................................................................................118
8.4.
Výsledky a jejich diskuse ................................................................................118
8.4.1. Separace glutamové kyseliny metodou CITP ................................................118
8.4.2. Separace glutamové kyseliny metodou HPLC ..............................................120
8.4.3. Srovnání metod CITP a HPLC ......................................................................121
8.4.4. Závěr ..............................................................................................................123
9. Závěr ..........................................................................................................125
10. Literatura ....................................................................................................128
4
SEZNAM ORIGINÁLNÍCH PUBLIKACÍ
Výsledky disertační práce byly publikovány v následujících třech článcích (I-III) a šesti
příspěvcích na vědeckých konferencích (A-F).
I
Dušek, M.; Kvasnička, F.; Lukášková, L.; Krátká, J. Isotachophoretic
determination of added phosphate in meat products. Meat Science 2003, 65, 765769.
II
Dušek, M.; Kvasnička, F.; Moravcová, J. Stanovení organických kyselin
v silážích kapilární izotachoforézou a kapilární zónovou elektroforézou. Chemické
Listy. (zařazen k tisku, vyjde v čísle 07/04)
III
Moravcová, J.; Kleinová, T.; Loučka, R.; Tyrolová, I.; Kvasnička, F.; Dušek, M.;
Čeřovský, M. Effect of additives on cumestrol content in laboratory alfalfa
silages. Czech Journal of Animal Science 2003, 48, 425-431.
PŘÍSPĚVKY NA KONFERENCÍCH
A
Dušek, M.; Lukášková, L.; Kvasnička, F.; Votočková, P; Krátká, J. Stanovení
obsahu fosfátů v masných výrobcích. XXXII. Symposium o nových směrech
výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem 2001.
(přednáška)
B
Dušek, M.; Mittelbach, R.; Kvasnička, F.; Krátká, J. HPLC a CITP stanovení
kyseliny glutamové v potravinách. XXXIII. Symposium o nových směrech výroby
a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem 2002.
(přednáška)
C
Dušek, M.; Kvasnička, F.; Krátká, J. Stanovení organických kyselin v silážích
kapilární izotachoforézou (CITP) a kapilární zónovou elektroforézou (CZE).
IV. Konference mladých vědeckých pracovníků, Brno 2002. (přednáška)
5
D
Dušek, M.; Kvasnička, F. Determination of polyphosphates by capillary
isotachophoresis and by on-line coupled CITP-CZE. Separation in the
Bioscience - SBS 2001, Praha 2001. (poster)
E
Dušek, M.; Kvasnička, F. Determination of polyphosphates by capillary
electrophoresis with conductivity detection. Euregionale 2002 in Aachen Spring Symposium of the GDCh-JCF, Aachen 2002. (poster)
F
Dušek, M.; Macková, P.; Kvasnička, F.; Míková, K. Využití CITP stanovení
karboxylových kyselin pro hodnocení kvality vajec. XXIV. Symposium o nových
směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem
2003. (poster)
6
SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK
α-CD
α-cyclodextrin
β-CD
β-cyclodextrin
2-MCE
2-merkaptoethanol
3-HBDH
3-hydroxybutyrát dehydrogenáza
AMP
adenosin-5-monofosfát
ATP
adenosin-5-trifosfát
BF
bifurkační blok
BGE
základní elektrolyt (background electrolyte)
BHA
butylhydroxyanisol
BHT
butylhydroxytoluen
BHBA
kyselina 3-hydroxymáselná (β-hydroxymáselná, 3-hydroxybutanová)
BICIN
N,N-bis(hydroxyethyl)glycin
CAPS
kyselina 3-(cyklohexylamino)-1-propan sulfonová
CE
kapilární elektromigrační metody
CEC
kapilární elektrochromatografie
CGE
kapilární gelová elektroforéza
CIEF
kapilární izoelektrická fokuzace
CITP
kapilární izotachoforéza
CMC
kritická micelární koncentrace (critical micellar concentration)
CoA
koenzym A
CPM
celkový počet mikroorganizmů
CTAB
cetyltrimethylamonium bromid
CZE
kapilární zónová elektroforéza (capillary zone electrophoresis)
DAD
UV detektor diodového pole (diode array detector)
DBD-PZ
4-N,N-dimethylaminosulfonyl-7-piperazin-2,1,3-benzoxadiazol
DMMAC N,N-dimethyl-2-merkapto-ethyl-amonium chlorid
Dns-Cl
dansyl chlorid
EACA
kyselina e-amino-n-kapronová
EDTA
kyselina ethylendiamintetraoctová
EOF
elektroosmotický tok (electroosmotic flow)
FEP
fluorovaný kopolymer ethylenu a propylenu
FITC
fluorescein isothiokyanát
FMOC
9-fluorenylmethyl chloroformiát
GABA
kyselina γ-aminomáselná
GC
plynová chromatografie (gas chromatography)
GTP
glutamát-pyruvát transamináza
HEPES
kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N´-ethansulfonová
His
L-histidin
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
(high performance liquid chromatography)
HPMC
hydroxypropylmethylcelulosa
HSAA
N-hydroxysuccinimidyl-α-(9-akridine)-acetát
HV
zdroj stejnosměrného vysokého napětí
IDP
inosin-5-difosfát
IEC
iontově výměnná chromatografie (ion exchange chromatography)
INT
iononitrotetrazonium chlorid
IPD
nepřímý fotometrický detektor
ITP
inosin-5-trifosfát
LE
vedoucí elektrolyt (leading electrolyte)
L-LDH
L-laktát
LOD
limit detekce (limit of detection)
LOQ
limit kvantifikace (limit of quantification)
MEKC
micelární elektrokinetická kapilární chromatografie
dehydrogenáza
(micellar electrokinetic chromatography)
MES
kyselina 2-[N-morfolin]ethansulfonová
MF
mobilní fáze
MO
mikroorganizmus
MPA
kyselina merkaptopropionová
MS
hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry)
MTAB
myristyltrimethylamonium bromid
NAC
N-acetylcystein
NAD
nikotinamidadenin dinukleotid
NADH
hydrogennikotinamidadenin dinukleotid
8
NBDI
o-(4-nitrobenzyl)-N,N´-diisopropylisourea
NBD-PZ
4-nitro-7-piperazin-2,1,3-benzoxadiazol
NPM
nejvyšší povolené množství
NDA
naftalen dikarboxaldehyd
OPA
o-ftalaldehyd
P1
monofosfát
P2
difosfát
P3
trifosfát
P4
tetrafosfát
PEP
fosfoenolpyruvát
PK
pyruvátkináza
PDC
2,6-pyridindikarboxylová kyselina
RP
reverzní fáze
RSD
relativní standardní odchylka stanovení (relative standard deviation)
PVP
polyvinylpyrrolidon
SC
cholát sodný
SCS
sukcinyl-koenzym A-syntetáza
SD2
směrodatná odchylka (standard deviation)
SDS
laurylsulfát sodný (sodium dodecyl sulphate)
SPE
extrakce na pevné fázi (solid phase extraction)
TAPS
kyselina N-[tris(hydroxymethyl)]-3-methylaminopropan sulfonová
TBHQ
tercbutylhydroxychinon
TE
koncový elektrolyt (terminating electrolyte)
THF
tetrahydrofuran
TLC
tenkovrstvá chromatografie (tin layer chromatography)
TRICIN
N-(2-hydroxymethyl)aminomethan
TRIS
tris(hydroxymethyl)aminomethan
TTAB
tetradecyltrimethylammonium bromid
9
1. ÚVOD
Pojem elektroforéza v sobě zahrnuje celý soubor procesů založených na migraci
nabitých částic - iontů v stejnosměrném elektrickém poli. Po dlouhou dobu od chvíle,
kdy Tiselius v roce 1937 poprvé použil elektroforézu jako analytickou metodu pro
separaci bílkovin, byla efektivita separace značně omezena konvekcí a difúzí tepla.
Proto byly první metody založené na separaci v takových materiálech (gelech), v jejichž
prostředí byly tyto negativní procesy eliminovány. V době, kdy začaly být dostupné
křemenné kapiláry s vnitřním průměrem menším než 100 µm a s prvními komerčními
CE přístroji, dochází k prudkému rozvoji CE metod a jejich aplikace nacházejí
uplatnění v rozličných oblastech, jenž zahrnují průmyslovou (Stover, 1990),
farmaceutickou, potravinářskou (Kvasnička, 2000) a biochemickou analýzu. Jen do
roku 1997 je publikováno více než 4000 článků a různých aplikací kapilárních
elektromigračních metod (Tagliaro et al., 1997). Oproti ostatním analytickým metodám
jsou výhodami CE metod vysoká separační účinnost (N > 104 až 106) při krátkém času
analýzy, malý objem dávkovaného vzorku (1 – 50 µl), je možné volit mezi několika
operačními módy (CZE, CITP, MEKC, CGE, CEC, CIEF), snadná optimalizace metod
a ve valné většině případů také vodné separační prostředí.
V této práci jsou v rámci doktorandského studia řešeny tři dílčí projekty. Prvním z
projektů je stanovení polyfosfátů (D, E) – přidaných fosfátů (I, A) v masných
výrobcích.
Druhým
je
stanovení
karboxylových
kyselin
kapilární
zónovou
elektroforézou v silážích (II, III, C) a kapilární izotachoforézou ve vejcích (F).
Posledním z těchto projektů je stanovení kyseliny glutamové v instantních polévkách
(B).
10
2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
2.1. PRINCIP ELEKTROMIGRAČNÍCH TECHNIK
Elektromigrační metody jsou založeny na rozdílné rychlosti pohybu různě
nabitých částic v elektrickém stejnosměrném poli. Na nabitou částici působí
v elektrickém poli síla (F1), která je úměrná náboji částice zi a intezitě elektrického pole
E.
F1 = z i × E
(2.1)
Proti síle F1 působí síla reprezentující odpor prostředí, která je úměrná okamžité
rychlosti nabité částice νi.
- F2 = k ×n i
(2.2)
V okamžiku, kdy se obě síly vyrovnají (F1 = – F2), začne se nabitá částice pohybovat
konstantní rychlostí (νi).
ni =
zi × E
k
(2.3)
kde k je konstanta úměrnosti iontu kulovitého tvaru a podle Stokesova zákona platí, že
k = 6 × p ×h × ri
(2.4)
Charakteristickou konstantu libovolného iontu je jeho pohyblivost (mobilita) µi, což je
jeho rychlost vztažená na jednotkovou intenzitu elektrického pole. Použitím mobility
lze zapsat rovnici (2.3) jako:
n i = mi × E
(2.5)
kde ν je rychlost (m.s-1), µi elektroforetická pohyblivost iontu (m2.V-1.s-1) a E je
intenzita stejnosměrného elektrického pole (V.cm-1). Elektroforetická pohyblivost µi je
pro daný ion a prostředí konstantní a kombinací rovnic (2.3), (2.4) a (2.5) je vyjádřená
jako:
mi =
zi
6 × p × ri ×h
(2.6)
kde q je náboj iontu, r je poloměr iontu a η je viskozita prostředí. Z této rovnice je jasné,
že malé ionty s vysokým nábojem mají vysokou mobilitu, zatímco nízkou mobilitu mají
málo nabité velké ionty. V nekonečně zředěných roztocích je iontová mobilita pro daný
ion konstantní a nazývá se absolutní mobilita, µ0. Prakticky, elektroforetické separace
11
neprobíhají
v nekonečně
zředěných
roztocích,
ale
v roztocích
o
konečných
koncentracích. V tomto případě iontová pohyblivost není konstantní a závisí na
koncentraci elektrolytového systému. Rychlost migrace iontů v takovémto systému je
menší než v podmínkách nekonečného zředění a je dána rovnicí:
n i = ma × E
(2.7)
kde µa je aktuální pohyblivost. Odchylka od ideálních podmínek může být vyjádřena
jako korekční faktor, f, jenž zejména závisí na iontové síle prostředí. Aktuální
pohyblivost je tedy možné vyjádřit z iontové pohyblivosti pomocí rovnice (2.8),
m act = f × m 0
(2.8)
přičemž korekční faktor f je funkcí náboje částice (zi) a iontové síly prostředí (I) a pro
silné organické kyseliny je možné jej vyjádřit rovnicí (2.9) (Friedl et al., 1995).
(2.9)
f i = exp(-0,77 z i × I )
V případě, že ionty přítomné v roztoku nejsou plně disociované, ovlivňuje stupeň jejich
disociace α pohyblivost iontu a mluvíme pak o jeho efektivní pohyblivosti, µeff. Pro
monovalentní látky je efektivní pohyblivost možné vyjádřit jako:
m eff = m act × a = m 0 × f × a
(2.10)
Pro monovalentní slabé kyseliny a zásady platí, že stupeň disociace závisí na jejich
disociační konstantě pKa a na pH pufrujícího prostředí, rovnice (2.11).
a=
1
1 + 10 pKa- pH
(2.11)
Vzhledem k tomu, že iontové sloučeniny jsou v roztoku přítomné jako různě nabité
částice A0, A1, A2 … Ak s odlišnou iontovou pohyblivostí µ0, µ1, µ2 … µk a aktuální
koncentraci c0, c1, c2 … ck, je možné efektivní pohyblivost µeff iontu i vyjádřit také jako:
m eff , i =
1
cA
k
k
i =0
i =0
å ci mi = å xi mi
(2.12)
kde c A je celková koncentrace látky A, xi je molární zlomek iontu i.
Princip elektroforetické separace je tedy založen na rozdílných pohyblivostech
iontů. Nejúčinnější separace dvou látek (slabých kyselin a zásad) je tedy při pH rovném
průměru jejich disociačních konstant. Tento způsob se nazývá „separace podle hodnot
pK“. Pokud je limitní pohyblivost separovaných kyselin dostatečně odlišná, je možné
12
tyto látky separovat za takového pH, kdy jsou plně disociovány. Tento způsob se
nazývá „separace podle pohyblivosti“ (Churáček et al., 1990).
2.1.1. Elektroosmotický tok (EOF)
Elektroosmotický tok je významná součást kapilárních elektroforetických separací
a představuje hlavní způsob pohybu iontů v hydrodynamicky otevřeném systému.
Uvnitř křemenné kapiláry dochází vlivem přítomnosti elektrolytu ke generování tří
vrstev. První je záporně nabitá stěna kapiláry, nepohyblivá vrstva, druhou pak tvoří
difusní vrstva kationtů vyrovnávající záporný náboj kapilární stěny. V elektrickém poli
se pak tato přilehlá vrstva pohybuje směrem ke katodě. Takto generovaný
elektroosmotický tok může být větší než jsou vlastní elektroforetické pohyblivosti iontů
obsažených ve vzorku. Důsledkem tohoto je, že kationty i anionty mohou být
separovány současně během jedné analýzy. První v pořadí migrují nejmenší kationty
s nejvyšším nábojem, přičemž rychlost se snižuje se snižujícím nábojem, po kationech
společně s EOF migrují všechny elektroneutrální látky. Separační pořadí aniontů,
migrujících po EOF, je opačné než pořadí kationtů a největší anionty s nejnižším
nábojem migrují dříve než malé a více nabité anionty.
Obrázek 1. Migrace iontů v přítomnosti elektroosmotického toku (EOF).
Velikost EOF je možné vyjádřit jako rychlost nebo pohyblivost pomocí vzorců:
n EOF =
e ×z
×E
h
(2.13)
13
m EOF =
e ×z
h
(2.14)
kde ζ je zeta potenciál, ε je dielektrická konstanta a η je viskozita. Generovaný
elektroosmotický tok závisí na složení elektrolytu tak, že klesá se snižujícím se pH
(slabší disociace silanolových skupin) a stoupá s jeho rostoucí iontovou silou.
Pohyblivost analytu v systému s generovaným elektroosmotický tokem je dána
jako součet efektivní pohyblivosti iontu µeff, a pohyblivosti EOF, µEOF.
m = m eff + m EOF
(2.15)
Prakticky lze hodnotu pohyblivosti vypočítat z experimentálních parametrů podle
rovnice
m=
l
l×L
=
t × E t ×V
(2.16)
kde V je vložené napětí, l je efektivní a L je celková délka kapiláry a t je migrační čas.
Kombinací rovnic (2.15) a (2.16) lze vypočítat hodnotu efektivní pohyblivost iontu.
2.1.2. Instrumentace CE metod
Základní CE přístroj se skládá z dávkovacího systému, separační kapiláry,
obvykle o vnitřním průměru od 20 do 100 µm, v případě izotachoforetického
analyzátoru ZKI 02 o průměru 800 a 300 µm, a délce od 20 do 100 cm, zdroje vysokého
stejnosměrného napětí, elektrod a detektoru. Objem dávkovaného vzorku činí 10 –
20 nl, tj. 1 – 2 % objemu kapiláry, což klade vysoké nároky na přesnost dávkování.
Vzorek může být do systému dávkován hydrodynamicky, elektrokineticky a nebo
ventilem s fixním objemem. Nejčastěji používanou metodou detekce analytů je UV
detekce, další možností je použití fluorescenční, vodivostní, elektrochemické
ampérometrické detekce a v poslední době také hmotnostní (MS) detekce (Tagliaro
et al., 1998).
14
Obrázek 2. Základní schéma CE přístroje.
2.2. ROZDĚLENÍ KAPILÁRNÍCH ELEKTROMIGRAČNÍCH TECHNIK
Mezi kapilární elektromigrační metody patří:
- kapilární zónová elektroforéza (CZE)
- micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC nebo MECC)
- kapilární elektrochromatografie (CEC)
- kapilární izotachoforéza (CITP)
- kapilární gelová elektroforéza (CGE)
- kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)
Elektromigrace probíhá buď v nosném (základním) elektrolytu, jehož koncentrace
je řádově větší než koncentrace vzorku, a nebo v diskontunuálním prostředí, kde se
ionty vzorku výrazně podílejí na přenosu náboje separačním sloupcem (kolonou,
kapilárou). Kapilární zónová elektroforéza patří do první skupiny, neboť používá nosný
elektrolyt o stejném složení i koncentraci v celém systému a separace probíhá za
konstantního proudu a napětí. Izoelektrická fokusace je příkladem separace v nosném
elektrolytu nekonstantního složení, což je nejčastěji pufr s lineárním gradientem pH.
Diskontunuálním prostředím může být samotný vzorek – metoda pohyblivého rozhraní
a kapilární izotachoforéza.
15
2.2.1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
Kapilární zónová elektroforéza je nejrozšířenější módem kapilární elektroforézy a
jde o techniku principiálně nejjednodušší. Pohyb nabitých částic je způsoben
napěťovým spádem v elektrickém poli, přičemž ionty migrují ve směru a v poměru
určeném jejich nábojem a pohyblivostí a při migraci kapilárou vytváří v základním
elektrolytu samostatné zóny, které jsou neostré. V hydrodynamicky otevřeném systému
kationty migrují jako první v pořadí, neboť směr jejich migrace je stejný jako směr
migrace elektroosmotického toku (EOF). Neutrální látky se eluují následovně, ale
nejsou separovány, protože nemají vlastní mobilitu a migrují pouze s EOF. Anionty se
eluují jako poslední, neboť směr jejich migrace je opačný než EOF (viz. kapitola 2.1.1).
CZE separace probíhá v kapiláře naplněné základním elektrolytem (BGE).
Základní elektrolyt použitý pro separaci by měl mít dostatečnou pufrovací kapacitu,
nízkou absorpci světla (při použití přímé UV detekce) a nízkou vodivost s ohledem na
tvorbu Joulova tepla. Vodivost roztoku zůstává prakticky během celého separačního
děje konstantní a tudíž i potenciálový spád se během separace nemění.
2.2.2. Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie (MEKC)
Micelární
elektrokinetická
kapilární
elektrochromatografie
je
technika
kombinující princip kapilární zónové elektroforézy a chromatografie na reverzní fázi.
MEKC umožňuje separaci elektroneutrálních látek, pomocí přídavku povrchově aktivní
látky do základního elektrolytu, a to v koncentraci větší než je její kritická micelární
koncentrace (např. CMC pro SDS je 8 až 9 mM). Po překročení CMC dojde v prostředí
základního elektrolytu k tvorbě micel, jejichž hydrofobní řetězce se vždy orientují
dovnitř micely a hydrofilní skupiny se orientují vně do vodného prostředí. Anioaktivní
povrchově aktivní látky jako je SDS migrují k anodě, to je opačně než je směr EOF.
Vzhledem k tomu, že rychlost EOF je větší než migrační rychlost micel, je jejich
výsledný směr pohybu shodný se směrem elektroosmotického toku. Výsledný separační
princip je tedy složen z migrace částic ve volném roztoku a distribuce částic mezi
volným roztokem a micelární pseudofází. Více hydrofobní analyt interaguje silněji s
micelami a je tedy micelami déle „zadržován“.
16
2.2.3. Kapilární elektrochromatografie (CEC)
Kapilární elektrochromatografie je svým
principem nejblíže kapalinové
chromatografii. Tok mobilní fáze je v CEC vyvolán aplikací vysokého napětí na
kapiláru a je totožný s EOF. Hlavní výhodou je tedy pístový rychlostní profil
elektroosmotického toku mobilní fáze, což umožňuje dosahovat při separaci
několikanásobně vyšších účinností. Použitím rozdílných náplní kapiláry je možné měnit
selektivitu stanovení, stejně jako u kapalinové chromatografie.
2.2.4. Kapilární izotachoforéza (CITP)
2.2.4.1. Princip kapilární izotachoforézy
Izotachoforetické (ITP) stanovení je založeno na rozdílné pohyblivosti iontů
stejného znaménka ve stejnosměrném elektrickém poli. V ITP je v jedné analýze možné
dělit buď anionty, nebo kationty. Separace se může provádět na nosiči (papír, sloupec,
gel) nebo ve volném roztoku. Ve volném roztoku se nejčastěji realizuje v kapiláře a
odtud název kapilární ITP. Tato separační metoda je využitelná pro separaci
ionogenních látek jako jsou organické kyseliny a báze, aminokyseliny, peptidy,
proteiny, kovové ionty apod. Izotachoforéza pracuje s malými množstvími vzorku.
Umožňuje stanovit ještě desítky ng látek, což při nástřiku jednotek až desítek ml vzorku
vede k analyzovatelným koncentracím na úrovni jednotek až desítek mg.l-1 (mg.kg-1).
Tato technika se vyznačuje vysokou přesností a citlivostí. Dalšími výhodami jsou
minimální úprava vzorku, nízké provozní náklady, univerzálnost a vysoká citlivost.
V ITP se používají dva základní elektrolyty - vedoucí a zakončující. V případě
analýzy aniontů vedoucí elektrolyt obsahuje anion L, který má nejvyšší pohyblivost z
celé separované směsi. Součástí vedoucího elektrolytu je protiion P opačného znaménka
než vedoucí ion, který zaručuje během analýzy definované pH. Zakončující elektrolyt
obsahuje anion T, který má nižší pohyblivost než kterýkoliv ze separovaných iontů.
Vzorek A, B se vkládá do rozhraní těchto elektrolytů. Po zapnutí stejnosměrného
elektrického proudu migrují zóny v pořadí jejich pohyblivosti. Za zónou vedoucího
aniontu L se vyděluje nejpohyblivější ze směsi (A), za ním migruje zóna směsi aniontů
A a B a před zónou zakončujícího aniontu T migruje zóna B. Po dosažení ustáleného
stavu (viz. Obrázek 3), tj. po úplné separaci všech složek se tyto pohybují stejnou
17
rychlostí v těsně za sebou oddělených zónách v pořadí klesající pohyblivosti.
V ustáleném stavu tedy platí rovnice (2.17)
n = m L × E L = m i × Ei = m T × ET = konst.
(2.17)
kde m L , mi a mT jsou efektivní pohyblivosti vedoucího, separovaného a koncového
iontu a EL, Ei a ET jsou intenzity elektrického pole v odpovídajících zónách. Pro tento
stav typický pro izotachoforézu je charakteristické:
i.
každá ze zón obsahuje pouze jeden druh aniontu (pokud bylo dosaženo úplné
separace)
ii.
ve všech zónách je přítomen stejný protiion shodný s protiiontem vedoucího
elektrolytu
iii.
koncentrace příslušného aniontu je podél zóny konstantní a mimo ni nulová,
zóny jsou uspořádány v pořadí klesající efektivní pohyblivosti od vedoucího
k zakončujícímu iontu (kromě případu inverze pohyblivosti)
iv.
fyzikální vlastnosti (koncentrace, elektrická vodivost, intenzita elektrického
pole, pH, teplota) se mění od zóny k zóně skokem a toto dovoluje použití
fyzikálně-chemických metod detekce pro vyhodnocení separace
Konstantní koncentrace iontu v jeho zóně a ostré ohraničení jednotlivých zón je
při izotachoforetické separaci zaručené tzv. samozaostřujícím efektem. V případě, že
anion A se difúzí dostane do zóny B, kde je vyšší intenzita elektrického pole, bude tento
urychlený a vrátí se do vlastní zóny. Analogicky, když se anion B dostane do zóny A o
nižší intenzitě elektrického pole, je jeho migrace zpomalená a vrátí se do vlastní zóny.
V důsledku tohoto jsou hranice mezi zónami velmi ostré (cca 0,1 mm) a fyzikální
vlastnosti (E, pH, teplota, vodivost, UV absorpce apod.) se na hranicích mění skokem,
což umožňuje použití fyzikálních metod detekce. Koncentrace iontu v zóně není
libovolná, ale je vázaná tzv. Kohlrauschovou regulační funkcí (2.18), která je základem
kvantitativního vyhodnocení
ci = c L
mi m L + m P z L
×
×
m L mi + m p zi
(2.18)
kde ci a cL jsou látkové koncentrace separované látky a vedoucího elektrolytu v jejich
zónách po dosažení ustáleného stavu; µi, µL a µP jsou pohyblivosti separovaného
vedoucího iontu a protiiontu a zi, zL jsou náboje odpovídajících iontů. Praktickým
18
důsledkem této skutečnosti je, že v případě nadávkování koncentrovaného vzorku se
koncentrace sníží na koncentraci odpovídající ustálenému stavu a naopak při
nadávkování zředěného vzorku dochází k zakoncentrování (viz. Obrázek 4), což je
žádané zvláště v případě stopové analýzy. V ITP je běžné 103 až 105 násobné
zakoncentrování během separace.
Obrázek 3. Separace směsi aniontů A a B izotachoforetického principu; a) situace na
počátku analýzy; b) situace po určité době od startu analýzy; c) situace po dosažení
ustáleného stavu; d) grafické znázornění průběhu napětí (V), intenzity elektrického pole
(E) a koncentrace (c) po dosažení ustáleného stavu.
19
Obrázek 4. Koncentrační efekt v izotachoforéze. Stejné množství nX látky X bez ohledu
na analyzovaný objem (VX1 < VX2) a koncentraci (cX1 > cX2) za stejných separačních
podmínek (v různých průřezech kapiláry) po dosažení ustáleného stavu se bude
nacházet ve stejném objemu VX, protože koncentrace cX v zóně je určena
Kohlrauschovou regulační funkcí.
2.2.4.2. Způsob detekce a vyhodnocení analytů v CITP
Detektor je umístěný na konci kapiláry a analytické údaje se vyhodnocují "online". V současnosti jsou nejpoužívanějšími typy detekce vodivostní a gradientová
(univerzální detekce), které využívají rozdílné vodivosti resp. gradientu elektrického
pole v jednotlivých zónách. Mezi nejpoužívanější specifické detektory patří UV
detektor. Optimální variantou je kombinace univerzálního detektoru s UV detektorem.
Kvalitativní informaci v ITP poskytuje výška vlny na záznamu z univerzálního
detektoru. Výška se nejčastěji vyjadřuje jako poměrné číslo RSH (Relative Step Height)
získané poměrem rozdílu výšky vlny látky X a vlny vedoucího iontu hX – hL a rozdílu
výšky vlny zakončujícího a vedoucího iontu hT - hL (viz. Obrázek 5). Při identifikaci
neznámé látky X se zjištěná hodnota RSH porovná s hodnotou RSH standardu St
analyzovaného za shodných podmínek. Zóny se v kapiláře pohybují konstantní rychlostí
(konstantní hnací proud) a koncentrace iontu v zóně je také konstantní. Z toho vyplývá,
že doba průchodu zóny detektorem je přímo úměrná nadávkovanému množství látky.
Ostrá rozhraní mezi zónami umožňují velmi přesné měření délky zóny a tedy i vysokou
přesnost výsledků.
20
lX
lS t
T
R
St
hT - hL
hSt - hL
hX - hL
X
L
čas
Obrázek 5. Izotachoforegram rozdělené dvousložkové směsi neznámé látky X a
standardu St; R je signál detektoru (ohmický odpor), hi je výška vln příslušných složek a
li je jejich délka.
2.2.4.3. Volba vedoucích a koncových elektrolytů
Velmi důležitým problémem při volbě elektrolytového systému pro jakýkoliv typ
elektroforézy (a tedy i pro izotachoforézu) je ionizace analyzovaných látek. K jejich
separaci je třeba, aby byly alespoň částečně disociovány či protonizovány, tj. aby jejich
efektivní pohyblivost byla dostatečně velká. Z praktického hlediska je ještě
akceptovatelná minimální pohyblivost 5.10-9 m2.V-1.s-1.
Hodnota pH se volí tak, aby se využila optimální pufrační kapacita systému.
V některých případech (při dělení iontů silných elektrolytů) pufrační schopnost
protiionu není nutná, jindy je třeba dvou nebo více pufrujících protiiontů. Koncový
elektrolyt vhodný pro separaci kationtů má mít nižší pH než vedoucí elektrolyt, při
analýze aniontů platí opačný požadavek. V izotachoforéze je pufrování zón poněkud
21
složitější než v ostatních typech elektroforézy. Není zde žádný základní elektrolyt a celé
pufrování je úkolem pouze protiionového systému. Toto pufrování není jednoduché,
neboť poměry v protiionovém systému se mění od zóny k zóně. V izotachoforéze
průběh pH od vedoucí zóny ke koncové podléhá přesným zákonitostem. V anionové
izotachoforéze pH zón ve směru od vedoucí ke koncové zóně stoupá, v kationové klesá.
Jednoznačně platí toto pravidlo v případě silných elektrolytů. Obecně lze říci, že čím
kyselejší je vedoucí elektrolyt při kationové analýze, tím kyselejší jsou zóny vzorku. Při
anionové analýze je situace analogická s tím rozdílem, že průběh pH je opačný.
Doporučuje se, aby pK látky, jež je zdrojem koncového iontu, bylo vyšší než pK
nejslabší kyseliny analyzované směsi (jinak by se mohly „ztrácet“ méně kyselé
komponenty v zakončujícím elektrolytu).
Obecná pravidla pro volbu operačního systému shrnuje Tabulka I. Jako vedoucí
ion je zpravidla volen rychlý ion plně disociované látky, která je k dispozici ve vysoké
čistotě. Jako koncové ionty je ve vodných systémech vždy nutné brát v úvahu H3O+
(kationická analýzy) či OH- (anionická analýza), které musí vždy tvořit potenciálně
poslední zónu. Vzhledem k tomu, že tyto ionty mají ve vodě nejvyšší pohyblivost ze
všech iontů, mohou se pohybovat mnohem rychleji a důsledkem může být
nekontrolovaný pohyb těchto iontů přes izotachoforetická rozhraní, a tím narušení
izotachoforézy.
Tabulka I. Obecná pravidla pro volbu elektrolytových systémů (Boček et al., 1987).
Parametr
Vedoucí ion
Zakončující ion
Protiion
Podmínka ionizace analytů
Kation-ová analýza
K+, Na+, NH4+, H3O+
H3O+, slabá báze
Slabá kyselina HA
pH £ pKBH + 1
Anion-ová analýza
Cl-, NO3-, OHOH-, slabá kyselina
Slabá báze BH
pH ³ pKHA - 1
2.2.4.4. Základní doporučené operační systémy
Kationty: vedoucí anion K+- (0,001 – 0,05 M-KOH) + protiion + 0,05 – 0,2 %
aditivum (hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza,
polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon)
22
Tabulka II. Základní doporučené operační systémy po stanovení kationtů
(Boček et al., 1987).
pHL
4,0 – 5,5
5,5 – 6,5
6,5 – 7,5
7,8 – 8,8
8,8 – 9,8
9,0 –10,0
9,8 – 10,8
Protiion
octová
MES, kakodylová
HEPES
TAPS
boritá
glycin
b-alanin
Zakončující kation
H3O+ (octová kyselina), b-alanin, EACA, kreatinin, TBA
EACA, Histidin, imidazol, kreatinin, TRIS
TRIS, His,
TRIS, BICIN, TRICIN
TRIS, triethanolamin
TRIS, lysin, ethanolamin,
NH4+, ethanolamin
Anionty: vedoucí anion Cl- (0,002 – 0,02 M-HCl) + protiion + 0,05 – 0,2 % aditivum
(hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, polyvinylalkohol,
polyvinylpyrrolidon)
Tabulka III. Základní doporučené operační systémy pro stanovení aniontů
(Boček et al., 1987).
pHL
2,0 – 3,0
2,5 – 3,5
3,0 – 4,0
4,0 – 5,0
4,5 – 5,5
5,5 – 6,5
6,5 – 7,5
7,5 – 8,5
8,5 – 9,5
9,0 –10,0
Protiion
Glycin
Glycylglycin
b-alanin
6-aminokapronová
Kreatinin
Histidin
Imidazol
Tris
Ammediol
Ethanolamin
Zakončující anion
Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová
Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová
Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová
Kyselina kapronová, glutamová, MES
Kyselina kapronová, glutamová, MES
Kyselina kapronová, glutamová, MES, HEPES
Kyselina MES, HEPES, TAPS
(TAPS, glycin, b-alanin) + Ba(OH)2
(CAPS, glycin, b-alanin, EACA) + Ba(OH)2
(CAPS, EACA, GABA) + Ba(OH)2
2.2.5. Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
Kapilární gelová elektroforéza je vlastně kapilární zónová elektroforéza ve
vhodné gelové matrici. Separačním principem je tedy migrace nabitých částic v
prostředí molekulárního síta vlivem vloženého potenciálového spádu. Gelová
elektroforéza aplikovaná v kapilárním měřítku přináší několik výhod oproti klasickému
deskovému uspořádaní. Je možné použít 10 až 100-krát větší elektrické pole, bez
projevení se negativního vlivu Joulova tepla. Dalšími výhodami jsou detekce analytů
přímo v kapiláře a možnost automatizace stanovení. Hlavní nevýhodami jsou malá
reprodukovatelnost přípravy gelem plněných kapilár a jejich nízká životnost.
23
2.2.6. Kapilární izoelektrická fokuzace (CIEF)
Kapilární izoelektrická fokuzace je velmi rozšířenou metodou pro separaci
proteinů. Principem je separace amfolytů v pH gradientu na základě rozdílných hodnot
jejich izoelektrických bodů (pI). Vzorek se aplikuje ve směsi se základním amfolytem
(směs spojitě pokrývající kyselé, neutrální až zásadité amfolyty), jenž definuje gradient
pH v kapiláře. Po aplikaci napětí dojde po určité době ke stavu, ve kterém všechny
amfolyty dosáhnou polohy v kapiláře odpovídající jejich izoelektrickému bodu
(pH = pI). Tento stav se projeví poklesem proudu procházejícího kapilárou k nulové
hodnotě. Metoda izoelektrické fokuzace má tedy dvě fáze, a sice vlastní fokuzaci a fázi
detekce-mobilizace (aplikace tlaku, chemická mobilizace).
2.2.7. Technika spojování separačních kapilár „column-coupling“
Tato technika využívá spojení dvou kapilár bifurkačním blokem a umožňuje tak
využit předseparační kapiláru pro oddělení makrosložek vzorku a na analytické kapiláře
provést separaci žádaných látek (Kanianský & Marák, 1990; Kanianský et al., 1999;
Kvasnička et al., 2001; Valcárcel et al., 2001). Další výhodou dvoukolonového
uspořádání je možnost použít pro separaci elektrolyty o různé koncentraci (CITP-CITP
systém koncentrační kaskády), nebo systému dvou různých elektrolytů (dvourozměrná
izotachoforéza – 2D-CITP) a nebo CITP-CZE separační mód, který umožňuje zvýšit
účinnost CZE separace zakoncentrováním analytů v CITP kroku (Foret et al., 1990). Na
Obrázku 6 je znázorněna CITP-CZE separace. (A) ITP separace – předseparační
kapilára; separace probíhá mezi vedoucím (LE) a koncovým elektrolytem (TE), zóny
analytů (1, 2, 3 a 4) jsou zakoncentrovány do oddělených zón, kde makrosložka
matrice (1) má nejvyšší pohyblivost ze složek vzorku. (B) CZE separace – separační
kapilára; separace probíhá v prostředí základního elektrolytu (BGE), naprostá většina
makrosložka matrice (1) byla v bifurkačním bloku oddělena, ostatní analyty (2, 3 a 4)
migrují separační kapilárou v oddělených zónách. Toto uspořádání je vhodné pro
analýzu stopových koncentrací ionogenních látek v nadbytku iontů v matrici a
umožňuje tak až 100–krát zvýšit detekční limit v porovnání s CITP (Foret et al., 1993).
24
Obrázek 6. Schématická ilustrace spojení kapilární izotachoforézy (CITP) a kapilární
zónové elektroforézy (CZE). (A) CITP separace, (B) CZE separace, I1 – směr toku
proudu v CITP módu, I2 – směr toku v CZE módu, BF – bifurkační blok.
V literatuře je popsáno využití CITP-CZE pro analýzu anorganických iontů
(Kanianský et al., 1994) a Fe3+ jako Fe(III)-EDTA komplex (Blatný et al., 1997) v říční
vodě, EDTA v majonézách (Kvasnička & Míková, 1996), flavonoidů v rostlinných
extraktech (Urbánek et al., 2002), lysozymu ve vaječném bílku (Kvasnička, 2003) a pro
farmaceutické aplikace (Gyseler et al., 1999).
25
2.3. VYUŽITÍ KAPILÁRNÍCH ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD
V ANALÝZE POTRAVIN
Potraviny se obecně skládají z velmi mnoha látek rozdílných chemických
vlastností. S příchodem moderních analytických metod, plynové (GC) a kapalinové
chromatografie (HPLC), byly tyto metody již od počátku požívány pro analýzu
potravin. Zejména kapalinová chromatografie je pro analýzu potravin hojně využívaná,
avšak tato metoda má v některých případech nedostatečné separační možnosti.
V porovnání s elekromigračními metodami nelze HPLC stanovení jednoduše selektivně
modifikovat pro vybrané analyty a HPLC stanovení je také řádově finančně nákladnější.
Stanovení netěkavých a nestabilních látek plynovou chromatografii je bez předchozí
derivatizace nemožné a tím se její oblast použití v analýze potravin značně zužuje.
Kapilární elektromigrační metody mohou tedy, s výjimkou stanovení lipidů, sloužit jako
alternativní analytické techniky s vysokou variabilitou a mnohostranným použitím
v analýze potravin (Dong, 1999; Kvasnička, 2000). Pro stanovení analytů v potravinách
je možné využít všech kapilárních elektromigračních metod, ale velká většina aplikací
je založena na využití kapilární izotachoforézy (CITP), a to zejména pro analýzu
biogenních kationtů, anorganických kyselin a jejich solí (Blatný & Kvasnička, 1999),
kapilární zónové elektroforézy (CZE) a micelární elektrochromatografie (MECK), jež
umožňuje stanovit elektroneutrální a nepolární látky. Např. syntetická barviva
(Frazier et al., 2000), vitamin A, antioxidanty a konzervační látky v nealkoholických
nápojích (Thompson et al., 1995). Jednou z velkých výhod použití obecně všech
elektromigračních metod je snadná příprava vzorků, kdy obvykle postačuje připravit
vodné roztoky či extrakty.
Analytické rozbory potravin se provádějí pro stanovení jejich kvality a zdravotní
nezávadnosti, tudíž jde tedy o tři základní oblasti, v nichž se uplatňují CE metody:
(i) stanovení složení deklarovaného výrobcem – stanovení organických kyselin
(mléčné, octové, jablečné, vinné, citrónové, izocitrónové (Ježek & Suhaj, 2001),
fumarové (Kvasnička & Voldřich, 2000b), kyseliny askorbové a dehydroxyaskorbové
(Cancalon, 1999) v ovocných šťávách, džusech a vínech, sacharidů, flavonoidů,
vitaminů (Cancalon, 2003), aminokyselin (lysin, methionin, 3-methylhistidin)
(Kvasnička, 1999), bílkovin – stanovení ovoalbuminu a lysozymu (Stover, 1988;
26
Gilges et al., 1994; Baryla & Lucy, 2000; Kvasnička, 2003), kreatininu v masných
výrobcích (Kvasnička & Voldřich, 2000a).
(ii) stanovení potravinářských aditiv – antioxidantů, konzervačních látek, barviv,
sladidel (viz. kap. 2.1.3), ochucovadel – glutamát, guanosin-5-monofosfát, inosin-5monofosfát (Kenndler & Huber, 1980) a anorganických solí (polyfosfáty v masných
výrobcích a sýrech).
(iii) stanovení látek ohrožujících zdraví konzumenta – tzn. těžké kovy, rezidua
pesticidů a antibiotik, přírodní toxiny – glukosinoláty, glykoalkaloidy (Kvasnička et al.,
1994), tetrodotoxin, biogenní aminy – stanovení MEKC (Nouadje et al., 1995) a CZE
(Lange et al., 2002) v mléčných výrobcích, MEKC stanovení v rybách (Křížek
& Pelikánová, 1998), víně (Nouadje et al., 1997) a sojové omáčce (Rodriguez et al.,
1996).
Zákon číslo 110/1997 Sb. ve znění Vyhlášky 53/2002 Sb. takovéto látky přesně
definuje a pro každou látku také určuje její maximální přípustné množství v určité
potravině.
2.3.1. Stanovení potravinářských aditiv
Barviva
Syntetická
barviva
jsou
v potravinách,
obvykle
v nápojích
a sirupech,
stanovována kapilární zónovou elektroforézou (CZE). Razze et al. (1995) popisuje
separaci barviv v borátovém pufru o pH 7,5 s přídavkem β-CD a hmotnostní detekcí.
Další autoři uvádějí separace v alkalickém prostědí základních elektrolytů o pH 9,0
(Liu et al., 1995), pH 9,5 (Royle et al., 1998), pH 10,5 (Berzas Nevado et al., 1999),
pH 11,0 (Urquiza & Beltrán, 2000). Analyty se detektují přímou UV detekcí při 200,
220, 254 a 280 nm, přičemž je třeba při použití DAD detektoru volit příslušnou vlnovou
délku pro jednotlivé barviva. Karovičová et al. (1991) popisuje CITP separaci
syntetických barviv s vodivostní detekcí v prostředí vedoucího elektrolytu o pH 3,5
(10 mM HCl – β-alanin) a 5 mM kyselinou octovou jako koncovým elektrolytem.
27
Konzervační látky, antioxidanty, sladidla
Konzervační látky (kyselina benzoová, sorbová), antioxidanty (BHA, BHT,
TBHQ) a sladidla (sacharin, cyklamát, Acesulfam K, Aspartam) se většinou stanovují
ve stejných druzích potravin, jako jsou: víno, nealkoholické dietní nápoje, džusy,
ovocné sirupy, džemy, sojové omáčky atd.. V literatuře jsou popsána simultánní
stanovení těchto analytů micelární elektrochromatografií v nápojích a v dietním džemu
(Boyce, 1999; Richard et al., 2000). Při samostatném stanovení konzervačních látek se
obvykle používají základní elektrolyty o pH ~9, které mohou být modifikovány
přídavkem α-/β-CD (Kuo & Hsieh, 1997) a nebo 5 % acetonitrilu (Cancalon, 1999). Pro
stanovení antioxidantů v potravinách se téměř výhradně používá kapilární micelární
elektrochromatografie. Stejně jako u stanovení konzervačních látek se pro separaci
používají alkalické základní elektrolyty o pH 9 – 10 s přídavkem SDS (Hall et al., 1994;
Abrantes et al., 1997), SC/SDS/methanolu (Boyce & Spickett, 1999).
Simultánní stanovení sladidel (sacharin, Acesulfam K, Aspartam) je možné
micelární elektrochromatografií (Trenerry, 1998; Richard et al., 2000). Pro samostatné
stanovení aspartamu je možné použít kapilární izotachoforézu (Kvasnička, 1987) a
kapilární zónovou elektroforézu, kde se separace provádí v alkalickém prostředí
fosfátového pufru (Pesek & Matyska, 1997), glycinového pufru – pH 9,0 (Walker et al.,
1997), borátového pufru – pH 9,35 (McDevitt et al., 1998, Sabah & Scriba, 1998).
2.4. FOSFÁT A POLYFOSFÁTY
Používání polyfosfátů jako aditiv v potravinářském průmyslu je zavedeno snad na
celém světě již několik desetiletí. Přídavkem polyfosfátů, respektive derivátů kyseliny
fosforečné zvyšujeme obsah fosforu nad jeho přirozenou hladinu. Polyfosfáty, jako
potravinářské aditivum, jsou nejčastěji používány zejména v masném průmyslu a dále
pak při výrobě sýrů.
2.4.1. Přirozený obsah fosforu v mase
Fosfor přirozeně přítomný v mase v množství od 1200 do 2500 mg.kg-1, je jednou
z významných složek masa (veškeré živé hmoty). Sloučeniny fosforu jsou klíčové v
28
energetickém metabolizmu, kde fungují jako zásobárna energie v podobě ATP, GTP,
fosfoenolpyruvátu a kreatinfosfátu. Sloučeniny fosforu s lipidy (fosfolipidy) jsou
součástí biomembrán a tvoří tak důležitou část biologických struktur.
2.4.2. Polyfosfáty v masných výrobcích
V masné technologii jsou polyfosfáty přidávány zejména pro zvýšení vaznosti
masa (tj. jeho schopnost vázat vodu) a tím ke snížení hmotnostních ztrát při tepelném
opracování. Polyfosfáty, jež vyvazují těžké kovy do komplexu, také zabraňují změnám
barvy, zpomalují oxidaci lipidů a stabilizují vitamín C. Dále snižují i tepelnou odolnost
mikroorganizmů a udržováním bílkovin v rozpustném stavu zlepšují rovněž emulgaci
tuků. Požadovaný účinek zvýšení vaznosti pomocí aditivních polyfosfátů se vysvětluje
vazbou vápenatých iontů, obecně vícemocných kationtů kovů, čímž dochází k disociaci
příčných vazeb ve struktuře svalové tkáně. Uvolněním pevných vazeb aktomyosinu se
od sebe filamenta mohou vzdalovat a uvolnit tak prostor pro molekuly vody. Přítomné
polyfosfáty také posouvají pH masa do oblasti vzdálené od izoelektrického bodu a tím
rovněž přispívají ke zvýšení vaznosti (Pipek, 1995).
Nejčastěji jsou používané směsi difosfátu (pyrofosfátu), trifosfátu a tetrafosfátu.
Je třeba dodat, že pouze difosfát vyvolává disociaci aktinu a myosinu přímo, kdežto
trifosfát a více kondenzované fosfáty až po enzymovém rozkladu na difosfát
(Hamm & Neraal, 1977). Enzymy trifosfatáza a pyrofosfatáza, jež jsou přítomny v
tepelně neopracovaném mase, jsou odlišně citlivé ke změně teploty (trifosfatáza je méně
závislá). Tohoto je využíváno při výběru složení směsí polyfosfátů, neboť rozdílný
poměr mezi obsahem trifosfátu a difosfátu může ovlivnit průběh reakcí v mase.
Trifosfáty jsou degradovány na difosfát během kratší doby, než se při tepelném
opracování dosáhne teploty, při které dojde k inaktivaci trifosfatázy. Proto byl v tepelně
opracovaných masných výrobcích nalezen společně s fosfátem pouze difosfát.
Nadměrný příjem polyfosfátů v potravě způsobuje, že jejich rezidua v těle
konzumenta vyvazují zejména vápenaté a hořečnaté ionty a tím tak o ně organismus
ochuzují. Z tohoto důvodu je ze zákona 110/1997 Sb. O potravinách a tabákových
výrobcích dle vyhlášky 53/2002 Sb. stanoven maximální povolený přídavek polyfosfátů
do masných výrobků, který činí 5000 mg.kg-1, počítáno jako P2O5.
29
2.4.3. Metody stanovení fosfátu a polyfosfátů
Klasické metody
Pro sledování a kontrolu obsahu fosforu (fosfátu) v potravinách se používají
převážně klasické analytické metody, jako jsou gravimetrie a spektrofotometrie. Při
gravimetrickém stanovení celkového fosforu je ze vzorku fosfor vysrážen ve formě
komplexu chinolin fosfomolybdenanu (ISO 2294-1974).
Spektrofotometrické stanovení je založeno na reakci fosfátu s molybdenanem
sodným s kyselinou askorbovou, jež slouží jako redukční činidlo reakce, a vzniku
modrého komplexu [(MoO2.4MoO3)2.H3PO4] a na měření jeho absorbance při vlnové
délce λ = 823 nm (Pulliainen & Wallin, 1994; Pulliainen & Wallin, 1996). Autoři
(Cattaneo & Balzaretti, 1997) uvádějí jako redukční činidlo hydrazin a vlnovou délku
maximální absorbance komplexu λ = 600 nm. Pulliainen (Pulliainen & Wallin, 1994)
uvádí, že spektrofotometrické stanovení fosforu je aplikovatelné pro všechny typy
potravin. Při použití obou metod je nutné nejprve vzorek mineralizovat na suché nebo
mokré cestě. Z toho plyne nevýhoda této metody, která umožňuje stanovení pouze
celkového fosfátu přirozeně přítomného společně s aditivním bez možnosti rozlišit jeho
jednotlivé formy.
Elektromigrační metody
Z kapilárních elektromigračních metod je pro stanovení polyfosfátů možné použít
kapilární izotachoforézu (CITP), kapilární zónovou elektroforézu (CZE) a kapilární
gelovou elektroforézu (CGE). Kapilární izotachoforéza z nich byla první prakticky
využívanou metodou. Autoři (Boček et al., 1978), separovali P1, P2 a P3 použitím
vedoucího elektrolytu obsahujícím 5 mM HCl s 10 mM histidinu (pH = 6) a 10 mM
kyselinou glutamovou jako koncovým elektrolytem. Motooka et al. (1983) využili
obdobný separační systém HCl – histidin (pH = 5,5) pro separaci P1 – P4. Ve své další
práci autor (Motooka et al., 1984) separoval cyklické metapolyfosfáty (P3m, P4m, P6m,
P8m). Janoš (1990) publikoval separaci trimetafosfátu, jenž je pro lidské zdraví
potenciálně nebezpečný, P1 a P2 v potravinářských aditivech.
Možnost využití kapilární zónové elektroforézy pro analýzu anorganických iontů
je dlouho známa (Jorgenson & Lukacs, 1981). Protože však polyfosfáty neabsorbují v
30
UV oblasti, tak byly první články o separace polyfosfátů publikovány až mnohem
později. Ve všech publikovaných pracích je k detekci polyfosfátů používána nepřímá
UV detekce. Autoři (Stover & Keffer, 1993) separovali P3, P2 a P1 v křemenné kapiláře
(75 µm I.D.) v prostředí ftalátového pufru o pH = 4. Doby analýzy byla 5 minut a
anodický směr EOF byl zajištěn přídavkem dodecyltrimethylamonium bromidu do
základního elektrolytu. Autoři popisují nízkou detekční citlivost pro citlivost P3 a P2 a
slabou opakovatelnost pro P3. Další autoři (Shamsi & Danielson, 1995) studovali
separaci polyfosfátů (P1 – P4) v základním elektrolytu obsahujícím AMP a to v
intervalu pH od 6,8 do 8,3. Autoři dosáhli dobré separace P1, P2 a P3 použitím
elektrolytu 5 mM ATP + 100 mM H3BO3 o pH = 7,10 s přídavkem Mg2+, přičemž
separace P3 a P4 byla možná pouze s přídavkem 0,2 mM EDTA do základního
elektrolytu. Na tuto práci navazují autoři (Wang & Li, 1996), kteří použili pro úspěšnou
separaci P1, P2, P3 a P3m základní elektrolyt obsahující 10 mM ATP a 0,05 mM CTAB
o pH = 3,5. Separace polyfosfátů s vyšším počtem atomů fosforu je také proveditelná
kapilární zónovou elektroforézou. Stover (1997) publikoval separaci polyfosfátů, s
počtem atomů fosforu Pn < 30, v systému s kationickým elektroosmotickým tokem a s
nepřímou UV detekcí při 254 nm.
Pro separaci polyfosfátů s dlouhým řetězcem lze použít také kapilární gelovou
elektroforézu (CGE) s nepřímou UV detekcí (Wang & Li, 1998). Polyfosfáty byly
separovány v kapiláře naplněné lineárním gelem připraveným polymerací 12 % roztoku
akrylamidu, 20 mM TRIS a 5 mM benzen-1,2,4,5-tetrakarboxylové kyseliny (pH = 7,2).
Ve vzorku syntetických anorganických polymerů kondenzovaných fosfátů bylo touto
metodou separováno a detekováno více než 30 sloučenin.
Tématem separace oxoaniontů fosforu se zabývá (Stover, 1999) ve své práci na
toto téma a dalším podrobným přehledem CE metod autoři Wang & Li, (1996; 1998;
1999).
Chromatografické metody
Chromatografické techniky jsou velmi často také využívány pro analýzu
kondenzovaných fosfátů. Je popsána metoda (Krzynowek, 1995) detekce polyfosfátů v
mořských rybách metodou tenkovrstvé chromatografie (TLC). Nejpoužívanější však je
metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Touto metodou je možné
31
stanovit lineární i cyklické polyfosfáty a stanovit také délku jejich řetězce. Z různých
možných módů HPLC je pro stanovení polyfosfátů nejpoužívanější iontová
chromatografie. Pro detekci polyfosfátů se používají tyto metody:
(i) spektrofotometrická post-kolonová detekci s molybdenanem (Linares et al.,
1991; Halliwell et al., 1996) či s FeCl3 a kyselinou sulfanilovou (Matsunaga & Oozumi,
1990); (ii) nepřímá UV detekce (Shamsi & Danielson, 1993; Svoboda & Schmidt,
1997); (iii) vodivostí detekce (Stover et al., 1994; Baluyot & Hartforf, 1996; Cui et al.,
2000; Sekiguchi et al., 2000).
2.4.4. Stanovení přidaného fosfátu v masných výrobcích
Legislativa definuje maximální přídavek polyfosfátů jako 5000 mg P2O5 v
kilogramu výrobku. Spektrofotometrická metoda, jež se téměř výhradně pro stanovení
P2O5 v potravinách používá, dokáže stanovit pouze celkový obsah fosfátu. Obsah
přidaného (aditivního) fosfátu v masném výrobku je nutné vypočítat z rozdílu mezi
celkovým obsahem P2O5 a fosfátem přítomným v mase. Obsah přidaného fosfátu v
mg.kg-1 se tedy vypočte podle vzorce:
X = A - ((B × C ) × F ) ×10 4 (mg.kg-1)
(2.16)
kde X je obsah přidaných fosfátů (mg.kg-1), A je obsah celkového fosforu v mg P2O5 v
kg, B je obsah bílkovin v % [N(%) . 6,25], C je poměr mezi obsahem fosforu a bílkovin
v mase (0,0106, 1 g bílkovin masa obsahuje průměrně 10,6 mg P) (Kłossovska, 1998) a
F je přepočítávací faktor mezi fosfátem a fosforem (2.17).
P2O5 = 2,29 . P
(2.17)
2.5. KARBOXYLOVÉ KYSELINY V SILÁŽÍCH
2.5.1. Vznik karboxylových kyselin v silážích
Při přípravě siláže je rostlinný materiál nařezán a zkompaktněn a skladován tak,
aby fermentační proces probíhal za nepřítomnosti kyslíku, tj. aby byl z materiálu
32
odstraněn vzduch a dále bylo zabráněno jeho přístupu k silážovanému materiálu.
Přirozeně přítomné mikroorganizmy přeměňují část cukrů a dalších energeticky
využitelné složky přítomné v materiálu na karboxylové kyseliny. Hlavní karboxylovou
kyselinou, jenž je produkována mikroorganizmy při správném průběhu fermentace, je
kyselina mléčná, která je produkována bakteriemi mléčného kvašení. Pokud dojde
k zvrhnutí fermentačního procesu činností mikroganizmu Clostridium butyricum
z následné fermentace obsahuje siláž velké množství kyselin máselné a octové a jen
nízký obsah kyseliny mléčné.
Bakterie mléčného kvašení jsou gram pozitivní, fakultativně anaerobní bakterie,
které přeměňují více než 50 % cukrů na mléčnou kyselinu a zahrnují rody jako jsou
Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Enteroccocus, Pediococcus, Leuconostoc,
přičemž Lactobacillus plantarum je hlavní hetero–fermentativní laktobacil podílející se
na fermentačním procesu (Ohmono et al., 2002).
2.5.2. Hodnocení kvality siláže
Posoudit kvalitu siláže je možné na základě posouzení jejího chemického složení.
Hlavními parametry pro určení kvality siláže je obsah karboxylových kyselin. S
ohledem k tomu, že kyselina mléčná je hlavním produktem fermentačního procesu, jsou
tyto parametry vztaženy na její obsah. Průměrný obsah kyseliny mléčné je 6,6 %
v sušině siláže a to představuje 60 % obsahu všech kyselin. U siláže s excelentním
průběhem fermentace je obsah kyseliny mléčné v sušině v intervalu od 3 do 14 %.
Také obsah dalších karboxylových kyselin vzniklých hetero-fermentativním
kvašením (kyselina octová), činností baktérií rodu Propionibacterium (kyselina
propionová) a činností sacharolytických klostridií (kyselina máselná) je velmi důležitý
pro posouzení kvality siláží. Většina siláží obsahuje jen velmi málo kyseliny
propionové. V silážích s nízkým obsahem sušiny (< 25 %) je kyselina propionová
přítomná v koncentracích od < 0,2 do 1,0 %, na rozdíl od siláží s obsahem sušiny 35 až
45 %,
kde
přítomnost
kyselina
propionová
nemusí
být
ani
detektována
(Kung & Shaver). Kyselina octová se vyskytuje ve vyšším množství (3 % až 4 %)
v silážích s velmi nízkým obsahem sušiny (< 25 %), dále pak u siláží s prodlouženou
fermentační dobou a také v případech, kdy nebyla správně dodržena technologie
silážování. Vyšší obsah kyseliny octové bývá také nalezen, pokud bylo použito kultury
33
Lactobacillus buchneri pro zlepšení aerobní stability siláže. Siláž, která obsahuje
vysoké koncentrace kyseliny máselné (> 0,5 % v sušině), je velmi nekvalitní, proces
prodělal klostridiální fermentaci a vlastní siláž má nízký energetický obsah. Celkový
obsah kyselin se vyjadřuje jako titrační kyselost (tedy spotřeba NaOH či KOH při titraci
do pH 8,3, vztažená na jednotku hmotnosti siláže), zatímco vlastní hodnota pH siláže je
výslednicí obsahu přítomných kyselin, zásaditých a tlumivých látek. Žádoucí hodnoty
pH jsou v intervalu 3,8 – 4,2. Hodnoty pH vyšší než 4,2 indikují riziko zvrhnutí
fermentačního procesu při následném skladování siláže (Kung & Shaver).
Další hlavní parametry, které je možné sledovat u siláží, je obsah ethanolu, jenž
ukazuje činnost kvasinek během fermentace, a podíl amoniakálního dusíku (NH3-N) z
celkového obsahu dusíku, kdy hodnoty pod 10 % značí dobrou fermentaci materiálu a
naopak hodnoty vyšší než 20 % špatnou fermentaci (Kung & Shaver). Průměrné
hodnoty těchto kvalitativních ukazatelů jsou pro různé typy siláží sumarizovány
v Tabulce IV.
Tradiční metodou (Flieg, 1938; Zimmer, 1966) je hodnocení kvality pomocí tzv.
Fliegovy stupnice, kdy je vzorek siláže destilován s vodní parou a kyselina octová a
máselná jsou poté stanoveny v destilátu titračně. Do výpočtu se dále zahrnuje pH
vodného výluhu a obsah sušiny a výsledek je vyjádřen pomocí bodů odvozených z
nelineární stupnice. Přesnost této metody je značně omezena nízkou selektivitou, a
proto byly hledány účinnější separační analytické postupy. Hodnocení kvality siláží se v
ČR provádí podle ČSN 467092, metodou odvozenou od metody popsané Fliegem.
Tabulka IV. Průměrné hodnoty parametrů různých typů siláží (Kung & Shaver).
Parametr
Obsah sušiny (%)
pH
Kyselina mléčná (% suš.)
Kyselina octová (%suš.)
Kyselina propionová (% suš.)
Kyselina máselná (%suš.)
Ethanol (%suš.)
Amoniakální dusík - NH3-H (%)
Luštěninov
á siláž
30-40
4,3-4,7
7-8
2-3
< 0,5
< 0,5
0,2-1,0
10-15
Luštěninov
á siláž
45-55
4,7-5,0
2-4
0,5-2,0
< 0,1
0
0,5
< 12
Travní
siláž
30-35
4,3-4,7
6-10
1-3
< 0,1
0,5-1,0
0,5-1,0
8-12
Kukuřičná
siláž
30-40
3,7-4,2
4-7
1-3
< 0,1
1-3
1-3
5-7
Kukuřičná
siláž
70-75
4,0-4,5
0,5-2,0
< 0,5
< 0,1
0,2-2,0
0,2-2,0
< 10
34
2.5.3. Metody stanovení karboxylových kyselin v siláží
Karboxylové kyseliny mohou být v silážích stanoveny použitím různých
chromatografických technik. Plynovou chromatografií (Lopez et al., 1976; Richardson
et al., 1989), kapalinovou chromatografií (Mulin & Emmons, 1997; Alonso et al., 1998;
Cunha et al., 2001; Wei et al., 2001) a tenkovrstvou chromatografií (Sobu et al., 1995).
Další možností je využití elektromigračních technik (Boček et al., 1978; Buchberger
et al., 1997). Velkou výhodou elektromigračních metod oproti chromatografickým je
jednoduchá příprava vzorku, což je zvláště důležité pro rutinní analýzy velkých souborů
vzorků. Rovněž doba analýzy je obvykle kratší při stejné separační účinnosti.
2.6. KARBOXYLOVÉ KYSELINY VE VEJCÍCH
2.6.1. Obsah karboxylových kyselin ve vejcích
Významnými indikátory kvality, stáří a mikrobiální nezávadnosti vajec je obsah
organických kyselin, zejména kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné. Obsah
dalších kyselin, jako jsou kyselina mravenčí, octová, pyroglutamová, pyrohroznová,
fumarová a citrónová se v průběhu stárnutí také mění jak v důsledku vlastních
metabolických procesů ve vejci, tak působením mikroorganizmů. Zvýšený obsah
kyseliny jantarové a 3-hydroxymáselné značí silnou mikrobiální kontaminaci
(Littmannová et al., 1982), kyselina 3-hydroxymáselné také signalizuje, že se jedná o
vejce oplodněné (Littmannová et al., 1982; Simeonovová et al., 1999). V čerstvých
vejcích představuje kyselina mléčná, citrónová a pyroglutamová hlavní složku
karboxylových kyselin, vedle těchto makrokomponent (ve smyslu obsahu kyselin) se
zde nachází v podstatně menší míře kyselina pyrohroznová, 3-hydroxymáselná,
fumarová, jantarová a jablečná (Littmannová et al., 1982). Vedle výše zmíněných
kyselin lze sledovat i změny koncentrace kyseliny pyroglutamové (L-5-oxopyrrolidin-2karboxylové) a kyseliny močové. Ve žloutku, na rozdíl od bílku, se tyto kyseliny
nachází v dosti proměnlivém množství. Obsah kyseliny pyroglutamové se během
skladování zvyšuje na 100 až 200 mg.kg-1. Ve žloutku kyselina pyroglutamová dosahuje
vyšších hodnot (až 170 mg.kg-1), ale její obsah kolísá v závislosti na věku nosnice
(maximálních hodnot dosahuje uprostřed snáškového cyklu), proto tedy není vhodným
(reprodukovatelným) „markerem“ pro určení jakosti (Rossi et al., 1995).
35
V Tabulce V jsou uvedeny obsahy kyselin v čerstvě sneseném vejci a jejich
změny v průběhu skladování. Průměrný obsah kyseliny mléčné v čerstvém vejci je
133 mg.kg-1 sušiny, kyseliny jantarové 2 mg.kg-1 sušiny a kyseliny 3-hydroxymáselné
okolo 2,2 mg.kg-1 sušiny. Hodnoty kyseliny jantarové, resp. 3-hydroxymáselné se
během skladování neporušených skořápkových vajec výrazně nemění a zůstávají na
úrovni čerstvých vajec, a to i při skladování při 30 °C, jejich hodnoty se zvyšují pouze v
případě
mikrobiálního
znehodnocení,
resp.
jedná-li
se
o
oplodněné
vejce
(Littmannová et al., 1982).
Tabulka V. Průměrný obsah organických kyselin v čerstvě sneseném vejci (mg v kg
sušiny) a změny obsahu při skladování vajec za (A) vyloučení mikrobiální kontaminace
(MO) a vajec záměrně kontaminovaných (B). (Littmannová et al., 1982;
Kyselina mléčná
Kyselina jantarová
Kyselina
pyrohroznová
Kyselina fumarová
Kyselina jablečná
Kyselina citrónová
133,0
2,0
Podmínky
Intenzita
tvorby
Koncentrace
kyseliny
Simeonovová et al., 1999).
Poznámka
obsah kyseliny mléčné se při teplotě 5 °C během 100 dnů
nemění, během 4-5 týdnů skladování při 20 °C se obsah
A ++
zvyšuje na 400-550 mg.kg -1 sušiny, při teplotě 30 °C až na
500-700 mg.kg -1 sušiny
dosahuje hodnot až 8000 mg.kg-1 sušiny při MO kontaminaci
5.1010, stanovený limit přesahuje při překročení MO
B +++
kontaminaci 1.107, při rostoucí kontaminací koncentrace
kyseliny mléčné klesá
- obsah se nemění ani během skladování při 30 °C
A
dosahuje hodnot až 300 mg.kg -1 sušiny při MO kontaminaci
B ++
5.1010, přesahuje limit při překročení MO kontaminace 1.107
11,3
B
++
až 250 mg.kg -1 sušiny při MO kontaminaci 5.1010
3,1
11,1
151,1
B
B
B
A
+
+
+
-
B
+
s MO kontaminací její obsah klesá až k nulovým hodnotám
s MO kontaminací její obsah klesá až na 1,2 mg.kg -1 sušiny
s MO kontaminací její obsah klesá až na 7,4 mg.kg -1 sušiny
obsah se nemění ani během skladování při 30 °C
lehký nárůst, dosahuje hodnot 15 mg.kg -1 sušiny při
mikrobiální kontaminaci 7.1010, limit přesahuje při překročení
mikrobiální kontaminace 5.107, u oplodněných vajec se obsah
zvyšuje až na 380 mg.kg -1 sušiny
během skladování se obsah mírně zvyšuje na 100 až 200
mg.kg -1, ve žloutku (PGM) dosahuje až 170 mg.kg -1, ale její
koncentrace kolísá v závislosti na věku nosnice
obsah se během stárnutí významně nemění, kolísá okolo
10 mg.kg -1
Kyselina
3-hydroxymáselná
2,2
Kyselina
pyroglutamová
98
A
+
Kyselina močová
10
A
-
36
2.6.2. Legislativní požadavky na obsah karboxylových kyselin ve vejcích
Obsahy kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné jsou ve vaječných
výrobcích považovány za kriteria jejich kvality. Dle Vyhlášky 200/2003 Sb. může
vaječný výrobek obsahovat maximálně 1000 mg kyseliny mléčné, 25 mg kyseliny
jantarové a 10 mg kyseliny 3-hydroxymáselné v kilogramu sušiny neupraveného
vaječného výrobku. Dále pak vyhláška specifikuje skladovaní vajec při nekolísavé
teplotě prostředí plus 5 °C až 18 °C, relativní vlhkosti vzduchu 70 – 75 % a minimální
trvanlivost čerstvých vajec 28 dní od data snážky. Stejně jako pro vejce existují také
legislativní požadavky týkající se vaječných hmot. Vaječné hmoty je společný název
pro bílky, žloutky nebo celý vaječný obsah, resp. vaječná směs, zvaná melanž. Vaječné
hmoty se dále mohou používat ve formě tekuté, mražené nebo sušené.
Pro získání těchto vaječných hmot se výtluk vajec provádí ručně nebo strojově.
Vytlouká se při teplotě max. 12°C. Vejce určená k dalšímu zpracování se zpracovávají
nejpozději do 72 hodin po prosvícení, po vytlučení se ihned ošetřují. Je zakázáno
provádět oddělování vaječné hmoty rozdrcením a odstředěním skořápek. Pro výtluk se
nesmí zpracovávat vejce, která vykazují smyslové vady, biologické a mikrobiální vady,
vejce s patrným vývojem zárodku a inkubovaná vejce z líhní. Nejvhodnější je in-line
zpracování čerstvě snesených vajec přímo v produkčním závodě. U starších a špinavých
vajec se zvyšuje riziko mikrobiální kontaminace, např. vejce s čistou skořápkou má po 7
dnech skladování 65 až 1850 mikroorganizmů v g obsahu, vejce se špinavou skořápkou
za stejných podmínek skladování 2,2.106 mikroorganizmů (Simeonovová et al., 1999).
Do oběhu lze uvádět pouze pasterovanou vaječnou hmotu. Vaječná hmota, která
nebyla zpracována ihned po vytlučení, musí být neprodleně zchlazena na teplotu 4 °C a
do 48 hodin zpracována nebo mrazena. Nezávazně je podle ČSN 572 301 na vaječné
hmoty stanoven obsah sušiny, udávané jako kvalitativní znak při posuzování vaječných
hmot (Tabulka VII).
37
Tabulka VI. Složení slepičího vejce (Simeonovová et al., 1999).
Složky
Voda
Sušina
- proteiny
- lipidy
- sacharidy
- minerální látky
Celé vejce
(%)
65,6
34,4
12,1
10,5
0,9
10,9
Skořápka a blány
(%)
1,6
98,4
3,3
stopy
stopy
95,1
Bílek
(%)
87,9
12,1
10,6
stopy
0,9
0,6
Žloutek
(%)
48,7
51,3
16,6
32,6
1,0
1,1
Tabulka VII. Kvalitativní požadavky na vaječné hmoty.
Složky vejce
Bílek
Žloutek
Melanž
Obsah
sušiny (min %)
tuku (min%)
10,5
43,0
26,0
23,5
9,8
Tabulka VIII. Mikrobiální požadavky na vaječnou hmotu (Vyhláška 200/2003 Sb.).
Mikroorganizmus
Salmonaella spp.
Staphylococus aureus
Mezofilní aerobní bakterie
Enterobacteriaceae
Navážka
v 25 g/ 25 ml
v1g
v 1 g/1 ml
v 1 g/1 ml
Požadavek
nesmí být přítomna
nesmí být přítomen
max. 105
max. 102
Mikrobiologické vyšetření pasterovaného produktu neposkytuje žádné údaje o
hygienickém stavu původního materiálu. Koncentrace organických kyselin nejsou
většinou pasterací ovlivněny, jejich hodnoty mohou poukazovat na mikrobiální stav
výchozí suroviny (Littmannová et al., 1982). Toto platí zejména pro kyselinu mléčnou,
jantarovou a 3-hydroxymáselnou. Obsah kyseliny mléčné ve vaječné hmotě před
pasterací tedy nesmí být vyšší než 1000 mg v kilogramu sušiny. Využití dalších kyselin
je poněkud problematické. Kyselina pyrohroznová je při tepelném zákroku částečně
dekarboxylována a těkavé mastné kyseliny (mravenčí, octová, propionová a máselná) se
během zpracování ztrácejí a lze tyto kyseliny tedy jen obtížně přesně stanovit (Velíšek,
1999).
38
2.6.3. Změny organických kyselin bez vlivu exogenní kontaminace
Karboxylové kyseliny jsou ve vejcích přítomné jako produkty metabolických
přeměn a jiných reakcí. Vaječná hmota je velmi složitá a jedinečná matrice. Lze tedy
uvést pouze teoreticky možné obecné metabolické cesty vzniku nebo vývoje
organických kyselin. Působením vlastních vaječných enzymů se vaječná hmota
rozkládá na jednodušší látky. Obecně ve žloutku dochází k hlubším enzymovým
změnám než v bílku (Hejlová, 2001).
V bílku a žloutku (v sušině) je přibližně stejný obsah sacharidů, celkem asi
10 g.kg-1 a většina sacharidů je vázána na proteiny (Hejlová, 2001; Simeonovová et al.,
1999). Ve volné formě se v bílku nachází zejména glukosa (0,4 g.kg-1), ve žloutku je ve
volné formě 0,13 až 0,2 g.kg-1 volných sacharidů, z nichž 98 % tvoří také glukosa.
Metabolitem sacharidů (také lipidů a proteinů) je kyselina pyrohroznová (pyruvát). Ze
sacharidů se tvoří i další kyseliny, např. kyselina mléčná, jantarová, fumarová, jablečná
a citrónová.
Rozkladem bílkovin se zvyšuje obsah volných aminokyselin (Lück & Pavlik,
1956), zejména kyseliny glutamové, prolinu, leucinu, serinu, glycinu a methioninu.
Volné aminokyseliny difundují ze žloutku do bílku. Oxidační deaminací nebo
transaminací α-aminokyselin vznikají α-oxokyseliny (pyrohroznová), které mohou být
prekurzory hydroxykyselin (mléčné, jablečné, citronové). Kyseliny pyrohroznová,
fumarová a pyroglutamová mohou být také produkty Streckerovy degradace
aminokyselin. Další možností vzniku karboxylových kyselin je enzymová katalýza, kdy
z kyseliny fumarové může v živých systémech za katalýzy enzymem aspartasou vznikat
kyselina asparagová (Velíšek, 1999) a kyselina pyroglutamová z glutathionu*
(Rossi et al., 1995).
Rozkladem bílkovin vznikají kromě volných aminokyselin pyrimidinové báze
(uracil), nukleosidy (uridin), aminy, kyselina močová, močovina a amoniak (Morris,
1987; Rossi et al., 1995). Koncentrace kyseliny močové se během stárnutí vejce
významně nemění a kolísá okolo 10 mg.kg -1. Obsah amoniaku u čerstvého vejce činí
okolo 0,6 mg ve vejci, ve zkaženém vejci se nachází až 11,8 mg (Musil, 1956). Z bílku
se amoniak uvolňuje do okolí, ve žloutku se naopak hromadí, čímž se hodnota pH
*
tripeptid γ-glutamylcysteinglycin
39
žloutku zvyšuje (Hejlová, 2001; Simeonovová et al., 1999). Obsah uridinu stejně jako
obsah kyseliny pyroglutamové v čerstvém vejci v závislosti na věku nosnice je v bílku a
ve žloutku zvláště proměnlivý. Limitní hodnota byla navržena jako < 50 mg.kg -1 v
bílku pro vejce jakostní podskupiny A. Uridin je prekurzorem pro uracil (pyrimidinovou
bázi), jako dalšího zajímavého indexu zkažených vaječných produktů (Morris, 1987;
Míková & Davídek, 2000).
Během zpracování a skladování vzniká z lysinu reakcí s glukosou Maillardovou
reakcí 2-furoylmethyl-L-lysin (furosin). Jeho obsah se ve žloutku příliš nemění, v bílku
díky
alkalickému
prostředí
probíhá
Maillardova
reakce
intenzivněji.
Obsah
2-furoylmethyllysinu (furosinu) by ve vejcích jakostní skupiny A extra neměl
přesáhnout maximální množství 60 mg ve 100 g bílku, ve vejcích jakostní skupiny A
90 mg ve 100 g bílku. Stanovení furosinu v bílku bylo navrženo komisí EU pro
hodnocení kvality vajec (Rossi et al., 1995; Simeonovová et al., 1999).
Kyselina 3-hydroxymáselná se nachází v krvi a většině živočišných orgánů. Může
být (spolu s acetooctovou kyselinou a acetonem) konečným produktem β-oxidace
mastných kyselin, která je významná pro získání energie uloženého v podobě velkého
množství vznikajících molekul ATP (Vodrážka, 1999). Přítomnost kyseliny 3hydroxymáselné signalizuje nejen mikrobiální kontaminaci, ale též, že se jedná o vejce
oplodněné (Littmannová et al., 1982; Simeonovová et al., 1999). Zvýšený obsah
kyseliny 3-hydroxymáselné může být zaznamenán ve vejci již 6. den po oplodnění a
tento nárůst pokračuje i po odumření zárodku.
Zvýšení tvorby organických sloučenin jako je kyselina mléčná, jantarová, 3hydroxymáselná, pyrohroznová a pyroglutamová je tedy jedním ze znaků stárnutí vajec
(Littmannová et al., 1982). U některých organických kyselin (kyselina citrónová,
jablečná a fumarová) má tento trend opačnou klesající tendenci (viz. Tabulka VI).
2.6.4. Změny karboxylových kyselin způsobené činností mikroorganizmů
Vaječný obsah je ideálním prostředím pro růst a rozmnožování mikroorganizmů.
Bílek a žloutek čerstvých vajec zdravých nosnic zpravidla neobsahuje mikroorganizmy
(Hejlová, 2001). V některých případech může dojít k pronikání mikroorganizmů
hematogenní (krevní) cestou v průběhu tvorby vejce ve vaječníku nebo kongenitální
cestou při průchodu vejcovodem a kloakou. Původci endogenní infekce jsou zejména
40
rody Salmonella, Shigella, Escherichia a Proteus (Musil, 1956; Simeonovová et al.,
1999). Průnik mikroorganizmů z vnějšího prostředí přes skořápku, tedy exogenní
kontaminace je nejčastější příčinou kontaminace vajec bakteriemi rodu Salmonella,
Shigella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Campylobacter jejuni, Clostridium
perfringens, Escherichia coli (Simeonovová et al., 1999; Muchová, 2001).
Na suché skořápce dominují G+ mikroorganizmy, zejména koky. Na vlhké
skořápce převažují G- mikroorganizmy. Enzymy G- mikroorganizmů, především
proteázy, způsobují hnilobný rozklad vaječné hmoty postupně až na aminokyseliny,
které jsou dekarboxylací a deaminací štěpeny na jednodušší látky – organické kyseliny
(máselná, valerová, mravenčí, octová), aldehydy, alkoholy, amoniak, sirovodík a CO2.
Obsah amoniaku bývá v mikrobiálně zkaženém vejci přibližně 11,8 mg (Musil, 1956;
Hejlová, 2001).
U chladírenských vajec je třeba počítat s pomnožováním mikroorganizmů na
povrchu a pronikáním psychrotrofních mikroorganizmů do vaječného obsahu.
Především to jsou bakterie rodu Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, atd.
(Šilhánková, 1995) jež využívají aminokyseliny a řadu organických kyselin jako zdroj
uhlíku. Nedostatečná výměna vzduchu a vysoká vlhkost dávají předpoklady pro růst a
rozmnožování plísní (Hejlová, 2001). Ty rostou nejen na povrchu, ale i uvnitř vajec. U
plísně Mucor bylo zjištěno, že neprorůstá skořápkou do vejce. Ostatní plísně
(Penicillium, Aspergillus, aj.) rostou nejen na povrchu, ale prorůstají skořápkou a rostou
i pod ní (Musil, 1956). Produkty rozkladné činnosti plísní jsou karboxylové kyseliny†
(citrónová, glukonová, fumarová), alkoholy a CO2. Některé z plísní rostou i za velmi
nízké teploty. U plísní se kromě sacharolytických uplatňují také proteolytické a
lipolytické účinky.
Organické kyseliny mohou vznikat nejrůznějšími metabolickými procesy
mikroorganizmů. Základním anaerobním katabolickým procesem sacharolytických
mikroorganizmů je Embden-Meyerhofova metabolická cesta (glykolýza). Vzniklý
pyruvát (kyselina pyrohroznová) je klíčovým meziproduktem pro další metabolické
procesy různé pro daný typ mikroorganizmu, například pro homofermentativní
(Streptococcus) nebo heterofermentativní (Leuconostoc, Lactobacillus fermentum,
†
Rizopus nigricans se používá pro průmyslovou produkci fumarové kyseliny a plíseň Aspergillus niger je
významným producentem kyseliny citrónové (Šilhánková, 1995; Míková et al., 2001).
41
Lactobacillus brevis, Lactobacillus bucheri) mléčné kvašení. Některé striktně aerobní
bakterie (Pseudomonas) pro vznik meziproduktu pyruvátu využívají EntnerDoudoroffovu metabolickou cestu (Šilhánková, 1995).
Organické kyseliny jsou produkty metabolismu mezofilních aerobních a
fakultativně anaerobních bakterií (Escherichia coli, Enterobacter agglomerans,
Enterobacter
cloacae,
Bacillus
cereus,
Bacillus
spp.,
Streptococcus
spp.,
Staphylococcus aureus), které zkvašují cukry za tvorby organických kyselin
(York et al., 1972; Šilhánková, 1995; Simeonovová et al., 1999).
Kyselina mléčná se vyskytuje ve dvou formách, D- a L- formě. L-mléčná kyselina
je často finálním produktem metabolismu většiny žijících organismů (Vodrážka, 1995;
Fukushima, 2001). Kyselinu
D-mléčnou
produkují pouze některé mikroorganizmy
(Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Leuconostoc cremoris). Některé
bakterie mléčného kvašení produkují racemickou směs obou isomerů (Šilhánková,
1995). Kyselina 3-hydroxymáselná může být, vedle kyseliny máselné, produktem
zvláštního typu metabolismu pyruvátu, který probíhá u anaerobního rodu Clostridium
nebo může být výsledným produktem β-oxidace mastných kyselin (Šilhánková, 1995).
Tabulka IX. Výskyt bakterií na vaječné skořápce. (Hejlová, 2001; Simeonovová et al.,
1999). 1 – výskyt příležitostně, 2 – na většině vajec v malém množství, 3 – vždy
přítomny ve velkém množství.
Rod (čeleď)
Micrococcus
Staphylococcus
Escherichia
Achromobacter
Aeromonas
Proteus
Actinomyces
Frekvence
výskytu
3
2
2
2
1
1
2
Rod (čeleď)
Enterococcus
Bacillus
Pseudomonas
Alcaligenes
Aerobacter
Clostridium
Flavobacterium
Frekvence
výskytu
1
2
2
2
2
1
2
42
Tabulka X. Bakterie produkující ve vejcích kyselinu mléčnou, jantarovou a octovou.
+ střední až silná tvorba, – slabá, téměř žádná tvorba.
Bakterie
Charakteristika
Escherichia coli
G-, fakultativně anaerobní,
heterofermentativní mléčné kvašení
Enterobacter
agglomerans
G-, fakultativně anaerobní,
heterofermentativní mléčné kvašení
G-, fakultativně anaerobní,
heterofermentativní mléčné kvašení
G+;mikroaerofilní až anaerobní,
Streptococcus spp.
homofermentativní mléčné kvašení
Streptococcus faecalis G+; mikroaerofilní až anaerobní
Salmonella
G-, fakultativně anaerobní
choleraesuis
G+; aerobní a fakultativně anaerobní,
Bacillus cereus
heterofermentativní (tvoří značné
množství kyselin)
Bacillus spp.
G+; aerobní a fakultativně anaerobní
Pseudomonas
G-, aerobní, bez kvasných schopností
fluorescens
Pseudomonas
G-, aerobní, bez kvasných schopností
aeruginosa
Staphylococcus aureus G-, fakultativně anaerobní
Intenzita tvorby kyseliny
octové
mléčné
jantarové
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Enterobacter cloacae
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
+
-
2.6.5. Metody stanovení organických kyselin
Organické kyseliny lze stanovit v bílku, žloutku, vaječné melanži, sušeném
vaječném výrobku a ve vaječných výrobcích metodami plynové (GC) a kapalinové
chromatografie (HPLC), chromatografií na tenké vrstvě, enzymovými metodami a
elekromigračními metodami. Stanovení organických kyselin tradičními analytickými
metodami (GC, HPLC) je v tak složité matrici, jakou jsou vzorky potravin, časově
náročné, protože často vyžaduje složitou úpravu vzorku. Samotné procesy pro
předúpravou vzorku, přítomnost ostatních kyselin a další interferující složky (proteiny,
lipidy), znesnadňují stanovení a metody mohou poskytovat chybné výsledky.
Plynová chromatografie
Nezbytným krokem pro stanovení organických kyselin ve vejcích a vaječných
produktech je vysrážení proteinů a lipidů. Littmannová (Littmannová et al., 1982a)
uvádí vyčeření vzorku použitím kyseliny sírové a fosfowolframové, přečištění na
koloně Celite/Na2SO4 a separaci na polární stacionární fázi po převedení kyselin na
43
příslušné methylderiváty. Metoda byla použita pro analýzu jak vajec, tak cereálních
výrobků, vaječného těsta a piškotového pečiva. Kyseliny mléčná, 3-hydroxymáselná,
jantarová,
jablečná,
citronové
byly
v těchto
matricích
spolehlivě
stanoveny
v koncentracích nižších než 2 mg v kg sušiny. Autoři uvádí dobrou opakovatelnost,
reprodukovatelnost a zpětný nález.
Kapalinová chromatografie
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je metodou často používanou pro
stanovení karboxylových kyselin (Lodi & Rossin, 1995). Analýza jednoduchých kyselin
v potravinách vzhledem k možnému výskytu interferujících látek většinou vyžaduje
jejich předběžnou separaci. Cocchi et al. (2002) uvádí pro stanovení kyseliny mléčné,
jantarové, citrónové, jablečné a octové v balzámovém octu po extrakci na pevné fázi
(SPE). Organické kyseliny je možné stanovit iontově výměnnou chromatografií, iontově
párovou chromatografií a chromatografií na reverzní fázi použitím vodných mobilních
fází (Schwarzenbacher, 1982). Iontově výměnnou chromatografií (IEC) se separace
provádí na silně kyselém iontoměniči a jako mobilní fáze se používají zředěné roztoky
anorganických kyselin. Castellari et al. (2001) použil pro stanovení organických kyselin
v pivu jako mobilní fázi 0,045 M H2SO4 s přídavkem 6 % acetonitrilu, kyseliny byly
detekovány UV detekcí a refraktometrickou detekcí. Obdobné podmínky použil
Schneider et al. (1987) a Shimazu & Watanabe (1981) pro stanovení kyseliny citronové,
vinné, mléčné a octové ve víně a hroznových výliscích, Panari (1987) pro stanovení
kyseliny pyroglutamové, jantarové, mravenčí, mléčné, octové, propionové a
pyroglutamové v sýrech. Cunha et al. (2001) pro stanovení kyselin mléčné, octové,
jantarové a citronové v olivovém oleji a Cocci et al. (2002) pro stanovení
karboxylových kyselin v balzámovém octu. Polman (1995) srovnává tři ionexové
chromatografické kolony pro stanovení kyseliny jantarové, mléčné a octové ve
fermentovaných výrobcích. Uvádí, že tyto kyseliny byly dobře kvantifikovatelné a že je
tuto metodu možné dobře využít i pro takovýto složitý typ matrice.
Při separaci na reverzní fázi (RP) se používají kolony s nepolární stacionární fází,
nejčastěji C18. Pro separaci organických kyselin je možné použít vodnou mobilní fázi
s nulovým obsahem organické fáze a nebo přídavek iontopárových činidel do mobilní
fáze. Escobal et al. (1997) a Hasib et al. (2002) popisují separaci organických kyselin
44
v rostlinných materiálech na C18 koloně a použití 0,25% kyseliny octové, respektive
zředěné kyseliny fosforečné jako mobilní fáze. Jako iontově párová činidla pro separaci
organických kyselin na reverzní fázi je možné použit salicylany některých alifatických
aminů, kdy je retence a rozlišení závislé na délce alkylového řetězce činidla, průtoku
mobilní fáze a na použité stacionární fázi. Relativně nízká iontová vodivost a vysoký
molární absorpční koeficient salicylových iontů umožňuje použít jak nepřímou UV, tak
i vodivostní detekci (Terweij-Groen & Kraak, 1997; Gennaro & Bertolo, 1989).
Hlavní nevýhodou výše popsaných metod stanovení je nízká absorbance
karboxylových kyselin v UV oblasti. Pro zvýšení detekčního limitu je možné využít pro
separaci iontově párovou chromatografii a nebo použitím derivatizačních činidel
modifikovat molekulu a tím několikanásobně zvýšit detekční limit (Nollet, 2000).
Pokud se pro stanovení karboxylových kyselin použijí derivatizační činidla, tak se tyto
deriváty separují na reverzní fázi. Vlastní derivatizace může být prováděná mimo
kapalinový chromatograf (off-line pre-column derivatization), před kolonou (on-line
pre-column derivatization) a nebo až následně po separaci (post-column derivatization).
Nejpočetnější a nejvýznamnější jsou reakce s takovými derivatizačními činidly, u nichž
lze vyvolat působením ultrafialového záření intenzivní fluorescenci (Churáček et al.,
1990). Deriváty karboxylových kyselin, které mohou být detekované jak fluorescenční
detekcí, tak i UV detekcí při 254 nm. Buslig (1982) použil 2,4-dinitrofenylhydrazin
(DNP) pro stanovení organických kyselin v citrusovém ovoci. Tomufumi Santa et al.
(1999), Fukushima et al. (2001) a Cheng Zhi Huang et al. (2002) uvádějí více jak deset
dalších
možných
derivatizačních
činidel,
z nichž
je
O-(4-nitrobenzyl)-N,N´-
diisopropylisomočovina (NBDI) nejrozšířenějším používaným činidlem (Steiner et al.,
1984; Badoud & Prat, 1986; Cunha et al., 2001; Cunha et al., 2002).
Enzymové metody
Stanovení kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné se provádí nejčastěji
enzymově, a to pomocí komerčních souprav (Bergner-Lang & Beutler, 1986; LittmannNienstedt & Beutler, 1988; Míková & Davídek, 2000). Pro stanovení těchto kyselin v
tekutém vaječném obsahu je nutná deproteinace pro odstranění interferujících látek.
45
Princip stanovení L-mléčné kyseliny:
L -LDH
¾® pyruvát + NADH+ + H+
(1) L-laktát + NAD+ ¬¾ ¾
GTP
¾® L-alanin + 2-oxoglutarát
(2) pyruvát + L-glutamát ¬¾
Množství NADH vznikajícího v první reakci je ekvivalentní množství L-mléčné
kyseliny. Vznikající množství NADH je stanoveno měřením absorbance při 340 nm.
Princip stanovení jantarové kyseliny:
SCS
¾® IDP + sukcinyl-CoA + P
(1) sukcinát + ITP + CoA ¾¾
PK
(2) IDP + PEP ¾¾® ITP + pyruvát
L -LDH
(3) pyruvát + NADH + H+ ¾¾ ¾® L-laktát + NAD+
Množství oxidovaného NADH je ekvivalentní množství jantarové kyseliny stanoveno
měřením absorbance při 340 nm.
Princip stanovení D-3-hydroxymáselné kyseliny:
3-HBDH
¾® acetoacetát + NADH + H+
(1) D-3-hydroxybutyrát + NAD+ ¾¾ ¾
diaforáza
¾® NAD+ + formazan
(2) NADH + INT + H+ ¾¾ ¾
NADH vznikající v první reakci (1) je oxidováno v druhé rovnici (2) pomocí INT
(jódonitrotetrazolium chlorid), množství vznikajícího formazanu je stanoveno měřením
absorbance při 492 nm.
Elektromigrační metody
Elektromigrační metody vesměs nevyžadují složité úpravy vzorku, ovšem vaječná
hmota je složitá matrice, která vyžaduje odstranění některých interferujících látek,
vysokomolekulárních složek (proteinů, lipidů), které mohou analýzu značně ovlivňovat.
Lze použít extrakční činidla, centrifugaci, ultrafiltraci, deproteinaci vzorku (Ewaschuk
et al., 2002) a obrácenou dialýzu (Špička & Helclová, 1995). Organické kyseliny jsou
dobře extrahovatelné ve vodě, která tedy slouží jako vhodné rozpouštědlo a splňuje
předpoklady (má co nejnižší vodivost, vzorek se v něm dobře rozpouští a rozpuštěné
ionogení látky ochotně disociují).
Pro stanovení kapilární zónovou elektroforézou je nutné zvolit nosný elektrolyt
s takovou hodnotou pH, která co nejblíže odpovídá hodnotám pK stanovovaných
46
kyselin, aby byly ve vzorku přítomny ve formě iontů, které jsou disociovány a které lze
následně separovat. Nejúčinnější separace dvou kyselin je při pH odpovídajícímu
průměru jejich disociačních konstant (Churáček et al., 1990). Dalším způsobem jak
separovat kyseliny je využití tvorby komplexů či asociátů analytů s protiionem
použitým ve vedoucím elektrolytu (např. separace jablečné kyseliny od citronové
založené na rozdílné interakci s vícemocným protiionem). Poslední možností ovlivnění
separace je použití vodno-organických rozpouštědel, které mnohdy výrazným způsobem
ovlivňují pohyblivost separovaných organických kyselin.
Nejrozšířenější metodou detekce analytů je přímá a nepřímá UV detekce. Přímá
UV detekce je zejména vhodná pro látky, jež v UV oblasti absorbují světlo, nebo tvoří
stabilní sloučeniny či komplexy s látkami, které v UV absorbují. Organické kyseliny,
jako jsou např. kyselina mléčná, máselná, octová a propionová, neabsorbují ve viditelné
oblasti světla a v UV oblasti absorbují poměrně slabě. K detekci lze použít nepřímý
fotometrický detektor (IPD) (Kandl & Kupina, 1999), vodivostní detektor, hmotnostní
detektor nebo nepřímou UV detekci s použitím UV absorbujícího činidla, a to nejlépe
samotného elektrolytu (Foret et al., 1989; Kandl & Kupina, 1999). Nejčastěji používaný
vodivostní detektor zaznamenává průchod zón a měří elektrickou vodivost, resp. odpor
vznikající mezi dvěma elektrodami.
Kapilární izotachoforéza je vhodnou metodou pro identifikaci a stanovení
organických kyselin v potravinách. Hlavní výhodou je jednoduchá úprava vzorku a
krátký čas analýzy. Boček et al. (1978) uvádí použití kapilární izotachoforézy pro
stanovení kyseliny mravenčí, octové, mléčné, propionové a máselné v silážích.
Reijenga et al. (1982) popisuje izotachoforetickou separaci kyseliny vinné, citronové,
askorbové a sorbové ve víně a dále uvádí další možné použití pro separaci organických
kyselin Krebsova cyklu. Karovičová et al. (1990) popisuje separaci kyseliny mléčné,
jantarové, octové, citronové a jablečné ve fermentovaném zelí a víně. V Tabulce XI
jsou uvedené některé další separační podmínky pro stanoveni organických kyselin jak
CZE, tak i CITP metodou.
Pro stanovení organických kyselin ve vejcích není doposud v literatuře uváděná
žádná metoda.
47
Tabulka XI. Možné složení elektrolytových systémů použitelných pro CZE stanovení karboxylových kyselin v potravinách.
Analyt
LOD
(mg.l-1)
Podmínky
Detekce
BGE: 15 mM ftalát + 0,6 mM TTAB (pH = 5,6),
V = -15 kV, t = 25 °C
nepřímá UV
BGE 1: 3 mM fosfát + 0,5 mM MTAB, (pH = 6,5),
I = 6,5 µA
přímá UV
(185 nm)
BGE 2: 7 mM ftalát + 2 mM MTAB + 5%(v/v) MeOH
(pH = 6,1), I = 16 µA
nepřímá UV
(254 nm)
Kyselina citronová, vinná, mléčná
BGE: 180 mM Na2HPO4 + 1 mM CTAB + 15% (v/v)
MeOH
přímá UV (200 nm)
Kyselina octová, mléčná, jablečná,
citrónová
BGE: 5 mM PDC + 0,5 mM CTAB (pH 5,6)
V = -25 kV, t = 18 °C
nepřímá UV
(200, 350 nm)
IPD
Kyselina jablečná, mléčná,
glutamová, jantarová
BGE: 0,02 M kyselina benzoová + L-histidin (pH 6,2)
nepřímá UV
(254 nm)
-
Foret et al. (1989)
Kyselina mléčná, octová, askorbová,
fosforečná, jablečná, vinná,
citronová
LE1: HCl + β-alanin + 0,1% PVP (pH = 3,8)
LE2: HCl + EACA + 0,1% PVP (pH = 4,5)
LE3: HCl + EACA + 0,1% PVP (pH = 5,2)
TE: 5 (10) mM kyselina kapronová
vodivostní
-
Karovičová et al. (1990)
BGE: 10 mM MES + L-histidin + 0,5 mM TTAB
vodivostní
-
Huang et al. (1999)
BGE: 5 mM kyselina sorbová + 0,5 TTAB (pH = 6,0)
nepřímá UV
(254 nm)
-
Buchberger et al. (1997)
LE: 12 mM HCl + 20 mM urotropin
TE: 10 mM NaHCO3
vodivostní
-
Boček et al. (1978)
LE: 10 mM HCl + β-alanin + 0,05% polyvinylalkohol +
0,2% hydroxyethylcelulosa (pH = 2,90)
TE: 5 mM propionan sodný
přímá UV (254 nm)
vodivostní
Kyselina mravenčí, jablečná,
citronová, octová, mléčná,
jantarová
Kyselina jablečná, octová, jantarová,
mléčná
Kyselina mravenčí, octová,
propionová, máselná
Kyselina mravenčí, octová,
propionová, máselná
Kyselina mravenčí, octová,
propionová, máselná
Kyselina vinná, citronová, mléčná,
askorbová, sorbová, mléčná,
jantarová, octová, malonová,
jablečná, glukonová
Literatura
0,008-0,08
Wang et al. (2003)
0,015-0,054
Castineira et al. (2002)
2,5-5,0
1,5
Vorarat et al. (2002)
Kandl & Kupina (1999)
Reijenga et al. (1982)
48
2.7. KYSELINA GLUTAMOVÁ
2.7.1. Použití glutamátu sodného v potravinách
Glutamát sodný je látkou patřící do skupiny intenzifikátorů chuti, protože jeho
hlavní funkcí využívanou v potravinářském průmyslu je zvyšování intenzity chutě a
vůně potravin a pokrmů. Z chemického hlediska je glutamát sodný sodnou solí kyseliny
L-glutamové,
což je přirozeně se vyskytující neesenciální aminokyselina (tzn., že lidský
organismus nepotřebuje kyselinu glutamovou pro zajištění správného fungování všech
základních funkcí), která se vyskytuje i v mnoha potravinách obsahujících bílkovinymaso, zelenina, drůbež, mléko (Hegenbart, 1994) a je produkována i lidským tělem.
Téměř veškeré množství kyseliny L-glutamové, které je přijímáno organismem ve formě
potravy, je metabolizováno v žaludku a využíváno jako zdroj energie. Další důležitou
funkcí glutamátu je jeho působení v zažívacím traktu, kde funguje jako specifický
prekurzor pro biosyntézu glutathionu, argininu a prolinu v tenkém střevě.
Glutamát sodný se vyskytuje ve dvou formách: buď volný, nebo vázaný na jiné
aminokyseliny nebo bílkovinné molekuly. V potravinách se zpravidla vyskytují obě
formy glutamátu současně. Porovnáním obsahu glutamátu v jednotlivých druzích
potravin byly zjištěny výrazné rozdíly, obsah glutamátu se v závislosti na druhu
potraviny pohybuje v rozpětí od 2 mg volného glutamátu ve 100 g hmoty v kravském
mléce až do 9800 mg vázaného glutamátu ve 100 g hmoty v sýru parmazán. Obsah
vázaného glutamátu v potravinách je několikanásobně vyšší, v kravském mléce je obsah
vázaného glutamátu 410-krát vyšší (410 mg vázaného glutamátu/mg volného
glutamátu), u tresky 233-krát vyšší (2101/9), u vajec 69-krát vyšší (1583/23) a u hrachu
28-krát vyšší (5583/200).
Základní chuťové vlastnosti mnoha potravin a hotových pokrmů a jejich
komplexní aroma je schopen zintenzivňovat pouze volný glutamát, tento druh glutamátu
zároveň neovlivňuje míru zastoupení jednotlivých chutí v pokrmu (např. nezvyšuje
kyselost nebo hořkost pokrmů). Vysoký obsah volného glutamátu obsahují právě ty
druhy potravin (např.: sýr parmazán – 1200 mg volného glutamátu na 100 g potraviny;
rajčata – 140 mg volného glutamátu na 100 g potraviny), které jsou používány při
výrobě hotových pokrmů, kterým dodávají jejich typické aroma a chuť a tím je
zvyšována atraktivnost těchto pokrmů pro spotřebitele.
49
Glutamát zvýrazňuje chuť a aroma sloučenin, které se aktivně podílejí na tvorbě
vůně a chuti, jež jsou typické pro danou potravinu. Glutamát zvýrazňuje chuť a aroma
tvorbou jedinečného chuťového vjemu jménem umami, pátý chuťový vjem vedle
sladké, slané, kyselé a hořké chuti. Chuť umami výrazně změní vnímání slané, sladké,
hořké a kyselé chuti daného pokrmu, zároveň také ovlivňuje, jak se jednotlivé složky
potraviny na dané chuti podílejí. Bylo zjištěno, že chuťový vjem umami vytváří takové
sloučeniny, které se nepodílejí na tvorbě ani jedné ze základních čtyř chutí. Z toho
vyplývá, že chuti umami nemůže být dosaženo ani kombinací základních čtyř chutí.
Chuť umami je pokrmu dodávána glutamátem a 5´-ribonukleotidy (Kawakita, 1992),
které se také vyskytují v mnoha druzích potravin. Glutamát a ribonukleotidy způsobují
vzájemnou interakci aromatických látek pokrmu a chuťových receptorů a tím dochází
současně k interakci aromatická látka-glutamát-receptor. Ribonukleotidy zvyšují
intenzitu těchto interakcí. Intenzivním spojením aroma a receptorů je také zesilován
synaptický signál, který je přenášen z receptorů do mozku. Zároveň je také
prodlužována doba, po kterou je chuť pokrmu vnímána na jazyku, a to až třikrát, čímž
se také zvýrazňuje chuť pokrmu. Tento jev se označuje jako „Linger Longer“
(Maynard et al., 1965; Frank, 1999).
Obsah sodíku v glutamátu sodném je 12,3 %, proto potraviny obsahující glutamát
mají typickou slanou chuť. Glutamát sodný je také používán v potravinářském průmyslu
jako částečná náhražka chloridu sodného, glutamátem lze snížit obsah chloridu sodného
(kuchyňská sůl) až o 40 % při zachování intenzity slané chuti. Práh vnímání glutamátu
je 6,25.10-4 mol.l-1, to je vyšší hodnota, než u hořké a kyselé chuti, ale nižší hodnota než
u sladké chuti a přibližně stejná hodnota, jako u slané chuti. K vytvoření žádoucí chuti
pokrmu je postačující přídavek glutamátu v rozmezí od 0,2 až do 0,8 % z celkového
obsahu pokrmu v závislosti na druhu pokrmu (Kawakita, 1992). Obsah glutamátu
sodného lze také snížit, pokud je použit ve směsi s 5´- ribonukleotidy, jejichž potřeba
nutná k vytvoření stejné intenzity chuti a aroma, je daleko nižší, než u glutamátu,
pohybuje se v rozmezí 0,02 do 0,04 % z celkového obsahu pokrmu. Pokud je tedy
glutamát sodný použit ve směsi s ribonukleotidy, tak dojde ke snížení ceny surovin
(pokud použijeme směs 50:50, tak dojde ke snížení přibližně o 30 %) při zachování
kvality pokrmu.
50
2.7.1.1. Pravidla pro použití glutamátu sodného v potravinách
Používání glutamátu sodného v potravinách a při výrobě hotových pokrmů musí
být v souladu s příslušnými vyhláškami. Obsah glutamátu sodného (chemický název
daný vyhláškou č. 53/2002 Sb. je monohydrát L-glutamanu monosodného) ve výrobku
je nutno uvést na obalu daného výrobku buď slovně nebo pod kódem E. Podle vyhlášky
53/2000 Sb. je pro glutamát sodný přidělen kód E 621, pro kyselinu glutamovou E 620 a
pro jiné soli kyseliny glutamové E 622 až E 625. Glutamát sodný je možno používat u
těch komodit, kde je povoleno použití kyseliny glutamové, a to jednotlivě nebo v
kombinaci až do výše nejvyššího povoleného množství. Při použití v kombinaci nesmí
suma jejich množství překročit hodnotu nejvyššího povoleného množství. Nejvyšší
povolené množství pro kyselinu glutamovou a její soli (glutamát sodný, draselný,
vápenatý, amonný a hořečnatý – skupina látek pod označením E 620 až E 625) v
potravinách kromě nealkoholických nápojů je 10 000 mg.l-1, resp. 10 000 mg.kg-1.
V kořenících a ochucovacích přípravcích je povoleno použití nezbytného množství (tj.
množství nezbytné pro dosažení zamýšleného technologického účinku při zachování
správné výrobní praxe) kyseliny glutamové a jejích solí.
Dodržování povolených limitů je pro výrobce potravin a hotových pokrmů, do
kterých se glutamát přidává, vhodné nejen z právního, ale i z technologického hlediska.
Glutamát sodný vylepšuje chuť kvalitního pokrmu, vyrobeného z kvalitních surovin, ale
nevylepší chuť pokrmu špatné kvality prostým přidáním většího množství glutamátu,
protože přídavek glutamátu nad vhodné množství nemá téměř žádný vliv na chuť.
Naopak, použití nadměrného množství glutamátu má za následek vznik nežádoucí chuti.
Mnoho potravin, do kterých je přidáván uměle vyrobený glutamát, ve skutečnosti
obsahují nižší obsah glutamátu než potraviny, ve kterých se glutamát vyskytuje
přirozeně (například parmazán obsahuje 10-krát více glutamátu, než drůbeží bujón, do
kterého je přidáván uměle vyrobený glutamát).
2.7.1.2. Vliv konzumace glutamátu na lidské zdraví
Člověk zkonzumuje denně průměrně 20 gramů glutamátu (Waqlker & Lupien,
2000), z tohoto množství tvoří volný glutamát pouze velmi malou část, denní příjem
volného glutamátu se pohybuje kolem 1 gramu, zatímco lidské tělo produkuje denně 50
51
gramů volného glutamátu. Protože se zvyšuje spotřeba glutamátu při výrobě
potravinářských výrobků a přípravě pokrmů, bylo provedeno mnoho vědeckých studií
zkoumajících vliv glutamátu na lidské zdraví. Na základě posouzení více než dvou
stovek vědeckých prací zabývajících se touto problematikou byla kyselina glutamová a
její amonné, vápenaté, sodné a draselné soli v roce 1988 podle studie „FAO/WHO
Expert Committee on Food Additives” (JECFA) zařazeny do kategorie „Acceptable
Daily Intake not Specified“, což je kategorie, kam jsou zařazovány pouze nejbezpečnější
potravinářská aditiva, pro která není stanovena žádná maximální denní dávka (Joint
FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 1988; Waqlker & Lupien, 2000).
Zmíněnou komisí bylo zjištěno, že hladina glutamátu ve střevním a jaterním
metabolismu a v krevním oběhu se zvyšuje pouze po velmi vysokých dávkách
glutamátu (více než 30 mg volného glutamátu na kilogram tělesné váhy) zaváděných do
žaludečního traktu žaludeční sondou. Dále bylo touto studií zjištěno, že konzumace
glutamátu nezpůsobuje zvýšení hladiny glutamátu v mateřském mléce, a také že
glutamát neprochází přes placentu. Nebyly také prokázány žádné toxické a karcinogenní
účinky glutamátu, stejně tak nebyla zjištěna souvislost mezi konzumací glutamátu a
vzniku defektů u narozených dětí. Dětský trávicí trakt metabolizuje glutamát stejně jako
trávicí trakt u dospělých lidí. Glutamát může způsobit poruchu centrálního nervového
systému pouze pokud je aplikován parenterálně (mimostřevně) nebo konzumací velmi
vysokých dávek glutamátu. Protože žádné další riziko vyplývající z konzumace
glutamátu včetně „syndromu čínských restaurací“ nebylo potvrzeno, byl glutamát
zařazen do zmíněné kategorie. V roce 1991 bylo zařazení do zmíněné kategorie
potvrzeno organizacemi „Federation of American Societies for Experimental Biology“
(FASEB) a „Federal Drug Administration“ (FDA) (Waqlker & Lupien, 2000). Tím
ovšem není vyloučeno, že existují jedinci citliví na obsah glutamátu v potravinách.
52
Tabulka XII. Obsah volného glutamátu v potravinách.
Potravina
Kravské mléko
Vejce
Hovězí maso
Ryby (makrela)
Kuře
Brambory
Kukuřice
Ústřice
Rajčata
Obsah volného glutamátu
(mg ve 100 g)
2
23
33
36
44
102
130
137
140
Potravina
Brokolice
Houby
Hrách
Grepový džus
Rajčatový džus
Vlašský ořech
Sójová omáčka
Parmazán
Roquefort
Obsah volného glutamátu
(mg ve 100 g)
176
180
200
258
260
658
1090
1200
1280
2.7.2. Stanovení přidaného glutamátu v potravinách
Do skupiny metod, které jsou nejčastěji používány pro stanovení glutamové
kyseliny a ostatních aminokyselin, patří především vysokoúčinná kapalinová
chromatografie na reverzní fázi (RP–HPLC) a kapilární izotachoforéza (CITP).
2.7.2.1. Stanovení kyseliny glutamové HPLC
Metody, které byly vyvinuty pro stanovení obsahu kyseliny glutamové, obecně
aminokyselin, ve vzorcích potravin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
(HPLC) na reverzní fázi (RP) nejčastěji využívají fluorescenční detekci s
předkolonovou derivatizací vzorku, elektrochemickou detekci nebo UV/VIS detekci
(viz. Tabulka XIV).
Protože kyselina glutamová nemá vlastnosti vhodné pro její detekci pomocí
fluorescenčního nebo UV/VIS detektoru (neabsorbuje v UV-VIS oblasti), je nutno ji
derivatizovat, čímž získáme analyt, který je možno analyzovat s použitím dané detekce.
Derivatizaci je možno provádět před, nebo po vlastní separaci. Derivatizace prováděná
před separací slouží ke konverzi aminokyselin na derivát s optimálními vlastnostmi pro
analýzu. U předkolonové derivatizace je možno vybrat takové reakční podmínky, aby
citlivost analýzy byla maximální. Naopak s použitím postkolonové derivatizace má
analýza nízkou citlivost a vyžaduje také náročnější vybavení laboratoře a přísnou
kontrolu experimentálních podmínek. Analýza kyseliny glutamové předkolonovou
derivatizací tedy zahrnuje tři kroky:
53
i) převedení kyseliny glutamové na derivát s fluorescenčními
vlastnostmi/absorbující v UV-VIS oblasti
ii) vlastní separace aminokyselin
iii) fluorescenční/UV detekce
Pro derivatizaci aminokyselin je možné použít několik různých derivatizačních činidel
lišících se chemickou strukturou, rychlostí derivatizace a stabilitou získaných derivátů.
Vzniklé deriváty se také liší rozdílnou excitační a emisní vlnovou délkou používanou
při fluorimetrické detekci. Pro derivatizaci je nutno volit takové činidlo, při kterém je
dosaženo nejvyšší citlivosti a přesnosti analýzy pro daný analyt. Přehled možných
derivatizačních činidel, je společně s podmínkami reakce a detekčními podmínkami
uveden v Tabulce XIII.
2.7.2.2. Stanovení kyseliny glutamové CE metodami
V literatuře je popsáno jen velmi málo aplikací kapilárních elektromigračních
metod pro stanovení aminokyselin. Hlavním problémem při separaci je vlastní detekce
analytů. Vzhledem k tomu, že valná většina aminokyselin jen velmi málo absorbuje
v UV oblasti, je nutné aminokyseliny, stejně jako v případě HPLC, před vlastní separací
derivatizovat. Například Michaelsen et al. (1994) použil pro derivatizaci aminokyselin
dansyl chlorid, které separoval micelární elektrokinetickou chromatografií. Je možné
použít všech způsobů derivatizace. Oguri et al. (1997) použil pro stanovení
aminokyselin v bílkovinných hydrolyzátech derivatizazaci přímo v kapiláře naplněné
separačním elektrolytem a směsí OPA/NAC jako derivatizačního činidla. Lee & Lin
(1994) použili pro detekci aminokyselin nepřímou UV detekci, která nevyžaduje
derivatizaci. Tato metoda je v principu jednoduchá, ale není selektivní a má nízkou
citlivost.
Kenndler & Huber (1980) použili kapilární izotachoforézu s přímou vodivostní
detekcí pro stanovení intenzifikátorů chuti - glutamátu, guanosin-5´-monofosfátu a
inosin-5´-monofosfátu v potravinách. Pro separaci použili vedoucí elektrolyt o pH 6
s přídavkem 0,05 % PVP a MES jako koncový elektrolyt. Autoři uvádí limit detekce
10 mg v kg potraviny.
54
Tabulka XIII. Přehled derivatizačních činidel.
o-ftalaldehyd (OPA)
SR´
CHO
COOH
R
+
NR
R´SH
NH2
CHO
OPA reaguje s alfa amino skupinou za přítomnosti sulfohydrylových sloučenin, jako je 2merkaptoethanol (2-ME), 3-merkaptopropionová kyselina (3-MPA), 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-Dglucopyranosa (TATG), N-acetylcystein (NAC) nebo Na2SO3.
Detekce:
· Přímá UV detekce (338 nm)
· Fluorescenční detekce: Ex./Em. 330/418 nm; 340/450 nm
· Elektrochemická detekce
9-Fluorenylmethyl chloroformiát (FMOC)
R
COOH
+
COOH
NH2
C O
H2
Cl
C O
H2
O
N CH
H
O
R
FMOC reaguje jak s primárními aminy tak se sekundárními aminy. Vzniklé deriváty jsou za
laboratorních teploty velmi stabilní. Nezreagované derivatizační činidlo může rušit stanovení, a proto je
třeba ho z roztoku vyextrahovat nepolárním rozpouštědlem.
Detekce:
· Přímá UV detekce (254 nm)
· Fluorescenční detekce: Ex./Em. 265/315 nm; 340/450 nm
Dansyl chlorid (Dns-Cl)
H3C
N
H3C
CH3
+
R
N
CH3
COOH
NH2
SO2Cl
R
S O N
H
O
COOH
Dns-Cl reaguje jak s primárními aminokyselinami tak se sekundárními aminy. Vzniklé deriváty jsou za
laboratorních teploty velmi stabilní. Nezreagované derivatizační činidlo může rušit stanovení, a proto je
třeba ho z roztoku vyextrahovat nepolárním rozpouštědlem.
Detekce:
· Fluorescenční detekce: Ex./Em. 350/530; 265/315 nm; 340/450 nm.
55
Dabsyl chlorid
H3C
R
N
H3C
H3C
N N
SO2Cl
N N
S O N
H
O
+
COOH
NH2
R
N
H3C
COOH
Dabsyl chlorid [4-Dimethylaminoazobenzen-4´-sulfonyl chlorid] reaguje jak s primárními
aminokyselinami tak se sekundárními aminy. Vzniklé deriváty jsou za laboratorních teploty velmi
stabilní. Nezreagované derivatizační činidlo může rušit stanovení, a proto je třeba ho z roztoku
vyextrahovat nepolárním rozpouštědlem.
Detekce:
· Fluorescenční detekce:Ex./Em. 350/530 nm; 265/315 nm; 340/450 nm.
N-hydroxysuccinimidyl-α-(9-acridine)-acetát (HSAA)
O
O
O
O N
H2C
COOH
O N
H
H2C
O
R
+
R
COOH
NH2
N
N
HSAA reaguje s primárními aminokyselinami v slabě alkalickém prostředí (pH=8,5). Čas potřebný k
úplné derivatizaci 30 minut při 60 ºC.
Detekce:
· Fluorescenční detekce: Ex./Em. 385/435.
Fluorescein isothiokyanát (FITC)
S
NCS
N
COOH
R
COOH
COOH
N
H
R
COOH
+
NH2
HO
O
O
HO
O
O
FITC reaguje s primární amino skupinou a tato reakce velmi závisí na pH. Fluorescenční detekce je
velmi citlivá a dokáže zachytit už tisíce molekul.
Detekce:
· Fluorescenční detekce: Ex./Em. 495/519 nm.
56
Tabulka XIV. Přehled experimentálních podmínek používaných pro stanovení glutamové kyseliny a ostatních aminokyselin pomocí
HPLC.
Komodita
Masné výrobky,
„chinese food“ a
instantní polévky
Podmínky
Derivatizace
Detekce
Fluorescenční:
Ex:340 nm
Em:389 nm
Fluorescenční:
Ex:340 nm,
Em:450 nm
Literatura
Kolona: C18, RP-LC,
MF: acetonitril/fosfátový pufr (pH=7,0)/voda (80/180/740)
DMMAC/OPA
Portské víno
Kolona: C18 (Narrow Bore)
MF: A: 20 mM octanový pufr (pH=7,2)
B: 100 mM octanový pufr (pH=9,1)/acetonitril/methanol (20/40/40)
OPA/MPA
-
Kolona: C18
MF: 12,5 mM Na2B4O7.10 H2O / 15 mM H3BO3/50 mM SDS
FMOC
UV: 215 nm
PrinCE Application note
-
Kolona: C18 (5-mm)
MF: A: acetonitril/methanol/octanový pufr (10/40/50)
B: acetonitril/octanový pufr (50:50)
FMOC
UV: 254 nm
Strein et al. (1999)
-
Kolona: C18 (3-mm)
MF: 20 mM citran sodný (pH=2,8)/acetonitril
NDA
Fluorescenční
Devoto
Biologický materiál
Kolona: Micra NPS ODS-II, 3-mm
MF: A: 0,05 M Na2HPO4 (pH=6,1)/acetonitril/THF
B: 0,05 M Na2HPO4 (pH=4,8)/acetonitril/THF
C: acetonitril/THF/voda
OPA/2-MCE
Fluorescenční
Piepponen & Skujins (1997)
Biologický materiál
Kolona: C 18 5-mm RP-LC
MF: A: 0,1 M octanový pufr (pH=6.95)/methanol (90/10)
B: methanol
OPA/2-MCE
Fluorescenční:
Ex:330 nm,
Em:418 nm
Kehr
Biologický materiál
Kolona: Spherisorb ODS-2 (5-mm)
MF: 17% metanol + 0,03 M NaH2PO4 + 0,01 M Na2HPO4 + 2 mM
EDTA (pH=7,0)
Fluorescenční:
Ex:340 nm,
Em:450 nm
Tcherkas & Denisenko,
(2001)
OPA/2-MCE
Beljaars et al. (1996)
Herbert et al. (2000)
57
Biologický materiál
Kolona: Ultrasphere ODS (5-mm)
MF: A: 0,05 M octan sodný : methanol (9:1) + 2% THF
B: methanol + 0,05% THF
OPA/2-MCE
Fluorescenční
Betancort Rodríguez et al.
(1997)
Lidské sérum
Kolona: Spherisorb ODS-2 (5-mm)
MF: 10-19% MeOH + 0,01-0,02 M Na2HPO4 + 0,01-0,02 NaH2PO4
+ 2 mM Na2EDTA (pH=7.0)
OPA/2-MCE
Elektrochemická
detekce
Tcherkas et al. (2001)
Biologický materiál
Kolona: C18 HR-80 RP-LC (3-mm)
MF: 28% MeOH + 0,1 M Na2HPO4 + 0,13 mM Na2EDTA
OPA/2-MCE
Coulometrická
detekce
Donzanti a Yamamoto,
(1998)
58
3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE – PLÁN POKUSŮ
Kapitola 5. Stanovení fosfátů a polyfosfátů:
i) • stanovení polyfosfátů CITP-CITP,CITP-CZE a CZE metodou
- změřeni kalibračních křivek P1, P2, P3 (P4)
- zjištění detekčního limitu (LOD) a limitu kvantifikace (LOQ)
- opakovatelnost metody, opakovatelnost stanovení
• srovnání metod
ii) • stanovení celkového fosforu spektrofotometrickou metodou
• stanovení fosforu v čistých bílkovinách
• stanovení celkového dusíku Kjehldahlovou metodou
• spektrofotometrické stanovení přidaných fosfátů ve vzorcích masných výrobků
• stanovení polyfosfátů ve vzorcích masných výrobků kapilární izotachoforézou
• izotachoforetické stanovení přidaných fosfátů ve vzorcích masných výrobků
• srovnání spektrofotometrického a izotachoforetického stanovení
Kapitola 6. CZE a CITP stanovení karboxylových kyselin v silážích:
• stanovení karboxylových kyselin CZE a CITP metodou
- nalezení vhodných separačních podmínek pro CZE analýzu
- změřeni kalibračních křivek kyseliny mléčné, propionové, octové a máselné
- stanovení detekčního limitu (LOD) a limitu kvantifikace (LOQ) stanovení
- opakovatelnost metody, opakovatelnost stanovení
• stanovení karboxylových kyselin v silážích vojtěšky CZE a CITP metodou
• srovnání výsledků obou metod
Kapitola 7. CITP stanovení karboxylových kyselin ve vejcích:
• optimalizace izotachoforetické metody pro stanovení organických kyselin
v čerstvém vaječném obsahu
• pokus skladování melanže: stanovení organických kyselin metodou CITP-CITP
ve vaječném obsahu (melanži) skladované při teplotě 5 °C během 34 dnů a
stanovení celkového počtu mikroorganizmů.
59
• skladovací pokus skořápkových vajec: stanovení organických kyselin metodou
CITP-CITP ve skořápkových vejcích uchovávaných při teplotách 5, 14 a 30 °C
v průběhu 38 dnů a stanovení celkového počtu mikroorganizmů
• analýza melanží připravených ze skořápkových vajec uchovaných při 4 °C 48
hodin a její mikrobiologický rozbor
• srovnání enzymové a izotachoforetické metody stanovení kyseliny mléčné,
jantarové a 3-hydroxymáselné
Kapitola 8. Stanovení kyseliny glutamové:
• stanovení kyseliny glutamové kapilární izotachoforézou
- nalezení vhodných separačních podmínek
- změření kalibrační křivky kyseliny glutamové
- stanovení detekčního limitu (LOD) a limitu kvantifikace (LOQ) stanovení
- opakovatelnost metody, opakovatelnost stanovení
- stanovení kyseliny glutamové ve vzorcích instantních polévek
• stanovení kyseliny glutamové kapalinovou chromatografií
- nalezení vhodných separačních podmínek, volba derivatizačního činidla a
mobilní fáze
- změření kalibrační křivky
- zjištění detekčního limitu (LOD) a limitu kvantifikace (LOQ)
- opakovatelnost metody, opakovatelnost stanovení
- stanovení kyseliny glutamové ve vzorcích instantních polévek
• srovnání výsledků obou metod
60
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE A MATERIÁL
4.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
9-fluorenylmethyl chloroformát, >98%, (Sigma-Aldrich, ČR)
aceton, p.a., (Penta, ČR)
β-alanin, č., (Austranal-preparate, A)
bis-tris propan, >99%, (Sigma-Aldrich, ČR)
glycin-glycin (Gly-Gly), >99%, (Sigma-Aldrich, ČR)
GTK Agar, (Imuna, SR)
dihydrogenfosforečnan draselný, č., (Lachema, ČR)
difosforečnan sodný dekahydrát, p.a., (Lachema, ČR)
fosforečnan sodný dodekahydrát, >98%, (Sigma-Aldrich, ČR)
hexakyanoželeznatan draselný trihydrát, p.a., (Lachema, ČR)
hydroxid draselný, p.a., (Lachema, ČR)
hydroxid sodný, p.a. (Lachem, ČR)
hydroxypropylmethylcelulóza, (Sigma-Aldrich, ČR)
L-histidin,
č., (Reanal, H)
chlorid sodný, p.a., (Lachema, ČR)
molybdenan sodný dihydrát, p.a., (Lachema, ČR)
kyselina 2-[N-morpholino]ethansulfonová, >99,5%, (Sigma-Aldrich, ČR)
kyselina 3-hydroxymáselná, >99%, (Sigma-Aldrich, ČR)
kyselina ε-amino-n-kapronová (EACA), >98%, (Sigma-Aldrich, ČR)
kyselina askorbová, p.a., (Lachema, ČR)
kyselina citronová, p.a., (Lachema, ČR)
kyselina fumarová, p.a., (Lachema, ČR)
kyselina L-glutamová kyselina, (Mann Research Laboratories, USA)
kyselina chlorovodíková, p.a., (Penta, ČR)
kyselina jantarová, p.a, (Lachema, ČR)
kyselina octová, p.a. (Penta, ČR)
kyselina pyroglutamová, >99,8%, (Sigma-Aldrich, ČR)
kyselina pyrohroznová, č. (Lachema, ČR)
kyselina sírová, p.a., (Penta, ČR)
61
kyselina sorbová, p.a. (Lachema, ČR)
kyselina trichloroctová, č., (Penta, ČR)
mléčnan litný, p.a., (Fluka, ČR)
methanol, p.a. (Penta, ČR)
octan sodný, p.a. (Lachema, ČR)
oxid zinečnatý, p.a., (Lachema, ČR)
Pepton, (Imuna, SR)
peroxid vodíku, p.a., (Lachema, ČR)
síran zinečnatý, hemihydrát, p.a., (Lachema, ČR)
tetraboritan disodný, p.a., (Lachema, ČR)
trifosforečnan sodný, 90-95%, (Sigma-Aldrich, ČR)
Tween 80, (Merck, BRD)
4.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE
Izotachoforetický analyzátor ZKI 02 (Labeco, SK):
a) předseparační kapilára: FEP (fluorovaný kopolymer ethylenu a propylenu),
160 mm × 0,8 mm
b) analytické kapiláry: FEP, 90 mm × 0,3 mm
FEP, 160 mm × 0,3 mm
c) vodivostní detektor
d) UV detektor (254 nm)
e) software: ITPWin 2.20, (KasComp, SK)
Kapalinový chromatograf:
a) čerpadlo, P580 (Gynkotek, BRD)
b) autosampler, Gina 50 (Gynkotek BRD)
c) fluorescenční detektor, RF 2000 (Dionex, USA) / UCI 100 (Dionex, USA)
d) kolona, Purospher RP-C18, 5µm, 124 × 4 mm (Merck, Darmstadt, BRD)
e) kolonový termostat, LCO 101 (ECOM, ČR)
f) software, Chromeleon 6.30 Build 576 (Dionex, USA)
62
Ostatní:
·
laboratorní analytické digitální váhy AND, ER-120A (A&D, J)
·
ultrazvuková lázeň Ultrasonic DM1 (Tesla, ČR)
·
homogenizátor Ultraturax (IKA Werme, BRD)
·
vakuová balička Tecnovac S 100 DGT (Tecnovac srI, I)
·
vodní lázeň JULABO 13 (Julabo, BRD)
·
UV/VIS spektrofotometr Lambda 11 (Perkin Elmer, BRD)
·
sušárna KC-65 (Chirana, ČR)
·
KJELTEC AUTO PLUS 1030 Analyser (Foss Tecator AB, S)
·
DIGESTION SYSTEM 20 1015 DIGESTER (Foss Tecator AB, S)
·
termostat (TCH 100, ČR)
·
laboratorní odstředivka EBA 010 (Eba, BDR)
·
muflová pec MLW (VEB Electro Bad Frankenhausen, DDR)
·
Spectronic® 20 GENESISTM, (Spectronic instruments, Rochester NY, USA)
·
kuchyňský robot Moulinex LA Moulinette R 68 (Moulinex, F)
·
ruční mixér E EM 0031 (AEG, BRD)
·
membránový filtr (0,45 µm) (Macherey-Nagel, BRD)
·
enzymová komerční souprava pro:
kyselinu L-mléčnou – Nr. 0 139 084, (Boehringer, BRD)
kyselinu jantarovou – Nr. 0 176 281, (Boehringer, BRD)
kyselinu 3-hydroxymáselnou – Nr. 0 176 281, (Boehringer, BRD)
63
5. STANOVENÍ FOSFÁTŮ A POLYFOSFÁTŮ
5.1. POUŽITÉ VZORKY
Vzorky masných výrobků byly získány v maloobchodní síti. Neprodleně po
zakoupení bylo vždy zhruba 100 g výrobku rozmělněno a v uzavřeném polyetylenovém
sáčku skladováno při –14 °C do doby analýzy. Pro stanovení fosfátů bylo použito
14 vzorků šunek, 10 vzorků párků, 5 vzorků sekané, 5 vzorků paštik a jeden vzorek
mortadelly.
ŠUNKY
OSTATNÍ MASNÉ VÝROBKY
11H
krůtí šunka zauzená
1F
jemný párek
12H
lázeňská šunka
2F
holandský párek se sýrem
13H
šunka „ala kreveta“
3F
vídeňský párek
14H
farmářská šunka
4F
párky apetit
16H
kuřecí šunka
5F
debrecínské párky
17H
sendvič šunka
6F
moravské párky
18H
šunka klasik
7F
baby párky
19H
šunka delikates
8F
špekáčky extra
20H
picnic šunka
9F
papriková klobása
21H
šunka Bohemia
10F
kominický česnekový salám
22H
šunka mini
15M
italská mortadela
23H
šunka billa
26P
francouzská paštika d´Artagnan
24H
baby šunka
27P
šunková pěna
25H
šunkový salám
28S
jemná sekaná pečeně bavorská
29S
lahůdková sekaná
30S
bavorská sekaná
31P
játrový sýr
32S
domácí sekaná
33P
lahůdková paštika
34P
bruselská paštika
64
5.2. STANOVENÍ POLYFOSFÁTŮ CE METODAMI
5.2.1. Příprava vzorku
Vzorky pro CITP-CITP stanovení polyfosfátů byly připraveny navážením 1 g
homogenizovaného vzorku s přesností na tři desetinná místa do 100 ml odměrné baňky.
Ke vzorku bylo přidáno 50 ml vody a baňka byla umístěna do ultrazvukové lázně. Po
30 minutách byl obsah baňky ochlazen a doplněn vodou po značku, následně byl obsah
zfiltrován přes papírový filtr a filtrát přímo použit pro analýzu.
Pro stanovení jednotlivých polyfosfátů ve vzorcích průmyslových směsí
polyfosfátů bylo odváženo 300 mg do 100 ml odměrné baňky a pro vlastní analýzu byl
tento roztok 100-krát naředěn na koncentraci ~30 mg.l-1.
5.2.2. Podmínky analýzy
Separace byly prováděny na izotachoforetickém analyzátoru ZKI 02, a to ve třech
separačních módech CITP-CITP, CITP-CZE a CZE. V prvních dvou módech byla
prováděna v dvoukapilárním uspořádání s předseparační kapilárou (FEP, 90 mm × 0.8
mm, I.D.) a separační kapilárou (FEP, 90 mm × 0.3 mm I.D.). Vzorek byl dávkován
ventilem s fixním objemem 35 µl. V CZE módu byly separace prováděny
v jednokapilárním uspořádání (FEP, 90 mm × 0.3 mm I.D.) a vzorek byl dávkován CZE
ventilem s fixním objemem 200 nl. Pro detekci analytů byla ve všech případech použita
přímá vodivostní detekce.
Použité elektrolyty a hodnoty separačních proudů jsou uvedeny v Tabulce XV.
Připravené elektrolyty byly skladovány při 5 °C. Kalibrační křivky byly připraveny
příslušným naředěním standardních roztoků o koncentraci 10 mmol.l-1 a 1 mmol.l-1. Pro
CITP-CITP byla použita pětibodová kalibrační křivka o koncentracích 10, 50, 100, 200
a 500 µmol.l-1, pro CITP-CZE o koncentracích 2, 4, 6, 8, 10 µmol.l-1 a pro CZE
čtyřbodová kalibrační křivka o koncentracích 25, 50, 75, 100 µmol.l-1.
65
Tabulka XV. Složení použitých elektrolytů a separační podmínky pro CITP-CITP,
CITP-CZE a CZE stanovení polyfosfátů.
Parametr
Dávkovaný objem
Vedoucí elektrolyt
(LE)
Koncový elektrolyt
(TE)
CITP-CITP
35 µl
10 mM HCl + 20 mM
Gly-Gly + 0.05% HPMC,
pH=3,05
Separační systém
CITP-CZE
35 µl
10 mM HCl + 20 mM GlyGly +0.05% HPMC,
pH=3,05
5 mM kyselina citronová
5 mM kyselina citronová
Základní elektrolyt
(BGE)
Separační proud
Předseparační kapilára
Separační kapilára
-
10 mM kyselina citronová +
6 mM β-alanin + 1 mM
BTP, pH=3,10
250 µA
50 µA
250 µA
50 µA (4,9 kV)
CZE
200 nl
10 mM kyselina
jantarová + 13 mM
β-alanin, pH=3,72
35 (4 kV)
5.3. STANOVENÍ CELKOVÉHO FOSFORU
5.3.1. Příprava roztoků
(a) Roztok 50% hydroxidu draselného: 50 g KOH bylo rozpuštěno v 50 ml vody
(b) Roztok molybdenanu sodného: Opatrně bylo smícháno 140 ml koncentrované
kyseliny sírové v 300 ml vody, vychlazeno na pokojovou teplotu a přidáno 12,5 g
molybdenanu sodného. Doplněno vodou do 500 ml.
(c) Roztok kyseliny askorbové: Ve vodě bylo rozpuštěno 5 g kyseliny askorbové a
doplněno do 100 ml.
(d) Směs molybdenanu a askorbové kyseliny: 25 ml roztoku (b) s 10 ml roztoku
kyseliny askorbové (c) a doplněno destilovanou vodou po značku ve 100 ml odměrné
baňce.
(e) Zásobní
roztok
fosforu:
1,0967 g
dihydrogenfosforečnanu
draselného
(KH2PO4) bylo rozpuštěno ve vodě, v 250 ml odměrné baňce doplněno po značku.
Tento roztok obsahuje 1,0 mg P v ml.
(f) Pracovní roztok fosforu: Do 500 ml odměrné baňky bylo odpipetováno 5 ml
zásobního roztoku (e) a doplněno po značku. Tento roztok obsahuje 0,01 mg P
v jednom ml.
66
5.3.2. Spektrofotometrické stanovení celkového fosforu
Do 50 ml žíhacího kelímku bylo naváženo 1,0 – 1,5 g homogenizovaného vzorku
s přesností na tři desetinná místa a 0,5 g oxidu zinečnatého, který byl skleněnou
tyčinkou do vzorku dobře zapracován. Pro kontrolu byl stejným způsobem paralelně
připravován i slepý pokus, kdy byl do kelímku odvážen pouze oxid zinečnatý. Takto
připravené vzorky byly předsušeny 1 – 2 hodiny při 110°C a poté byly přemístěny do
muflové pece vyhřívané na 525°C po dobu minimálně 2 hodin. Do vychladlých kelímků
se vzorky bylo přidáno 5 ml vody a 5 ml 36% kyseliny chlorovodíkové. Kelímky byly
přikryty skleněným sklíčkem a 5 minut povařeny. Poté byly vzorky zfiltrovány přes
papírový filtr do 100 ml odměrné baňky a kelímky vypláchnuty horkou vodou.
Přefiltrované vzorky byly neutralizovány 50% hydroxidem draselným do vzniku slabé
opalescence Zn(OH)2, poté byla po kapkách přidávána koncentrovaná kyselina
chlorovodíková tak, aby právě jednou kapkou došlo k vymizení opalescence.
Do 50 ml odměrné baňky bylo pipetováno 0,5 – 10,0 ml připraveného vzorku, dle
předpokládaného obsahu fosforu. Kalibrační křivka byla připravena pipetováním 0,5;
1,0; 1,5; 2,0; 2,5 a 3,0 ml pracovního roztoku fosforu (f) do 50 ml odměrných baněk
společně s 15 ml destilované vody. Ke vzorkům a standardním roztokům bylo přidáno
20 ml směsi molybdenanu a kyseliny askorbové (d). Obsah v baňkách byl 15 minut
zahřívám ve vroucí vodní lázni, následně byl obsah v baňce ochlazen a doplněn po
značku. Byla proměřena absorbance takto připravených vzorků proti slepému pokusu
při vlnové délce 823 nm.
5.4. STANOVENÍ CELKOVÉHO DUSÍKU
1,5 g homogenizovaného vzorku bylo odváženo s přesností na tři desetinná místa
do mineralizační zkumavky. Ke vzorku bylo přidáno 10 ml koncentrované kyseliny
sírové, tableta katalyzátoru (K2SO4 + CuSO4) a 10 ml koncentrovaného peroxidu
vodíku. Mineralizace vzorků (DIGESTION SYSTEM 20) byla prováděna standardním
programem, s teplotou rostoucí během jedné hodiny až na 420 °C a výdrží při této
teplotě 60 min. Celková mineralizace trvala 2 hodiny 15 min. Titrace byla prováděna
automaticky na přístroji KJELTEC Auto Plus 1030. Obsah celkového dusíku
v hmotnostních procentech byl ve vzorku spočítán podle vzorce (5.1)
67
N=
1,4007 × c × (V - Vsl )
(%)
m
(5.1)
kde c je koncentrace (mol.l-1) a V je spotřeba (ml) odměrného roztoku HCl, m je
navážka vzorku (g), Vsl spotřeba (ml) odměrného roztoku pro slepý pokus.
5.5. STANOVENÍ DUSÍKU A FOSFORU V ČISTÉ BÍLKOVINĚ
Do 50 ml Erlenmeyerovy baňky byly naváženy 2 g homogenizovaného vzorku
s přesností na tři desetinná místa a přidáno 20 ml destilované vody, baňka byla přikryta
hodinovým sklíčkem a obsah zahříván 30 minut ve vroucí vodní lázni. Po ochlazení a
přidání 10 ml 10% kyseliny trichloroctové byl obsah baňky ponechán 12 hodin stát při
laboratorní teplotě. Sraženina byla zfiltrována a na filtru promyta 2% trichloroctovou
kyselinou a následně destilovanou vodou do neutrální reakce filtrátu. Sraženina
zachycená na filtračním papíru byla použita pro stanovení dusíku a nebo po smíšení
s ZnO pro stanovení celkového fosforu.
5.6. ZÍSKANÉ VÝSLEDKY A JEJÍCH DISKUSE
5.6.1. Elektroforetické stanovení polyfosfátů
CITP-CITP
Proměřením pětibodových kalibračních rovnic v intervalu od 10 do 500 µmol.l-1
byly získány kalibrační rovnice (koncentrace µmol.l-1 vs. délka zóny L v sekundách) pro
monofosfát: c = 5,43.10-3.L – 8,66.10-3 (r = 0.9999); difosfát: c = 3,94.10-3.L – 0,24.10-3
(r = 0.9996) a trifosfát: c = 3,17.10-3.L – 1,18.10-3 (r = 0.9994). Kalibrační křivky byly
spolehlivě lineární do koncentrace 1000 µmol.l-1. Detekční limit (LOD) byl 2 µmol.l-1 a
limit kvantifikace (LOQ) 5 µmol.l-1 pro všechny analyty. Opakovatelnost stanoveni
polyfosfátů vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka (RSD) z šesti opakovaných
měření standardu o koncentraci 100 µmol.l-1 byla 4,2 %.
Obrázek 7A ukazuje typický izotachoforegram vzorku masného výrobku (šunky)
a Obrázek 7B záznam separace standardní směsi polyfosfátů (P1 – P4). Polyfosfáty jsou
68
separované podle jejich mobility v poradí tetrafosfát, trifosfát, difosfát a monofosfát.
Ačkoli rozdíl mezi relativní výškou zóny (RSH) mezi tertrafosfátem a trifosfátem je
relativně malý, je možné za těchto podmínek (viz. Tabulka XV) tri- a tetrafosfát od sebe
oddělit. Jejich separace je však na hranici možností. Vyšší polyfosfáty již v tomto
systému není možné separovat.
Reálné vzorky masných výrobků obsahují prakticky pouze monofosfát a difosfát,
neboť vyšší polyfosfáty se v důsledku působení enzymového aparátu masa na ně
přeměnily. Směsi polyfosfátů používané v masném průmyslu obvykle obsahují trifosfát
a difosfát jako majoritní složky a monofosfát a tetrafosfát jako složky minoritní,
přičemž obsah tetrafosfátů přestavuje méně než 5 % celkového obsahu polyfosfátů.
Obsah monofosfátu, difosfátu a případně trifosfátů byl stanoven ve 34 vzorcích
masných výrobků a v šesti vzorcích různých druhů mas. Nalezené hodnoty byly
vyjádřeny jako celkový obsah P2O5 v kg. Koncentrace polyfosfátů byly přepočítány na
P2O5 podle vzorců (5.2a, b, c)
c1
× MrP 2O 5 ×1000
20
Obsah monofosfátu =
m
(mg.kg-1)
c2
× MrP 2O 5 ×1000
10
(mg.kg-1)
Obsah difosfátu =
m
c3
× MrP 2O 5 × 1000
6,666
Obsah trifosfátu =
m
(mg.kg-1)
(5.2a)
(5.2b)
(5.2c)
kde Mr je molární hmotnost P2O5 – 141,945 g.mol-1, c1 je koncentrace monofosfátu
(mol.l-1), c2 koncentrace difosfátu (mol.l-1), c3 koncentrace trifosfátu (mol.l-1) a m je
navážka vzorku (g).
69
A
TE
R
P1
P2
LE
375
400
425
450
[s]
475
500
10,5
B
9,5
525
TE
8,5
7,5
6,5
5,5
P1
R
4,5
3,5
P2
2,5
P4
1,5
P3
LE
0,5
470
480
490
500
[s]
510
520
530
Obrázek 7. Izotachoforegram (A) vzorku šunky, (B) standardní směsi polyfosfátů
(P4 30 µmol.l-1; P3, P2, P1 20 µmol.l-1).
CITP-CZE
Proměřením pětibodových kalibračních rovnic v intervalu od 2 do 10 µmol.l-1
byly získány kalibrační rovnice (koncentrace µmol.l-1 vs. plocha píku) pro monofosfát:
c = 11,6.10-3 . A + 0,83, difosfát: c = 4,3.10-3 . A + 4,3.10-3 a trifosfát: c = 4,5.10-3 . A +
4,62 s korelačními koeficienty 0.999, 0.999 a 0.996. Kalibrační křivky byly zcela
lineární do koncentrace 50 µmol.l-1. Limit detekce byl ≥ 0.2 µmol.l-1 a limit kvantifikace
0,5 µmol.l-1 pro všechny analyty.
Jak je z uvedených výsledků zřejmé, umožňuje „on-line“ spojení CITP a CZE
rapidně snížit detekční limit metody, a to zhruba 10-krát oproti jednodimenzionální
CITP-CITP metodě. Konfigurace izotachoforetického analyzátoru ZKI 02 dovoluje
70
oddělit makrosložky matrice vzorku od samotného analytu (Kanianský et al., 1994).
V případě, že jde o vzorky masných výrobků, jsou touto makrosložkou chloridové
ionty. Pro vlastní CITP-CZE stanovení byly tedy použity dva elektrolytové systémy.
Pro CITP krok byl použit vedoucí elektrolyt (LE): 10 mM HCl + 20 mM Gly-Gly
+ 0,05% HPMC a koncový elektrolyt (TE): 5 mM kyselina citronová, což je stejný
systém použitý v předchozím případě. Složení separačního elektrolytu (BGE), pro CZE
separaci v druhém kroku je třeba volit tak, aby tento splňoval tyto požadavky:
(i) separační elektrolyt obsahuje nejlépe stejné látky jako koncový elektrolyt (TE)
předchozího izotachoforetického kroku; (ii) vodivost separačního elektrolytu musí být
dostatečně rozdílná od analytů, tak aby odezva vodivostního detektoru byla dostatečně
velká, ale na druhou stranu by koncentrace měla být taková, aby nedocházelo
k elektromigrační disperzi ve velmi zředěném roztoku (Šustáček et al., 1991); (iii)
hodnoty pH BGE a LE předchozího izotachoforetického kroku by měly být co nejbližší.
Elektrolyt splňující tyto požadavky byl připraven z kyseliny citronové a β-alaninu jako
pufrujícího kationu (pKa = 3,552) o hodnotě pH 2,9.
Separační pořadí lineárních polyfosfátů závisí na délce jejich řetězce, molekuly
s delším řetězcem mají kratší migrační čas. Nejpomalejší monofosfát se separuje
s nejdelším migračním časem. Toto separační pořadí je v rozmezí od pH 3 do pH 6
nezávislé na hodnotě pH elektrolytu (Stover & Keffer, 1993) a je možné ho změnit
pouze přídavkem polyvalentních protiiontů s brzdícím efektem. Vliv přídavku bis-tris
propanu (s náboj molekuly 2+) na migrační čas polyfosfátů závisí na délce řetězce. Čím
delší je řetězec, tím více je bržděn. Na Obrázku 8 je možné vidět změny migračních
časů v elektrolytech, kde byla část β-alaninu nahrazena bis-tris propanem (BTP)
v poměru 2:1. Migrační čas jednotlivých polyfosfátů byl sledován v elektrolytech
s koncentrací BTP od 0 do 2 mM. Malý přídavek BTP (0,5 mM) má zásadní vliv na
migrační čas tetrafosfátu a přídavek 2 mM má už takový vliv, že změní separační pořadí
trifosfátu a difosfátu. Elektrolyt použitý pro separaci byl připraven z 10 mM kyseliny
citronové, 6 mM β-alaninu a 1 mM BTP.
71
10,0
9,0
Migrační čas (min)
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Koncentrace BTP (mM)
Obrázek 8. Vliv koncentrace BTP na migrační čas polyfosfátů. P1 (○), P2 (∆), P3 (□) a
P4 (´).
Stabilita polyfosfátů v roztoku
Je známé, že polyfosfáty hydrolyzují ve vodných roztocích. Rychlostní konstanta
této hydrolýzy závisí na pH, koncentraci a teplotě roztoku. Autoři (Motooka et al.,
1983) uvádí, že roztok polyfosfátů o koncentraci 2000 mg.l-1 nemění své složení po
dobu 24 hodin. Provedenými experimenty bylo zjištěno, že jsou stabilní i roztoky
difosforečnanu a trifosforečnanu sodného o koncentracích 20 mg.l-1. Koncentrace
polyfosfátů použitých pro CITP-CZE stanovení jsou však jen 1 mg.l-1, tedy zhruba
dvacetkrát nižší. V roztocích o takovéto koncentraci je už vliv hydrolýzy poměrně
významný a tím dochází ke změnám poměru mezi jednotlivými formami polyfosfátů.
Na Obrázku 9 je záznam průběhu relativní změny koncentrací polyfosfátů v roztoku při
laboratorní teplotě v průběhu 210 minut. Po čtyřech hodinách byl v roztoku přítomný
pouze monofosfát.
72
250
Relativní změna koncentrace (%)
200
150
100
50
0
0
50
100
150
200
250
Čas (min)
Obrázek 9. Relativní změna koncentrací polyfosfátů v závislosti na čase, počáteční
koncentrace trifosforečnanu sodného 10 mg.l-1. P1 (○), P2 (∆) a P3 (□) .
CZE
Proměřením čtyřbodových kalibračních řad v intervalu od 25 do 100 µmol.l-1 byly
získány kalibrační rovnice (koncentrace µmol.l-1 vs. plocha píku A) pro monofosfát:
c = 0.3944 . A + 0,574, difosfát c = 0.1888 . A + 6,435, trifosfát c = 0.1267 . A + 4.099
a tetrafosfát c = 0.1284 . A + 10.222 s korelačními koeficienty r 0.9999, 0.999, 0.999 a
0.999. Kalibrační křivky byly zcela lineární do 150 µmol.l-1. Limit detekce (LOD) pro
tetrafosfát byl 4 µmol.l-1 a pro tri-, di- a monofosfát byl ≤ 2 µmol.l-1. Limit kvantifikace
(LOQ) byl pro tetrafosfát 10 µmol.l-1, pro ostatní pak 5 µmol.l-1. Opakovatelnost
stanovení polyfosfátů, vyjádřená jako relativní standardní odchylka RSD šesti
opakovanými měřeními standardu o koncentraci 50 µmol.l-1, byla 4,5 %.
Odezva vodivostního detektoru je závislá na počtu atomů fosforu v molekule
lineárního polyfosfátu (Motooka et al., 1983; Sekiguchi et al., 2000). Tato závislost
73
byla také zjištěna a pro tri-, di- a monofosfát platí že se odezva detektoru jedenkrát
zvýší s každým dalším atomem fosforu v molekule polyfosfátu.
Na Obrázku 10B je elektroforegram roztoku polyfosforečné kyseliny o
koncentraci 30 mg.l-1. Kyselina polyfosforečná byla analyzována proto, aby bylo
prokázáno že separaci tetra-, tri-, di- a monofosfátu neruší žádný z dalších polyfosfátů, a
to jak lineárních, tak cyklických metafosfátů. Ze sedmi píků byl tetra-, tri-, di- a
monofosfát identifikovaný metodou standardního přídavku a porovnáním jejich
migračních časů se standardy. Lze předpokládat, že zbývající jsou metafosfáty s různým
počtem atomů fosforu v molekule. CZE metoda byla použita pro stanovení jednotlivých
polyfosfátů
v fosfátových
přípravcích
používaných
v masném
průmyslu.
V Tabulce XVI jsou uvedeny naměřené výsledky a obsah jednotlivých fosfátů je
vyjádřen jako P2O5. Na Obrázku 10C je uvedený záznam jednoho z těchto vzorků.
Tabulka XVI. Obsah polyfosfátů vyjádřený jako (%) P2O5 v polyfosfátových směsích.
FSM 2001
PROMAS SM 20
PROTUK 25
P4
0.5
-
P3
31.7
48.5
5.5
Obsah P2O5 (%)
P2
P1
13.4
3.1
8.8
4.3
1.1
Suma
48.7
57.3
9.8
74
Obrázek 10. Elektroforegram (A) 50 mmol.l-1 standardní směsi tetrafosfátu (P4),
trifosfátu (P3), difosfátu (P2) a monofosfátu (P1), (B) roztok polyfosforečné kyseliny
(30 mg.l-1), (C) roztok (30 mg.l-1) komerční směsi polyfosfátů - FSM 2001.
75
5.6.2. Spektrofotometrické stanovení přidaných fosfátů
Regresní
rovnice
spektrofotometrického
stanovení
celkového
fosforu
(koncentrace fosforu mg.l-1 vs. absorbance A) byla c = 16,99 . A – 0,0007 (korelační
koeficient r = 0,9998). Pro stanovení opakovatelnosti metody bylo pro jeden ze vzorků
provedeno šest paralelních stanovení. Průměrný obsah P2O5 v tomto vzorku byl
0,408 ± 0,007 g ve 100 g a vypočítaná relativní standardní odchylka‡, RSD = 1,6 %,
mezi těmito stanoveními představuje opakovatelnost stanovení.
Pro stanovení přidaného fosfátu v masných výrobcích bylo nejdříve nutné vyjádřit
celkový obsah fosforu jako oxid fosforečný P2O5 a obsah dusíku ve vzorcích přepočítat
na obsah bílkovin.
P2O5 (mg) = 2,29 . P (mg)
(5.3)
Obsah bílkovin (%) = 6,25 . obsah dusíku (%)
(5.4)
Z těchto hodnot byly vypočítány obsahy přidaného fosfátu (P2O5) v mg.kg-1 ze vzorce:
Obsah přidaných fosfátů = A – [((B . 0,0106)) . 2,29)] . 104 (mg.kg-1)
(5.5)
kde A je obsah celkového fosforu vyjádřený jako mg P2O5 v kg, B je obsah bílkovin
v %. Hodnoty byly vypočítány ze dvou paralelních měření, přičemž hodnoty byly
akceptované pokud relativní standardní odchylka mezi nimi byla menší než
opakovatelnost metody. Všechny naměřené hodnoty pro analyzované masné výrobky
jsou uvedené v Tabulce XIX.
‡
standardní odchylka - SD 2 = å N ( xi - x )
n =1
N -1
2
2
relativní standardní odchylka - RSD(% ) = SD ×100
x
76
5.6.3. Izotachoforetické stanovení přidaných fosfátů
5.6.3.1. Poměr mezi volným fosfátem a bílkovinami v mase
Obsah přidaného fosfátu referenční metodou (tj. spektrofotometrické stanovení
celkového fosforu) je počítán podle vzorce (5.6) jako rozdíl mezi celkovým obsahem
fosfátů a fosfáty přirozeně přítomnými v bílkovině. Kapilární izotachoforézou se
stanovují fosfáty ve vodném extraktu a proto je možné stanovit pouze ve vodě rozpustné
formy fosfátů. Protože však 80 – 90% všech fosfátů přirozeně přítomných v mase je ve
vodě rozpustných, bylo nezbytné změnit metodu výpočtu. Rovnice (5.7) ukazuje, jak
byl změněn způsob výpočtu a také, že bylo nezbytné nalézt nový koeficient R, který je
definovaný jako poměr mezi množstvím rozpustných přirozeně přítomných fosfátů a
obsahem bílkovin v mase.
RM: Obsah přidaných fosfátů = 2,29 . [∑PRM – (obsah bílkovin . 0,0106)] (5.6)
CITP: Obsah přidaných fosfátů = ∑P2O5 CITP – (obsah bílkovin . R) (5.7)
Pro stanovení tohoto poměru R bylo analyzováno šest vzorků čtyř druhů mas tj.
vepřové, hovězí, kuřecí a krůtí. U těchto vzorků byl stanoven celkový obsah bílkovin a
čistých bílkovin, celkový obsah fosfátu, fosfát v čistých bílkovinách referenční
spektrofotometrickou metodou a obsah rozpustných fosfátů kapilární izotachoforézou.
Naměřené hodnoty jsou uvedené v Tabulce XVII.
Tabulka XVII. Celkový obsah bílkovin (%) a čistých bílkovin (%), celkový obsah
fosfátu referenční metodou (mg.kg-1), obsah fosfátu v čistých bílkovinách (mg.kg-1) a
obsah rozpustných fosfátů (mg.kg-1) stanovených v šesti různých druzích masa. RM –
referenční metoda, CITP – kapilární izotachoforéza.
Obsah bílkoviny (%)
Obsah čistých bílkovin (%)
Celkový obsah P2O5 (RM)
Celkový obsah P2O5 v čisté
bílkovině (RM)
Rozpustný P2O5 (CITP)
Rozpustný P2O5 (RM)
Vepřová
kýta
20,2±0,3
20,8±1,0
4937±124
Hovězí
zadní
21,9±0,2
19,6±0,2
4441±105
Kuřecí
stehno
20,8±0,2
16,8±0,4
4513±83
Kuřecí
prsa
24,1±0,6
20,0±1,2
5377±63
513±1
770±8
981±39
825±1
3549±2
4424±125
3089±5
3295±21
3671±114 3531±198
4403±10
4552±54
Krůtí
Krůtí
stehno
prsa
22,46±0,05 26,3±0,2
19,7±0,5 20,4±1,5
4120±64 5445±122
494±36
467±40
3620±24 3931±31
3626±308 4878±361
77
Z těchto dat byly vypočítány tři koeficienty, a to poměr mezi celkovým obsahem fosfátu
a bílkovinami (i), poměr mezi rozpustným (volným) fosfátem a bílkovinami (ii) a poměr
mezi fosfátem obsaženým v čisté bílkovině a bílkovinami (iii). Tyto koeficienty jsou
uvedeny v Tabulce XVIII.
Tabulka XVIII. Poměr mezi celkovým obsahem fosfátu a bílkovinami (mg.g-1), poměr
mezi rozpustným fosfátem a bílkovinami (mg.g-1) a poměr mezi fosfátem obsaženým
v čisté bílkovině (mg.g-1).
Vepřová kýta
Hovězí zadní
Kuřecí stehno
Kuřecí prsa
Krůtí stehno
Krůtí prsa
x
RSD (%)
(i)
Celkový obsah P2O5 vs.
obsah bílkovin (mg.g -1)
24,5 ± 0,7
20,4 ± 0,5
21,8 ± 0,5
22,2 ± 0,7
22 ± 1
20,8 ± 0,5
21 ± 1
6,9
(ii)
Rozpustný P2O5 vs. obsah
bílkovin (mg.g -1)
17,6 ± 0,3
14,0 ± 0,1
15,8 ± 0,2
18,2 ± 0,5
15,9 ± 0,1
14,9 ± 0,2
16 ± 2
9,7
(iii)
P2O5 v čisté bílkovině vs.
obsah bílkovin (mg.g -1)
2,55 ± 0,05
3,51 ± 0,05
4,8 ± 0,2
3,5 ± 0,9
2,2 ± 0,2
2,2 ± 0,2
4±1
30,4
Průměrná hodnota poměru mezi celkovým obsahem fosfátu a obsahem bílkovin je
21 ± 1 mg.g -1 což odpovídá 0,0092 ± 0,0004 mg P v gramu bílkoviny. Tato nalezená
hodnota je ve velmi dobré shodě s hodnotou uváděnou v literatuře (Kłossovska, 1998).
Naměřené hodnoty se pohybují v intervalu od 22 do 24,5 a jejich relativní standardní
odchylka je 6,9 %, z toho je zřejmé že tento poměr je relativně málo ovlivněný
živočišným druhem a typem masa.
Nejdůležitější
z koeficientů
uvedených
v Tabulce XVIII
je
poměr
mezi
rozpustným fosfátem a obsahem bílkovin. Nalezená průměrná hodnota je 16 ± 2 mg.g -1.
Hodnoty se u tohoto poměru pohybují v širším intervalu od 14,0 do 18,2 s relativní
standardní odchylkou 9,7 %, což znamená, že tento poměr je více závislý na živočišném
druhu a typu masa. Znalost tohoto poměru umožňuje změnit rovnici (5.7) na její
prakticky využitelnou formu, která má následující tvar:
Obsah přidaných fosfátů = F – 10 . (B . 16,2) (mg P2O5 v kg)
(5.8)
78
kde B je obsah bílkovin (%), F je obsah rozpustných fosfátů stanovených kapilární
izotachoforézou (mg P2O5 v kg).
Pro doplnění byl také vypočítán poměr mezi obsahem P2O5 v čistých bílkovinách
a celkovým obsahem bílkovin jehož průměrná hodnota je 4 ± 1 mg.g -1 s relativní
standardní odchylkou 30,4 %. Na rozdíl od předchozích dvou je tento poměr již striktně
závislý na živočišném druhu a typu masa. Pro tvrzení, že obsah fosfátu, potažmo
fosforu, je charakteristický pro určitý druh masa bohužel nebyl zpracován dostatečný
soubor vzorků masa. Obsah fosfátu v čistých bílkovinách byl změřen pro potvrzení
předpokladu, že obsah rozpustných fosfátů odpovídá rozdílu mezi obsahem celkových
fosfátů a fosfáty přítomnými v čisté bílkovině masa. Hodnoty vypočítané jako tento
rozdíl, tzn. obsah rozpustných fosfátů stanovený referenční spektrofotometrickou
metodou, jsou uvedené na posledním řádku v Tabulce XVII. Rozdíly mezi obsahem
rozpustných fosfátů stanoveným kapilární izotachoforézou a vypočítaným u některých
vzorků je možné vysvětlit tím, že svalovina obsahuje sloučeniny fosforu, které nejsou
pevnou součástí bílkovin masa a zároveň je není možné stanovit kapilární
izotachoforézou jako rozpustné fosfáty tj. nukleotidy, fosfolipidy, kreatinfosfát.
Obsah přidaných fosfátů stanovených ve vzorcích masných výrobků kapilární
izotachoforézou a vypočítaných podle vzorce (5.8) je společně s obsahem bílkovin a
obsahem přidaných fosfátů stanovených spektrofotometrickou referenční metodou
uveden v Tabulce XIX.
5.6.4. Srovnání metod stanovení přidaných fosfátů
Soubor 34 vzorků masných výrobků byl rozdělen do dvou skupin, na šunky a na
ostatní masné výrobky. U vzorků (7P, 8P, 14H, 22H, 31P, 33P, 28S a 38S) jsou
stanovené hodnoty přidaných fosfátů řádově odlišné, vzhledem k tomu, že se jedná o
výrobky nižší kvality, je možné tyto rozdíly vysvětlit přídavkem jiných (vaječné,
mléčné, sojové, atd.) bílkovin do těchto výrobků. Rozdílný poměr mezi celkovým a
volným fosfátem v těchto aditivech (Alli & Barker, 1981; Brooks & Morr, 1984) může
v důsledku ovlivnit vypočítanou hodnotu přidaných fosfátů. Záporné hodnoty, které se
objevují u obou metod, jsou způsobeny přídavkem takových surovin (přísad), jenž zvýší
obsah dusíku, potažmo bílkovin, a má nižší poměr mezi obsahem celkového fosfátu ku
obsahu bílkovin než má maso.
79
Pro porovnání výsledků CITP a referenční metody byl z výsledků uvedených
v Tabulce XIX zkonstruován graf (Obrázek 11), kde na ose x jsou vynesené hodnoty
stanovené referenční metodou a na ose y jsou výsledky CITP stanovení. Vztah mezi
výsledky obou metod byl vyjádřen regresní rovnicí ve tvaru:
cCITP = (0,904 ± 0,063) . cRM – (104 ± 122)
Pokud by obě metody poskytovaly shodné výsledky, pak by koeficienty regresní
rovnice§ byly rovné 1, respektive 0. Vzhledem k tomu, že hodnota směrnice přímky je u
vypočítané regresní rovnice menší než jedna, je možné říci, že CITP metoda stanovení
přidaných
fosfátů
poskytuje
systematicky
nižší
nálezy
než
referenční
spektrofotometrická metoda. Tyto nižší nálezy mohou být vysvětleny faktem, že obě
metody v principu stanovují rozdílné formy fosfátů.
Tabulka XIX. Obsah bílkovin (%), obsah přidaných fosfátů (mg.kg-1) stanovená
referenční metodou (RM) a kapilární izotachoforézou (CITP).
I. Vzorky šunek
Obsah přidaných fosfátů
Obsah
(mg.kg -1)
Vzorek
bílkovin
(%)
RM
CITP
11H
19,2 ± 0,1 3730 ± 29 3580 ± 45
12H 15,28 ± 0,01 3330 ± 55 2550 ± 28
13H 23,58 ± 0,07 2060 ± 37 2050 ± 15
14H 16,96 ± 0,07 2660 ± 89 1650 ± 14
16H 11,89 ± 0,02 3830 ± 44 3700 ± 50
17H
11,0 ± 0,2 2000 ± 45 1890 ± 14
18H 14,09 ± 0,01 3110 ± 15 3150 ± 22
19H 19,80 ± 0,05 1710 ± 35 1940 ± 14
20H 11,68 ± 0,08 1960 ± 46 1230 ± 11
21H
15,8 ± 0,2 2030 ± 46 1850 ± 48
22H
14,4 ± 0,8 3220 ± 187 2430 ± 20
23H
9,41 ± 0,05 3380 ± 35 3230 ± 46
24H 14,95 ± 0,09 1550 ± 24 1550 ± 25
25H
13,5 ± 0,8 2290 ± 142 2950 ± 23
§
II. Vzorky ostatních masných výrobků
Obsah
Obsah přidaných fosfátů
Vzorek
bílkoviny
(mg.kg -1)
(%)
RM
CITP
1F
11,46 ± 0,08 560 ± 15
639 ± 19
2F
13,5 ± 0,3
446 ± 9
34,6 ± 0,5
3F
13,71 ± 0,03
399 ± 8
417 ± 3
4F
12,6 ± 0,1
1870 ± 52
1907 ± 16
5F
12,54 ± 0,05
627 ± 3
831 ± 10
6F
12,59 ± 0,08
540 ± 5
590 ± 17
7F
14,26 ± 0,05 1390 ± 15
423 ± 5
8F
10,16 ± 0,02
-81 ± 2
-88,9 ± 0,7
9F
16,6 ± 0,3
-553 ± 14
-472 ± 5
10F
9,8 ± 0,2
960 ± 30
676 ± 5
15M 10,39 ± 0,05 2150 ± 22
1610 ± 25
26P
14,5 ± 0,2
330 ± 5
-469 ± 5
27P
4,55 ± 0,07
980 ± 16
1032 ± 12
31P
11,2 ± 0,1
1720 ± 23
872 ± 9
33P
7,5 ± 0,1
2300 ± 47
986 ± 8
34P
10,1 ± 0,3
-258 ± 9
-904 ± 7
28S
11,3 ± 0,4
710 ± 27
114,4 ± 0,9
29S
11,0 ± 0,1
650 ± 11
585 ± 7
30S 11,59 ± 0,05 960 ± 29
993 ± 7
32S
12,9 ± 0,3 -1070 ± 27
-480 ± 5
y = a.x + b; x = y potom se tedy a = 1 a b = 0
80
4000
CITP (mg P2O5/kg)
3000
2000
1000
0
-1000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
RM (mg P2O5/kg)
Obrázek 11. Grafické srovnání obsahu přidaných fosfátů ve vzorcích masných výrobků
stanovených referenční metodou (RM) a kapilární izotachoforézou (CITP). ○ – šunky,
● – ostatní masné výrobky.
5.6.5. Závěr
5.6.5.1. Stanovení polyfosfátů kapilárními elekromigračními metodami
Polyfosfáty byly stanoveny třemi metodami, a to jednodimenzionální kapilární
izotachoforézou (CITP-CITP), „on-line“ spojením kapilární izotachoforézy a kapilární
zónové elektroforézy (CITP-CZE) a kapilární zónovou elektroforézou (CZE). U každé
metody byly nalezeny její výhody a nevýhody (viz. Tabulka XX) a na jejich základě
byly metody využity pro stanovení polyfosfátů v masných výrobcích nebo pro stanovení
složení polyfosfátových přípravků používaných v masném průmyslu. CITP-CITP
metoda byla tedy použita pro stanovení polyfosfátů v masných výrobcích a CZE metoda
pro analyzování polyfosfátových směsí. Metoda CITP-CZE by mohla být využita pro
stanovení monofosfátu ve velmi malých koncentracích. Její využití pro vyšší
81
polyfosfáty je limitováno jejich nízkou stabilitou ve velmi zředěných roztocích, kde má
použití CITP-CZE metody reálný smysl.
Tabulka XX. Porovnání jednotlivých CE metod stanovení polyfosfátů.
Technika
CITP-CITP
CITP-CZE
CZE
Výhody
· robustní technika
· možnost oddělení makrosložek matrice od
analytu
Nevýhody
· nemožnost separovat polyfosfáty s vyšším
počtem molekul fosforu než čtyři
· velmi nízký detekční limit LOD ≥ 0.2
µmol.l-1
· možnost oddělení makrosložek matrice od
analytu
· vysoká selektivita (CZE krok slouží jako
druhá dimenze separace)
· vysoký objem vzorku dávkovaný do CITP
kroku (více než stovky µl) je ideálním
nástřikem pro CZE krok (analyty jsou
zakoncentrovány ve velmi úzkých
zónách)
· metoda je limitovaná nízkou stabilitou
velmi zředěných roztoků polyfosfátů
· rychlost jedné analýzy
· schopnost separovat a stanovit lineární a
cyklické formy polyfosfátů
· snadná optimalizace separačních
podmínek a složení separačního
elektrolytu
· pouze jeden separační krok, z matrice
není možné odstranit makrosložky
5.6.5.2. Stanovení přidaných fosfátů kapilární izotachoforézou
V této práci byly porovnány dvě metody stanovení fosfátů v masných výrobcích,
resp.
fosfátů
přidaných
spektrofotometrickou
do
metodou
výrobku.
porovnány
Aby
mohly
s hodnotami
být
výsledky
naměřenými
získané
kapilární
izotachoforézou, bylo nutné nejdříve nalézt nový přepočítávací faktor mezi obsahem
rozpustného fosfátu a obsahem bílkovin v mase. Hodnota tohoto přepočítávacího
faktoru byla stanovena na 16,2 mg P2O5 na g bílkovin. Z obsahu fosfátů stanoveného
kapilární izotachoforézou, tj. obsahu rozpustných fosfátů, obsahu bílkovin a tohoto
přepočítávacího faktoru byly vypočítány obsahy přidaných fosfátů a srovnány
s hodnotami stanovenými referenční metodou. Izotachoforetickou metodu je možné
použít pro stanovení přidaných fosfátů, ale stejně jako je tomu u spektrofotometrického
stanovení, je třeba stanovit obsah bílkovin ve vzorku. Je tedy možné pouze nahradit
82
časově
náročné
spektrofotometrické
stanovení
celkového
fosforu
rychlým
izotachoforetickým stanovením.
V žádném z analyzovaných masných výrobků nebyla překročena limitní hodnota
(5000 mg.kg-1 P2O5) přidaných fosfátů. Otázkou k zamyšlení však zůstává, zda je vůbec
nutné stanovovat obsah přidaných fosfátů, jak určuje legislativa. Výhodnější by bylo
stanovit kapilární izotachoforézou celkový obsah rozpustných fosfátů, jenž se právě
podílí na ochuzování organizmu konzumenta zejména o vápenaté a hořečnaté ionty.
83
6. CZE A CITP STANOVENÍ KARBOXYLOVÝCH
KYSELIN V SILÁŽÍCH
6.1. VZORKY SILÁŽÍ A JEJICH ÚPRAVA
Řezanka z vojtěšky byla silážována v laboratorním měřítku v sáčcích a pro
každou analýzu byl otevřen jeden sáček. Odebráno bylo vždy 5 g materiálu, přidáno
bylo 20 ml ethanolu a 0,5 ml chloroformu a vzorky byly skladovány při –18 °C. Při
extrakci vodou byl takto upravený vzorek kompletně převeden do 500 ml kádinky a k
němu bylo přidáno přesně 200 ml vody. Obsah v kádince byl použitím ručního mixéru
homogenizován po dobu 3 minut a následně zfiltrován přes filtrační papír. Takto
připravené filtráty byly 100, 50, 25 nebo 10-krát naředěny s ohledem na obsah kyselin
ve vzorku a před vlastní analýzou byly tyto roztoky filtrovány přes membránový filtr.
6.2. PODMÍNKY ANALÝZY
Pro elektroforetickou separaci (CITP a CZE) byl použit izotachoforetický
analyzátor ZKI 02 ovládaný programem ITPWin 2.20. Separace byly prováděny v
analytické kapiláře (160 mm×0,3 mm I.D.) s přímou vodivostní detekcí. Vzorky byly do
systému dávkovány pomocí dávkovacího kohoutu s fixním objemem 35 µl, respektive
200 nl. V Tabulce XXI jsou uvedena složení použitých separačních elektrolytů.
Základní roztoky standardů kyselin o koncentraci 10 mmol.l-1 byly připravené
rozpuštěním přesně odváženého množství octanu sodného, kyseliny propionové,
mléčnanu litného, máselnanu sodného a fosforečnanu sodného v destilované vodě.
Tabulka XXI. Složení použitých elektrolytů a separační podmínky.
Separační systém
CITP
CZE
Dávkovaný objem
35 µl
200 nl
10 mM HCl + 22 mM EACA +
Vedoucí elektrolyt (LE)
0.05% HPMC, pH = 4,5
Koncový elektrolyt (TE)
5 mM kyselina kapronová
Základní elektrolyt (BGE)
6 mM MES + 4 mM His, pH = 5,9
Separační proud
75/30 µA
20 (~5kV)
Parametr
84
6.3. VÝSLEDKY A DISKUSE
6.3.1. CZE
Složení nosného elektrolytu bylo zvoleno s ohledem na použitou vodivostní
detekci tak, aby jeho specifická elektrická vodivost byla pokud možno co nejmenší.
Separace byla optimalizována v nosných elektrolytech s pH v intervalu od 5,5 do 6,5 na
standardní směsi kyselin a fosfátu, který v tomto intervalu pH migruje v blízkosti
kyseliny mléčné a propionové, hodnoty pH nosného elektrolytu byly nastaveny změnou
poměru mezi MES a
L-histidin
L-histidinem.
V elektrolytu o složení 6 mM MES a 4 mM
(pH 5,9) byly kyseliny mléčná a propionová od fosfátu spolehlivě odděleny,
pokud byla koncentrace každé z nich v intervalu 10 – 60 µmol.l-1 (Obrázek 12A).
Pětibodové kalibrační křivky byly změřeny pro kyselinu octovou a kyselinu
mléčnou v intervalu 50 – 500 µmol.l-1 a pro kyselinu propionovou, máselnou a fosfát v
rozmezí koncentrací 20 – 60 µmol.l-1 s ohledem na to, že tyto kyseliny byly ve vzorcích
v minoritním zastoupení. Limit detekce (LOD), stanovený jako poměr S/N = 3, pro tyto
kyseliny je 3 µmol.l-1 a limit kvantifikace (LOQ), poměr S/N = 10, je 10 µmol.l-1.
Metoda tedy má 10-krát nižší detekční limit než metoda přímé UV detekce při 185 nm,
kterou
pro
stanovení
karboxylových
kyselin
v
siláži
použil
Buchberger
(Buchberger et al., 1997). Doba trvání analýzy za těchto podmínek byla 7 minut.
6.3.2. CITP
Pro stanovení karboxylových kyselin je možné použít několik různých
elektrolytových systémů. Hodnota pH vedoucího elektrolytu je obvykle v intervalu 3 až
5 a složení koncového elektrolytu je voleno podle toho, jaké karboxylové kyseliny je
třeba stanovit. Elektrolytový systém použitý v této práci se skládal z vedoucího
elektrolytu (LE): 10 mM HCl + 22 mM EACA + 0,05 % (m/v) HPMC (pH 4,5) a
koncového elektrolytu (TE): 5 mM kyselina kapronová. Tento systém je odlišný od
systému použitého Bočkem (Boček et al., 1978) pro analýzu siláží. Pětibodové
kalibrační křivky (Tabulka XXII) byly pro kyselinu octovou, mléčnou, propionovou a
máselnou změřeny v intervalu koncentrací 40 – 120 µmol.l-1. Limit detekce pro CITP
stanovení každé kyseliny je 2 µmol.l-1 a limit kvantifikace, stanovený jako 1 s zóna, je
85
5 µmol.l-1. Z hlediska citlivosti je tato metoda srovnatelná s CZE stanovením. Doba
jedné analýzy ale byla 21 minut, což je oproti CZE hodnota zhruba třikrát vyšší.
Tabulka XXII. Koeficienty kalibračních rovnic (a, b) jednotlivých analytů a jejich
korelační koeficient r. A – plocha píku, L – délka zóny.
Analyt
Kyselina octová
Kyselina mléčná
Kyselina propionová
Kyselina máselná
Kyselina fosforečná
Kyselina octová
Kyselina mléčná
Kyselina propionová
Kyselina máselná
CZE: c = a.A + b (µmol.l-1)
a
b
0,349
0,276
0,364
1,065
0,346
0,605
0,328
3,821
0,293
3,015
CITP: c = a.L + b (µmol.l-1)
a
b
3,5
18,9
5,3
1,1
7,9
12,3
5,0
11,9
r
0,998
0,998
0,997
0,999
0,998
r
0,998
0,998
0,995
0,999
Pořadí separace v CZE módu je: kyselina octová, mléčná, fosforečná, propionová
a máselná (Obrázek 12A). Protože je záměrem použít tuto metodu pro posuzování
kvality siláží, je nezbytné, aby analyty byly dokonale separovány i ve vzorcích s
nestandardním obsahem kyselin. Na Obrázku 12B je záznam kvalitního vzorku siláže
(vzorek 6, Tabulka XXIV), vzorek obsahuje pouze kyseliny mléčnou a octovou. Siláž
(vzorek 4, Tabulka XXIV), u které došlo k zvrhnutí správného fermentačnímu procesu
obsahuje vysokou koncentraci kyseliny propionové a máselné a jen velmi málo kyseliny
mléčné (Obrázek 12C). V CITP módu se pořadí kyselin při separaci liší a zóna kyseliny
octové migruje až za kyselinou mléčnou. Rozdíly mezi relativními výškami zón analytů
jsou dostatečně rozdílné (Obrázek 13A) a separaci neruší žádná ze složek matrice
vzorku. Pro srovnání jsou na obrázcích 13B a C uvedeny záznamy stejných vzorků jako
na obrázcích 12B a C.
86
Obrázek 12. Elektroforegram standardní směsi 60 µmol.l-1 (A), vzorku siláže se
správným (B) a nesprávným (C) průběhem fermentačního procesu. (B) vzorek 6
(Tab. XXIV) 100-krát zředěný, (C) vzorek 4 (Tab. XXIV) 10-krát zředěný. 1 – kyselina
octová, 2 – kyselina mléčná, 3 – fosfát, 4 –kyselina propionová, 5 – kyselina máselná.
87
Obrázek 13. Izotachoforegram standardní směsi 60 µmol.l-1 (A), vzorku siláže se
správným (B) a nesprávným (C) průběhem fermentačního procesu. (B) vzorek 6
(Tab. XXIV) 20-krát zředěný, (C) vzorek 4 (Tab. XXIV) 20-krát zředěný. 1 – kyselina
octová, 2 – kyselina mléčná, 3 – fosfát, 4 –kyselina propionová, 5 – kyselina máselná.
88
6.3.3. Srovnání CZE a CITP
Pomocí vypracovaných metodik CZE a CITP byla stanovena koncentrace kyselin
v 10 vzorcích modelových siláží. Pro porovnání obou metod byla kapilární
izotachoforéza považována za metodu referenční. Porovnáním obsahů všech kyselin
(Obrázek 14) naměřených oběma metodami (30 hodnot, Tabulka XXIV), byla získána
rovnice regresní přímky ve tvaru: cCZE = (1,22 ± 0,05).cCITP – (0,6 ± 0,5); r = 0,962. Z
hodnot parametrů této regresní přímky, směrnice a úseku na ose y, je patrné, že CZE
metoda poskytuje systematicky vyšší hodnoty. Největší rozdíly vykazují stanovené
koncentrace kyseliny mléčné (Tabulka XXIV) a tato se také nejvíce podílí na hodnotě
směrnice regresní přímky, která je vyšší než očekávaná hodnota 1. Ne všechny kyseliny
však vykazují stejné rozdíly koncentrací, proto byly stejným způsobem vyhodnoceny
jednotlivé kyseliny (Tabulka XXIII). Statistické vyhodnocení prokázalo, že koncentrace
kyseliny mléčné se odlišují nejvíce a také že CZE metoda poskytuje systematicky vyšší
nálezy kyseliny mléčné. Koncentrace ostatních kyselin jsou vzájemně srovnatelné,
neboť interval spolehlivosti těchto koeficientů v sobě zahrnuje 1, respektive 0 a proto se
dají CZE a CITP považovat za metody, jež poskytují stejné výsledky stanovení kyseliny
octové, propionové a máselné.
Vyšší nálezy kyseliny mléčné z CZE stanovení je možné vysvětlit tím, že při CZE
stanovení migruje společně s kyselinou mléčnou také jedna ze složek matrice vzorku,
kterou není možné od kyseliny mléčné oddělit za použitých podmínek analýzy. Ostatní
analyty jsou dobře separované a žádná ze složek matrice vzorku jejich analýzu neruší.
Tabulka XXIII. Koeficienty regresních přímek statistického srovnání koncentrací
jednotlivých kyselin stanovených CITP a CZE, (cCZE = a.cCITP + b).
Analyt
Kyselina mléčná
Kyselina octová
Kyselina propionová
Kyselina máselná
Počet bodů
9
10
5
6
Koeficienty regresní přímky
Směrnice
Úsek na ose y
(a )
(b )
1,4 ± 0,1
-1,7 ± 1,3
1,05 ± 0,09
0,4 ± 1,0
1,1 ± 0,2
0,2 ± 0,3
1,2 ± 0,3
-0,6 ± 1,4
r
0,98
0,97
0,98
0,94
89
25,00
-1
c (CZE) [mg.g ]
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
-1
c (CITP) [mg.g ]
20,00
25,00
Obrázek 14. Grafické srovnání koncentrací kyselin stanovených CITP a CZE.
○ – kyselina mléčná, □ – kyselina octová, ∆ – kyselina propionová, × – kyselina
máselná.
90
Tabulka XXIV. Výsledky stanovení kyseliny mléčné, octové a propionové v silážích metodami CZE a CITP.
Koncentrace kyselin (mg.g-1)
Vzorek
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
a
Octová
4,4 ± 0,2
4,8 ± 0,8
2,5 ± 0,2
11,42 ± 0,6
8,47 ± 0,02
16,20 ± 0,02
7,22 ± 0,4
14,5 ± 0,3
12,01 ± 0,05
5,5 ± 0,2
CITP
Mléčná
Propionová
6,21 ± 0,03
-a
6,29 ± 0,02
1,22 ± 0,02
7,53 ± 0,04
0,61 ± 0,02
1,03 ± 0,05
4,47 ± 0,03
0,5 ± 0,3
1,98 ± 0,01
15,3 ± 0,2
-a
26,4 ± 0,3
-a
19,4 ± 0,2
-a
17,10 ± 0,04
-a
12,89 ± 0,05
0,5 ± 0,1
Máselná
0,95 ± 0,05
3,9 ± 0,1
5,20 ± 0,09
8,1 ± 0,2
10,3 ± 0,5
-a
-a
-a
-a
5,6 ± 0,2
Octová
5,5 ± 0,2
5,6 ± 0,2
1,8 ± 0,1
12,5 ± 0,1
10,7 ± 0,7
17,21 ± 0,05
8,05 ± 0,01
15,6 ± 0,8
10,2 ± 0,1
2,9 ± 0,2
CZE
Mléčná
8,9 ± 0,2
7,9 ± 0,1
9,4 ± 0,5
0,39 ± 0,02
-a
17,2 ± 0,1
35,5 ± 0,2
25 ± 1
17,70 ± 0,05
14,5 ± 0,1
Propionová
-a
1,3 ± 0,3
0,55 ± 0,05
4,9 ± 0,3
2,9 ± 0,2
-a
-a
-a
-a
0,84 ± 0,05
Máselná
1,0 ± 0,1
4,5 ± 0,1
7,0 ± 0,3
7,9 ± 0,2
13,0 ± 0,5
-a
-a
-a
-a
4,0 ± 0,2
méně než detekční limit
91
6.3.4. Závěr
Prezentované výsledky ukazují, že CZE je možné použít jako alternativní
techniku k CITP pro stanovení karboxylových kyselin v silážích. Záleží pouze na tom,
zda je třeba analyzovat velké množství vzorků v co nejkratším čase a v tomto případě
použít CZE metodu s 3-krát kratším časem jedné analýzy nebo klást důraz na absolutní
hodnotu koncentrace kyseliny mléčné a zvolit v tomto případě správnější stanovení
pomocí CITP. CZE metoda nalezne využití zvláště v případech, kdy se průběžně sledují
změny obsahu karboxylových kyselin během fermentačního procesu a tak není kladen
takový důraz na absolutní hodnoty obsahu kyselin.
92
7. CITP STANOVENÍ KARBOXYLOVÝCH KYSELIN VE
VEJCÍCH
7.1. POUŽITÉ VZORKY
Pro skladovací pokus (skořápkových) vajec byla použita vejce hybridní linie IsaBrown, 52 týdnů starých nosnic přibližně ve věku uprostřed snáškového cyklu.
a) Přibližně 12 hodin po snášce byla vejce rozdělena do tří skupin, přičemž každá
byla skladována při různé teplotě (5 °C, 14 °C, 30 °C). V průběhu 38 dnů byla třikrát
v týdnu (ob den) z takto skladovaných vajec připravena melanž homogenizací
ultraturaxem. Těsně před přípravou melanže byla vždy skořápka vejce ošetřená 80%
etanolem.
b) Skladovací pokus melanže byl proveden tak, že ~200 ml melanže připravené
(ad a) bylo skladováno v chladu a v temnu při teplotě +5 °C, v kádince přikryté
parafilmem.
7.2. STANOVENÍ SUŠINY
Obsah sušiny ve vaječné melanži se stanovil sušením, které probíhalo při teplotě
(103 ± 2) °C do konstantní hmotnosti. Obsah vody byl vypočítán ze vztahu:
w=
m2
×100 (%)
m1
(7.1)
kde m1 je hmotnost vzorku před sušením (g), m2 je hmotnost vzorku po sušení (g) a w je
obsah sušiny ve vzorku.
7.3. PODMÍNKY CITP-CITP ANALÝZY
7.3.1. Příprava vzorků pro kapilární izotachoforézu
Vzorek z připravené melanže byl navážen (2,5 g) do 25 ml odměrné baňky a
společně s 15 ml destilované vody umístěn do ultrazvukové lázně po dobu 5 min.
Následným záhřevem při 60 °C po dobu 30 min došlo k inaktivaci vlastního
93
enzymového systému vejce a koagulaci vaječných bílkovin. Obsah v odměrné baňce byl
ochlazen a doplněn po rysku destilovanou vodou. Vzorek byl zbaven koagulovaných
proteinů a lipidové frakce odstředěním (2000 RPM, 20 minut) a následně byl
supernatant zfiltrován přes papírový filtr s vysokou hustotou pórů a před vlastní
analýzou ještě přes membránový filtr (0,45 µm).
7.3.2. CITP-CITP stanovení organických kyselin
Pro elektroforetickou separaci (CITP-CITP) byl použit izotachoforetický
analyzátor ZKI 02 v dvoukapilárním uspořádání složeném z předseparační kapiláry
(160 mm × 0,8 mm I.D.) a separační kapiláry (160 mm × 0,3 mm I.D.). Vzorky byly do
systému dávkovány pomocí dávkovacího kohoutu s fixním objemem 35 µl. Detekce
analytů byla prováděna přímou vodivostní detekcí.
Složení elektrolytových systémů a použité hodnoty hnacích proudů jsou uvedeny
v Tabulce XXV. Pro kalibrační křivku jednodimenzionální CITP-CITP byly připraveny
standardní roztoky kyseliny mléčné o koncentracích 25, 50, 75, 100, 125 µmol.l-1 a
kyseliny jantarové, 3-hydroxymáselné a octové 12,5; 25; 37,5; 50; 62,5 µmol.l-1 ze
zásobních 10 mM roztoků. Pro dvoudimenzionální CITP-CITP byly připraveny
standardní roztoky všech kyselin o koncentracích 5, 10, 20, 50 a 100 µmol.l-1 ze
zásobních 10 mM roztoků.
Tabulka XXV. Složení separačních elektrolytů a podmínky analýzy dvou systémů
CITP-CITP.
LE1
LE2
TE
I1
I2
Jednodimenzionální
Dvoudimenzionální (2D)
CITP-CITP
CITP-CITP
10 mM HCl + 20 mM β-alanin + 0,05% HPMC 10 mM HCl + 20 mM β-alanin + 0,05% HPMC
(pH = 3,6)
5 mM HCl + 10 mM β-alanin + 0,05% HPMC
5 mM kyselina kapronová
5 mM kyselina sorbová
250 µA
250 µA
50 (25 µA)
15 (5 µA)
Zpětný nález při 50 % a 100 % přídavku
Pro zpětný nález kyselin byl analyzován vzorek a podle odezvy příslušné kyseliny
bylo přidáno takové množství standardu, aby jeho odezva byla dvojnásobná (100%
přídavek) nebo jeden a půl násobná (50% přídavek).
94
Opakovatelnost CITP-CITP metody
Opakovatelnost metody byla zjištěna na vzorku 1504_1 (15/04/2002, 5°C), ze
kterého bylo šestkrát odváženo po 2,5 g vzorku melanže a v připravených extraktech
byl stanoven obsah kyselin. Opakovatelnost metody byla vyjádřena jako relativní
standardní odchylka.
7.4. POSTUP MIKROBIOLOGICKÉHO STANOVENÍ
Celkový počet mikroorganizmů (CPM) byl stanoven po desetinásobném ředění
melanže postupem dle ČSN ISO 4833.
7.4.1. Příprava médií pro mikrobiologické stanovení
GTK agar
22,5 g GTK agaru bylo rozpuštěno a rozvařenou v 1000 ml destilované vody a
vysterilováno v Erlenmeyerových baňkách o objemu 250 ml.
Ředící fyziologický roztok
V 1000 ml destilované vody bylo rozpuštěno 8,5 g chloridu sodného, 1,0 g
peptonu a 1,0 g Tweenu 80. Po dokonalém rozpuštění byl objem rozdělen po 9,0 ml do
zkumavek a vysterilován.
7.5. ENZYMOVÉ METODY
7.5.1. Příprava vzorku
5 g homogenizovaného vaječného obsahu bylo naváženo do 25 ml odměrné
baňky, přidáno 10 ml demineralizované vody, promícháno a vloženo do 90 °C horké
vodní lázně po dobu 20 minut. Poté byla suspenze zchlazena na 20 – 25 °C. K obsahu
byl postupně přidáno po 1 ml Carrezova činidla** I a II. Následně doplněno 0,1 M
NaOH roztokem po rysku, promícháno, centrifugováno a přefiltrováno přes filtrační
**
Carrezovo činidlo I - 15,0 g K4[Fe(CN)6].3H2O v 100 ml destilované vody
Carrezovo činidlo II - 30,0 g ZnSO4.7H2O v 100 ml destilované vody
95
papír s nejjemnějšími póry. K analýze bylo odpipetováno 0,1 až 1,0 ml filtrátu podle
předpokládaného množství dané kyseliny.
7.5.2. Postup měření
Postup měření probíhal dle návodu přiloženému ke každé enzymové soupravě.
7.5.3. Výpočet
Koncentrace analytu se vypočítala podle vztahu:
c=
V .Mh
× DA (g.l-1)
e .d .v.1000
(7.2)
kde V je konečný objem v pipetě (ml), v je objem odebraného vzorku do pipety (ml),
Mh je molekulární hmotnost vzorkované látky (g.mol-1), d je dráha světelného paprsku
(cm), ∆A je rozdíl absorbancí naměřený před a po proběhnutí reakce, ε je absorbanční
koeficient, pro NADH při 340 nm je 6,3 l.cm-1.mol-1 a pro formazan při 492 nm je 9,9
l.cm-1.mol-1.
Při výpočtu je třeba vycházet z naváženého množství vzorku, obsah kyseliny na
kg vzorku je tedy:
Obsah =
c
×1000 (g.kg-1)
m
(7.3)
kde c je koncentrace kyseliny (g.l-1) a m je navážka vzorku (g). Obsah kyselin byl dále
přepočítán na sušinu vzorku.
7.6. ZÍSKANÉ VÝSLEDKY A JEJICH DISKUSE
7.6.1. Stanovení sušiny
Limitní hodnoty prioritních stanovovaných kyseliny (mléčná, jantarová, BHBA)
jsou udávané podle Evropské unie v gramech na kilogram sušiny. Vzorek vaječné
96
melanže obsahuje 23,3 ± 0,1 % sušiny. Obsah sušiny byl stanoven pro vybrané vzorky
melanží, nebylo možné měřit její obsah u všech analyzovaných vzorků, ale předpokládá
se, že obsah sušiny téměř odpovídá kvalitativnímu požadavku na vaječnou melanž.
Podle ČSN 572301 by měl obsahovat minimálně 23,5 % (viz. Tabulka VII). Pro další
výpočty bylo, v zájmu co možná největšího zjednodušení, předpokládáno, že všechna
analyzovaná vejce mají obsah sušiny 25 %.
7.6.2. Izotachoforetické stanovení organických kyselin ve vejcích
Stanovení organických kyselin proběhlo v dvoukapilárním uspořádání, kde první
– předseparační kapilára slouží k zakoncentrování analytů vzorku a případně k oddělení
makrokomponent matrice vzorku (např. chloridových iontů) a analytická kapilára pro
vlastní separaci žádaných látek. Pro stanovení organických kyselin při prvním pokusu
skladování melanže byla použita jednodimenzionální CITP-CITP (tzn. koncentrace
vedoucího elektrolytu v předseparační a separační kapiláře byla stejná), ovšem
vzhledem k nízkým koncentracím kyseliny jantarové a 3-hydroxymáselné byl pro
skladovací pokus skořápkových vajec zvolen systém koncentrační kaskády, tedy
metoda s použitím různých koncentrací vedoucích elektrolytů. V tomto případě byl ve
druhém kroku použitý vedoucí elektrolyt s poloviční koncentrací (viz. Tabulka XXV).
Pořadí separace v CITP-CITP módu je: kyselina pyrohroznová, fumarová, citronová,
pyroglutamová,
mléčná,
jantarová,
glutamová,
3-hydroxymáselná
a
octová
(Obrázek 15A). Kyselina 3-hydroxymáselná a octová tvoří v tomto použitém systému
tzv. inverzi pohyblivostí, při níž dochází v případech kdy je monotónní průběh pH či
efektivních pohyblivostí narušen (Boček et al., 1987). K inverzi pohyblivostí dochází i
v reálných vzorcích neobsahujících kyselinu 3-hydroxymáselnou, kdy inverzi společně
s octovou kyselinou tvoří jiná složka matrice vzorku (i, Obrázek 15C). Prakticky
inverze mobilit v tomto případě usnadní identifikace kyseliny octové, případně 3hydroxymáselné v této složité matrici vzorku. Na Obrázku 15B je záznam melanže
připravené z čerstvě sneseného vejce a na Obrázku 15C melanže připravené z vejce
skladovaného 14 dní při 30 °C.
Limit detekce (LOD) byl stanoven jako délka jednosekundové zóny a je 2,5 mg
kyseliny v kg sušiny a limit kvantifikace (LOQ) je zhruba třikrát větší a tedy 7,5 mg
kyseliny v kg sušiny.
97
Tabulka XXVI. Regresní koeficienty a a b kalibračních rovnic pro jednotlivé analyty a
jejich korelační koeficient r.
Analyt
Kyselina pyrohroznová
Kyselina mléčná
Kyselina glutamová
Kyselina octová
Kyselina jantarová
Kyselina 3-hydroxymáselná
c = a.L+b (µmol.l-1)
a
b
1,6887
-4,3571
1,4861
-4,9834
2,1449
-8,0589
1,9792
-1,7131
1,6149
-4,5647
1,5105
-1,6849
r
0,9999
0,9977
0,9999
0,9993
0,9973
0,9993
Tabulka XXVII. Charakteristika CITP-CITP metody pro vybrané analyty. RSD –
relativní standardní odchylka, n – počet měření, Ttab – tabelovaná hodnota (Method
Validation).
Analyt
Kyselina pyrohroznová
Kyselina mléčná
Kyselina glutamová
Kyselina octová
Opakovatelnost
stanovení, (n = 6)
RSD (%)
Ttab
2,1
7,3
3,8
5,3
1,9
5,3
2,9
7,3
Opakovatelnost metody
(n=6)
RSD (%)
Ttab
5,8
7,3
4,8
5,3
3,4
5,3
5,4
7,3
Zpětný nález
(%)
85
92
96
82
Ttab
80-110
90-107
90-107
80-110
98
Obrázek 15. Izotachoforegram (A) standardní směsi kyselin o koncentraci 50 (100)
µmol.l-1, (B) vzorku melanže připravená z čerstvého vejce a (C) z vejce skladovaného
14 dnů při 30 ºC. 1 – kyselina pyrohroznová, 2 – kyselina fumarová, 3 – kyselina
citronová, 4 – kyselina pyroglutamová, 5 – kyselina mléčná, 6 – kyselina jantarová,
7 – kyselina glutamová, 8 – 3-hydroxymáselná, 9 – kyselina octová, i – neidentifikované
složky.
99
7.6.3. Skladovací pokus melanže
Bylo provedeno osm paralelních měření během třiceti osmi dnů, kde bylo
stanovováno jednodimenzionální CITP-CITP množství organických kyselin ve vaječné
melanži, skladované při 5°C. Dále byl určen celkový počet mikroorganizmů (CPM).
Skořápka vajec nebyla před výtlukem záměrně ošetřená, aby byla možnost pozorovat
nárůst především exogenní mikrobiální kontaminace ve vaječné hmotě a zároveň
sledovat změnu obsahu organických kyselin (viz. Obrázek 16).
Na počátku měření byly všechny kyseliny ve vzorku přítomné, pouze množství
kyseliny jantarové a BHBA bylo menší než je limit detekce tj. méně než 20 mg/kg
sušiny. Obsah jednotlivých kyselin se stoupajícím celkovým počtem mikroorganizmů
roste. 19. den měření značně klesl obsah kyseliny mléčné a kyseliny jantarové, což je
srovnatelné s výsledky, které uvádí literatura (York & Dawson, 1972), kdy při
koncentraci CPM 5,4.108 MO.ml-1 došlo k snížení množství kyseliny mléčné a
jantarové ve vejci naočkovaném Eschericha coli. To je možné vysvětlit tím, že určité
mikroorganizmy mohou využívat organické kyseliny právě tak, jako je produkovat
(York & Dawson, 1972). Nebo také pomnožením některých mikroorganizmů (jak lze v
této fázi skladování pozorovat), které pro svůj vývoj kyselinu využívají. V dalším
průběhu opět dochází ke stoupajícímu trendu mléčné kyseliny a zároveň začíná růst
obsah i kyseliny octové. Mulder et al. (1988) uvádí, že kyselina jantarová je vhodný
indikátor mikrobiální kvality, na rozdíl od kyseliny mléčné, která kolísá, což je zřejmé i
z tohoto pokusu.
100
3000
10
2500
8
mg/kg sušiny
6
1500
log (MO/ml)
2000
4
1000
2
500
0
0
0
5
10
15
20
25
30
35
čas (dny)
Obrázek 16. Změna obsahu kyselin a nárůst mikroorganizmů s časem v průběhu
skladování vaječné melanže při 5 °C. ▲ – kyselina mléčná, ■ – kyselina octová, ● –
CPM.
7.6.4. Skladovací pokus skořápkových vajec
Podle Vyhlášky 200/2003 Sb. k zákonu 166/1999 Sb., o veterinární péči, a v
ČSN 572109 jsou specifikovány požadavky na jakost slepičích skořápkových vajec.
Tato vyhláška stanoví skladování vajec I. třídy jakosti a vajec II. třídy jakosti B při
nekolísavé teplotě prostředí plus 5 °C až 18 °C, relativní vlhkosti vzduchu 70-75 % a
dobu prodeje jako čerstvých vajec maximálně 28 dní. Byl tedy proveden skladovací
pokus, kdy byla vejce rozdělena do tří sad a skladována při třech různých teplotách 5,
14 a 30 °C po 38 dnů. Teplota 30 °C měla představovat extrémní skladovací podmínky.
Z každé skladované sady byla odebrána vejce na mikrobiologický rozbor (CPM) a pro
izotachoforetické stanovení organických kyselin. Vzhledem k předpokládanému
nízkému obsahu kyseliny jantarové a 3-hydroxymáselné byla v tomto případě použita
metoda koncentrační kaskády CITP-CITP, s limitem detekce 2,5 mg.kg-1 sušiny.
101
Ve vzorcích byl sledován jednak obsah kyselin, které uvádí legislativa tj. kyseliny
mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné a dále pak obsah kyseliny pyrohroznové,
pyroglutamové, citronové, glutamové a octové. U všech vzorků byl také stanoven CPM,
“růstové křivky” jsou pro teploty 5, 14 a 30 °C uvedeny na Obrázku 17. Na rozdíl od
předchozí kapitoly, kde byl sledován nárůst MO především exogenní kontaminací, v
tomto případě se jedná spíše o kontaminaci endogenní.
7
6
log MO (CPM / ml)
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
dny
25
30
35
40
Obrázek 17. Vývoj MO během skladování skořápkových vajec při 5, 14 a 30 °C.
▲
– 5 °C, ■ – 14 °C, ● – 30 °C.
7.6.4.1. Změna obsahu kyseliny pyrohroznové
V čerstvém vejci se nachází kyselina pyrohroznová v množství asi 14 mg.kg-1
sušiny, což se přibližně shoduje s výsledky, které uvádí literatura (Littmannová et al.,
1982). Průběh změn obsahu kyseliny pyrohroznové (Obrázek 18) je po dobu 12 dnů
zhruba stejný bez výraznějšího vlivu teploty skladování vajec. Třetí den dojde k poklesu
koncentrace a ta opět narůstá až do 11. dne, kdy dojde k druhému poklesu zhruba na
počáteční hodnotu. Od této doby už je obsah kyseliny pyrohroznové závislý na teplotě a
102
při teplotě 5 a 14 °C začíná pomalu, při teplotě 30 °C prudce, vzrůstat. U vajec
skladovaných při 14 °C dochází k výrazným výkyvům hodnot, což může být dáno
charakterem samotné kyseliny. Pyruvát je klíčovým meziproduktem metabolismu
většiny látek a má různé metabolické způsoby dalšího rozkladu, proto může mít za
následek takový charakter kolísání.
Obsah kyseliny pyrohroznové by mohl být ukazatelem kvality vajec, limitní
hodnota by mohla být 55 – 60 mg.kg-1 sušiny, což odpovídá koncentraci
mikroorganizmů 5.104 CPM v ml. Této hodnoty dosáhnou vejce skladovaná při 30°C za
13 – 15 dnů a vejce skladovaná při 5 °C až po 30 dnech skladování.
100
90
80
c (mg/kg)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
dny
25
30
35
40
Obrázek 18. Změna obsahu kyseliny pyrohroznové během skladování čerstvých vajec
při teplotě 5, 14 a 30 °C. ▲ – 5 °C, ■ – 14 °C, ● – 30 °C.
7.6.4.2. Změna obsahu kyseliny mléčné
Obsah kyseliny mléčné má zpočátku u všech skořápkových vajec při všech
teplotách skladování mírně stoupající tendenci. Přibližně po šestém dnu skladování lze
pozorovat rozdíly v obsahu (Obrázek 19), u vajec skladovaných při 30 °C obsah
kyseliny mléčné stále stoupá na rozdíl od vajec skladovaných při 5 a 14 °C, kde dojde
103
po šestém dnu k poklesu na zhruba počáteční koncentraci. Obsah kyseliny mléčné u
vajec skladovaných při 5 a 14 °C během dalších 25 dnů nikterak významně nevzrůstá a
spíše kolísá okolo hodnoty 300 mg.kg-1 sušiny. Po maximální době skladovatelnosti,
tedy po 28 dnech je zřetelný nárůst kyselin ve všech vejcích skladovaných při různých
teplotách. Littmannová et al. (1982) uvádějí podobný trend hodnot.
Obsah kyseliny mléčné je používán jako hlavní ukazatel kvality vajec, hodnota
1000 mg.kg-1 sušiny byla však v tomto experimentu překročena až po 35 dnech
skladování při 30 °C, což odpovídá koncentraci mikroorganizmů 106 CPM v ml
(Obrázek 14). Pro splnění požadavku na koncentraci mikroorganizmů < 5.104 by tento
limit měl být tedy 600 mg.kg-1 sušiny.
1200
1000
c (mg/kg)
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
dny
25
30
35
40
Obrázek 19. Změna obsahu kyseliny mléčné během skladování čerstvých vajec při
teplotě 5, 14 a 30 °C. ▲ – 5 °C, ■ – 14 °C, ● – 30 °C.
104
7.6.4.3. Změna obsahu kyseliny glutamové a octové
Kyselina glutamová je jedna z makrosložek přítomných ve vaječném obsahu
vedle kyseliny mléčné, pyroglutamové a citrónové. Koncentrace kyseliny glutamové
(Obrázek 20) je až do třetího dne stejná a v tuto dobu dojde k výraznému poklesu na
50 – 60 % původního obsahu, který je stejný pro všechny teploty. Po tomto poklesu
nastává nárůst na zhruba původní hodnoty obsahu. Doba, kdy dojde k druhému poklesu
obsahu kyseliny glutamové, již závisí na teplotě skladování a při 30 °C dojde k tomuto
poklesu nejdříve a to již 9. den, při teplotě 14 °C je to 11. den a při 5 °C je to až 18 den.
Další průběh je už pozvolný pokles, či nárůst, a to na hodnoty odpovídající počátečním
koncentracím. Obsah kyseliny glutamové tedy není možné použít jako ukazatel kvality
vajec a vzhledem k tomu, že její obsah nejvíce kolísá prvních 14 dní skladování, a to
bez vlivu teploty skladování, není možné jí využít jako “marker kvality” vaječné hmoty
ve vaječných výrobcích.
Změna obsahu kyseliny octové (Obrázek 21) má vzestupný charakter, který je
přerušen pouze jedním prudkým nárůstem mezi 10. a 16. dnem skladování, kdy míra
tohoto nárůstu závisí na teplotě skladování a je největší u vajec skladovaných při 30 °C.
Po 35 dnech skladování obsah kyseliny octové vzroste na 50 mg.kg-1 u teplot
skladování 5 a 14 °C a na hodnotu 85 mg.kg-1 u teploty 30 °C.
Využití kyseliny octové jako ukazatele kvality vajec by bylo dosti sporné, neboť
obsah octové kyseliny je v období okolo 28. dne stejný jako u čerstvých vajec a
maximálních hodnot dosahuje po více než 35 dnech skladování, ale také už 15. den.
105
500
450
400
c (mg/kg)
350
300
250
200
150
100
50
0
0
5
10
15
20
dny
25
30
35
40
Obrázek 20. Změna obsahu kyseliny glutamové během skladování čerstvých vajec při
teplotě 5, 14 a 30 °C. ▲ – 5 °C, ■ – 14 °C, ● – 30 °C.
120
110
100
90
c (mg/kg)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
den
Obrázek 21. Změna obsahu kyseliny octové během skladování čerstvých vajec při
teplotě 5, 14 a 30 °C. ▲ – 5 °C, ■ – 14 °C, ● – 35 °C.
106
7.6.4.4. Změna obsahu ostatních kyselin
Průběh změn obsahu kyseliny pyroglutamové a citronové koresponduje s
výsledky změřenými Littmannovou (Littmannová et al., 1982), který udává, že obsah
těchto zůstává během skladování stejný, respektive klesá a ani vliv teploty nemá na
tento průběh významnější vliv.
Kyseliny jantarová a 3-hydroxymáselná nebyly během měření zaznamenány pro
jejich nižší obsah než je limit detekce pro sledované kyseliny (LOD = 10 mg.kg-1
sušiny). Volba těchto kyselin jako „markerů“ čerstvosti a kvality vajec proto není
vhodná, neboť nejvyšší přípustná množství jsou překračována až u vajec silně
znehodnocených a prakticky nepoživatelných.
U všech měřených karboxylových kyselin je znatelnější kolísání hodnot
jednotlivých kyselin než v případě sledování kyselin u skladování melanže. Lze to
předpokládat, protože pro stanovení v tomto pokusu byla odebírána jednotlivá vejce,
která jsou jedinečná svým složením.
Pravděpodobně také nelze v takovýchto grafech jednotlivé body propojit, právě
pro jedinečné procesy v každém vejci, ale bylo tak učiněno pro lepší názornost a
přehled. Vlastní grafy zde nejsou prezentovány. V Tabulce XXVIII jsou pouze uvedeny
koeficienty regresních rovnic pro jednotlivé teploty. Z hodnot regresních rovnic lze
vyčíst obsah kyselin na počátku, tedy obsah u čerstvých vajec (b – úsek na ose y), a
trend vývoje kyselin (a – směrnice).
Trend nárůstu u vajec skladovaných při 5 °C je zřejmý především pro kyselinu
mléčnou, kde lze podle rovnice regrese říci, že její hodnota každý den vzroste přibližně
o 10 mg kyseliny v kg sušiny. Poslední měření ovšem 39. den, kdy obsah kyseliny
mléčné vzrostl na hodnotu 400 mg.kg-1 sušiny. Pro legislativu je stěžejní dvacátý osmý
den skladování. Proto lze říci, že každodenní přírůstek kyseliny do maximální doby
skladovatelnosti bude menší než 10 mg kyseliny v kg sušiny. Podobně lze jako v
předchozím případě uvést podobný trend jednotlivých kyselin vajec skladovaných při
14 a 30 °C. U vajec skladovaných při nejvyšší teplotě je nejlépe vidět nárůst všech
kyselin. Během 28 dnů nebyla překvapivě překročena limitní hodnota kyseliny mléčné,
teprve 39. den analýzy dosáhla hodnoty 1040 mg.kg-1 sušiny (viz. Obrázek 19).
107
Tabulka XXVIII. Koeficienty lineární regrese a, b a korelační koeficienty r závislosti
obsahu kyselin na délce skladování při 5, 14 a 30 °C.
Kyselina
Kyselina pyrohroznová
Kyselina mléčná
Kyselina glutamová
Kyselina octová
Kyselina pyrohroznová
Kyselina mléčná
Kyselina glutamová
Kyselina octová
Kyselina pyrohroznová
Kyselina mléčná
Kyselina glutamová
Kyselina octová
c (mg.kg-1) = a*den + b
a
b
5 °C
1,1523
9,2481
10,691
118,58
1,2138
215,51
0,8746
15,253
14 °C
0,043
217,6
9,7643
115,74
0,6013
20,928
0,9257
25,694
30 °C
2,4097
12,07
20,044
180,49
3,04023
196,69
1,6638
15,41
r
0,6304
0,7692
0,5221
0,4614
0,0634
0,6253
0,3954
0,3888
0,8667
0,9158
0,4119
0,5778
7.6.4.5. Srovnání čerstvých vajec a jejich skladovaných melanží
Podle legislativy vaječná hmota, která není zpracována ihned po vytlučení, musí
být neprodleně zchlazena na teplotu 4 °C a nejpozději do 48 hodin dále zpracována
nebo zmrazena (Vyhláška 200/2003 Sb). V stejném smyslu byl prováděn další
experiment. Pro předcházející experiment byla z vajec skladovaných při třech různých
teplotách připravována melanž a ihned v ní byl stanovován obsah karboxylových
kyselin. V tomto experimentu byly tyto melanže dále skladovány při 4 °C po dobu
48 hodin jak požaduje legislativa. Po 48 hodinách byl v těchto melanžích znovu
stanoven obsah karboxylových kyselin. Takto byly získány dvojice koncentrací kyselin,
a to v původním vejci skladovaném při určité teplotě a z něj připravené melanže
skladované přesně podle požadavků Vyhlášky 200/2003 Sb. Cílem bylo zjistit, jak
způsob skladování vajec, respektive skladovací teplota ovlivní kvalitu z nich připravené
melanže.
Sloupcové
grafy
zkonstruované
pro
teplotu
5 °C
(Obrázek 22),
14 °C
(Obrázek 23) a 30 °C (Obrázek 24) porovnávají ve dvou sloupcích koncentraci kyseliny
mléčné v původním vejci (■) a z něj připravené melanže skladované 48 hodin při 4 °C
(■). Ve vejcích skladovaných při 5 °C jsou oproti druhým dvěma teplotám nejnižší
obsahy kyseliny mléčné, ale v průběhu 48 hodin zde dojde k jejímu nárůstu, a to až o
100 % počátečního obsahu. V melanžích připravených z vajec skladovaných při 14 a
108
30 °C došlo ke zpomalení tvorby kyseliny mléčné a v některých případech i k jejímu
úbytku. Bylo předpokládáno, že trend bude zcela opačný, kdy největší rozdíly mezi
obsahem kyseliny mléčné ve vejci a příslušné melanži budou pro 30 °C. Tento
experiment však ukazuje, že melanž připravená z vajec skladovaných při 5 °C má sice
na počátku menší počáteční obsah kyseliny mléčné, ale po 48 hodinách skladování je
obsah kyseliny mléčné víceméně stejný jako v melanži připravené z vajec skladovaných
při 14 °C. Úbytky kyseliny mléčné v některých vzorcích je zřejmě možné vysvětlit tím,
že změna teploty o 14 (25) °C je pro mikroorganizmy silným stresujícím faktorem a
jejich reakcí je zpětné metabolizování kyseliny mléčné.
600
vejce
melanž
500
c (mg/kg)
400
300
200
100
0
1
7
9
14
den
16
21
23
25
Obrázek 22. Srovnání obsahu mléčné kyseliny skořápkových vajec skladovaných při
5 °C a z nich připravených melanží.
109
400
vejce
melanž
350
300
c (mg/kg)
250
200
150
100
50
0
1
7
9
14
den
16
21
23
25
Obrázek 23. Srovnání obsahu mléčné kyseliny skořápkových vajec skladovaných při
14 °C a z nich připravených melanží.
1200
vejce
melanž
1000
c (mg/kg)
800
600
400
200
0
1
7
9
14
den
16
21
23
25
Obrázek 24. Srovnání obsahu mléčné kyseliny skořápkových vajec skladovaných při
30 °C a z nich připravených melanží.
110
7.6.4.6. Srovnání CITP-CITP a enzymové metody
Pro srovnání izotachoforézy s enzymovou metodou byly vybrány vzorky, které
byly nejprve analyzovány CITP-CITP a u kterých byl patrný obsah kyselin, nebo kde se
dal očekávat nárůst kyseliny jantarové, resp. kyseliny 3-hydroxymáselné.
Kyselina 3-hydroxymáselná
Analyzované
vzorky
jsou
seřazeny
vzestupně
s
dobou
skladování
(Tabulka XXIX). Ve vzorku 1. (čerstvé vejce) nebyla metodou CITP-CITP kyselina 3hydroxymáselná detekována, ale enzymovou metodou byly nalezeny 4 mg.kg-1.
Kyselina 3-hydroxymáselná nebyla dále CITP-CITP metodou detektována v žádném
vzorku i přesto, že enzymovou metodou byla v těchto vzorcích prokázána její
přítomnost. Ovšem je třeba říci, že při měření enzymovou metodou byly rozdíly
absorbancí ∆A asi 10-krát nižší, než je doporučovaná hodnota, což vnáší do výsledků
značné chyby. Naměřené hodnoty mohly být tedy mnohem vyšší než ve skutečnosti
jsou.
Kyselina jantarová
Analyzované vzorky jsou seřazeny vzestupně s dobou skladování. Kyselina
jantarová nebyla detektována ani u jednoho ze vzorků (Tabulka XXIX) analyzovaných
CITP-CITP metodou a proto byl její obsah vyjádřen jako < 10 mg.kg-1 sušiny.
Enzymovou metodou byla kyselina jantarová stanovena v intervalu od 2 do 12 mg.kg-1
sušiny. Podobně, jako je tomu v předchozím případě, pro nízkou koncentraci kyseliny
jantarové ve vzorku byly ∆A příliš nízké a tedy měření bylo zatíženo značnou chybou.
Tyto metody jsou pří takto nízkých koncentrací kyselin nesrovnatelné. Přesto jsou
nalezené koncentrace u vzorků skladovaných při 30 °C do dobu 28 dnů nižší než je limit
25 mg.kg-1. To ukazuje na to, že tento legislativní požadavek není optimálně nastaven.
Kyselina mléčná
Srovnání CITP a enzymové metody bylo prověřeno u kyseliny mléčné, u které byl
v obou případech pozitivní nález kyseliny (Tabulka XXIX). Porovnáním hodnot jejích
obsahů (Obrázek 25) byla získána rovnice regresní přímky ve tvaru:
111
cCITP = 0,9696 . cENZ + 121,02; r = 0,863.
Z hodnot parametrů této regresní přímky je patrné, že CITP metoda poskytuje vyšší
nálezy, neboť stanoví obě formy kyseliny mléčné na rozdíl od enzymové metody,
kterou je možné stanovit pouze (L) formu. Rozdíly tedy způsobuje přítomná (D) forma
kyseliny mléčné, jenž je produktem některých MO.
Tabulka XXIX. Hodnoty kyseliny 3-hydroxymáselné, jantarové a mléčné stanovené
dvoudimenziální kapilární izotachoforézou (CITP-CITP) a enzymovou metodou (ENZ).
Vzorek
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Kyselina 3-hydroxymáselná
CITP-CITP
ENZ
c (mg.kg-1)
< LOD
4
< LOD
6,4
< LOD
10,8
< LOD
5,2
< LOD
6,8
< LOD
4,8
< LOD
9,2
< LOD
11,0
< LOD
11,6
Kyselina jantarová
CITP-CITP
ENZ
c (mg.kg-1)
< LOD
2,8
< LOD
2,8
< LOD
8,0
< LOD
5,1
< LOD
9,0
< LOD
12,1
< LOD
8,8
-
Kyselina mléčná
CITP-CITP
ENZ
c (mg.kg-1)
301
176
316
315
336
238
341
230
364
226
495
305
489
382
586
459
-
112
600
550
c (CITP) (mg/kg)
500
450
400
350
300
250
200
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
c (ENZ) (mg/kg)
Obrázek 25. Srovnání izotachoforetické (CITP) a enzymové (ENZ) metody stanovení
kyseliny mléčné ve vejcích.
7.6.5. Závěr
Cílem bylo najít takové podmínky izotachoforetické separace, které by se daly
použít pro stanovení karboxylových kyselin ve vejcích, a to zejména kyseliny mléčné,
jantarové a 3-hydroxymáselné. Metoda koncentrační kaskády CITP byla optimalizována
pro separaci kyseliny pyrohroznové, pyroglutamové, mléčné, citronové, jantarové,
glutamové, octové a 3-hydroxymáselné s detekčním limitem (LOD) 2,5 mg.kg-1 sušiny.
Tato metoda byla využita pro studium změny obsahu kyselin během skladování vajec
při 5, 14 a 30 °C. Cílem experimentů bylo ověřit, zda jsou legislativní limity pro
kyselinu mléčnou (1000 mg.kg-1 sušiny), jantarovou (25 mg.kg-1 sušiny) a 3hydroxymáselnou (10 mg.kg1 sušiny) zvoleny vhodně a u ostatních kyselin, zda by se
daly využít také jako ukazatele kvality vajec, nebo jako “markery” vaječného obsahu ve
výrobcích.
113
Výsledky ukázaly, že limit kyseliny mléčné 1000 mg.kg-1 sušiny je příliš vysoký a
je dosažen ve vejcích, která jsou již viditelně nezpůsobilá ke konzumaci. Spíše než 1000
mg.kg-1 sušiny by bylo třeba jako limit považovat koncentraci 600 – 700 mg.kg-1
sušiny. Stejně tak je vysoký i limit pro kyselinu jantarovou (25 mg.kg-1 sušiny), neboť
tento nebyl překročen u vajec skladovaných při 30 °C po 28 dnech. Z dalších
analyzovaných kyselin byla použitelná pro posuzování kvality vajec kyselina
pyrohroznová, jejíž maximální hodnota by mohla být 60 mg.kg-1 sušiny. Protože se
obsah kyseliny pyrohroznové ve vejcích mění v závislosti na stáří nosnic a na období
snáškového cyklu, platí tato hodnota s určitostí pouze pro tato použitá vejce (hybridní
linie Isa-Brown, 52 týdnů staré nosnice). Vzhledem k tomu, že je obtížné stanovit
nějakou výchozí (ještě přijatelnou) hodnotu stejně jako rozhodnout, kdy už je
koncentrace nepřijatelná, se kyselina pyrohroznová jako „marker“ jakosti běžně
nepoužívá. Ostatní analyzované kyseliny se jako indikátory nehodí, neboť jejich
hodnota se v průběhu skladování výrazně nemění (pyroglutamové, citrónová) a nebo je
naopak její průběh během skladování proměnlivý (glutamová, octová).
V
neprospěch
použití
kyseliny
mléčné
jako
„markeru“
mikrobiálního
znehodnocení může svědčit pokles jejího obsahu u skladované melanže 20. den při
mikrobiální kontaminaci asi 2,5.107 MO v ml. Při skladování melanží z vajec
skladovaných při teplotě 5 °C byl patrný nárůst kyseliny mléčné. Pokud byla melanž
připravena z vajec skladovaných při 30 °C a uchovávána při 4 °C k nárůstu kyseliny
mléčné téměř nedocházelo, spíše se její hodnota stabilizovala. To by bylo možné
vysvětlit teplotním šokem pro přítomné mikroorganizmy produkující kyselinu. Na
základě analýzy kyseliny mléčné v melanži tedy nelze jednoznačně určit (predikce)
teplotní režim skladování vajec a popřípadě odhadnout stáří (čerstvost) vajec.
Srovnání dvoudimenzionální kapilární izotachoforézy (2D CITP-CITP) a
enzymové metody ukázalo dva zásadní výsledky. Za prvé, že i přes snížení detekčního
limitu na 2,5 mg.kg-1, nebyly kyseliny jantarová a 3-hydroxymáselná detektovány ve
vzorcích, u kterých byly pozitivní nálezy těchto kyselin enzymovou metodou. Dále pak,
že ani použití enzymových setů pro vzorky s tak nízkými koncentracemi, v jakých se
tyto kyseliny nacházejí ve vejcích, není zcela vhodné, neboť měřené rozdíly absorbancí
∆A byly v obou případech nižší než jsou minimální doporučované hodnoty ∆A uváděné
v návodech k těmto stanovením. Spolehlivě porovnány mohly tak být pouze hodnoty
114
kyseliny mléčné. Na základě hodnot koeficientů regresní přímky je možné prokázat, že
2D CITP-CITP metoda poskytuje systematicky vyšší nálezy kyseliny mléčné. Tento
fakt je možné zčásti vysvětlit tím, že izotachoforetická metoda stanoví, na rozdíl od
enzymové, obě formy (D- a L-) kyseliny mléčné. Dalším důvodem pro nižší nálezy
kyseliny mléčné může být fakt, že takováto stanovení pomocí enzymových setů jsou
velmi náročná na preciznost a přesnost jejich provedení. Oproti tomu izotachoforetické
stanovení je jednoduché a také několikanásobně levnější. Možností jak ještě více snížit
mez detekce, by mohlo být použití techniky spojení izotachoforézy a zónové
elektroforézy (CITP-CZE) s o řád nižším detekčním limitem analytů.
115
8. STANOVENÍ KYSELINY GLUTAMOVÉ
8.1. PŘÍPRAVA VZORKŮ
Celkem bylo analyzováno 15 vzorků instantních polévek. Příprava polévek k
analýze byla prováděna přesně podle návodu uvedeného na obalu výrobku, uvařené
polévky byly zfiltrovány přes papírový filtr se středně širokými póry (Filtrak 389) a
filtrát byl zmrazen a uchováván při teplotě –18 °C až do doby jeho analýzy.
Pro izotachoforetické stanovení byly použity přímo takto připravené vzorky, pro
stanovení metodou HPLC byly vzorky před analýzou derivatizovány. Seznam vzorků,
jejich popis a výrobce je uveden v Tabulce XXX.
Tabulka XXX. Popis vzorků instantních polévek.
Vzorek
1.
2.
3.
4.
Název vzorku a popis
Instantní česneková polévka Maggi, 12 g.
Instantní polévka čínská Maggi, 12 g.
Instantní polévka s těstovinami hovězí Podravka, 18 g.
Instantní nudlová polévka hovězí Vitana, 60,5 g
(těstoviny) + 4,5g (koření).
5.
Instantní nudlová polévka hovězí Vifon, 60 g.
6.
Instantní nudlová polévka hovězí Heinz, 85 g.
7.
Instantní nudlová polévka hovězí Vifon, 60 g.
8.
Instantní nudlová polévka hovězí VI-Huong, 65 g.
9.
Instantní nudlová polévka kuřecí Vitana, 60,5 g.
(těstoviny) + 4,5g (koření).
10.
Instantní nudlová polévka kuřecí Vifon, 60 g.
11.
Instantní nudlová polévka kuřecí Heinz, 85 g.
12.
Instantní nudlová polévka kuřecí speciál Vifon, 60 g.
13.
Instantní nudlová polévka kuřecí Vifon, 60 g.
14.
Instantní nudlová polévka kuřecí Lucky, 70 g.
15.
Instantní nudlová polévka kuřecí Indomie, 57 g..
Výrobce
Nestlé Food s r.o.,Slovensko.
Nestlé Food s r.o., Slovensko.
Podravka d.d., Chovatsko.
Hanwha Foods Hungary Ltd.,
Maďarsko.
Vietnam Food industries company,
Vietnam.
P.T.Heinz Suprama Sidoarjo
Indonésie.
Vietnam Food industries company,
Vietnam.
Thien Huong Food Joint Stock Co.,
Vietnam.
Hanwha Foods Hungary Ltd.,
Maďarsko.
Vietnam Food industries company,
Vietnam.
P.T.Heinz Suprama Sidoarjo,
Indonésie.
Vietnam Food industries company,
Vietnam.
Vietnam Food industries company,
Vietnam.
An Thai Food Industries, Ltd.,
Vietnam.
PT.Indofood Sukses Makmur Tbk,
Indonésie.
116
8.2. IZOTACHOFORETICKÉ STANOVENÍ GLUTAMOVÉ KYSELINY
Pro izotachoforetickou separaci (CITP) byl použit izotachoforetický analyzátor
ZKI 02
v
jednokapilárním
uspořádáním
složeném
z
separační
kapiláry
(160 mm × 0,3 mm I.D.). Vzorky byly dávkovány pomocí dávkovacího kohoutu s
fixním objemem 35 µl. Detekce analytů byla prováděna přímou vodivostní detekcí.
Elektrolytový systém použitý v této práci se skládal z vedoucího elektrolytu (LE): 10
mM HCl + 20 mM L-histidin + 0,05 % (m/v) HPMC; pH = 6,0 a koncového elektrolytu
(TE): 5 mM kyselina 2-[N-morfolino]ethansulfonová (MES). Hodnota aplikovaného
hnacího proudu byla 80, respektive 40 µA. Doba trvání analýzy, při použití kombinace
proudů o těchto hodnotách, byla 15 minut.
Standardy kyseliny glutamové byly připravovány z 10 mM zásobního roztoku,
který byl skladován při 5 °C. Pro izotachoforetické stanovení glutamové kyseliny bylo
připraveno 7 standardů o koncentracích 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,14; 0,20 mmol.l-1.
Vzorky pro analýzu byly ředěny 100-krát nebo 500-krát v závislosti na koncentraci
glutamové kyseliny ve vzorku.
8.3. STANOVENÍ GLUTAMOVÉ KYSELINY METODOU HPLC
8.3.1. Derivatizace
Pro HPLC stanovení byl jako derivatizační činidlo použit 9-fluorenylmethyl
chloroformiát (FMOC). Zásobní roztok derivatizačního činidla (15 mmol.l-1) byl
připraven odvážením 0,16 g činidla, které bylo převedeno do 25 ml odměrné baňky a
doplněno acetonem po rysku. Příprava vzorku k analýze byla prováděna takto: 500 µl
vzorku bylo odpipetováno do 5 ml vialky. K tomuto objemu bylo přidáno 350 µl
0,05 M roztoku tetraboritanu disodného a 150 µl derivatizačního činidla. Následně byla
vialka se směsí uzavřena, její obsah byl promíchán a ponechán přesně dvě minuty v
klidu, tak aby proběhla derivatizační reakce. Poté byly ke směsi přidány 2 ml n-hexanu,
který ukončí derivatizační reakci, směs byla řádně protřepána až do odbarvení spodní
vodné vrstvy, obsahující derivatizované aminokyseliny. Po odbarvení bylo 500 µl ze
spodní vrstvy odpipetováno, převedeno do 1,8 ml vialky a smícháno s 500 µl roztoku
tetraboritanu disodného. Stejným postupem byla připravena pětibodová kalibrační řada
o koncentracích 1, 2, 3, 4, 5 µmol kyseliny glutamové v litru.
117
8.3.2. HPLC stanovení
Jako mobilní fáze pro HPLC stanovení byla použita směs octanového pufru (A) a
metanolu (B) o poměru 55 : 45. Octanový pufr byl připraven smícháním 2,5 g kyseliny
octové a 1,7 g trihydrátu octanu sodného a doplněním směsi na objem jednoho litru.
Průtok mobilní fáze při analýze byl 1 ml.min-1. Kolona byla po celou dobu analýzy
temperována na teplotu 30 ºC. Excitační vlnová délka pro fluorescenční detekci byla
nastavena na 265 nm, emisní vlnová délka na 315 nm. Doba HPLC analýzy jednoho
vzorku trvala 35 minut.
8.4. VÝSLEDKY A JEJICH DISKUSE
8.4.1. Separace glutamové kyseliny metodou CITP
Pro separaci glutamové kyseliny byl použit elektrolyt o pH 6, jak uvádí autoři
Kenndler a Huber (1980) je toto pH je optimální pro stanovení potravinářských aditiv.
Izotachoforetický záznam vybraného vzorku je na Obrázku 26. Z tohoto obrázků je
zřejmé, že kyselinu glutamovou lze ve vzorcích instantních polévek velmi dobře
separovat bez interferencí s ostatními složkami vzorku. Identifikace glutamové kyseliny
byla prováděna porovnáním relativní výšky vlny (RSH) standardu a vzorku.
Kvantifikace glutamové kyseliny byla prováděna dosazením délky vlny (L) do rovnice
její
kalibrační
křivky:
c (mmol.l-1) = 0,0069 . L + 0,004.
Hodnota
korelačního
koeficientu r (0,9997) prokazuje linearitu odezvy detektoru, v intervalu od 0,02
do 0,2 mmol.l-1.
Vzorky byly vždy ředěny tak, aby délka vlny ležela v rozpětí kalibrační křivky.
Každý z 15 vzorků byl minimálně jednou znovu naředěn a změřen, u každého vzorku
bylo provedeno tolik měření, dokud RSD dvou paralelních měření nebylo nižší než
hodnota opakovatelnosti metody. Výsledky měření jsou v Tabulce XXXII. Obsah
glutamové kyseliny v analyzovaných výrobcích podle CITP se pohybuje od 0,48 % do
7,58 % glutamové kyseliny z celkové hmotnosti výrobku.
118
Tabulka XXXI. Obsah kyseliny glutamové, poměr mezi obsahem kyseliny glutamové
a nejvyšším povoleným množstvím (NPMa) a posouzení splnění limitu daného
vyhláškou 53/2002 Sb. v 15 vzorcích instantních polévek analyzovaných CITP
metodou.
Vzorek
Obsah kys. glutamové Obsah kys. glutamové
(g) v 1 porci
(g.l-1)
0,470 ± 0,005
0,91 ± 0,01
0,590 ± 0,006
0,760 ± 0,008
0,340 ± 0,004
0,410 ± 0,005
0,430 ± 0,005
0,410 ± 0,005
1,37 ± 0,02
0,740 ± 0,008
3,09 ± 0,03
0,97 ± 0,01
0,740 ± 0,008
0,690 ± 0,008
0,450 ± 0,005
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,35 ± 0,03
4,55 ± 0,05
2,94 ± 0,03
2,54 ± 0,03
0,86 ± 0,01
0,82 ± 0,01
1,08 ± 0,01
1,03 ± 0,01
4,56 ± 0,05
1,84 ± 0,02
6,18 ± 0,07
2,43 ± 0,03
1,84 ± 0,02
1,73 ± 0,02
1,13 ± 0,01
Poměr mezi obsahem
kyseliny glutamové a
NPM (%)
23,6
45,5
29,4
25,4
8,6
8,3
10,8
10,3
45,6
18,4
61,8
24,3
18,4
17,3
11,3
Splnění limitu
daného vyhláškou
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
ANO
a
NPM - nejvyšší povolené množství glutamové kyseliny v potravinách obecně kromě
nealkoholických nápojů dané vyhláškou č. 53/2002 Sb.
TE
1
R
LE
Čas
Obrázek 26. Izotachoforegram vzorku č. 13 instantní polévky. 1 – kyselina glutamová.
119
8.4.2. Separace glutamové kyseliny metodou HPLC
Pro stanovení glutamové kyseliny byla použita metoda publikovaná v literatuře
(Strein et al., 1999), která byla částečně modifikovaná pro podmínky této práce.
Nejkritičtějšími bodem při analýze kyseliny glutamové metodou HPLC je příprava
FMOC derivátů kyseliny glutamové. Na opakovatelnost jejich přípravy má vliv průběh
derivatizační reakce, tzn. zda reakce probíhá stechiometricky s dobrou výtěžností a zda
vzniklé deriváty jsou dostatečně stabilní. V této práci byl jako derivatizační činidlo
vybrán 9-fluorenylmethyl chloroformiát (FMOC), který je označován jako činidlo, které
má nejvyšší stabilitu derivátů. Pokusy bylo ověřeno, že FMOC deriváty kyseliny
glutamové jsou stabilní minimálně po dobu 24 h při laboratorní teplotě. Na Obrázku 27
je uvedený typický chromatografický záznam vzorku analyzované polévky. Kyselině
glutamové odpovídá pík s elučním časem 12,3 min, který je od ostatních složek vzorku
dobře separovaný.
Kvantifikace glutamové kyseliny byla prováděna dosazením plochy píku do
rovnice její kalibrační křivky: c (µmol.l-1) = 9,337 . A + 0,356. Hodnota korelačního
koeficientu r (0,999) prokazuje linearitu odezvy detektoru, v intervalu od 1 µmol.l-1 do
5 µmol.l-1. Výsledky HPLC stanovení kyseliny glutamové v 15 vzorcích jsou
v Tabulce XXXII.
Tabulka XXXII. Opakovatelnost metody a opakovatelnost stanovení vyjádřené jako
relativní standardní odchylka (RSD), zpětný nález (%), limit detekce (LOD) a limit
kvantifikace (LOQ) stanovení kyseliny glutamové kapalinovou chromatografií (HPLC)
a kapilární izotachoforézou (CITP). n – počet měření.
Metoda
HPLC
CITP
Opakovatelnost metody Opakovatelnost stanovení
(RSD), (n = 6)
(RSD), (n = 6)
12 %
1,1 %
1,5 %
>1 %
Zpětný nález (%)
100%
50%
přídavek přídavek
91,4
84,7
97,7
87,2
LOD
LOQ
10 µg.l-1
1 mg.l-1
30 µg.l-1
3 mg.l-1
120
30.0
EM:315 nm
mV
25.0
20.0
15.0
12.27- Glutamic Acid
10.0
5.0
0.0
-5.0
0.0
min
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
Obrázek 27. Chromatogram vzorku instantní polévky. 12,27 min – kyselina glutamová.
8.4.3. Srovnání metod CITP a HPLC
Naměřené hodnoty glutamové kyseliny ve vzorcích byly přepočítány na
koncentrace v g.1-1 vzorku. Hodnoty naměřené metodou HPLC byly srovnávány s
výsledky získanými metodou CITP, která byla zvolena jako referenční, vzhledem k
tomu že poskytuje lepší výsledky opakovatelnosti a i převážné většiny ostatních
parametrů. Graf lineární regrese (viz. Obrázek 28) byl získán z dat Tabulky XXXIII, a
to vynesením koncentrací glutamové kyseliny naměřených kapalinovou chromatografií
(HPLC) proti koncentracím zjištěným referenční, tj. izotachoforetickou (CITP),
metodou. Získána rovnice regresní přímky ve tvaru:
cHPLC = 0,7682 . cCITP + 0,1652; r= 0,935.
Z hodnoty směrnice a úseku na ose y je patrné, že CITP poskytuje systematicky vyšší
hodnoty, tzn. interval spolehlivosti těchto koeficientů v sobě nezahrnuje 1. Jak je
121
pozorovatelné z hodnot uvedených v Tabulce XXXIII a na Obrázku 28, rozdíly obou
metod spočívají v nižších nálezech glutamové kyseliny HPLC metodou.
Jako nejpravděpodobnější příčina nižších hodnot koncentrací glutamové kyseliny
je zřejmě samotná příprava vzorku k analýze, která se skládá z daleko více kroků, než je
tomu u přípravy vzorků pro CITP. Veliký rozdíl je v ředění vzorků, pro CITP byly
vzorky ředěny maximálně 500-krát, pro HPLC byly všechny vzorky ředěny 10 000-krát
a při takto vysokém ředění se zvyšuje chyba měření. Dále chyba narůstá při vlastní
derivatizaci, kdy se ještě více projeví chyba při pipetování velmi malých objemů vzorku
a složek derivatizačního činidla. Dále je při derivatizaci třeba velmi dbát na správné
naředění vzorku. Při vyšší koncentraci nemusí dojít k derivatizaci ze 100 % a výsledky
mohou být o to nižší.
Tabulka XXXIII. Obsah kyseliny glutamové stanovený v 15 vzorcích instantních
polévek kapalinovou chromatografií (HPLC) a kapilární izotachoforézou (CITP),
relativní standardní odchylka (RSD) mezi těmito výsledky.
Vzorek
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Obsah kyseliny glutamové (g.1-1)
HPLC
CITP
2,5 ± 0,4
2,35 ± 0,03
3,3 ± 0,5
4,55 ± 0,05
2,4 ± 0,4
2,94 ± 0,03
1,8 ± 0,3
2,54 ± 0,03
0,9 ± 0,1
0,86 ± 0,01
0,9 ± 0,1
0,82 ± 0,01
1,2 ± 0,2
1,08 ± 0,01
0,9 ± 0,1
1,03 ± 0,01
4,0 ± 0,6
4,56 ± 0,05
1,5 ± 0,2
1,84 ± 0,02
5,0 ± 0,8
6,18 ± 0,07
2,6 ± 0,4
2,43 ± 0,03
1,2 ± 0,2
1,84 ± 0,02
1,6 ± 0,2
1,73 ± 0,02
0,7 ± 0,1
1,13 ± 0,01
RSD
(%)
4,4
22,5
14,3
24,1
3,2
6,6
7,4
9,5
9,3
14,4
14,9
4,8
29,8
5,5
33,2
122
7,0
6,0
c HPLC (g.1-1)
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
c CITP (g.l-1)
Obrázek 28. Srovnání izotachoforetické (CITP) a chromatografické (HPLC) metody
stanovení kyseliny glutamové v instantních výrobcích.
8.4.4. Závěr
Cílem práce bylo porovnat CITP a HPLC stanovení glutamové kyseliny.V
15 vzorcích instantních dehydratovaných výrobku byl stanovena glutamová kyseliny
kyselina pomocí obou metod. Z naměřených výsledků je patrné, že pro stanovení
obsahu kyseliny glutamové a jejích solí v potravinách může být využita jak CITP, tak
HPLC. Přesto, z hlediska přesnosti analýzy, opakovatelnosti metody, náročnosti
přípravy vzorků a obsluhy, separace a identifikace glutamové kyseliny je CITP
robustnější
metodou,
vhodnou
pro
rutinní
analýzu
glutamové
kyseliny
v
potravinářských výrobcích.
123
Vyšší detekční limit CITP metody (řádově 100-krát) není pro stanovení
glutamové kyseliny v instantních výrobcích limitujícím faktorem, neboť obsah
glutamové kyseliny je v těchto výrobcích dostatečně vysoký.
124
9. ZÁVĚR
Cílem dílčích měření této práce bylo vypracovat metody elektroforetického
stanovení vybraných analytů a to: polyfosfátů, karboxylových kyselin, kyseliny
glutamové a tyto metody využít pro hodnocení kvality potravin. Uváděné
elektroforetické metody byly srovnány s metodami, které jsou pro stanovení příslušných
analytů standardně používány.
V polyfosfátových přípravcích používaných v masném průmyslu byly jednotlivé
polyfosfáty stanoveny kapilární izotachoforézou, kapilární zónovou elektroforézou a
„on-line“ spojením kapilární izotachoforézy a kapilární zónové elektroforézy. Byly
posouzeny výhody a nevýhody jednotlivých metod s tím závěrem, že každá z těchto
metod je vhodná pro určitý typ matrice a každá má také jiný limit detekce. Jako
nejvhodnější metoda pro stanovení polyfosfátů v masných výrobcích byla zvolena
kapilární izotachoforéza.
Stanovení přidaných fosfátů v masných výrobcích založené na izotachoforetickém
stanovení jednotlivých polyfosfátů bylo srovnáno s klasickou spektrofotometrickou
metodou. Na souboru 34 vzorků různých masných výrobků bylo prokázáno, že je
možné touto metodou nahradit klasické stanovení. Pro výpočet obsahu přidaných
fosfátů byl zjištěn poměr mezi volným fosfátem a bílkovinami v mase, jehož hodnota je
16,2 mg P2O5 na gram bílkovin. V příslušné kapitole jsou dále uvedené i další
koeficienty mezi obsahem různých forem fosfátů a bílkovinami masa.
Pro stanovení přidaných fosfátů tedy byla nalezena možná alternativní metoda
jejich stanovení v masných výrobcích, ale zůstává otázkou, zda je vůbec nutné množství
přidaných fosfátů stanovovat. Přirozeně přítomné rozpustné fosfáty masa totiž mohou
organizmus konzumenta ochuzovat o vápenaté a hořečnaté ionty stejně jako fosfáty
přidané během zpracování. Bylo by proto vhodnější legislativně definovat pouze
maximální přípustné množství rozpustných fosfátů. Vzhledem k tomu, že jeden
kilogram masa obsahuje okolo 5000 mg fosfátů z nichž 80 %, tj. zhruba 4000 mg, jsou
formy fosfátů rozpustné ve vodě, bylo by možné při technologické přípravě určitého
masného výrobku snadno vypočítat maximální možný přídavek polyfosfátových směsí.
V masném výrobku by pak mohl být tento celkový obsah rozpustných fosfátů stanoven
kapilární izotachoforézou nebo jinou elektromigrační technikou, bez nutnosti
125
stanovovat celkový obsah dusíku a používat k vlastnímu výpočtu jakékoli přepočítávací
koeficienty.
Kapilární zónová elektroforéza byla použita pro stanovení kyseliny mléčné,
octové, propionové a máselné v silážích. Cílem bylo nalézt rychlou metodu stanovení
těchto kyselin pro analýzy velkého počtu vzorku, kde použití kapilární izotachoforézy
jako alternativní elektromigrační metody by bylo příliš časově náročné. Použitou
metodou se podařilo zkrátit čas jedné analýzy na jednu třetinu oproti izotachoforetické
metodě.
Karboxylové kyseliny jsou významný ukazatel kvality vajec a obsah kyseliny
mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné je Vyhláškou 200/2003 Sb. limitovaný. Pro
jejich
stanovení
byl
vypracován postup stanovení kapilární izotachoforézou
v dvoukolonovém uspořádání s různou koncentrací separačních elektrolytů (2D CITPCITP). Tyto použité separační podmínky umožnily stanovit vybrané karboxylové
kyseliny
–
kyselinu
mléčnou,
jantarovou,
3-hydroxymáselnou,
glutamovou,
pyrohroznovou, citronovou, octovou a pyroglutamovou s detekčním limitem 2,5 mg
v kilogramu sušiny.
Změna obsahu karboxylových kyselin byla sledována ve vejcích skladovaných při
5, 14 a 30 ºC. Během 38 dnů skladování byl obsah jednotlivých karboxylových kyselin
stanovován v průběžně odebíraných vejcích. Cílem bylo nalézt závislosti mezi obsahem
jednotlivých kyselin, teplotou skladování, dobou skladování a celkovým počtem
mikroorganizmů (CPM). Hodnoty kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné
nalezené ve vejcích po 28 dnech skladování byly porovnány s legislativními limity pro
skořápková vejce. Kyselina jantarová a 3-hydroxymáselná nebyly v průběhu skladování
vůbec detektovány. Obsah kyseliny mléčné překročil limitní hodnotu 1000 mg.kg-1 až
po více jak 30 dnech skladování při 30 ºC. Přičemž další požadavek, aby obsah CPM
byl nižší než 5.104, byl při této teplotě překročen již zhruba 15. den skladování, kdy
koncentrace kyseliny mléčné byla okolo 600 mg. kg-1. Vhledem k tomu, že ani
v průběhu skladování při teplotě 30ºC nebyly limitní obsahy kyselin překročeny, bylo
by třeba poněkud pozměnit legislativní požadavky na jejich obsah. Obecně obsah
karboxylových kyselin v průběhu skladování kolísá. Proto u valné většiny
126
analyzovaných kyselin nemohla být nalezena nějaká limitní hodnota ve vztahu k
mikrobiální kvalitě vejce.
Získané výsledky stanovení kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné
izotachoforetickou metodou byly pro vybrané vzorky srovnány se stanovením pomocí
komerčních enzymových setů. V případě kyseliny jantarové a 3-hydroxymáselné byl
jejich obsah enzymovými metodami ve vzorcích stanoven, a to v koncentracích nad
mezí detekce izotachoforetické metody. Avšak je třeba uvést, že při takovýchto nízkých
koncentracích bylo enzymové stanovení zatížené výraznou chybou. Proto v tomto
případě pro jejich stanovení není enzymová metoda zcela vhodná a u izotachoforetické
metody by bylo třeba ještě zvýšit mez detekce.
V 15 vzorcích instantních polévek bylo použitím kapilární izotachoforézy
sledováno, zda obsah kyseliny glutamové nepřekračuje limit 1000 mg.kg-1. Hlavní
výhodou izotachoforetického stanovení s přímou vodivostní detekcí je, že není nutná
stanovení komplikující derivatizace glutamové kyseliny, jak je tomu v případě použití
HPLC metody.
127
10. LITERATURA
Abrantes, S.; Philo, M. R.; Damant, A. P.; Castle, L. Application of capillary electrophoresis in migration
studies of food contact materials. I. Substituted phenolic additives. High Resolution Chromatography
1997, 20, 270-274.
Alonso, E. V.; de Torres, A. G.; Pavon, J. M. C. Determination of organic acids in wines. A review.
Quimica Analitica 1998, 17, 167-175.
Alli, I.; Baker, B. E. Constitution of leguminous Seeds. A note on protein-phytic acid interactions during
isolation of acid-soluble protein from Phaseolus Beans. Journal of the Science of Food and
Agriculture 1981, 32, 588-592.
Badoud, R.; Prat, G. Improved HPLC analysis of some carboxylic acids in food and beverages as their pnitrobenzyl esters. Journal of Chromatography 1986 360, 119-136.
Baluyot, E. S.; Hartford. C. G. Comparison of polyphosphate analysis by ion chromatography and by
modified end-group titration. Journal of Chromatography A 1996, 739, 217-222.
Baryla, N. E.; Lucy, Ch. A. Simultaneous determination of cationic and anionic proteins using
zwitterionic surfactants in capillary electrophoresis. Analytical Chemistry 2000, 72, 2280-2284.
Beljaars, P. R.; Van Dijk, R.; Bisschop, E.; Spiegelenberg, W. M. Liquid Chromatographic Determination
of Free Glutamic Acid in Soup, Meat Products and Chinese Food: Interlabory Study. Journal of
AOAC International 1996, 79, 697-702.
Bergner-Lang, B.; Beutler, H. O. Enzymatische Bestimmung der D(-)-3-Hydroxybuttersäure in
Eiprodukten. Deutsche Lebensmittel Rundschau 1986, 82, 23-26.
Berzas Nevado, J. J.; Guiberteau Cabanillas, C.; Contento Salcedo, A. M. Method development and
validation for the simultaneous determination of dyes in foodstuffs by capillary zone electrophoresis.
Analytica Chimica Acta 1999, 378, 63-71.
Betancort Rodríguez, J. R.; García Reina, G., Santana Rodríguez, J. J. Determination of Free Amino
Acids In Microalgae by High-performance Liquid Chromatography Using Pre-column Fluorescence
Derivatization. Biomedical Chromatography 1997, 11, 335-336.
Blatný, P.; Kvasnička, F.; Kenndler, E. Trace determination of iron in water on the ppb level by UV
detection of the Fe(III)-EDTA complex with on-line coupling of capillary isotachophoresis and
capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A 1997, 757, 297-302.
Blatný, P.; Kvasnička, F. Application of CITP and CZE in Determination of Inorganic Anions in Food
and Feed Samples. Journal of Chromatography A 1999, 834, 419-431.
128
Boček, P.; Deml, M.; Gebauer, P.; Dolník, V. Analytická kapilární izotachoforéza. Academia: Praha
1987.
Boček, P.; Pavelka, S.; Grígerová, K.; Deml M.; Janák J. Determination of lactic and acetic acid in silage
extracts by analytical isotachophoresis. Journal of Chromatography 1978, 154, 356-359.
Boyce, M. C. Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweeteners permitted as
additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography. Journal of Chromatography A
1999, 847, 369-375.
Boyce, M. C.; Spickett, E. E. Separation of food grade antioxidants (synthetic and natural) using mixed
micellar electrokinetic capillary chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999,
47, 1970-1975.
Brooks, J. R.; Morr, Ch. V. Phosphorous and phytate content of soybean protein components. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 1984, 32, 672-674.
Buchberger, W.; Klampfl, Ch. W.; Eibensteiner, F.; Buchgraber, K. Determination of fermenting acids in
silage by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 1997, 766, 197-203.
Cancalon, P. F. Analytical monitoring of citrus juices by using capillary electrophoresis. Journal of
AOAC International 1999, 82, 95-106.
Cancalon, P. F. Vitamin analysis by capillary electrophoresis. LC&GC Europe 2003, 8, 2-7.
Castellari, M.; Sartini, E.; Spinabelli, U.; Riponi, C.; Galassi, S. Determination of carboxylic acid,
carbohydrates, glycerol, ethanol, and 5-HMF in beer by high-performation liquid chromatography and
UV-refractive index double detection. Journal of Chromatographic Science 2001, 39, 235-238.
Castineira, A.; Peňa, R. M.; Herrero, C.; García-Martín, S. Analysis of Organic Acids in Wine by
capillary electrophoresis with Direct UV Detection. Journal of Food Composition and Analysis 2002,
15, 319-331.
Cattaneo, P.; Balzaretti, C. Fosforo totale nei prodotti carnei e metodi per la determinazione. Ingegneria
Alimentare 1997, 1, 7-13.
Cocchi, M.; Lambertini, P.; Manzini, D.; Marchetti, A. Determination of Carboxylic Acids in Winegars
and in Aceto Balsamico Tradizionale di Modena by HPLC and GC Methods. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 2002, 50, 5255-5261.
Courtesy of Dr. P. Devoto. Department of Neuroscience, University of Cagliari, Italy.
Cui, H.; Cai, Fa; Xu, Q. Determination of triphosphate in frozen cod and scallop adductor by ion
chromatography. Journal of Chromatography A 2000, 884, 89-92.
129
Cunha, S. C.; Ferreira, I. M.; Fernandes, J. O.; Faria, M. A.; Beatriz, M.; Oliveira, P. P.; Ferreira, M. A.
Determination of lactic acid, acetic, succinic, and citric acid in table olives by HPLC/UV. Journal of
Liquid Chromatography & Related Technologies. 2001, 24, 1029-1038.
Cunha, S. C.; Fernandes, J. O.; Faria, M. A.; Ferreira, I. M.; Ferreira, M. A. Quantification of organic
acids in grape musts and port wines. Ciencia y Tecnología de los Alimentos 2002, 3, 212-216.
ČSN 57 2109. Slepičí vejce konzumní tříděná. Český normalizační institut: Praha 1998.
ČSN 57 2301. Vaječné výrobky. Vaječná hmota. Federální úřad pro normalizaci a měření: Praha 1992.
ČSN 46 7092. Metody zkoušení krmiv – Část 43: Hodnocení jakosti fermentačního procesu siláže. Český
normalizační institut: Praha 1999.
ČSN EN ISO 4833. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda pro stanovení celkového
počtu mikroorganizmů – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 ºC. Český normalizační
institut: Praha 2003.
Dong, Y. Capillary electrophoresis in food analysis. Trends in Food Science & Technology 1999, 10, 8793.
Donzanti, B. A., Yamamoto, K. B. An improved and rapid HPLC-EC method for the isocratic separation
of amino acid neurotransmitters from brain tissue and microdialysis perfusates. Life Sciences 1988,
43, 913-922.
Escobal, A.; Gonzales, J.; Iriondo, C.; Laborra, C. Liquid chromatographic determination of organic acids
in txakoli from Bizkaia. Food Chemistry 1997, 58, 381-384.
Ewaschuk, J. B.; Zello, G. A.; Naylor, J. M.; Brocks, D. R. Metabolic acidosis: separation methods and
biological relevance of organic acids. Journal of Chromatography B 2002, 781, 39-56.
Flieg, O. Ein Schüssel zur Bewertung von Gärfutterproben. Futterbau und Gärfutterbereitung 2,
Reichnährsand und Forschung – Dienstung 1938.
Foret, F.; Fanali, S.; Ossicini, L.; Boček, P. Indirect photometric detection in capillary electrophoresis.
Journal of Chromatography 1989, 470, 229-308.
Foret, F.; Šustaček, V.; Boček, P. On-line isotachophoretic sample preconcentraction for enhancement of
zone detectability in capillary zone electrophoresis. Journal of Microcolumn Separation 1990, 2, 229233.
Foret, F.; Křivánková, L.; Boček, P. Capillary Zone Electrophoresis. VCH Verlagsgesellschaft mbH:
Weinheim 1993.
130
Frank, P. Flavor Tricks. Food Product Design: Northbrook 1999.
Frazier, R. A.; Inns, E. L.; Dossi, N.; Ames, J. M.; Nursten, H. E. Development of a capillary
electrophoresis method for the simultaneous analyses of artificial sweeteners, preservatives and colors
in soft drinks, Journal of Chromatography A 2000, 876, 213-220.
Friedl, W; Reijenga, J. C.; Kenndler, E. Ionic strength and charge number correction of mobilities of
multivalent organic anions of capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 1995, 709, 163170.
Fukushima, T.; Lee, Jen-Ai; Korenaga, T.; Ichihara, H.; Kato, M.; Imai, K. Simultaneous determination
of D-lactic acid and 3-hydroxybutyric acid in rat plasma using a column-switching HPLC with
fluorescent derivatization with 4-nitro-7-piperazino-2,1,3-bonzoxadiazole (NBD-PZ). Biomedical
Chromatography 2001, 15, 189-195.
Gennaro, M. C.; Bertolo, P. L. Determination of the principal anionic components in wines and soft
drinks, by ion interaction reversed phase high-performance liquid chromatography. Journal of
Chromatography A 1989, 472, 433-440.
Gilges, M.; Kleemss, M. H.; Schomburg, G. Capillary zone electrophoresis separations of basic acidic
proteins using poly(vinyl alcohol) coatings in fused silica capillaries. Analytical Chemistry 1994, 66,
2038-2046.
Gyseler, J.; Helk, B.; Dambacher, S.; Tjaden, U. R.; Greef, J. Characterization of recombinant cytokyne
fragments using isotachophoresis-capillary zone electrophoresis, reverse phase high liquid
chromatography, and mass spectrometry. Pharmaceutical Research 1999, 16, 593-781.
Halliwell, D., J.; McKelvie, I. D.; Harth, B. T.; Doger, H. Separation and determination of condensed
phosphates in waste waters by ion chromatography coupled with flow injection. Analyst 1996, 121,
1089-1093.
Hall, C. A. III, Zhu, A; Zeece, M. G. Comparison between capillary electrophoresis and highperformance liquid chromatography separation of food grade antioxidants. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 1994, 42, 919-921.
Hamm, R.; Neraal, R. Enzymic breakdown of tripolyphosphate and diphosphate in minced meat. XII.
Influence of the breakdown of tripolyphosphate and diphosphate on the water-holding capacity of
meat. Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung und Forschung 1977, 164, 243-.
Hasib, A.; Jaouad, A.; Mahrouz, M.; Khouili, M. HPLC determination of organic acid in maroccan
apricot. Ciencia y. Tecnoología de los Alimentos 2002, 3, 207-211.
Hegenbart, S. Filtering the Facts on Flavor Enhancers. Food Product Design, Northbrook 1994.
131
Hejlová, Š. Hygiena a technologie vajec a vaječných výrobků. I. Straka: Újezd u Brna 2001.
Herbert, P.; Barros, P.; Ratola, N.; Alves, A. HPLC Determination of Amino Acids in Muts and Port
Wine Using OPA/FMOC Derivates. Food Chemistry and Toxicology 2000, 65, 1130-1133.
Huang, X.; Luckey, J. A.; Gordon, M. J.; Zare, R. N. Quantitative analysis of low molecular weight
carboxylic acids by capillary zone electrophoresis/conductivity detection. Analytical Chemistry 1989,
61, 766-770.
Chen Zhi Huang; Tomofumi Santa; Kazuhiro Imai. Development of 7-(N,N´-dimethylaminosulfonyl)-5N-aminoethyl)piperazino-1,2,3-benzoxadiazole as a water-soluble fluorogenic reagent for the
sensitive liquid chromatographic determination of saturated carboxylic acids. The Analyst 2002, 127,
741-747.
Churáček, J. Analytická separace látek. SNTL: Praha 1990.
Janoš, P. Determination of trimetaphosphate in pyrophosphate by capillary isotachophoresis. Journal of
Chromatography 1990, 516, 473-477.
Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. L-glutamic acid and its ammonium, calcium
monosodium and potassium salts. In Toxicological Evaluation of certain Food Additive and
Contaminants. WHO food Additive Series No. 22. Cambridge University Press: New York 1988.
Jorgenson, J. W.; Lukacs, K. D. High-resolution separations based on electrophoresis and electroosmosis.
Journal of Chromatography 1981, 218, 209-216.
Kandl, T.; Kupina, S. An improved capillary electrophoresis procedure for the determination of organic
acids in grape juice and wine. American Journal of Enology and Viticulture 1999, 50, 155-161.
Kanianský, D.; Marak, J. On-line coupling of capillary electrophoresis with zone electrophoresis. Journal
of Chromatography A 1990, 498, 191-204.
Kanianský, D.; Zelenský, I.; Hybenová, A.; Onuska, F. I. Determination of chloride, nitrate, sulfate,
nitrite, fluoride and phosphate by on-line coupled capillary isotachophoresis-capillary zone
electrophoresis. Analytical Chemistry 1994, 66, 4258-4264.
Kanianský, D.; Mařák, J.; Lastinec, J.; Reijenemga, J. C.; Onuska, F. I.. Capillary zone electrophoresis
with on-line izotachophoresis sample pre-treatment: Sample clean-up aspect. Journal of Microcolumn
Separation 1999, 11, 141-153.
Karovičová, J.; Drdák, M.; Polonský, J. Utilization of capillary isotachophoresis in the determination of
organic acids in food. Journal of Chromatography A 1990, 509, 283-286.
132
Karovičová, J.; Polonský, J.; Príbela, A.; Šimko, P. Isotachophoresis of some synthetic colorants in foods.
Journal of Chromatography A 1991, 545, 413-419.
Kawakita, Tetsuya L-Monosodium Glutamate (MSG), Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical
Technology. John Wiley & Sons: New York 1992.
Kehr, J. Determination of glutamate and aspartate in microdialysis samples by RP-HPLC with
fluorescence and electrochemical detection. Department of Neuroscience, Karolinska Institutet,
Stockholm, Sweden
Kenndler, E.; Huber, J. F. K. Simultane Identifizierung und Quantifizierung der Geschmacksverstärker
Glutamat, Guanosin-5-monophosphat in Lebensmitteln mit Isotachophorese. Zeitschrift für
Lebensmitteluntersuchung und Forschung 1980, 171, 292-296.
Kłossovska, B. Oznaczanie fosforu dodanego w produktach mięsnych. Gospodarka Mięsna 1998, 6, 4850.
Krzynowek, J. Practical application of thin-layer chromatography for detection of polyphosphates in
seafood. Journal of AOAC International 1995, 78, 1328-1332.
Křížek, M.; Pelikánová, T. Determination of seven biogenic amines in foods by micellar electrokinetic
capillary chromatography. Journal of Chromatography A 1998, 815, 243–250.
Kung, L.; Shaver, R. Interpretation and use of silage fermentation analysis report.
http://ag.udel.edu/departments/anfs/faculty/kung/articles/interpretation_and_use_of_silage.htm .
Kuo, K. L.; Hsieh, Y. Z. Determination of preservatives in food products by cyclodextrin-modified
capillary electrophoresis with multiwavelength detection. Journal of Chromatography A 1997, 768,
334-341.
Kvasnička, F. Analysis of the sweetener ASPARTAME by capillary isotachophoresis. Journal of
Chromatography 1987, 390, 237-240.
Kvasnička, F.; Price, K. R.; Ng, K.; Fenwick, G. R. Determination of potato glycoalkaloids using
isotachophoresis and comparison with a HPLC method. Journal of Liquid Chromatography 1994, 17,
1941-1951.
Kvasnička, F.; Míková, K. Determination of EDTA in mMayonnaise by on-line coupled capillary
isotachophoresis-capillary zone electrophoresis with UV detection. Journal of Food Composition and
Analysis 1996, 9, 231-242.
Kvasnička, F. Isotachophoretic determination of 3-methylhistidine, Journal of Chromatography A 1999,
838, 191–195.
133
Kvasnička, F.; Voldřich, M. Isotachophoretic determination of creatinine in meat and meat products.
Electrophoresis 2000, 21, 2848 – 2850. (a)
Kvasnička, F.; Voldřich, M. Determination of fumaric acid in apple juice by on-line coupled capillary
isotachophoresis - capillary zone electrophoresis with UV detection. Journal of Chromatography A
2000, 891, 175–181. (b)
Kvasnička, F. Application of capillary isotachophoresis in food analysis. Electrophoresis 2000, 21, 2780–
2787.
Kvasnička, F.; Jaroš, M.; Gaš, B. New configuration in CITP-CZE coupling. Journal of Chromatography
A 2001, 916, 131–142.
Kvasnička, F. Determination of egg white lysozyme by on-line coupled capillary isotachophoresis with
capillary zone electrophoresis. Electrophoresis 2003, 24, 860-864.
Lange, J.; Thomas, K.; Wittmann, Ch. Comparison of a capillary electrophoresis method with highperformance liquid chromatography of the determination of biogenic amines in various food samples.
Journal of Chromatography A 2002, 779, 229–239.
Lawrie, R. Developments in meat science-4. Elsevier Applied Science Publisher: London, 1988.
Lee, Y. H.; Lin, T. I. Capillary electrophoretic determination of amino acids with indirect absorbance
detection. Journal of Chromatography A 1994, 680, 287-297.
Linares, P.; Lunque de Castro, M. D.; Valcárcel, M. Determination of polyphosphates in intermediate
materials for detergent manufacture by ion high-performance liquid chromatography with postcolumn derivatization. Journal of Chromatography 1991, 585, 267-271.
Littmann, S.; Schulte, E.; Acker, L. Beurteilung des hygienischen Zustandes von Eiprodukten vor der
Pasteurisierung über das Muster der organischen Säuren, I. Gaschromatographische Methode zur
gleichzeitigen Bestimmung der organischen des Húhne. Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung
and Forschung 1982, 175, 101-105. (a)
Littmann, S.; Schulte, E.; Acker, L. Beurteilung des hygienischen Zustandes von der Pasteurisierung über
das Muster der organischen Säuren, II. Das Säurenmuster in Eiprodukten in Abhängigkeit von der
hygienischen Situation. Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung and Forschung 1982, 175, 106112. (b)
Littmann-Nienstedt, S.; Beutler, H. O. Auswertung des Ringversuches der Arbeitsgruppe “Ei-Analytik”
zur Bestimmung von (L-)Milchsäure, 3-Hydroxybuttersäure und Bernsteinsäure in Eiprodukten.
Deutsche Lebensmittel Rundschau 1988, 84, 320-323.
134
Liu, H. W.; Zhu, T.; Zhang, Y. N.; Qi, S. Z., Huang, A. J.; Sun, Y. L. Determination of synthetic
colourant food additives by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A 1995, 718,
448-453.
Lodin, S.; Rossin, G. Determination of some organic acids in sugar factory products. Journal of
Chromatography A 1995, 706, 375-383.
Lopez, J. M.; Preston, T. R.; Sutherland, T. M. The effect of various additives on lactic acid production in
ensiled sorghum (sorghum vulgare). Tropical Animal Production 1976, 3, 25-29.
López-Grío, S. Micellar liquid chromatographic separation of amino acids using pre- and post-column ophthalaldehyde/N-acetylcysteine derivatization. Analytica Chimica Acta 2000, 418, 153-165.
Lück, E.; Pavlik, A. Veränderungen der freien Aminosäuren in Schalleneiern während der Lagerung.
Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung and Forschung 1963, 123, 282-293.
Matsunaga, A.; Oozumi, T. Degradation of polyphosphates during manufacture of surimi-base products.
Bulletin of Japanesse Society of Science Fischeries 1990, 56, 2077-2082.
Maynard, A, A.; Pangborn, R. M,; Roessler, E. B. Principles of Sensory Evaluation of Food. Academic
Press: New York 1965.
McDevitt, V. L.; Rodríguez, A.; Williams, K. R.. Analysis of soft drinks: UV Spectrophotometry, Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis. Journal of Chemical Education 1998, 75, 625-629.
Method Validation. http://www.labcompliance.com/methods/meth_val.htm.
Michaelsen, S.; Moller, P; Sørensen, H. Analysis of dansyl. amino acids in feedstuffs and skin by micellar
electrokinetic capillary chromatography. Journal of Chromatography A 1994, 680, 299-310.
Míková, K.; Davídek, J. Kritéria čerstvosti a kvality slepičích vajec. Czech Journal of Food Science 2000,
18, 250-255.
Míková, K.; Rosenberg, M., Krištofíková, L. Výroby technicky důležitých dikarboxylových kyselin.
Chemické Listy 2001, 95, 28-33.
Morris, C. E. Determination of uracil uridine and formic acid in egg products by HPLC. Journal of
Chromatography 1987, 394, 408-413.
Motooka, I.; Nariai, H.; Nakazaki, K.; Tsuhako, M. Determination of average chain length of linear
polyphosphates by isotachophoresis. Journal of Chromatography A 1983, 260, 377-382.
Motooka, I.; Nariai, H.; Nakazaki, K.; Tsuhako, M. Isotachophoresis of cyclic condensed phosphates.
Journal of Chromatography 1984, 295, 533-536.
135
Muchová, P. Diplomová práce, VŠCHT 2001.
Mulder, R.; Bolder. N. M.; Steverink, A. T. G.; Muuse, B. G.; Hartog, J. M. P. Production of succinic and
lactic acid by selected pure cultures of microorganisms in whole egg products. Archiv fuer
Gefluegelkunde 1988, 52, 255-261.
Mulin, J. W.; Emmons, D. B. Determination of organic acids and sugars in cheese, milk and whey by
high performance liquid chromatography. Food Research International 1997, 30, 147-151.
Musil, F. Mikrobiologie vajec a vaječných výrobků. SNTL: Praha 1956.
Nollet, M. L. Food analysis by HPLC. Marcel Dekker: New York 2000.
Nouadje, G.; Nertz, M.; Verdeguer, Ph.; Couderc, F. Ball-lens laser-induced fluorescence detector as an
easy-to-use highly sensitive detector for capillary electrophoresis Application to the identification of
biogenic amines in diary products. Journal of Chromatography A 1995, 717, 335-343.
Nouadje, G.; Siméon, N.; Dedieu, F.; Nertz, M.; Puig, Couderc, F. Determination of twenty eight
biogenic amines and amino acids during wine aging by micellar electrokinetic chromatography and
laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography A 1997, 765, 337-343.
Oguri, S.; Yokoi, K.; Motohase, Y. Determination of amino acids by high-performance capillary
electrophoresis with on-line mode in-capillary derivatization. Journal of Chromatography A 1997,
787, 253-260.
Ohmono, S.; Tanaka, O.; Kitamoto, H. K.; Cai, Y. Silage and microbial performance, Old story but new
problems. JARQ 2002, 36 (2), 59-71.
Panari, G. HPLC of organic acid: an aproach to cheese analysis. Milchwissenschaft 1986, 41, 214-216.
Pesek, J. J.; Matyska, M. T. Determination of aspartame by high-performance CE (HPCE). Journal of
Chromatography A 1997, 781, 423-428.
Petteri Piepponen, T.; Skujins, A. Rapid and sensitive step gradient assays of glutamate, glycine, taurine
and aminobutyric acid by HPLC with an emphasis on microdialysis samples. Journal of
Chromatography A 1997, 757, 277-283.
Pipek, P. Technologie Masa I. Karmelitánské nakladatelství: Praha 1998.
Polman, K. A novel method for isolating and analyzing organic acids in biological cultures. Applied
Biochemistry and Biotechnology 1995, 51/52, 519-525.
PrinCE Application note BIO-3: Amino Acids analysis by Capillary Electrophoresis and fluorescence
detection. 1997.
136
Pulliainen, T. K.; Wallin, H. C. Determination of Total Phosphorus in Foods by Colorimetric
Measurement of Phosphorus as Molybdenum Blue after Dry-Ashing: NMKL Interlaboratory Study.
Journal of AOAC International 1994, 77, 1557-1561.
Pulliainen, T. K.; Wallin, H. C. Determination of Total Phosphorus in Foods by Colorimetry: Summary
of NMKL Collaborative Study. Journal of AOAC International 1996, 79, 1408-1410.
Razee, S.; Tamura, A.; Masujima, T. Improvement in the determination of food additive dyestuffs by CE
using b-cyckodextrin. Journal of Chromatography A 1995, 715, 179-188.
Richardson, A. J.; Calder, A. G.; Stewart, C. S.; Smith, A. Simultaneous determination of volatile and
non-volatile acidic fermentation products of anaerobes by capillary gas chromatography. Letters in
Applied Microbiology 1989, 9, 5-8.
Reijenda, J. C.; Verheggen, Th. P. E. M.; Everaerts, F. M. Simultaneous determination of organic and
inorganic acids and additives by capillary isotachophoresis using UV and a.c. conductivity detection.
Journal of Chromatography 1982, 245, 120-125.
Rodriguez, I.; Lee, H. K.; Li, S. F. Y. Separation of biogenic amines by micellar electrokinetic
chromatography. Journal of Chromatography A 1996, 745, 255-262.
Rossi, M.; Pompei, C.; Hidalgo, A. Freshness criteria based on physical and chemical modification
occurring in eggs during aging. Italian Journal of Food Science 1995, 2, 147-156.
Royle, L.; Ames, J. M.; Castle, L.; Nursten, H. E.; Radcliffe, C. M. Identification and Quantification of
Class IV Caramels using capillary electrophoresis and its application to soft drinks. Journal of Food
Science and Agriculture 1998, 76, 579-587.
Sabah, S.; Scriba, G. K. E. Determination of aspartame and its degradation and epimerization products by
capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 1998, 16, 1089-1096.
Sekiguchi, Y.; Matsunaga, A.; Yamamoto, A.; Inoue, Y. Analysis of condensed phosphates in food
products by ion chromatography with an on-line hydroxide eluent generator. Journal of
Chromatography A 2000, 881, 639-644.
Shamsi, S. A.; Danielson, N. D. Ion chromatography of polyphosphates and polycarboxylates using a
naphtalenetrisulfonate eluent with indirect photometric and conductivity detection. Journal of
Chromatography A 1993, 653, 153-160.
Shamsi, S. A.; Danielson, N. D. Ribonucleotides electrolytes for capillary electrophoresis of
polyphosphates and polyphosphonates with indirect photometric detection. Analytical Chemistry
1995, 67, 1845-1852.
137
Shimazu, Y.; Watanabe, M. Determination of organic acid in grape must and wine by high performance
liquid chromatography. Journal of Society of Brewing 1981, 76, 418-423.
Schneider, A.; Gerbi, V.; Redoglina, M. A rapid HPLC method for separation and determination of major
organic acids in grape musts and wines. American Journal of Enology and Viticulture 1987, 38, 151155.
Schwarzenbacher, R. High performance of liquid chromatography of carboxylic acid. Journal of
Chromatography 1982, 251, 339-358.
Simeonovová, J.; Míková, K.; Kubišová, S.; Ingr, I. Technologie drůbeže, vajec a minoritních živočišných
produktů. MZLU: Brno 1999.
Sobu, Y. M., Yamanaka, H., Netto, J. Z. Separation of organic acids from orange juice by TLC. Ecletica
Quimica 1995, 20, 95-100.
Stadelman, W. J. Quality preservation of shell eggs, Egg Science and Technology. AVI Publ. Co.:
Westport 1986.
Steiner, W.; Mueller. E.; Froehlich, D.; Battaglia, R. HPLC analysis of carboxylic acid as p-nitrobenzyl
esters in fruit juices and wine. Mitteilungen aus dem Geiete der Lebensmitteluntersuchung und
Hygiene 1982, 75, 37-50.
Stijve, T.; Diserens, J. M. Simplified Method for the Routine Determination of Organic Acids in Eggs
and Egg Products. Deutsche Lebensmittel Rundschau 1987, 83, 44-47.
Stover, F. S. Cationic capillary isotachophoresis of proteins. Journal of Chromatography 1988, 445, 417423.
Stover, F. S.; Keffer, S. S. Separation of condensed phosphates using capillary zone electrophoresis with
indirect UV detection. Journal of Chromatography A 1993, 657, 450-454.
Stover, F. S.; Bulmahn, J. A.; Gard, J. K. Polyphosphate separation and chain length characterization
using minibore ion chromatography with conductivity detection. Journal of Chromatography A 1994,
688, 89-95.
Stover, F. S. Capillary electrophoresis of longer-chain polypphosphates. Journal of Chromatography A
1997, 769, 349-351.
Stover, F. S. Capillary electrophoresis of phosphorous oxo anions. Journal of Chromatography A 1999,
834, 243-256.
Stover, F. Applications of capillary electrophoresis for industrial analysis. Electrophoresis 2000, 11, 750756.
138
Strein, T. G.; Poeschmann, J. L.; Prudenti, M. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography in the
Undergraduate Curriculum: Separation and Identification of the Amino Acids Residues in an
Unknown Dipeptide Using FMOC. Journal of Chemical Education 1999, 76, 820-825.
Svoboda, L.; Schmidt, U.; Simgle-column ion chromatography of linear polyphosphates. Journal of
Chromatography A 1997, 767, 107-113.
Šilhánková, Z. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Victoria Publishing: Praha 1995.
Špička, J.; Helclová, Z. Využítí dialýzy při izotachoforetickém stanovení kyseliny benzoové a sorbové.
Potravinářské vědy 1995, 13, 399-402.
Ježek, J.; Suhaj, M. Application of capillary isotachophoresis for fruit juice authentication. Journal of
Chromatography A 2001, 916, 185-189.
Šustáček, V.; Foret, F.; Boček, P. Selection of the background electrolyte composition with respect to
electromigration dispersion and detection of weakly absorbing substances in capillary zone
electrophoresis. Journal of Chromatography A 1991, 545, 239-248.
Svoboda, L.; Schmidt, U. Single-column ion chromatography of linear polyphosphates. Journal of
Chromatography A 1997, 767, 107-113.
Tagliaro, F.; Manetto, G.; Crivellente, F.; Smith, F. P. A brief introduction to capillary electrophoresis.
Forensic Science International 1998, 92, 75-88.
Takeshi Fukushima; Jen-Ai Lee; Takanori Korenaga; Hideaki-Ichihara; Masaru Kato; Kazuhiro Imai.
Simultaneous determination of D-lactic acid and 3-hydroxybutyric acid in rat plasma using a columnswitching HPLC with fluorescent derivatization with 4-nitro-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazone
(NBD-PZ). Biomedical Chromatography 2001, 15, 189-195.
Terweij-Groen, C. P.; Kraak, J. C. Ion-pair phase system for the separation of carboxylic acids, sulphonic
acid and phenols by high pressure liquid chromatography HPLC. Journal of Chromatography 1977,
138, 245-266.
Thompson, C. O.; Trenerry, V. C.; Kemmery, B. Micellar electrokinetic capillary chromatographic
determination of artificial sweeteners in low-Joule soft drinks and other foods. Journal of
Chromatography A 1995, 694, 507-514.
Tcherkas, Y. V.; Denisenko, A. D. Simultaneous determination of several amino acids, including
homocysteine, cysteine and glutamic acid in human plasma by isocratic reversed-phase-highperformance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A 2001,
913, 309-313.
139
Tcherkas, Y. V.; Kartsova, L. A.; Krasnova, I. N. Analysis of aminoacids in human serum by isocratic
reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of
Chromatography A 2001, 913, 303-308.
Tomofumi Santa; Taizo Okamoto; Seiichi Uchiyama; Kazumoto Mitsuhashi. A new fluoregenic reagent
for carboxylic acid, 7-acetylamino-4-merkapto-2,1,3-benzoxadiazone (AABD-SH), derived from an
empirical method for predicting fluorescence characteristic. The Analyst 1999, 124, 1689-1693.
Trenerry, V. C. Development of capillary electrophoretic methods for food analysis. Seminars in Food
Analysis 1998, 3, 309-338.
Trout, G. R.; Schmidt, G. R. Effect of phosphate type and concentration, salt level and method of
preparation on binding in restructured beef rolls. Journal of Food Science 1984, 49, 687-694.
Urbánek, M; Blechová, L.; Pospíšilová, M.; Polášek, M. On-line coupling of capillary electrophoresis and
capillary zone electrophoresis for the determination of flavonoids in methanolic extracts of
Hypericum perforatum leaves of flowers. Journal of Chromatography A 2002, 958, 261-271.
Urquiza, M. P.; Beltrán, J. L. Determination of dyes in foodstuffs by capillary zone electrophoresis.
Journal of Chromatography A 2000, 898, 271-275.
Valcárcel, M.; Arce, L.; Ríos, A. Coupling continuous separation techniques to capillary electrophoresis.
Journal of Chromatography A 2001, 942, 3-30.
Velíšek, J. Chemie potravin I. OSSIS: Tábor 1999.
Vodrážka, Z. Biochemie. Academia: Praha 1999.
Vyhláška č. 53/2002 Sb. Vyhláška ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví chemické požadavky na
zdravotní nezávadnost jednotlivých druhů potravin a potravinových surovin, podmínky použití látek
přidaných, pomocných a potravních doplňků. Sbírka zákonů 2002, částka 22.
Vyhláška MZe č. 124/2001 Sb. O požadavcích na odběr vzorků a principech metod laboratorního
zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsobu uchovávání vzorků. Sbírka zákonů 2001,
částka 50.
Vyhláška MZe č. 200/2003 Sb. Vyhláška o veterinárních požadavcích na vaječné výrobky.
Sbírka zákonů 2003, částka 72.
Vyhláška MZe č. 326/2001 Sb. Vyhláška Ministerstva zemědělství, kterou se provádí § 18 písm. a), d),
g), h), i) a j) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění
některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů, pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní
vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich. Sbírka zákonů 2001, částka 126.
140
Vorarat, S.; Aromdee, Ch.; Podokmai, Y. Determination of alpha hydroxy acids in fruits by capillary
electrophoresis. Analytical Sciences 2002, 18, 893-896.
Walker, J. C.; Zaugg, S. E.; Walker, E. B. Analysis of beverages by capillary electrophoresis. Journal of
Chromatography A 1997, 781, 481-485.
Wang, T.; Li, Sam F. Y. Separation of polyphosphates and polycarboxylates by capillary electrophoresis
in a carrier electrolyte contain adenosine 5´-triphosphate and cetyltrimethylamonium bromide with
indirect UV detection. Journal of Chromatography A 1996, 723, 197-205.
Wang, T.; Li, Sam F. Y. Separation of synthetic inorganic polymers of condensed phosphates by capillary
gel electrophoresis with indirect photometric detection. Journal of Chromatography A 1998, 802, 159165.
Wang, T.; Li, Sam F. Y. Separation of inorganic phosphorous-containg anions by capillary
electrophoresis. Journal of Chromatography A 1999, 834, 233-241.
Wang, M.; Qu, F.; Xiao-Quan Shan, Jin-Ming Lin. Development and optimization of a method for the
analysis of low-molecular-mass organic acids in plants by capillary electrophoresis with indirect UV
detection. Journal of Chromatography A 2003, 989, 285-295.
Waqlker, R.; Lupien, J. R. The Safety Evaluation of Monosodium Glutamate. Journal of Nutrition 2000,
130, 1049S-1052S.
Wei, M. C.; Chang, C. T.; Jen, J. F. Determination of organic acids in fermentation products of milk with
high performance liquid chromatography/on-lined micro-dialysis. Chromatographia 2001, 54,
601-605.
York, L. R.; Dawson, L. E. Organic Acid Accumulation in Egg Products Inoculated With Known
Bacterial Cultures. Poultry Science 1972, 51, 1244-1247.
Zimmer, E. Die Neufassung de Gärfutterschlüssels nach Flieg. Das Wirtschaftseigene Futter 1996, 12,
299-302.
141