8. Mikroskopické metody studia struktury a ultrastruktury buněk

8. Mikroskopické metody
8
1/9
Mikroskopické metody studia struktury a ultrastruktury buněk
• struktura buňky
• struktura cytoplazmy
• cytoskelet
• imunofluorescenční mikroskopie, fázový kontrast, interferenční mikroskopy, konfokální laserový skanovací mikroskop, NFOS, STM, AFM, SEM, TEM
8.1
Struktura buňky
Podle buněčné teorie (Schleiden a Schwann, 1839) jsou všechny živé organismy složeny z buněk. Podle vnitřní struktury rozlišujeme dva hlavní typy buněk: prokaryontní a
eukaryontní.
Struktura buněk prokaryontů je jednodušší a je tvořena jediným kompartmentem,
tzv. nukleocytoplazmatickou matrix. Oblast obsahující DNA (nukleotid) není zřetelně
oddělena od ostatní základní cytoplazmy. Eukaryonty, k nimž patří všechny vyšší druhy
rostlinných a živočišných buněk, vykazují mnohem složitější strukturu charakterizovanou
komplexní kompartmentací (buněčnými organelami). Hlavní příčina spočívá ve vyšší diferenciaci endoplazmatických membrán. Je zajímavé, že všechny buňky eukaryontů mají
přibližně stejné organely a rostlinné buňky se od živočišných liší v jejich zastoupení spíše
kvantitativně, než kvalitativně.
Základní buněčné organely:
Membránové organely s DNA
Jádro — kryté dvouvrstvou jadernou membránou s póry tvořenými speciálními bílkovinami (umožňují transport makromolekul). V jádře chromatin (DNA, RNA, histony proteiny o nízké molekulové hmotnosti) - euchromatin (rozmotaná DNA), heterochromatin (smotaná). Je navázáno na endoplazmatické retikulum. Caryotéka, caryoskelet, laminy
- na ně navázány makromolekuly DNA s bílkovinami. Jedno i více (až několik set) jadérek
- místo, kde se syntetizuje RNA.
Mitochondrie — tvořeny dvojitou membránou, jejíž vnitřní část zprohýbaná do tzv.
kryst (zvětšení reakční plochy a vytváří oddělené prostory pro různé chemické reakce).
Vnitřní prostor vyplňuje matrix. Vlastní DNA - semiautonomní organely. Probíhá zde
citrátový cyklus, respirační řetězec, oxidativní fosforylace a degradace mastných kyselin.
Plastidy — dvojitá membrána a vlastní DNA. Dělíme je na protoplasty (dosud nedozrále plastidy, z nich se tvoří další), leukoplasty (zásobní funkce - amylo-, proteo-,
oleoplasty), chromoplasty (barevné, chloroplasty, fenoplasty, atd.).
Další membránovité útvary
Cytoplazmatická membrána — spíše částí otázky 6.
Endoplazmatické retikulum (ER) — přímo navazující na nukleární obal jádra.
Jedná se o jednotlivou membránu, tvořící cisterny a váčky. Hladké retikulum - bez ribozómů, funkce syntézy lipidů a sacharidů. Hrubé ER s ribozómy, jehož funkcí je syntéza
bílkovin.
Golghiho aparát (GA) — membránovitá struktura, koláčky, placky na sobě. Navazuje na ER, z něhož jdou na GA proteiny. Produkty získané z ER jsou zde dále zpracovány.
Obsahují také lysosomy.
Vakuola — u rostlin, plní zásobní funkci.
8. Mikroskopické metody
2/9
Lysosomy — degradace látek, odstraňování cizích těles a buněčných struktur.
Nemembránové části buňky
Cytoplazma — vnitřní prostředí buňky
Cytoskelet — viz. dále.
Ribozomy — organely složené s RNA a bílkovin, v buňce jsou volně i přisedlé
k hrubému ER. Zodpovědné za syntézu bílkovin.
Buněčná stěna — u rostlin a hub.
Dělící vřeténko — mikrotubulární útvar vznikající v době dělení buňky.
Mikrotělíska (peroxizómy) — mají na starosti přeměnu aminokyselin a tuků na
cukry.
Inkluze — kapénkové nebo krystalické struktury, tvořené rezervními (glykogen, tuk,
bílkoviny) či odpadními látkami.
8.2
Struktura cytoplazmy
Základní cytoplazma představuje nitrobuněčné prostředí nezbytné jak pro existenci
buňky jako celku, tak pro činnost buněčných organel. Z hlediska molekulové struktury
představuje složitý disperzní systém obsahující jak analytické, tak koloidní složky. Součástí základní cytoplazmy jsou i jemné tabulární a vláknité útvary - mikrotubuly a mikrofilamenta, tvořící tzv. cytoskeletální systém. Základní cytoplazma přechází z tekutého
stavu sol (cytosol) do stavu gelu - hlavně v průběhu buněčných funkcí.
Složení: voda, anorganické látky, organické sloučeniny a biopolymery. Voda — hlavní
složka cytoplazmy, tvoří 70-85 %. Základní funkce vody v cytoplazmě:
• je rozpouštědlem anorganických i organických látek
• tvoří disperzní prostředí pro koloidní součásti cytoplazmy
• podílí se na transportu látek v buňce
• podílí se na vytváření osmotické rovnováhy uvnitř buňky
Anorganické složky a elektrolyty — nejvíce zastoupeny uhlík, vodík, kyslík, dusík,
síra a fosfor. Dále prvky nutné pro látkovou přeměnu a některé buněčné fyzikální procesy:
sodík, draslík, hořčík, vápník a chlór. Třetí skupinu tvoří stopové prvky, které často plní
úlohu koenzymů či jejich složek při biochemických pochodech: bór, fluór, jód, kobalt,
křemík, mangan, molybden, zinek a železo.
Elektrolyty — jsou sloučeniny, které ve vodě disociují na ionty. Jsou nezbytné jednak
pro metabolismus buňky, jednak pro vznik elektrických jevů v buňce. Největší důležitost
mají ionty draselné, hořečnaté, fosforečnanové, síranové, hydrogenuhličitanové a chloridové. Méně jsou zastoupeny sodné a vápenaté ionty.
Biopolymery — jsou představovány hlavně bílkovinami (10-20 %). Rozlišujeme dva
typy cytoplazmatických bílkovin: strukturní a globulární. Strukturní bílkoviny jsou přítomny v buňce především ve formě tenkých filament. Podílejí se na struktuře kontraktilního aparátu buňky. Globulární bílkoviny jsou rozpustné v cytoplazmě, jako enzymy
se účastní chemických reakcí. Lipdy (2 %) představují v cytoplazmě především zásobník
energie pro buňku. Sacharidy (asi 1 %) jsou taktéž zdrojem energie pro buňku. V menší
míře jsou v cytoplazmě obsaženy i nukleové kyseliny, zvláště RNA. Jsou však především
vázány na specifické cytoplazmatické struktury (jádro, ribozomy).
8. Mikroskopické metody
3/9
Optické vlastnosti: Základní cytoplazma dobře propouští viditelné světlo, nevykazuje žádnou specifickou absorpci, jeví se jako bezbarvá. Obsahuje-li pigmenty či chromofory, může vykazovat specifickou absorpci. V polarizovaném světle je izotropní (neobsahujeli vláknité struktury vykazující dvojlom). Průměrná hodnota indexu lomu kolísá mezi
1,38 a 1,44. Na rozdílech indexu lomu mezi základní cytoplazmou a cytoplazmatickými
strukturami je založena mikroskopická metoda fázového kontrastu. Mechanické vlastnosti:
Pevnost, či pružnost závisí na jejím koloidním stavu (gel pevnější, pružnější než sol).
Viskozita cytoplazmy: Je určována druhem a počtem vazeb mezi jejími stavebními
jednotkami, teplotou a složením vnějšího prostředí buňky. V průběhu některých buněčných funkcí se viskozita mění.
Povrchové napětí
Aktuální reakce: je obecně slabě kyselá (pH asi 6,8). Hodnota pH je poměrně stálá.
Cytoplazma se chová jako pufr, její pH se relativně rychle ustálí i při vnějším zásahu
(injekce kyselého či zásaditého roztoku).
V cytoplazmě lze pozorovat světelným mikroskopem oblasti homogenně opalescenční
hmoty — hyaloplazma, vyplňující prostor buňky v blízkosti cytoplazmatické membrány
a granuloplazmu, nacházející se v sousedství buněčného jádra a mající zrnitý charakter.
8.3
Cytoskelet
Speciálními imunofluorescenčními metodami lze v cytoplazmě prokázat složitý vláknitý
systém. Slouží k zajištění pohybu cytoplazmy a vnitrobuněčnému přenosu informace.
Tento systém se označuje jako cytoskelet.
Nejjemnější vlákna nesou název mikrofilamenta a jsou tvořena bílkovinnou aktinem. Průměr vláken 6 nm. Mají kontraktilní vlastnosti a polární strukturu. Hlavní funkce
mikrofilament je udržování tvaru buňky a zajištění jejího pohybu.
Mikrotubuly mají průměr vláken asi 22 nm a jsou tvořeny tubulinem. Tubulin má
dvě modifikace alfa a beta, které tvoří dimery spojené vodíkovými můstky. Dimery jsou
seřazeny do protofilament, přičemž 13 paralelně uložených protofilament tvoří vlastní
mikrotubulus. Mikrotubuly se snadno rozpadají na své podjednotky a zase se spojují.
Hrají důležitou roli při buněčném dělení, tubulin se stává součásti vřeténka. S velkou
pravděpodobností pak obnovují geometrii dceřinných buněk.
Intermediární filamenta mají průměr 8-11 nm. U epiteliálních buněk jsou tvořena
bílkovinou prokeratinem, u mezenchymálních buněk vimentinem a u svalových buněk cesmínem. Funkce není dosud zcela jasná, soudí se, že přispívají k celkové mechanické stabilitě buňky. Ze všech cytoskeletálních struktur jsou nejméně citlivé k působění fyzikálních
faktorů.
8.4
Metody mikroskopie
Rozlišovací schopnost lidského oka je jedna oblouková minuta, což odpovídá při pozorování z konvenční zrakové vzdálenosti bodům vzdáleným od sebe zhruba sedm setin
milimetrů. Použitím lupy lze tuto vzdálenost zmenšit řádově desetkrát. První mikroskop
byl zkonstruován v 16. století v Holandsku, dále zdokonalený v roce 1650 Anthony van
Leeuwenhoekem. Elektronový mikroskop byl zkonstruován ve třicátých letech 20. století.
Rozlišovací schopnost se tak posunula až na úroveň molekul a dnes jsme schopni pozorovat
s užitím tzv. tunelového mikroskopu i struktury atomární.
Pro mikroskopii lze v zásadě použít jakékoli vlnění, jehož vlnová délka je výrazně
kratší než rozměry objektu, který chceme pozorovat. Proto jsou pro mikroskopii vhodné
8. Mikroskopické metody
Obrázek 1: Schéma optické soustavy mikroskopu
4/9
F
i extrémně vysoké ultrazvukové frekvence (GHz). V případě použití elektronového mikroskopu uvažujeme vlnovou délku tzv. de Broglieových vln.
8.4.1
Optická mikroskopie
Základem optického mikroskopu jsou dvě soustavy čoček — objektiv a okulár. Obě
soustavy mají kladnou optickou mohutnost (v prvním přiblížení nahraditelné spojkami).
Objektiv vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz. Pozorovaný předmět musí být
umístěn mezi předmětovým ohniskem objektivu a jeho dvojnásobnou vzdáleností. Mechanická část spojující objektiv s okulárem se nazývá tubus. Obraz vytvořený objektivem je
pozorován okulárem, přičemž se musí nacházet těsně za předmětovým ohniskem okuláru.
Výsledkem je zvětšený, převrácený a neskutečný obraz (obr. ??).
Kondenzor je optická soustava, zajišťující dokonalé osvětlení zorného pole mikroskopu. Soustřeďuje světelné paprsky do místa, kde se nachází pozorovaný objekt. Některé
moderní, zejména fluorescenční mikroskopy mají v tubusu také čočku (mikroskopy s nekonečným optickým intervalem — Infinity Corrected Optics).
Celkové zvětšení Z mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu Zobj a okuláru
Zok :
Z = Zobj Zok =
∆d
,
fobj fok
(1)
kde d je konvenční zraková vzdálenost (0, 25 m), ∆ optický interval mikrokopu čili vzdálenost mezi obrazovým ohniskem objektivu a předmětovým ohniskem okuláru, fobj a fok
jsou příslušné ohniskové vzdálenosti.
Vhodnou kombinací čoček či použitím velmi silných okulárů by bylo možno vytvořit mikroskop s prakticky neomezeným zvětšením. Toto zvětšení by však neumožňovalo
rozlišit detaily (bylo by plané). Místo skutečných struktur by byly pozorovány ohybové
jevy a artefakty způsobené optickými vadami. Zvětšení je prakticky omezeno rozlišovací
8. Mikroskopické metody
5/9
schopností mikroskopu. Z výpočtů vycházejících z interference světelných paprsků po
průchodu strukturami zobrazovaného přemětu byla v 19. století Ernstem Karl Abbem
odvozena rozlišovací mez mikroskopu:
δ=
λ
,
n sin α
(2)
kde δ je mřížková konstanta (čili vzdálenost dvou vrypů mřížky, prakticky vzdálenost
dvou ještě rozlišitelných bodů), λ je vlnová délka použitého světla, n je index lomu
prostředí mezi čelem objektivu a krycím sklíčkem preparátu, α je úhel svíraný optickou
osou mikroskopu a pláštěm kužele, v němž se nacházejí paprsky, které z daného místa
preparátu mohou vstoupit do objektivu a podílet se na zobrazení. Výraz n sin α se nazývá
numerická apertura objektivu (NA).
Paprsek, který vystupuje z preparátu pod úhlem α se na rozhraní mezi krycím sklíčkem
a vzduchem láme od kolmice a nemůže se podílet na tvorbě obrazu. Při použití imerzního
prostředí (immergere — ponořit) v prostoru mezi čelem objektivu a krycím sklíčkem, které
představuje kapalina o stejném indexu lomu, jako má krycí sklíčko, se zvětší úhel α a omezuje
se možnost vzniku úplného odrazu světla na horní straně krycího sklíčka (přechod paprsků
z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího). Často se používá cedrový olej (n = 1, 52).
Při vyšším zvětšení je potřeba vyvarovat se otvorých vad objektivu, také se objevují
artefakty, které můžeme považovat za objekty.
Otvorová vada (též kulová či sférická) je způsobena tím, že objektiv není tvořen
dokonale tenkými čočkami. Navíc dochází ke značnému odchylování paprsku od optické
osy. Paprsky více odchýlené od optické osy jsou i více lámány. Bodový předmět je pak
zobrazen jako úsečka.
Barevná vada (též chromatická) je způsobena optickou disperzí, tj. závislost indexu
lomu na vlnové délce světla. Bodový předmět je zobrazován na různá místa optické osy
v závislosti na vlnové délce světla.
Vady lze korigovat kombinacemi vhodných spojných či rozptylných čoček z různých
materiálů o různém indexu lomu. Podle stupně korekce otvorové a barevné vady rozlišujeme zejména tyto objektivy:
Achromáty — korekce barevné vady (tj. objektiv má stejnou ohniskovou vzdálenost)
pro dvě barvy spektra, obvykle červené a modrozelené. Otvorová vada je korigována pro
světlo žluté.
Semiapochromáty — korekce barevné vady pro dvě barvy blíže k oběma koncům
viditelného spektra.
Apochromáty — korekce barevné vady minimálně pro tři barvy spektra. Otvorová
vada korigována pro dvě barvy. Nejdokonalejší objektivy pro pozorování v bílém světle.
Planachromáty a planapochromáty — korekce zklenutí zorného pole, které se
jinak projevuje nemožností zaostřit rovinný objekt současně v zorném poli mikroskopu.
Zvláštní význam pro mikrofotografii.
Podle účelu jsou vyráběny také různé okuláry:
Ortoskopické okuláry — přesně stejné zvětšení v celém zorném poli, vhodné k měřícím účelům.
Periplanatické okuláry — odstraňují astigmatickou vadu1 silněji zvětšujících objektivů.
Astigmatismus je způsoben nesouměrností lámavých ploch. Řez systémem, v níchž je optická mohutnost největší a nejmenší, jsou vzájemně kolmé2 a nazývají se meridiány. Rozdíl lomivosti v obou
hlavních řezech představuje tzv. astigmatický rozdíl. V jeho důsledku není ohnisko systému bodové,
nýbrž má tvar dvou úseček (tzv. fokály) vzájemně kolmých a posunutých vůči sobě. Viz. [1, str. 184]
1
8. Mikroskopické metody
6/9
Kompenzační okuláry — odstraňují zbytkovou vadu chromatickou.
Projektivy — používány při mikrofotografii.
Mikroskopy monokulární jsou tvořeny jediným okulárem. Binokulární mikroskopy
mají okuláry dva — pro pravé a levé oko, omezují tak zrakovou únavu. Světelný svazek
je v těchto mikroskopech rozdělen na dva pomocí hranolu zabudovaného v horní části
tubusu.
Při mikroskopii lze využít odraženého světla ze vzorku, kdy osvětlujeme vzorek ze
shora.
Při promítnutí paprsků zespoda pod určitým úhlem a odclonění paprků jdoucích podél
osy mikroskopu lze pozorovat preparátem rozptýlené paprsky. Rozptýlené světlo se jeví
jako světlé na temném pozadí — pozorování v temném poli.
Stereomikroskop využívá dva využívá dva samostatné objektivy a okuláry, tedy
v podstatě dva mikroskopy, jejichž optické osy spolu svírají určitý úhel, např. 15. Stereoskopické vidění je důležité u operačního mikroskopu, který nesmí navíc snímat
stranově převrácený obraz. Intenzivní světlo je přiváděno světlovody. Často je tento mikroskop vybaven možností plynulé změny ohniskové vzdálenosti objektivu čili zvětšení —
tzv. „zoomemÿ, takže při změně zvětšení není třeba znova zaostřovat.
Mikrofotografie na klasický fotografický materiál je dnes nahrazena digitálním přenosem obrazu na monitor. Vedle klasických úprav digitalizovaného obrazu (změna kontrastu,
jasu) rozšiřují možnosti mikroskopie numerické analýzy obrazu pomocí počítačů.
8.4.2
Speciální optické mikroskopy
Fluorescenční mikroskop využívá schopnost některých látek emitovat viditelné světlo
po ozáření světlem o kratší vlnové délce. Většinou se využívá dlouhovlnné UV záření a přilehlé oblasti viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami. Optika kondenzoru
musí být přizpůsobena požadavkům UV světla (křemenné sklo), přidány jsou také filtry
chránící lidský zrak před zbytkovým UV zářením. Fluorescenci vykazují např. aminokyselina tryptofan i jiné látky s aromatickým jádrem či heterocyklem. Výhodné je přidat
k preparátům speciální fluorescenční barviva (např. fluorochrom, fluorescenční sonda)
schopná specifické interakce s různými buněčnými strukturami. Při navázání fluorescenčního barviva na protilátku specifickou pro některou z bílkovin přítomných v cytoplazmě lze
selektivně zviditelnit např. složky cytoskeletu, chromatin, membránové bílkoviny, apod.
Fázově kontrastní mikroskop Při průchodu světelné vlny fázovým objektem nesledujeme změnu intenzity, nýbrž posun její fáze, a to v závislosti na rozdílu indexu lomu
dané struktury a jejího okolí, na délce optické dráhy i na vlnové délce světla. Mění se také
směr dalšího šíření vlny vlivem lomu, odrazu a rozptylu. Do přední ohniskové roviny kondenzoru je umístěna kruhová clona se zatemněným středem — světlo prochází jen úzkým
mezikružím. Paprsek projde vzorkem, dojde k odchýlení některých paprsků z původního
směru (ohyb, rozptyl, lom).
V zadní ohniskové rovině objektivu se nachází tzv. čtvrtvlnová destička (posunuje
fázi o +π/2 nebo −π/2). Tato destička má opět tvar mezikruží, na které dopadnou
především ty paprsky, které nezměnily svůj směr při interakci s fázovými objekty. Ostatní
paprsky čtvrtvlnovou destičku minou, nejsou tedy fázově posunuty. Interferencí paprsků
fázově posunutých i neposunutých je vytvářen obraz. Pozitivní fázový kontrast — fázově
posunuty jsou paprsky se změněným směrem šíření, fázové objekty se jeví jako tmavší vůči
svému pozadí. Negativně pozitivní kontrast — nevychýlené paprsky jsou fázově posunuty,
fázové objekty se jeví jako světlejší vůči svému pozadí.
8. Mikroskopické metody
7/9
Pomocí fázově kontrastnímu mikroskopu se lze vyhnout barvení pozorovaných objektů,
což je často u běžného optického mikroskopu nutné. Přítomnost barviva by mohla pro živý
systém znamenat zásadní změnu.
Interferenční mikroskop pracuje se dvěma koherentními světelnými svazky3 , znichž
jeden prochází pozorovaným objektem a druhý vedle něj. Interferencí těchto dvou oddělených paprsků vzniká obraz. Výhodou je možnost přímého měření indexu lomu.
U mikroskopu s diferenčním interferenčním kontrastem podle Nomarského (zkratka
DIC) preparátem prochází svazek polarizovaného světla, který je po průchodu objektivem rozštěpen na dva nepatrně vzájemně posunuté svazky pomocí dalšího polarizačního
filtru (nastává dvojlom). Takto jsou vytvořeny i dva vzájemně nepatrně posunuté obrazy,
navzájem „kolmo polarizovanéÿ. Místa, kde se plochy obrazů překrývají (s různým fázovým posunem), jsou vlivem interference zviditelněna změnou jasu (monochromatické)
nebo barevným obrysem (polychromatické světlo). Velmi citlivé i na velmi malou změnu
optické dráhy paprsků (optická dráha je součin indexu lomu a geometrické dráhy paprsku
v daném prostředí).
Polarizační mikroskop slouží ke zviditelnění opticky aktivní nebo dvojlom vykazující struktury. Vznikají spojením konvenčního mikroskopu a polarimetru4 , např. některé složky v cytoplazmě, nebo proudění cytoplazmy.
Mikroskop ultrafialového světla musí mít optiku z křemenného skla (proputnost pro UV
záření). Obraz nelze pozorovat okem, zviditelní se na luminiscenční stínítko. S ohledem na kratší
vlnovou délku bychom očekávali vyšší rozlišovací schopnost, která se v praxi nedostavuje. Umožňuje přímo pozorovat struktury, které propouští viditelné světlo, ale UV pohlcují (DNA, bílkoviny).
Laserový řádkovací konfokální mikroskop (též laserový řádkovací či skenovací konfokální mikroskop) je většinou osvětlován shora, pracuje s odraženým světlem a fluorescenčním
zářením. Světlo vychází z bodového zdroje (malý kruhový otvor ve cloně osvětlované laserovým světlem). Dále prochází polopropustným zrcadlem na čočku, která soustřeďuje paprsky
do ohniska v preparátu. Paprsky odražené z tohoto ohniska procházejí stejnou čočkou zpět na
polopropustné zrcadlo. Stejná čočka slouží jako objektiv i projektiv. Od polopropustného
zrcadla se světlo nesoucí o preparátu odráží na bodový otvor v další cloně předsazené citlivému
detektoru světla, obvykle fotonásobič. Optický systém je seřízen tak, že otvorem v této cloně
vlnění o stejné frekvenci, stejném směru kmitání, a stejnou fází.
Polarimetry měří stáčení roviny polarizovaného světla optickými látkami či jejich roztoky. Optickou
aktivitu vykazují opticky anizotropní krystaly, mající v různých směrech definovaných vůči krystalografickým osám různý index lomu, či roztoky organických látek s chirální strukturou (např. obsahující
asymetrický uhlík). Velikost úhlu stočení závisí na koncentraci a vlnové délce světla (optická rotační
disperze). Vhodné je použít zdroje monochromatického světla, nebo monochromatických filtrů. Světlo ze
zdroje dopadá na polarizátor (propouští jen lineárně polarizovanou složku), vyrobený např. z krystalu
islandského vápence vybroušeného do podoby Nicolova, nebo Glanova–Thompsonova hranolu. Levnější
jsou polarizační filtry (polaroidy) z organických polymerů. Světlo postupuje přes kyvetu s opticky aktivní
látkou do analyzátoru, který je obdobou polarizátoru. Analyzátorem lze otáčet a jeho poloha je indikována na stupnici polarimetru. Paprsky z analyzátoru jsou sledovány pomocí dalekohledu. U opticky
neaktivní látky všechny paprsky procházejí a vstupují do dalekohledu (světlé zorné pole), pravě když jsou
polarizační roviny polarizátoru a analyzátoru rovnoběžné. Jsou-li tyto dvě roviny na sebe kolmé, všechny
paprsky jsou v analyzátoru absorbovány (zorné pole je tmavé). U opticky aktivní látky hledáme takovou
polohu analyzátoru vůči polarizátoru, při níž je zorné pole dalekohledu osvíceno maximálně (nebo minimálně). v tomto stavu se odečítá úhel stočení. Polostínová metoda umožňuje sledovat rozhraní světlé
a tmavé plochy namísto jedné plochy odpovídající maximu (minimu). Viz. [1, str. 246]
3
4
8. Mikroskopické metody
8/9
projdou pouze paprsky, které se odrazily od bodových struktur v zaostřené rovině. Všechny
ostatní paprsky (rozptýlené preparátem nebo optickým systémem mikroskopu) jsou clony zachyceny. Právě tyto paprsky zhoršují kvalitu zobrazení v běžném mikrokopu, protože zvyšují
jas a snižují kontrast v celém zorném poli. Konfokálním mikroskopem lze pozorovat i poměrně
silné preparáty, včetně nativních. Řádkovací zařízení je systém otočných zrcadel, která mohou
posunovat ohnisko po těsně vedle sebe umístěných řádcích.
Konfokální mikroskop lze s výhodou upravit i pro fluorescenční mikroskopii. Preparát je
osvětlen laserovým světlem o kratší vlnové délce a snímáno je fluorescenční zařazení o vlnové
délce delší. Detektor je před budícím krátkovlnným světlem odstíněn vhodným barevným filtrem.
Podobně je chráněn i zdroj před dopadem fluorescenčního záření. Tento mikroskop má oproti
běžnému fluorescenčnímu mikroskopu lepší rozlišení, větší hloubku ostrosti a lze použít silnějších
preparátů.
„COSMIC Flying Spotÿ (COlour Scanning MICroscope) je barevný řádkovací mikroskop
„s letící stopouÿ. Místo mechanického řádkovacího systému je zde použito jasné bílé světelné
stopy přebíhající po řádcích na obrazovce osciloskopu. Obraz phybující se stopy je promítán
na preparát, kterým světlo prochází na kolektorovou čočku. Poté je světelný svazek rozložen na
třech odrazových barevných filtrech do tří barev (červená, zelená, modrá), které jsou samostatně
digitalizovány a použity pro konstrukci obrazu na obrazovce počítače. Hlavní výhodou je jednak
výborná rozlišovací schopnost, jednak pozoruhodný kontrast, kterého lze dosáhnout úpravou
jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu.
Optická skenovací mikroskopie v blízkém poli (near–field optical scanning microscopy,
NFOS). Velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátem a jsou měřeny jeho intenzity5 . Rozlišení je desetkrát až stokrát větší než u klasického světelného mikroskopu. Vzorky nemusí být ve vakuu (narozdíl od klasické elektronové mikroskopie), mohou být např. ve vodném roztoku, což je výhodné pro studium
biologických objektů.
Optická koherenční tomografie využívá ingračerveného světla o vlnové délce 1300 nm.
Původoní svazek je rozdělen do dvou svazků. Jeden z nich se odráží od zrcadla umístěného
v konstatní vzdálenosti od zdroje světla (svazek referenční). Druhý svazek je přiváděn optickým
vláknem endoskopické sondy se zrcadlem do vyšetřované tkáně. Různá hloubka odrazu tohoto
svazku vede k jeho různému fázovému posunu vůči svazku referenčnímu. Vyšší rozlišovací schopnost (10 µm) než vysokofrekvenční UV mikroskopické sondy, navíc nevyžaduje vazebné médium,
takže může být oddělena od vyšetřovaného povrchu tkáně vzduchem.
8.4.3
Elektronová mikroskopie
Elektronům lze přisoudit vlnovou délku, tzv. de Broglieovy hmotnostní vlny:
h
mv
(3)
1
eU = mv 2 ,
2
(4)
λ=
kde λ je de Broglieova vlnová délka, h Planckova konstanta, m relativistická hmotnost
elektronu, v jeho rychlost, e náboj elektronu, U urychlovací napětí mezi anodou a katodou
zdroje elektronů.
Otvorem v kovovém obalu skleněného hrotu, který má průměr 5 − 10nm, prochází úzký svazek argonového laseru. Tenký řez preparátu se pohybuje nad otvorem, kontrola vzdálenosti preparátu se děje
pomocí tunelového efektu. Detektor je umístěn nad preparátem.
5
8. Mikroskopické metody
9/9
Např. elektron o energii 1,5 eV má vlnovou délku 1nm.
Podobně jako u světelného mikroskopu, mají-li zobrazované předměty velikost srovnatelnou s vlnovou délkou, začne místo odrazu a lomu docházet
k ohybovým jevům, které zobrazení znemožní.
Vysokým urychlením elektronů lze dosáhnout ještě řádově 105 –krát kratších vlnových
délek. Rozlišovací schopnost mikroskopu vypočtená z rovnice (2) na straně 4 bude tedy
malá. Současně však vlivem velkých optických vad použitých čoček je poměrně malá i numerická apertura (NA) — řádově 10−2 . Chod elektronových paprsků lze ovlivňovat pouze
čočkami elektrostatickými nebo magnetickými. V elektronových mikroskopech jsou použity téměř výhradně čočky magnetické. V praxi mají elektronové mikroskopy rozlišovací
mez několik desetin nanometru, což odpovídá větším molekulám. Nelze používat čočky ze
skla ani jiného materiálu (využívá se magnetické čočky).
Skenovací tunelová elektronová mikroskopie ( scanning tunelling electron microscopy,
STM), nad povrchem preparátu se pohybuje velmi ostrý kovový hrot, ke kterému jdou
tunelovými jevy elektrony z povrchu preparátu. STM zobrazí elektronovou hustotu na povrchu s rozlišením na úrovni atomů. Není nutné vakuum, lze použít preparáty ve vodném
prostředí.
ATM atomic force microscopy, informace je získávána pomocí jehly, která kopíruje povrch vzorku. Rozlišení na úrovni molekul či atomů.
Rastrovací elektronová mikroskopie SEM (též skenovací nebo řádkovací, Scanning
Electron Microscope, SEM ). Velmi úzký elektronový paprsek, vychylovacím systémem je
nucen přejíždět povrch preparátu po řádcích. Dopadající elektrony se rozptylují do okolí,
případně vyrážejí jiné elektrony z povrchu preparátu. V blízkosti preparátu detektor.
Množství uvolněných elektronů závisí i na úhlu dopadu. Lze tak získat 3D „stínovanýÿ
obraz s velkou hloubkou ostrosti.
Rozlišení menší než u TEM o jeden až dva řády, ale možnost sledovat 3D strukturu.
Stejně jako u TEM lze využít pokovování vzorku, fixační metody jsou poměrně náročné.
TEM i SEM trpí artefakty vzniklými fixací a jinými úpravami vzorků.
Při ozáření vzorků elektronovými svazky vzniká charakteristické rtg. záření, kterého
lze využít pro chemickou analýzu vzorku. Výbava rentgenovými spektrometry u některých
SEM.
Transmisní elektronová mikroskopie TEM je založena na průchodu (transmisí)
fokusovaného elektronového svazku zkoumaným objektem. Rozbíhavý svazek z elektronového děla, kondenzorovou čočkou je soustřeďován na ultratenký preparát. Dojde k absorpci a rozptylu části svazku, což se projeví útlumem. Výsledný skutečný obraz na
luminiscenčním stínítku tvořen magnetickými čočkami objektivu a projektivu. Nutnost
ultratenkých řezů preparátu, nutnost přípravy ve vakuu, často využito pokovování. Pozorování nativních preparátů je tak vyloučené, pokud se nevyužije tzv. enviromentální
elektronový mikroskop, v nichž je preparát v prostředí o vysokém tlaku.
Akustická mikroskopie Vlnová délka hyperzvuk o frekvenci např. 1,55 GHz při rychlosti
šíření 1550 ms−1 činí 1 µm. Jedná se většinou o řádkovací mikroskopy. Metoda průchodová a
odrazová jsou krátce popsány v [1, str. 259].
8. Mikroskopické metody
10/9
Reference
[1] I. Hrazdira, V. Mornstein. Lékařská biofyzika a přístrojová technika, první vydání, Neptun, Brno, 2001
[2] V. Ptáček. Přednášky PřF:Bi5800 Buněčná biologie, Masarykova univerzita, jarní
semestr 2003
Poznámky
Strukturu buňky, složení cytoplazmy a cytoskelet lze nalézt v [1, str. 115-122], zde
napsaný text v podstatě kopíruje informace obsažené v knize, základní znalosti jsou doplněny z přednášek [2]6 .
Mikroskopické metody byly zpracovány z knihy [1, str. 249-259], opět zde podaný text
v podstatě kopíruje informace obsažené v knize, knížka prof. Hrazdiry a prof. Mornsteina
bude pro naučení otázky pravděpodobně stačit.
Vzhledem k tomu, že v knize [1] je dle mého názoru dostatek podkladů a text z přednášek prof. Ptáčka
doplňuje spíše středoškolské znalosti problematiky, k otázce bude bohatě stačit knížka prof. Hrazdiry a
prof. Mornsteina.
6