Devyser Resolution Návod k použití

Transkript

Devyser Resolution
Kat.č. 8-A012
Pro in vitro diagnostiku
Návod k použití
Devyser Resolution, Návod k použití, 7-A005-Cz, Jun-2012.
© Devyser AB 2012
Strana 1 z 28
NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE
This product is sold under the terms of an agreement between Devyser and Life
Technologies Corporation. The purchase of this product includes limited, nontransferable rights to use only the purchased amount of the product by the purchaser
solely for detection of inherited genetic disease for the purpose of human diagnostics. No other rights are conveyed. Further information on obtaining additional rights
for commercial use of intellectual property or products belonging to Life Technologies Corporation may be obtained by contacting [email protected]
© Devyser AB 2012
Strana 2 z 28
Obsah
Strana
1. Seznámení se systémem Devyser Resolution
4
2. Upozornění
5
3. Symboly použité na štítcích
6
4. Požadovaný materiál
7
4.1 Obsaženo v soupravě
7
4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě
7
5. Skladování a nakládání se soupravou
8
6. Požadavky na vzorek
8
7. Návod k použití
9
7.1 Postup zpracování Devyser Resolution
9
7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR
10
7.3 Detekce
11
8. Výsledky a analýza
13
9. Limitace požití
24
10. Reference
24
11. Upozornění zákazníkům
25
12. Kontaktní informace
25
© Devyser AB 2012
Strana 3 z 28
1. Seznámení se systémem Devyser Resolution
Použití
Souprava Devyser Resolution je in vitro diagnostický produkt pro
diagnózu aneuploidií chromozomů 13, 18, 21, X a Y.
Obsah soupravy
Souprava Devyser Resolution obsahuje reagencie připravené
k použití pro PCR amplifikace genetických markerů.
Postup
DNA extrakce – Souprava Devyser Resolution byla validována
s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51104)
pro extrakci DNA z lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp
DNA Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51304) pro extrakci DNA z biopsií
choriových klků.
Amplifikace - Souprava Devyser Resolution byl validován
s použitím přístrojů ABI GeneAmp® Systém 9600/9700/2720,
Eppendorf Mastercycler a MJ Research/Bio-Rad PTC200 s alpha
termoblokem pro 96 jamek.
Detekce – kompatibilní s genetickými analyzátory Applied
Biosystems (ABI PRISM® 310, 3100, 3130, 3500, 3730),
podporujícími barevnou sadu D.
Analýza dat – GeneScan® a GeneMapper®.
Princip metody QF-PCR analýza zahrnuje amplifikaci, detekci a analýzu krátkých
opakujících se sekvencí (STR) a konzervativních sekvencí. Pro
amplifikaci chromozom specifických sekvencí se používají
fluorescenčně značené primery, takže počet kopií každé
sekvence odpovídá počtu příslušných chromozomů.
Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí
automatického genetického analyzátoru. Relativní množství
každé alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu
píků, příp. jejich výšek. Normální diploidní vzorek obsahuje
příspěvek obou somatických chromozomů. Dvě alely chromozom
specifické STR sekvence jsou detekovány jako dva píky
v poměru 1:1, pokud je marker heterozygotní a jako jeden pík,
pokud
je
marker
homozygotní.
Detekce
další
alely
prostřednictvím tří píků v poměru 1:1:1 nebo jako dva píky
v poměru 2:1 resp. 1:2 znamená přítomnost další STR
sekvence,
která
může
znamenat
přítomnost
dalšího
chromozomu, jako je tomu u trizomie.
© Devyser AB 2012
Strana 4 z 28
2. Upozornění
A.
Devyser Resolution byl validován při použití celkového amplifikačního
objemu 25 µL. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným
výsledkům.
B.
Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních
zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry.
C.
Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné
šarže.
D.
Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou.
E.
Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky.
F.
Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou
reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro
amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci. Příprava reagencií a
extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební
materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se
přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru
používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové. Přístroje
ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci
DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory.
G.
Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace
musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním
materiálem.
H
Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované
rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a
reagenciemi si řádně omyjte ruce.
© Devyser AB 2012
Strana 5 z 28
3. Symboly použité na štítcích
Šarže
Exspirace
Výrobce
Počet testů
In vitro diagnostický medicínský prostředek
Skladujte při teplotě nižší nebo rovné
4. Požadovaný materiál
Kit
Katal.č.
Obsah soupravy
Devyser Resolution
8-A012
Devyser
Devyser
Devyser
Devyser
Devyser Resolution 21
8-A012-21
1x25 testů
8-A012-18
1x25 testů
8-A012-13
1x25 testů
Devyser Resolution XY
8-A012-XY
1x25 testů
© Devyser AB 2012
Resolution
Resolution
Resolution
Resolution
21
18
13
XY
Strana 6 z 28
4. Požadovaný material (pokrač.)
4.1 Obsaženo v soupravě
Konfigurace
Souprava Devyser Resolution obsahuje reagencie pro
analýzu maximálně 25 vzorků. Doporučuje se aktivovaný
reakční mix ihned po namíchání rozdělit do alikvotů. Před
rozplněním do zkumavek mix řádně promíchejte (viz sekce
7.1). Rozplňte po 20 μl a uložte při teplotě nižší, než –18ºC.
Vyvarujte se opakovanému rozmrazování.
Složky
Barva
víčka
Barva
Zkumavky
Štítek
Katal.č.
Obsah soupravy
Žlutá
Hnědavá
Devyser 21 PCR mix
4-A012
1x25 testů
Bílá
Hnědavá
Devyser 18 PCR mix
4-A013
1x25 testů
Oranžová
Hnědavá
Devyser 13 PCR mix
4-A014
1x25 testů
Červená
Hnědavá
Devyser XY PCR mix
4-A015
1x25 testů
Oranžová
Čirá
PCR Activator
4-A018
4x25 testů
4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě
Příprava reagencií



Plast pro termocykler
Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 10 µL*, 20
μL*, 100-150µL.
Nepudrované chirurgické rukavice
Extrakce DNA

Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční
soupravy.
Amplifikace


Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 5 μL*.


Inkubátor (suchý blok), termocykler s chlazením
Detekce

Termocykler: ABI GeneAmp® PCR System
9600/9700/2720 nebo Eppendorf Mastercycler nebo MJ
Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha
blokem.
Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM® 310,
3100, 3130, 3500, 3730).
Metodika je validovaná na polymerech: POP-4, POP-6 a
POP-7
© Devyser AB 2012
Strana 7 z 28
4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě (pokrač.)
Detekce
(pokrač.)




Gene-Scan-500 ROX Size Standard (ABI kat.č.401734/
#4310366).
Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu (ABI
kat.č.4311320).
1x Genetic Analyzer Buffer
Pipeta nebo dispenzor a špičkami s filtry pro 1,5 μL, 15 μL.*
Souprava pro barevnou kalibraci:
ABI3100/3130/3500/3730: Použijte DS-30 (Dye set D) Matrix Standard Kit (ABI katal.č.4345827).
ABI310:
Použijte: 6FAM™ (a), HEX (a), ROX™ (a) and NED™ (b).
Zvolte soubor modulu “GS STR POP4 (1 mL) D.md4”
(a): Fluorescent Amidite Matrix Standardy [6FAM™, TET, HEX,
TAMRA™, ROX™] (ABI cat# 401546)
(b) NED™ Matrix Standard (ABI cat # 402996)
*) Pipety musí mít přesnost ± 3% nastaveného objemu. Špičky
s filtry se používají jako prevence vzájemné kontaminace vzorků.
5. Skladování a nakládání se soupravou
A.
Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 oC.
B.
Reakční Master Mix může být uchováván při +2 až +8°C nejméně
7 dní a pod -18 °C až do data exspirace. Vyvarujte se
opakovanému rozmražování.
C.
Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR.
D.
Nemíchejte reagencie z různých šarží.
6. Požadavky na vzorek
Klinické
vzorky
Souprava Devyser Resolution je určena pro genomickou DNA
extrahovanou z plné krve, amniotické tekutiny a bioptických
vzorků z choriových klků.
Postup a
skladování
Dle pokynů výrobce.
© Devyser AB 2012
Strana 8 z 28
7. Návod k použití
Počet vzorků v
běhu
Každá souprava Devyser Resolution obsahuje reagencie pro
25 reakcí, které můžeme provést najednou, nebo postupně.
Doporučuje se zahrnout v každé analýze netemplátovou
kontrolu a pozitivní kontrolu. Abyste předešli kontaminaci,
vždy zavírejte nepoužívané zkumavky. Jakékoli zkumavky,
které jste nechali otevřené, vyhoďte.
7. 1 Postup zpracování Devyser Resolution
Reakční master mixy připravte ještě před přípravou vzorků, pokud provedete
celou metodu v jediném dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den,
připravte master mixy den následující.
Reakční Master Mix se připraví přidáním příslušného Devyser Resolution PCR Mixu
k PCR Activator
Devyser Resolution byl validován při použití celkového amplifikačního
objemu 25 µL. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným
výsledkům.
Prostor pro přípravu reagencií:
1. Určete počet vzorků, který budete analyzovat a připravte si příslušný počet zkumavek.
2. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte !
3. Přidejte 500 µL příslušného Devyser Resolution Mixu do
jedné zkumavky s PCR Aktivátorem. Označte zkumavku
podle přidaného mixu.
POZNÁMKA!>>
4. Ručně promíchejte opakovaným pipetováním ode dna
zkumavky. Zvortexujte zkumavky s reakčním Master
Mixem a krátce stočte. Samotné vortexování nestačí.
Reakční Master Mix je stabilní při +2-8°C nejméně 7 dní.
5. Napipetujte po 20 µL reakčního master mixu do PCR
zkumavek, příp. PCR stripu nebo destičky.
6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte.
7. Reakční Master Mix, připravený přidáním Devyser
Resolution Mixu (13, 18, 21 a XY) k PCR Activator,
může být uchováván při +2 až +8°C nejméně 7 dní a pod
-18 °C až do data exspirace. Vyvarujte se opakovaného
rozmražování.
© Devyser AB 2012
Strana 9 z 28
7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR
Extrakce DNA
Dle návodu výrobce. Pokud chcete použít jinou izolační
soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup
nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser
Resolution. Pro doporučené podmínky PCR a nastavení analýzy
je vhodné používat koncentraci DNA mezi 1 a 30 ng / PCR
reakci.
Přidání vzorku
V prostoru odděleném od prostor pro přípravu reagencií a
amplifikaci a detekci.
1. Přidejte 5 µl klinického vzorku (1-30 ng/PCR) a příslušné
kontroly do PCR zkumavek obsahujících reakční mix.
2. Zavřete zkumavky a krátce je stočte.
Amplifikace
Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler.
» Pro Eppendorf Mastercycler použijte mód “CNTRL TUBE”
» Pro GeneAmp® System 9700 nastavte “ramp speed” na
“9600 mode”.
» Pro MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha
blokem použijte funkci “Calculated vial temperature” a ramping mode (rychlost vyhřívání) “MAX”.
Amplifikační prostor:
Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího
teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace
o programování termocykleru):
95°C 15 min
94°C 30 sec; 58°C 90 sec; 72°C 90 sec for 26 cycles
72°C 30 min
4°C FOREVER
1. Nastavte reakční objem 25 µL.
2. Spusťte amplifikaci (délka cca 2 hodiny 45 minut).
3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z
termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Opatrně sejměte
víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem.
Amplifikovaný materiál nepřenášejte do před amplifikačních
prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a
detekčním prostoru.
© Devyser AB 2012
Strana 10 z 28
7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR (pokrač.)
Amplifikace (pokrač.)
Prvotní denaturace
95°C
15 min
Cyklování
Finální extenze
94°C
30 sec
72°C
72°C
90 sec
30 min
58°C
90 sec
Teplota prostředí
26 Cykly
4°C

7.3 Detekce
Příprava
vzorků
Řiďte se manuály pro příslušný analyzátor ABI PRISM®
ohledně údržby a nastavení přístroje. Než spustíte analýzu s
použitím soupravy Devyser Resolution, musí být analyzátor
nakalibrován na barevnou sadu D s příslušným polymerem.
Příprava vzorku pro ABI 310/ 3100/ 3130/ 3500/ 3730
1. Připravte nanášecí směs smícháním 3 µL velikostního
standardu (Gene-Scan-500 ROX) s 100 µL Hi-Di Formamidu
(směs stačí pro 6 jamek/zkumavek). .
2. Vortexujte 15 s.
3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých
zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí
směsi před vložením do analyzátoru.
4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/
zkumavky s ELFO nanášecí směsí.
5. Uzavřete destičku/zkumavky .
Příprava
přístroje
Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru
s následujícím nastavením:
» Sample ID.
» Zvolte velikostní standard: GS500(-250) ROX musí být
nastaven jako velikostní standard.
» Dye Set: D.
» Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a
přístroje.
© Devyser AB 2012
Strana 11 z 28
7.3 Detekce (pokrač.)
Run Modules
ABI 310
Run Parameters
Capillary length
POP-4
POP-6
47 cm
47 cm
Run temperature
60
60
Injection voltage
15
15
5-15
5-15
Injection time
Run voltage
Run time
15
15
40 min
65 min
POP-4
POP-6
POP-7
(ABI3130)
36 cm
ABI 3100/3130
Run Parameters
Capillary length
36 cm
36 cm
Run temperature
60
60
60
Injection voltage
2,5
2,5
2,5
Injection time
20
20
20
Run voltage
15
15
15
1700 s
3200s
1700 s
Run time
ABI 3500
Run Parameters
Capillary length
POP-7
50 cm
Run temperature
60 ˚C
Injection voltage
1,6 kV
Injection time
15 s
Run voltage
19,5 kV
Run time
1500 s
Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou
injekčního napětí a injekční doby.
© Devyser AB 2012
Strana 12 z 28
8. Výsledky a analýza
Principy
QF-PCR
Chromozom–specifické krátké opakované DNA sekvence (small
tandem repeats – STR) jsou amplifikovány PCR. Vizualizací
fluorescenčně značených primerů můžeme kvantifikovat PCR
produkty. Kvantifikace se provádí výpočtem plochy píku příslušné
STR pomocí automatického DNA sekvenátoru. STR se liší mezi
jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují trojice, čtveřice
nebo pětice nukleotidů. DNA amplifikovaná z normálního
heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí) pro
specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou
v daném rozsahu (viz obr. 8.1).
Obr. 8.1. Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1)
DNA amplifikovaná z trinomických jedinců vykáže buď další pík
(tři různé alely) se stejnou plochou (obr. 8.2), nebo jen dva píky
(dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu, než ten
druhý (viz obr. 8.3 a 8.4)
Obr. 8.2. . Trizomický troj-alelický marker (poměr ploch 1:1:1)
Obr. 8.3-4. Trizomický dvoj-alelický marker (8.3: poměr ploch
2:1; 8.4: poměr ploch 1:2)
Homozygotní jedinci (mají alely se stejnou délkou) nebo
monozomní vykážou pouze jeden pík (obr. 8.5).
Obr. 8.5 Homozygotní/monozomní marker
© Devyser AB 2012
Strana 13 z 28
8. Výsledky a analýza (pokrač.)
Principy QF-PCR
(pokrač.)
Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším
problémem pro testování abnormalit pohlavních
chromozomů. Pokud použijeme STR specifické pro
chromozom X, některé vzorky z normální ženy XX můžou
vykázat homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit
od vzorků s jediným X, jako při Turnerově syndromu.
Začleněním dalších STR markerů chromozomu X do analýzy
redukuje pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje
ji zcela.
Souprava Devyser Resolution XY řeší problém monosomie X
markerem 7X pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X a
obdobně markerem T2 pro relativní kvantifikaci chromozomu
X a 2. Pro normální ženu je poměr T2 i 7X 1:1 (obr. 8.6).
Pro normálního muže a ženu s monosomií X je typický
poměr 2:1 pro 7X a 1:2 pro T2 (obr. 8.7).
Obr. 8.6: Normální žena s poměrem ploch píků T2 i 7X 1:1
Obr. 8.7: Normální muž s poměrem T2 1:2 a poměrem 7X
2:1.
© Devyser AB 2012
Strana 14 z 28
Přehled markerů
Velikost
markeru
(bp)2
Název
Markeru
Pozice1
Markeru
21A
21q21.3
D21S1435
150 - 205
Modrá
21B
21q21.1
D21S11
220 - 285
Modrá
21C
21q22.3
D21S1411
256 - 353
Yellow
21D
21q22.13
D21S1444
438 - 494
Žlutá
21E
21q22.11
D21S2039
370 - 410
Žlutá
21F
21q22.2
D21S1412
386 - 449
Modrá
21G
21q22.3
D21S1446
430- 490
Zelená
21H
21q21.3
D21S1442
360 - 415
Zelená
21I
21q21.1
D21S1437
105 - 150
Žlutá
Barva fluoroforu
1. UCSC
2. Na základě zjištěných a vypočítaných rozměrech standardů. Mohou se objevit píky standardů mimo udávaný rozsah.
© Devyser AB 2012
Strana 15 z 28
Přehled markerů
Velikost
markeru
(bp)2
Název
Markeru
Pozice1
Markeru
18A
18p11.31
D18S391
190 - 230
Zelená
18B
18q12.3
D18S978
180 - 228
Žlutá
18C
18q12.3
D18S535
296 - 352
Žlutá
18D
18q22.1
D18S386
325 - 408
Zelená
18G
18q11.2
D18S1002
326 - 380
Modrá
18I
18q21.31
D18S858
360 - 415
Žlutá
18J
18p11.31
D18S976
430 - 487
Žlutá
Barva fluoroforu
1. UCSC
© Devyser AB 2012
Strana 16 z 28
Přehled markerů
Velikost
markeru
(bp)2
Název
Markeru
Pozice1
Markeru
13A
13q12.12
D13S742
232 - 327
Zelená
13B
13q21.32
- q21.33
D13S634
365 - 430
Modrá
13C
13q31.1
D13S628
425 - 474
Žlutá
13D
13q13.3
D13S305
413 - 490
Zelená
13E
13q22.1
D13S800
160 - 248
Žlutá
13F
13q12.2
D13S252
260 - 320
Modrá
13G
13q14.11
D13S325
312 - 417
Žlutá
Barva fluoroforu
1. UCSC
© Devyser AB 2012
Strana 17 z 28
Přehled markerů: Devyser Resolution XY
Velikost
markeru
(bp)2
Název
Markeru
Pozice1
Markeru
X1
Xq26.2
DXS1187
120 - 170
Zelená
X2
Xq13.1
DXS981
230 - 260
Zelená
X3
Xq26.2 –
q26.3
XHPRT
262 - 315
Žlutá
X4
Xq21.33
DXS6809
290 - 340
Modrá
X5
Xq25 26.1
DXS6854
392 - 430
Zelená
X6
Xq26
DXS8377
430 - 500
Modrá
X8
Xq21.31
DXS6803
100 - 140
Modrá
Y1
Yp11.31
SRY
235 (+/3bp)
Modrá
Y2
Yq11.223
DYS448
346 - 380
Modrá
XY1
Xp22.2
Yp11.2
AMEL-X
AMEL-Y
X = 105
Y = 111
(+/- 2,5 bp)
Zelená
XY2
Xq21.31
Yp11.31
DXYS267
180 - 222
Modrá
7X
7q34
Xq13
-
7 = 182
X = 202
(+/- 2bp)
Zelená
T2
Xq23
2p23.2
-
X= 114
2 = 118
(+/- 3 bp)
Žlutá
Barva fluoroforu
1. UCSC
© Devyser AB 2012
Strana 18 z 28
Provádění
analýzy
Při provádění manuální analýzy identifikujete píky markerů
v elektroforetogramu podle specifických velikostních rozpětí
markerů uvedených v seznamu markerů (strana 15-18). Pozor,
nastavení velikosti markerů se liší v závislosti na použitém elektroforetickém polymeru. Analýza dialelických markerů se provádí
kalkulací poměrů ploch píků (pík1/pík2). Pík1 je plocha píku
kratšího fragmentu, pík2 je plocha píku delšího fragmentu. Viz níže
– poměrová kritéria pro interpretaci.
Pro trialelické markery vždy výpočet začíná plochou nejkratšího
fragmentu (pík1), tj. pík1/pík2/pík3.
Homozygotní markery se označují jako neinformativní.
Poměrová kritéria (Ratio Criteria – RC)
Poměrové kritérium (RC) 1 se používá, když je vzdálenost píků <24bp
Poměrové kritérium (RC) 2 se používá, když je vzdálenost píků ≥24bp
Dialelické markery
Poměr
1:2
Neprůkazný
1:1
Neprůkazný
2:1
RC 1
<0,65
0,65-0,74
0,75-1,44
1,45-1,80
>1,80
RC 2
<0,65
0,65-0,74
0,75-1,54
1,55-1,80
>1,80
Trialelické markery
Poměr
Neprůkazný
1:1:1
Neprůkazný
RC 1
<0,74
0,75-1,44
>1,45
RC 2
<0,74
0,75-1,54
>1,55
Výškový poměr
Výškový poměr lze použít, když je poměr ploch hodnocen jako
"inconclusive" (neprůkazný). Použijí se stejná poměrová kritéria, jako pro výpočet
poměrů ploch.
© Devyser AB 2012
Strana 19 z 28
Interpretace
výsledků
Výsledek hodnotíme jako normální, pokud jsou alespoň dva
informativní markery v souladu s dialelickým genotypem,
ostatní markery jsou neinformativní.
Výsledek hodnotíme jako abnormální (trizomický), pokud
alespoň jsou alespoň dva informativní markery v souladu
s trialelickým genotypem, ostatní markery jsou
neinformativní.
Dialelický vzor je určen pomocí
Markerů se dvěma píky obdobné plochy/výšky, jejichž poměr
je hodnocen 1:1.
Trialelický vzor je určen pomocí
a) Markerů se dvěma píky odlišné plochy/výšky, jejichž poměr
je hodnocen 2:1 nebo 1:2.
b) Třemi píky obdobné plochy/výšky, kde je poměr píků
hodnocen jako 1:1:1.
Monosomie X je určena takto
a) Všechny markery X a XY mají homozygotní alelický vzor.
b) XY1 pík2 (Zelená , 108-113bp) a pík Y1 (Modrá , 233-238
bp) nejsou detekovány
c) Marker 7X ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde
je poměr píků hodnocen jako 2:1.
d) Marker T2 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde
je poměr píků hodnocen jako 1:2.
© Devyser AB 2012
Strana 20 z 28
Interpretace
výsledků
(pokrač.)
Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není
detekován, může to mít řadu příčin:
 Chromozomální mosaicismus











Částečná chromozomální trizomie
Stutter pík
–A pík (rameno píku)
Překryv barevného signálu mezi kanály
Elektroforetické spiky
Asymetrická amplifikace
Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony
Polymorfismus v oblasti nasedání primeru
DNA koncentrace je příliš vysoká, nebo příliš nízká.
DNA použitá v PCR je degradovaná.
Submikroskopické duplikace jednotlivých markerů.
Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace
sekvence AMEL-Y (XY1-Y) kvůli mutaci v místě nasedání
primeru.
Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace
sekvence 7X-X kvůli mutaci v místě nasedání primeru
Pokud jsou detekovány znaky pro normální i abnormální alelu
v jediném chromozomu, doporučujeme další testování pro
zjištění příčiny.
Pokud máme nekvalitní elektroforetogramy (výrazný přesah
signálu mezi kanály nebo elektroforetické spiky), neměli
bychom příslušná data interpretovat. PCR produkt můžeme
opakovaně nanést do analyzátoru a analyzovat znovu.
© Devyser AB 2012
Strana 21 z 28
Artefakty PCR
Stutter píky (obr. 8.8) jsou detekovány jako samostatné píky,
které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR
alela. Stutter píky můžeme zahrnout do do výpočtu poměru.
Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému
STR píku.
Obr. 8.8. Stutter pík je označen šipkou.
-A píky (obr. 8.9) jsou detekovány jako samostatné píky, které
jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou
(+A pík). –A píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů.
Obr. 8.9. –A a +A píky jsou vyznačeny šipkami
+A pík
-A pík
© Devyser AB 2012
Strana 22 z 28
Elektroforetické/ Během detekce může dojít k přesahu signálu mezi
Detekční
jednotlivými detekčními kanály. Vzniklé přesahující píky
artefakty
musí být z analýzy vyloučeny.
Obr. 8.10. Pík přesahující ze zeleného do modrého kanálu je
označen šipkou.
Elektroforetické spiky (obr. 8.11) se mohou v průběhu
detekce objevit jako ostré píky přítomné v několika
barevných kanálech. Píky vzniklé z elektroforetických spiků
musí být z analýzy vyloučeny.
Obr. 8.11. Elektroforetické spiky jsou orámovány.
© Devyser AB 2012
Strana 23 z 28
9. Limitace použití
A.
Použití soupravy je omezeno pro osoby vyškolené v PCR metodách.
B.
Souprava Devyser Resolution byla validována na cyklerech ABI
GeneAmp® 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler a MJ Research/
Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovou alpha blokem. Pokud chcete pro
klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace
soupravy Devyser Resolution pro tento cykler.
C.
Souprava Devyser Resolution je validována s izolačními soupravami
QIAamp DNA Blood Mini Kit pro extrakci DNA z plné lidské krve a
amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit pro extrakci DNA z biopsií
choriových klků. Další extrakční soupravy nebyly dostatečně
validovány a mohou vést k falešně negativním nebo falešně pozitivním
výsledkům.
D.
Souprava Devyser Resolution je určena pouze pro detekci specifických
chromozomálních aneuploidií dle návodu k použití. Souprava nebyla
testována pro detekci strukturálních změn, mozaiky ani abnormalit
v jiných, než uvedených chromozomech. Výsledky obdržené použitím
soupravy Devyser Resolution mohou být aplikovány pouze na tkáně
nebo specifické vzorky. Kontaminace mateřskými buňkami nebo
placentární mosaicismus můžou vést k nesouladu mezi výsledky
karyotypingu a výsledkům soupravy Devyser Resolution.
10. Reference
1.
2.
3.
CMGS Best Practice Guidelines for QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy
Hulthén, M et al. Reproduction (2003) 126, 279-297. ”Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorder: Advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR.
Nicolini, U et al. Human Reproduction Update. Vol 10, no.6 pp. 5, 2004. ”The
introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: Time for
reconsideration.
© Devyser AB 2012
Strana 24 z 28
11. Upozornění zákazníkům
Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser Resolution musí být interpretovány
s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta.
Devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí.
Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům
vlastněným třetí stranou.
12. Kontaktní informace
Devyser AB
Instrumentvägen 19
SE-12653 Hägersten
SWEDEN
Phone: +46-8-562 15 850
Homepage: www.devyser.com
Technická podpora
Phone: +46-8-562 15 850
E-mail: [email protected]
© Devyser AB 2012
Strana 25 z 28
© Devyser AB 2012
Strana 26 z 28
© Devyser AB 2012
Strana 27 z 28
© Devyser AB 2012
Strana 28 z 28

Devyser Resolution Návod k použití

Transkript

Podobné dokumenty

Návod k použití

1 Zápis ze schůze výboru Genetické společnosti Gregora Mendela

Hovorné telefony - Poliklinika Prosek

BlueGnome nabízí 26000 FISH prób lemujících lidský

My Document

Přehled laboratorních vyšetření OLG

Studium polymorfismu u vybraných populací smrku ztepilého Picea

Laboratorní příručka - genetická laboratoř

ŠVP 2009 - Gymnázium Rumburk