Část 3

Tkáňové inženýrství
a testování biokompatibility
polymerů
.
B. Dvořánková
Historie transplantací






2. st. př.n.l. – Čína – transplantace orgánů a štěpů
Indie – autologní kožní štěpy
3. st.n.l. – Kosmos a Damián – transplantace nohy
V roce 1668 popsal holandský lékař Job van Meereken
první úspěšnou transplantaci kosti - tkáňovým štěpem
získaným z lebky psa.
1. klinický přenos autologní kosti - 1820 v Německu
Alexis Carrel (1873 – 1951) - zakladatel cévní a
transplantační chirurgie. Zásoby tkání pro chirurgické
účely, vědecký základ metodám konzervací tkání.



Specializované tkáňové banky
30.léta 20.stol – Filatov - prvním transplantovaným
kadaverózním štěpem byla rohovka.
Začátek osmdesátých let - orgánové transplantace
Transplantace





Přenos živých buněk, tkáně nebo orgánu
z jedné části těla na jinou nebo z
jednoho jedince na jiného.
Transplantát – s vlastním cévním
zásobením
Štěp – bez cévního zásobení
Ledviny, srdce, játra, plíce, pankreas,
střevo, Langerhansovy ostrůvky
Kůže, krevní buňky, kostní dřeň
Transplantace
Autotransplantace – v rámci jednoho
organizmu
Syngenní (izo)transplantace –
jednovaječná dvojčata

U laboratorních zvířat imbrední kmeny
Alotransplantace – mezi geneticky
odlišnými jedinci v rámci druhu
Xenotransplantace – mezi jedinci dvou
různých druhů
Transplantace

Imunitní reakce příjemce proti
buňkám transplantátu

Hodně pacientů X málo orgánů
Imunita
Schopnost organizmu bránit se
proti antigenům – z vnějšího i
vnitřního prostředí
 Spouští imunitní odpověď
 Řídí ji imunitní systém

Imunitní systém


Zajišťuje integritu organizmu
Rozeznávání a odstraňování




nefunkčních složek organizmu – buňky
staré, mrtvé, nádorové, nemocné nebo tělu
cizí
parazitujících mikroorganizmů
cizorodých makromolekulárních látek
(proteiny, polysacharidy)
Obranyschopnost X autotolerance
Antigen



Molekula, na kterou je organizmus
schopen zareagovat specifickou imunitní
reakcí
Cizí
Vlastní – autoantigen
Většinou na ně nereaguje - imunotolerance
 Nadměrná reakce – poškození orgánů autoimunitní choroba

Prezentace antigenu - MHC

MHC I receptory – mají je všechny jaderné
buňky



prezentace cytosolických proteinů (peptidy buňce
vlastní + peptidy virů a bakterií žijících v cytosolu)
8-11 aminokyselin
receptory na povrchu Tc lymfocytů – rozeznávají
peptid i MHC receptor
aktiv. CD8+ T lymf.
MHC II receptory– 1.antigen-prezentující
buňky; 2. neprofesionální – epitelové,
endotelové b.


prezentace peptidů z prostředí mimo buňku
12-25 aminokyselin, vyšší citlivost
komplex antigenu s MHC II receptorem – aktiv.T
CD4+ lymfocytů
B-lymfocyty
T-lymfocyty rozpoznávají:



cizí antigeny v komplexu s vlastními
molekulami MHC, což vede k imunitní
reakci,
vlastní antigeny v komplexu s vlastními
molekulami MHC, což vede k toleranci,
cizí molekuly MHC (transplantační
reakce)
HLA typizace


HLA - Human Leukocyte Antigenes
Shoda v HLA antigenech mezi dárcem a
příjemcem i přes velký pokrok v
imunosupresivní léčbě je životně
důležitá pro transplantaci kmenových
buněk a má (stále) význam pro
dlouhodobé přežití transplantovaných
orgánů (ledviny, srdce, pankreas)
Tkáňové kultury

Jako buněčné kultury
jsou označovány
rostlinné, živočišné nebo
lidské buňky pěstované
mimo organizmus v
laboratoři.

Tato technika je
nazývána in vitro.
Tkáňové kultivace


Vědecké – biologický a lékařský výzkum
Výroba vakcín, očkovacích látek; výroba
biofarmak
vakcína proti vzteklině, očkovací látka proti obrně

Testování léčiv či materiálů pro klinické využití
možnost částečného nahrazení pokusů na zvířatech

Diagnostické
kultivace lymfocytů při karyotypizaci krevních buněk

Terapeutické

Tkáňové inženýrství
Buňky






normální buňky
nádorové buňky
kmenové buňky
multipotentní
buňky
primární kultury
buněčné linie
Interakce buněk s okolím

2D kultivace




3D kultivace




tkáňový polystyren
sklo
potažený povrch
proteinové sítě
polymerní sítě
ECM – matrigel, vyrobené
buňkami
neadhezivní povrchy sféry
Vzájemné ovlivňování buněk




Přímá kokultura
více buněčných
typů
Insertový systém
Kondiciovaná
média
Migrační testy
Biokompatibilita materiálu


biokompatibilita – snášenlivost látek zejm.
materiálů v biologickém prostředí;
biokompatibilní materiál se posuzuje podle
interakce s prostředím, zejm. podle
cytotoxického působení, podle toxikologických
a alergických reakcí, podle karcinogenních,
teratogenních či mutagenních reakcí, podle
vlivu na infekční procesy, podle rozsahu a
kvality biodegradace. Důležité je, aby
materiál neovlivňoval např. koagulace,
nevyvolával zánětovou reakci, neuvolňoval
potenciálně toxické látky apod.
Velký lékařský slovník
Biokompatibilita materiálu

Biokompatibilita je schopnost
materiálu fungovat ve specifické
aplikaci a vyvolat přiměřenou
odpověď hostitele
http://web.mit.edu/murj/www/v11/v11-Features/v11-f5.pdf
Testování biokompatibility

In vitro – testování cytotoxicity



– přímý – není bariéra mezi buňkami a materiálem
- agarový difuzní test – netestuje strukturu a
povrch
- eluční test
Nezohledňuje interakci materiálu s ostatními
buňkami v lidském těle


In vivo – materiál je implantován do
zvířecího těla - podle cílového využití u
člověka volba zvířete
Testování materiálu u člověka
Přímý test cytotoxicity



Výběr vhodných buněk
Jejich kultivace v přítomnosti materiálu
Hodnocení jejich růstu ve srovnání s kontrolou
- MTT test
Studium adheze a
proliferace vhodných
buněk na povrchu
polymerních materiálů
Hydrofobní/hydrofilní
Reliéf povrchu
Povrchové napětí –
kontaktní úhel
Přítomnost určitých
skupin
PTFE, povrch ošetřený
plazmovým výbojem,
naroubován PEG 300
Kmenové buňky

embryonální kmenové buňky


dospělé kmenové buňky






v průběhu embryonálního vývoje
cirkulující kmenové buňky – separace z krve
kostní dřeň
pupečníková krev
tkáň amniového vaku
tuková tkáň
indukované pluripotentní buňky
Kultivace buněk pro léčbu:



Náhrada epidermis
Náhrada chrupavky
Mezenchymové kmenové buňky



Kostní dřeň
Periferní krev
Pupečníková krev
Kůže




Největší orgán
lidského těla
Průměr 1,7 m2
Dvě hlavní vrstvy –
epidermis a dermis
Léčba rozsáhlých
kožních ztrát
představuje závažný
lékařský problém
Anatomia del corpo humano Juan
Valverde de Amusco (Rome, 1560)
Funkce lidské epidermis

Ochranná funkce




Metabolická funkce



mechanický úraz
ztráta tekutin
invaze patogenů
produkce vitaminu D, cytokinů a
interleukinů
termoregulace
Estetická funkce
Rozsáhlé popáleninové trauma
Popáleniny I.stupeň
II. stupeň
III. stupeň
Nutno hodnotit hloubku
termického úrazu i jeho
rozsah
Epidermis – není vaskularizovaná
- buňky jsou vyživovány difuzí přes bazální membránu
- pouze jeden buněčný typ – keratinocyty – dostačuje
pro její rekonstrukci
In vitro kultivace keratinocytů
- první lidský orgán připravený v laboratoři (Rheinwald
and Green), v klinické praxi použit poprvé v r. 1981
- určeno pro rozsáhle popálené pacienty s nedostatkem
odběrových míst
Kultivace keratinocytů I





autologní štěpy – jsou schopné vytvořit
trvalý kryt
léčba kožních ztrát v plné tloušťce
odběr - dermo-epidermální štěp 2-5 cm2
minimální doba přípravy cca 3 týdny
možno připravit tisíce cm2 epidermálních
štěpů
Kultivace keratinocytů II


allogení štěpy – nejsou schopné vytvořit trvalý
kryt
využívá se jejich stimulační účinek na hojení:






popáleniny IIa stupně
odběrové plochy
trofické defekty
otestovaní dárci – zbytková kůže z plastických
operací
zásoba zmražených buněk v kapalném dusíku
minimální doba přípravy 10-12 dní
Kultivované štěpy na textilním nosiči




velmi nízká úspěšnost přihojení
vysychání transplantovaných buněk
častá mikrobiální kontaminace štěpu z ranné
plochy
enzymatické odvolnění štěpu snižuje viabilitu
transplantovaných buněk
Vyvinout nový způsob
přípravy kultivovaných
epidermálních štěpů
Nový způsob kultivace keratinocytů



kultivace buněk a jejich aplikace přímo na
polymerním nosiči
kultivační podložka (nosič) by měl tvořit
optimální kryt pro transplantované buňky
vyloučení feedrových buněk z kultivačního
systému
Tkáňové inženýrství
Na přípravu nosiče pro kultivaci keratinocytů
byl vybrán
polyHEMA hydrogel
poly(2-hydroxyetyl metakrylát)
-ve vodném prostředí tvoří
hydrogel (35-40% vody)
-dlouhodobé zkušenosti s
využitím v medicíně
- kontaktní čočky
Krok 1 – vytvořit podmínky pro adhezi a
proliferaci buněk na povrchu hydrogelu
preinkubací
hydrogelového nosiče
v bovinním séru
dojde k sorpci
bílkovin na jeho
povrchu
Integra - schema



popáleninová
medicína
rekonstrukční
chirurgie
traumatologie
Integra - aplikace
Tvorba neodermis
Transplantace plochy
Výhody Integry






rychlé překrytí
velkých ploch
nedochází k rejekci
čas pro další
transplantace
DE štěpy 0,l - 0,2 mm
kosmetický a funkční
efekt
Integra“roste“ s
pacientem
Náhrada chrupavky

umělá chrupavka a kostní
implantáty vypěstované na
podložkách z buněk pacienta
samotného nebo z buněk
kostní dřeně


Autologní chondrocyty + Tissucol –
náhrada patelly
Contipro-group – lešení z kyseliny
hyaluronové






průhledná kopulovitě
zakřivená, dokonale čirá,
lesklý povrch
neprocházejí žádné cévy
součást opt. prostředí láme paprsky, filtruje UV
záření, +/- 43 dioptrií
ochrana proti vnějším
vlivům
vyživa - výměškem
slzného aparátu a
komorovou vodou
mnoho nervových
zakončení, citlivá na
dotyk, podráždění
Rohovka (cornea)
Rohovkový epitel - 5-6
vrstev buněk, stálá
regenerace
Endotel !!!
Zkalení rohovky, ztráta průhlednosti
Příčiny : poranění, poleptání, zánět (vrůstání cév),
glaukom, zvýš. obsah vody (protržení Descemetské m.
nebo endotelu) a další
Transplantace
rohovky
1905 Olomouc
Oční banky – skladování rohovek
Úspěšnost 90-95%

Keratoplastika – štěp z mrtvého dárce
 perforující – 7-8 mm, našití na mateřskou
roh.



přední lamelární keratoplastika
zadní lamelární keratoplastika
Laserové operace – jen určitá vrstva
Umělá rohovka
Komerčně dostupné rohovkové náhrady – keratoprotézy
AlphaClar – pHEMA - 2005
KeraKlar – rohovka není odstraněna v celé tloušťce
riziko poop.komplikací
jednodušší provedení - ambulantně
Schopnost akomodace v rozsahu 10 – 17 D,
věkem se snižuje (na 2D až 0,5D)
Zákal čočky
Šedý zákal - katarakta
Intraokulární čočka
Původně hydrofóbní, nyní
hydrofilní polymerní materiály –
hydrogely
Přesná dioptrická hodnota
Implantace do oka - náhrada
čočky při šedém zákalu