Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.

Transkript

Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.
Prokaryontní/eukaryontní geny
VýbČr a identifikace
genu pro pĜípravu
Ĝí
rekombinantního
p
proteinu
PĜíprava mRNA plné délky RACE
• Pokud je znám pouze fragment cDNA, mRNA
• U eukaryontních mRNA
• Na 5’ konci mRNA se nachází metylaþní þepiþka
• Na 3’konci polyA
• systém
té gene RACE
• kyselá pyrofosfatáza (TAP)
• Prokaryontní geny jsou bez intronu
• Pro klonování není nutné pracovat s mRNA
• Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace
genomické DNA
g
• Eukaryontní geny jsou mnohem složitČjší
• Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepĜekládané oblasti
• PĜi izolaci genu se nejþastČji pracuje s cDNA
• PĜipravena reverzní transkripcí mRNA izolované z bunČk
• Odpadá komplikované hledání a eliminace intronĤ
• NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
PĜíprava mRNA plné délky RACE
Optimalizace kodonĤ
Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.
• Exprese cizorodých (virových) proteinĤ neþekanČ nízká
• Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než
hostitelská buĖka
• DĤsledek - buĖka nemá dostatek nČkterých
ý tRNA p
pro translaci p
proteinu
• možnost optimalizace kodonĤ (codon optimization)
• analýza pomoví www aplikací (in silico analýza)
• k aa sekvenci se pĜiĜadí nová cDNA , aby pomČrné zastoupení tRNA
odpovídalo hostitelské buĖce
• cDNA lze pĜipravit
• cílenou mutagenzou
• pĜipravit sunteticky buć celou nebo þást
• VýtČžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho
Ĝádu
• Kodonová
K d
á optimalizace
ti li
mĤže
Ĥž zefektivnit
f kti it napĜíklad
Ĝíkl d i DNA vakcinaci
k i
i
Izolace RNA
PĜíprava
p a a na
a izolaci
o ac RNA
RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor
– nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buĖkami
roztoky (DEPC,
(
C certifikované
f
chemikálie od dodavatelĤ)
Ĥ)
laboratorní materiál
plast
l t ((chloroform
hl f
-2h
hod;
d 0
0,1
1 – 0,02
0 02 % DEPC ddH2O – 2 h
hod)
d)
(0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod)
(certifikovaný plast
plast, novČ otevĜené balení standardního plastu)
sklo (mytí jako pro tkánČ, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h
Guanidinová
Gua
d o á metoda
e oda izolace
o ace totRNA
o
RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor
– nutno jje denaturovat v p
prvním kroku manipulace
p
s buĖkami
Resuspendovat bb. v denaturaþním roztoku (10 ml/1g bunČk)
guanidin thiocyanate
4M
(efektivní denaturace proteinĤ, RNA solubilní)
citrát sodný
25 mM pH7
N-lauroylsarcosine
0.5 %
2- ME
0.1 M
tČsnČ pĜed použitím (1.8 ml)
pĜidat CH3COONa na finální 100 mM
pĜidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku)
pĜidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C
Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi
laboratorní pĜístroje (þistota
(þistota, RNAzap,
RNAzap chloroform)
centrifugace a pĜenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce
laboratorní pracovník (þistota, organizace práce, rukavice)
precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu
rozpuštČní pelety v DEPC
DEPC-ddH
ddH2O
Guanidinová
Gua
d o á metoda
e oda izolace
o ace totRNA
o
RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor
– nutno jje denaturovat v p
prvním kroku manipulace
p
s buĖkami
SmČs všech komponent (kromČ chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem
mnoha komerþnČ dostupných kitĤ
Isogen
soge ((Nippon
ppo Ge
Gene)
e)
RNA-Stat 60 (Tel-Test)
RNAzol B ((Cinna Scientific))
Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim)
TRI Reagent (Molecular Research Center)
TRIzol Reagent (Life Technologies)
SDS
S
S+p
proteináza
o e á a K - izolace
o ace RNA
Izolace cytoplasmatické RNA z tkáĖových kultur
BuĖky v PBS centrifugovat
Peletu resuspendovat v lyzaþním pufru , 0°C
50 mM Tris-Cl, pH 8.0
100 mM NaCl
5 mM MgCl2
0.5% (v/v) Nonidet P-40 (rozpouští bunČþnou membránu)
pĜipravit pomocí DEPC-H2O
Centrifugace a supernatant do nové zkumavky
PĜid t SDS na fifinálních
PĜidat
ál í h 0
0,2
2 % ((w/v)
/ ) a zamíchat
í h t (denaturace proteinĤ)
PĜidat proteinázu K na fin. 0,1 mg/ml, 37°C, 15 min (digesce proteinĤ)
PĜidat ekvivalentní objem P-Ch-IAA,
P Ch IAA protĜepat,
protĜepat centrifugace
centrifugace,
Když je interfáze objemná nahradit organ fázi Ch-IAA, protĜepat, centrifugovat
Precipitace RNA z vodní fáze doplnČním na 0,3M
0 3M CH3COONa + 70% EtOH
Resuspendovat RNA v DEPC-ddH2O uložit -70°C
LiCl
C izolace
o ace totRNA
o
z rostlinné
os
é tkánČ
á Č
Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy
Aktivované silikagelové kolony umožĖují purifikaci RNA pomocí
guanidinových pufrĤ s promČnnou koncentrací solí (Qiagen)
Izolace RNA z tkání s vysokým obsahem polysacharidĤ
TkáĖ rozdrtit v tekutém dusíku
PĜidat lyzaþní pufr, (pH 8.2 pomocí HCl) 0°C
0 18 M Tris
0.18
0.09 M LiCl
4.5 mM EDTA
1% SDS
PĜidat 1/3 objemu fenolu (ekvilibrovaného lyzaþním pufrem pĜed pĜidáním
SDS)
Homogenizovat, pĜidat ¼ objemu chloroformu, homogenizovat, 20 min, 50°C
Centrifugace a pĜenos vodní fáze (obsahující RNA) do nové zkumavky
Reextrakce F-Ch (až do vymizení interfáze) (3x), naposledy jen Ch (odstraní fenolu)
PĜidat LiCl na finálních 2M a precipitovat RNA 12 hod, 4°C
Promytí 2M LiCl, resuspendace v DEPC-H2O a reprecipitace v 2M LiCl
Resuspendovat finální RNA peletu v DEPC-ddH2O
Izolace
o ace NK po
pomocí
oc výmČnné
ý Č é chromatografie
c o a og a e na
a
anexu
DEAE
RNA
Purifikace NK iontovČ výmČnnou chromatografií
na anexu
DEAE aktivovaný silikagel - vazba DNA ovlivnČna pH a koncentrace solí
vazba
promývání
eluce
Purifikace NK iontovČ výmČnnou
chromatografií na anexu
Izolace RNA
savþí
þí RNA (Qiagen)
(Qi
)
Izolace RNA pomocí silika
silika-kolony
kolony RNeasy
VýtČžek totRNA (ȝg) max 100 ȝg
Zdroj
Bb. kultura ((1 x 106 bb.))
NIH/3T3
HeLa
COS-7
LMH
Huh
10
15
35
12
15
Myš/potkan tkáĖ (10 mg)
Embryo
b yo ((13
3d
dní))
Ledviny
Játra
Slezina
Th
Thymus
Plíce
Kvasinkovité houby (1 x
S cerevisiae
S.
25
5
20–30
40–60
30–40
40 50
40–50
10–20
107
bb.)
25
f
fungální
ál í RNA
Uložení
U
o e RNA a p
protekce
o e ce p
pĜi e
enzymatické
y a c é
manipulaci
Po izolaci je RNA rozpouštČna ve
H2O
pĜi -20°C mĤže dojít k degradaci bČhem nČkolika hodin
formamid
vhodné pro dlouhodobé uložení (- 80°C)
pĜed reakcemi s enzymy nutno formamid Ĝedit na max. koncentraci
5%, jinak zvyšuje stringenci, (jakoby reakce probíhala pĜi vyšší
teplotČ z pohledu hybridizaþních podmínek)
EtOH precipitát
pĜi -20
20°C
C až -80
80°
pĜed použitím pĜidat CH3COONa (pH5,2) na finální koncentraci 0.3M, precipitovat
peletu zpracovat jako obvykleykle
Rostliny (100 mg listĤ)
Arabidopsis
Maize
Tomato
Tobacco
35
25
65
60
Využití inhibitorĤ RNáz
Placentarní inhibitor RNáz – pracovní koncentrace (25
( to 50 U/ml)
/ )
PCR
C metoda
e oda izolace
o ace a a
amplifikace
p ace DNA
úseku
Výchozí materiál
Amplifikaþní techniky
pĜi izolaci DNA
p
1. mRNA - reverzní transkripce
2. genomická DNA
PCR amplifikace
1. pĜesná polymeráza proof reading
2 podmínky
2.
d í k PCR reakce
k se liší tteplotou
l t extenze
t
a teplotou
t l t hybridizace
h b idi
3. celkovČ þasovČ nároþnČjší
4 pro další manipulaci je tĜeba vnést PCR produkt do vektoru
4.
PCR
C návrh
á
p
primerĤ
eĤ
PCR návrh primerĤ
http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
PCR návrh primerĤ
http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
PCR
C metoda
e oda izolace
o ace a a
amplifikace
p ace DNA
Základní
á
í vlastnosti DNA polymeráz
á použitých
ž ý pro amplifikaci
f
MDA (multiple displacement amplification) DNA
1. genomická DNA pomocí fágové I29 DNA polymerázy
2. 1 z 106í107 chyb ve srovnání s Tag, 3’- 5’proofreading aktivita
MDA a
amplifikace
p ace DNA úse
úseku
u
multiple displacement amplification
3. amplifikace úsekĤ 7 – 10 kb
Výchozí materiál
4. primery hexamery modifikované thiofosfátem na 3’konci
1. genomická DNA
2. randomizované primery
MDA - multiple displacement amplification
DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Práce s g
genovými
ý a
proteinovými
databázemi
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Práce
áce s ge
genovými
o ý ap
proteinovými
o e o ý da
databázemi
abá e
Transformace
prokaryontních
p
y
bunČk
Chemická transformace E. coli
• velmi efektivní
• standardnČ používaná ve vČtšinČ laboratoĜí
• nízké náklady na provedení
• vyhĜívaná lázeĖ nebo kádínka s 42°C vodou je jediný pĜístroj
•p
pĜíprava
p
chemicky
y kompetentních
p
bunČk
•CaCl2
•RbCl
•CCMB80 ((KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl
g 2)
• vlastní transformace spoþívá v pĜidání DNA ke kompetentním buĖkám
• krátká inkubace - dochází k adhezi DNA na povrch bunČk
• tepelný šok (42°C, 30-90 min) (DNA vstupuje do buĖky)
• preinkubace bunČk v LB médiu (37°C, 1 hod)
• vyoþkování na tuhé selekþní pĤdy
Elektroporace
p
E. coli
• doþasná destabilizaci bunČþné membrány
navozené elektrickým pulsem
• možnost pĜipravit kompetentní bakterie
pĜedem
• bakteriální
b kt iál í suspenze ve sterilní
t il í vodČ
dČ pĜi
Ĝi
teplotČ tání ledu
p
bakterií v 10%
• uchování kompetentních
vodném roztoku glycerolu pĜi -80°C.
• podmínky elektroporace
• elektrický puls pĜes elektroporaþní
kyvetu s kompetentními buĖky
a DNA
Peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D:600 =
0,3; 10 pg DNA; pĜedchlazené
elektroporaþní kyvety 0,1 cm štČrbina; 25
PF; 1800 V; 200 . Transfekþní úþinnost
dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli
na 1 Pg DNA.
• koncentrace bunČk
• množství DNA
• velikost
lik t elektroporaþní
l kt
þ í kyvety
k
t
• elektrické napČtí
•kapacita
•pĜípadnČ odpor a prĤbČh pulsu
Metody transfekce savþích bunČk
Chemické metody
Transfekce
eukaryontních bunČk
•DEAE-dextran
DEAE dextran
•CaPO4
•Elektroporace
•Nukleofekce
•Liposomální transfekce
•Gene
G
gun
•Virové vektory
DEAE-dextran transfekce
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
kultivace bb. na Petriho miskách
nasadit bb. na koncentr. 2.104bb/cm2 a kultivovat v kult. mediu tak, aby zaplnily 75%
plochy misky
pĜipravit transfekþní médium DDD (na 1 cm2 ~ 100ml DDD)
DDD transfekþní médium:
DMEM obsahující 2.5% FCSI
100 mM
Chloroquine ( zásobní roztok 100mM)
1mg / ml
DNA (rozpuštČná v TE objem maximálnČ 1% DDD)
100mg / ml
DEAE-dextran (zásobní roztok 10 mg/ml v 1xPBS)
zahĜát na 37°C
složky pĜidávat za trvalého míchání v uvedeném poĜadí
odsát médium z kultivaþních misek (jamek)
okamžitČ nahradit DDD médiem a inkubovat 4 hod
hod. a co 5 min míchat krouživým
pohybem
stanovit bunČþnost
zahĜát 10% DMSO/PBS na 37°C
odsát transfekþní médium
pĜidat 2-3 objemy zahĜátého 10% DMSO/PBS
inkubovat 2 – 10 min
odsát DMSO/PBS a promýt 1xPBS (stejný objem jako 10% DMSO/PBS )
odsát a nahradit standardním množstvím complete medium obsahujícího10% FCSI
kultivovat dle potĜeby
Elektroporace savþích bunČk
• buĖky se pĜipravují bezprostĜednČ pĜed elektroporací
• promýváním v elektroporaþním pufru
1. RPMI 1640
2. RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM dithiothreitol
3. 1 x PBS
S
4. 15 mM HEPES pufr
5. elektroporaþní pufr 272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný,
pH
H 7,4,
7 4 1 mM
M MgCl
M Cl2
6. pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM CH3CO2K, 20 mM KOH,
pH 7,4
7 hypoosmolární elektroporaþní pufr
7.
CaPO4 transfekce savþích bunČk
precipitát CaPO4 a DNA vzniká za pomalého míchání HEPES pufru s roztokem CaPO4
a DNA
den pĜedem nasadit bb v exponenciální fázi rĤstu do 10 cm Petriho misek
precipitace DNA EtOH a resuspendování pelety v ddH2O a pĜidat CaPO4 na finální
0.25mM
• 500 P
Pl 2xHeBS do 15 konické zkumavky
y a ppĜidat DNA/CaPO4 ((10-50Pg)
Pg) po
p kapkách
p
•
•
HEPES-buffered saline (HeBS) roztok
16.4 g NaCl (0.28 M final)
11 9 g HEPES (0.05
11.9
(0 05 M final)
0.21 g Na2HPO4 (1.5 mM final)
800 ml H2O
Titrovat na pH 7.05 pomocí 5 N NaOH
PĜidat H2O do 1 litru
Sterilizovat filtrací 0.45-um nitrocellulózový filtr
Test transfekþní úþinnost
Uložit -20
20°C
C v 50-ml
50 ml aliquots
•
•
•
•
•
zamíchat na vortexu
precipitace 20 min za laboratorní teploty
opatrnČ po kapkách pĜidat na kultury bunČk v Petriho miskách
Inkubace 4 -16 hodin CO2 inkubátor
odsát médium a pĜidat þerstvé médium
Nukleofekce bunČk
Nukleofekce bunČk
Nukleofekce bunČk
Lipoplexy
p p y
Polyethyleniminy
y y
y
Liang et al, 2006; PNAS
Zanta et al, 1997; Bioconjugate Chemistry
Nanopartikule
p
lipidové
p
Virové transfekþní systémy
y
y pro
p
produkci transgenu
Efektivní infekce / transfekce pro urþité typy bunČk
receptorový mechanismus infekce cílové buĖky
• vakcínie
• EBV
• lentiviry
• adenoviry
• adenoasociované viry
• SV40
Zuber et al, 2003; Angew. Chem. Int. Ed.
Virové transfekþní systémy
y
y pro
p
produkci transgenu
Efektivita transfekce bunČk daná limitací velikosti inzertu –
p
sbalení DNA do virového ggenomu a
omezení dáno schopností
nikleokapsidy
• SV40
6 kb
• retroviry
2,5 kb integrace do genomu buĖky (Int)
• adenoviry
adeno ir
vstup
st p do b
buĖky
Ėk prostĜednict
prostĜednictvím
ím C/AR (Non-Int)
(Non Int)
• ssAAV
5 kb doba pro syntézu dsDNA nČkolik týdnĤ (Int)
• dsAAV
2.5 kb (1.2 kb)
okamžitý nástup exprese (Int)
• alfaviry
nejintenzivnČjší transientní exprese (Non-Int)
• vakcínie
20 kb (extranukleární)
Stabilita plasmidu a
transgenu v buĖkách
Homologní
g rekombinace,,
episom, ATB selekce
Episom - DNA element, který se mĤže replikovat nezávisle na replikaci
chromozomu (stejnČ jako plasmid), nebo se mĤže integrovat do chromozomu a
p
spoleþnČ
p
s chromozomální DNA. Po opČtném
p
vystĜižení
y
zde se replikovat
z chromozomu existuje jako cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i
geny pocházející z chromozomu.
F faktor - fertility (nebo sex) faktor umožĖuje pĜenos genetického materiálu
z jedné E. coli, která F faktor obsahuje (F+, samþí, dárcovská) do druhé, která F
faktor neobsahuje (F-, samiþí,
samiþí pĜíjemcovská) pĜi procesu zvaném konjugace
konjugace.
plasmid
episom
souþást bakteriálního chromosomu (Hfr - High freq. of recombination).
F plasmid tak jak byl pĤvodnČ popsán má délku témČĜ 105 párĤ bází.
Antibiotická
b o c á se
selekce
e ce p
prokaryot
o a yo
Název
Ampicillin
Pracovní
( / l)
(mg/ml)
50 - 100
Chloramfenikol
v metanolu
20
Gentamycin
15
Kanamycin
30
Tetracyklin v
70% etanolu
12
Mechanismus pĤsobení
Mechanismus rezistence
Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli,
inhibuje syntézu stČny potlaþením tvorby
pĜíþných
p
ý vazeb mezi ppeptidoglykany
p
gy y
Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu
interakcí s 50S podjednotkou ribozomu a
inhibuje reakci peptidyltransferázy
E-laktamáza hydrolyzuje ampicillin dĜíve
než se dostane do buĖky
Chloramphenikol acetyltransferáza
inaktivuje chloramphenikol
Baktericidní; inhibuje proteosyntézu
Aminoglykosid acetyltransferáza a
interakcí s L6 proteinem 50S podjednotky aminoglykosid nukleotydil transferáza
rybozomu
inaktivuje gentamicin; mutace v rplF brání
vazbČ gentamicinu
Baktericidní, inhibuje proteosyntézu,
Aminoglykosid (neomycin)
inhibuje translokaci a vyvolává poruchy
fosfotransferáza, aminoglykosid
þtení tripletĤ
acetyltransferáza a aminoglykosid
nukleotydil transferáza inaktivuje
gentamicin a kanamycin
Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu
Aktivní eflux tetracyklinu z buĖky
brání ve vazbČ aminoacyl tRNA na místo
A ribozomu
F faktor,
a o,Fp
plasmid
as d
V praxi minimalizovaná verze
geny zámČrnČ vnesené do F plasmidu (nebo F episomu)
ori místo pro zahájení replikace
rep gen kódující replikázu
par segregaþní geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a
ccd (ccd stands for coupled cell division) geny
vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nČjž je plasmid udržován
v následujících
j
g
generacích a dále napĜíklad
p
g
gen kódující
j Ȧ fragment
g
EE
galaktozidázy umožĖující D komplementaci.
XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq ǻ(lacZ)M15].
F' = bakterie, potomek kmene, v nČmž do chromozomu integrovaný F faktor
uvolnil i s nČkolika chromozomovými geny a dále je ve formČ episomu.
[Geny získané z chromozomální DNA]
þást transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklin
proAB - Ȗ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinu
represor laktózového
l któ
éh operonu lacI,
l I
gen kódující Ȧ fragment E-galaktozidázy ǻ(lacZ)M15.
Satelitní
Sa
e
kolonie
oo ep
pĜi se
selekci
e c a
ampicilinem
pc e
Transientní/permanentní
p
transfekce
bunČþná linie / efektivita transfekce / množství proteinu / kvalita proteinu
Systémy s transientní expresí transgenu
• plazmidové vektory
• att technologie klonování a pĜenosu DNA
• virové vektory (vakcínie životnost bunČk jen 1-2 dny)
Systémy
y
y s permanentní
p
expresí
p
transgenu
g
• plazmidové vektory
• linearizované
i
i
é vektory / cirkulární
i
á í vektory
• S/MAR elementy
Transientní expresní
p
systémy
y
y
Efektivita
e v sys
systémĤ
é Ĥ je ovlivnČna
ov v Č
• dosažitelnou úþinností transfekce
• poþtem kopií genu na buĖku
• intenzitou exprese a proteosyntézy
• screening expresních vektorĤ pĜed selekcí stabilnČ
transfekovaných
ý klonĤ
• rychlý screening efektu mutací na funkci proteinu
• izolace genu z cDNA knihovny - monitorováním
aktivity produkovaného proteinu
• retrovirové vektory
Transientní expresní
p
systémy
y
y
Stabilní - p
permanentní expresní
p
systémy
COS b
buĖky
Ėk z lledvin
d i Af
African
i
green monkey.
k
• selekce bunČk s integrací plazmidové DNA do genomu
• získány tranformací origin-defektivním SV40.
• COS exprimují
p
j SV40 velký
ý tumor ((T)) antigen
g nezbytný
y ýk
zahájení replikace virové DNA na SV40 ori.
• replikace mediovaná SV40 T antigenem mĤže amplifikovat
plasmidy obsahující SV40 ori >100,000 v buĖce
• vysoká úroveĖ exprese z transfekované DNA.
• nehomologní
h
l
í rekombinace
k bi
• kotransfekce dvČma nezávislými plasmidy v buĖce ligovány a následnČ integrovány
• když
y kotransfekce nízká nutno ligovat
g
in vitro
• þetnost integrace je u jednotlivých bb. linií individuální
Selekþní markery používané pro
kultury savþích bb. linií -
Bicistronické p
plasmidy
y
permanentní expresní systémy
dominantní selekce
• G418 – Tn5 neomycin fosfotransferáza
• selekce 3 – 4 týdny
• hygromycin - hygromycin fosfotransferáza
• blasticidin – bls gen puromycin – puromycin fosfotransferáza
• selekce bČhem nČkolika dnĤ
recesivní selekce
• eenzymy
y y purinové
pu ové a py
pyrimidinové
d ové b
biosyntetické
osy tet c é kaskády
as ády
• využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ
Amplifikace
p
transfekované DNA
Selekþní marker
gen
Recesivní selekþní markry
y pro
DHFR, dihydrofolate reductase;
CAD, carbamoyl-phosphate synthetase, aspartate
transcarbamoylase, a dihydroorotase;
Adenosine, alanosine, and 2'deoxycoformycin
Adenosine deaminase
Adenine azaserine,
Adenine,
azaserine and coformycin
Adenylate deaminase
b-aspartyl hydroxamate or albizzin
Asparagine synthetase
PALA
Aspartate
transcarbamolyase
Methotrexate
Dihydrofolate reductase
TK, thymidine kinase;
Methionine sulfoximine
Glutamine synthetase
ADA, adenosine deaminase;
Cadmium
Metallothionein
PNP, purine nucleoside kinase;
a-difluoromethylornithine
Ornithine decarboxylase
AK, adenosine kinase;
M lti l drugs
Multiple
d
P l
P-glycoprotein
t i 170
APRT adenosine
APRT,
d
i phosphoribosyltransferae;
h h ib l
f
6-azauridine or pyrazofuran
UMP synthetase
Mycophenolic acid
Xanthine-guanine
phosphoribosyltransferase
HGPRT, hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase;
Biosyntetická dráha purinĤ
SHMT, serine hydroxymethyl transferase;
TS, thymidylate synthetase;
methotrexát
IMPDH, inosine-monophosphate dehydrogenase.
Abbreviations used for enzymes involved in salvage
pathways:
XGPT, E.
XGPT
E coli
li xanthine-guanine
thi
i
phosphoribosyltransferase. Other abbreviations:
FH, tetrahydrofolate; xyl A, 9-b-D-xylofuranosyl adenine
Recesivní selekþní markery
yp
pro
Recesivní selekþní markeryy p
pro
hostitelská buĖka musí být deficientní v selekþní vlastnosti
recesivní selekce
• enzymy purinové a pyrimidinové biosyntetické kaskády
• využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ
• deficientní bb. linie
vČtšinou jde o purinovou a pyrimidinovou biosynthetickou dráhu
když je de novo syntéza purinĤ a pyrimidinĤ inhibována buĖky využívají alternativní dráhy (thymidin kináza, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferáza, adenine phosphoribosyltransferáza, adenosine kináza) ke pĜemČnČ nukleotidových prekurzorĤ
buĖky deficientní v enzymech alternativních drah pĜežívají když za normálních podmínek = de novo
syntéza kde je nezbytná dihydrofolate reduktáza a aspartát transkarbamyláza
1. když je de novo syntéza inhibována (methotrexate) buĖky deficientní v alternativní d. hynou;
pokud chybČjící enzym alternativní dráhy je dodán spoleþnČ s transgenem = možná selekce
2. buĖky deficientní v de novo syntetické dráze mohou být selektovány za souþasného odedbrání
nukleosidĤ = inhibice alternativní dráhy, pokud chybČjící enzym de novo dodán s transgenem
Amplifikace
p
transfekované DNA
Selekce methotrexátem se používá k amplifikaci kotransfekovaného genu
pro dihydrofolát reduktázu u CHO linie deficientní v DHFR (DG44)
Selekce nízkou koncentrací inhibitoru DHFR - metotrexátem po nČkolik mČsícĤ 9 - 12
OvČĜení exprese
transgenu
OvČĜéní transkripce
p transgenu
g
Screenin exprese
p
96 jjamkovýý
formát Bio Dot
RT-PCR
RT
PCR
Pozitivita reakce není jednoznaþnČ
prĤkazem pĜítomnosti proteinu
Screeningg exprese
p
mnohojamkový
j
ý
formát Dot Blot
MBL
+
Env
Skrínování supernatantĤ Dot Blot
Stem
MASP
collectins
TM
Signal
CRD
63 aa
secreted trimeric
protein
t i
470 aa
gp41
gp120
OvČĜení identityy p
proteinu p
pomocí
Western blotování
10% SDS PAGE native / reducing
Supernatants
Non-reducing
L
S
L
S
transfected
Reducing
L
S
L
of
liver
gp120+MBL+His
and
serum
were
separated on 10% SDS-PAGE, blotted
S
and probed with sera of the HIV-positive
patients
p
kD
kDa
and
visualized
by
y
chemiluminiscence of HRP-labeled anti
human Ig Fc mAb. Predicted weight of
amino-acid backbone of gp120+MBL is
250
64 6 kDa; pI=8,13.
64,6
pI=8 13
150
100
50
37
Reducing
gp120
+ MBL
Mock
gp120
+MBL
Mock
/
nonreducing
buffers differences
possible oligomerization.
~
Základní pojmy
p j y
Vybrané pojmy pro
molekulární
klonování
kl
á í
Operon - skupina genĤ nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripþní
jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genĤ, které
jsou transkribovány do polycistronické mRNA.
Gen - základní, fyzická a funkþní jednotka dČdiþnosti.
S k
Strukturní
í gen - úsek
ú k DNA zapojený
j ýd
do produkce
d k polypeptidového
l
id éh ĜĜetČzce.
Č
Urþuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do
regulace jejich exprese. Ne-regulaþní gen.
Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící
iniciaci transkripce z pĜilehlého promotoru.
Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripþní
faktory zahajující transkripci mRNA.
Základní p
pojmy
j y
Cis trans test
Cis-trans
Cis-trans komplementaþní test - párovací test sloužící k urþení zda dvČ rĤzné
recesivní
i í mutace
t
na opaþných
þ ý h chromosomech
h
h di
diploidního
l id íh organismu
i
((pozice
i in
i
trans) se vzájemnČ kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují rĤzné
geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se oznaþuje i jako test alelismu
Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou
komplementaci dvou trans mutací ve výše zmínČném cis-trans testu, ale
vykazující genetickou komplementaci
komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom
chromosomu (v poloze in cis).
Cistron je tedy sluþitelný s pojmem kódující þástí jednoho genu.
Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu.
Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein.
VnitĜní místo nasedání ribozomĤ – místo mezi dvČma úsekyy mRNA kde mĤže
dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepĜekládanou oblast
dvČ recesivní mutace ((a1,, a2))
pro diploidní, nebo þásteþnČ diploidní
urþuje zda dvČ mutace jsou lokalizovány do stejní funkþní jednotky nebo genu
Základní p
pojmy
j y
Kohezivní a tupé
p konce dsDNA
ýtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v pĜesnČ
urþených pozicích podle principu komplementarity bází a pĜinášejí aminokyseliny
k tvorbČ polypeptidového ĜetČzce
ĜetČzce.
Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je
nutné dodržet pĜi navrhování pĜekryvných míst a kohezivních koncĤ DNA bČhem
klonování.
GMO - geneticky modifikovaný organismus
organismus.
Vnesením cizorodé DNA jinou než pĜirozenou cestou (jako je infekce
bakteriofágem þi virem, konjugací pĜirozených plasmidĤ a td.) Manipulace je
definována zákony
y a vyhláškami
y
ýeské republiky
p
y ((zákon 178/2001;; 185/2001;;
78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a naĜízeními
Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003).
Roþní hlášení
Základní p
pojmy
j y
Nonsense suppression
- potlaþení efektu STOP kodonĤ v dĤsledku pĜítomnosti abnormálních tRNA
- vážou se na STOP triplet a pĜinášejí aminokyselinu
- umožĖují další prĤbČh translace.
- geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE)
- vČtšina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG)
(UAG), Orche (UAA)
(UAA).
Į komplementace
p
Į komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genĤ, z nichž jeden kóduje
N’ terminální úsek E-galaktozidázy (‫ ܤ‬fragment) a druhý kóduje C’ terminální
úsek E-galaktozidázy
E galaktozidázy (Ȧ fragment),
fragment) vede k vytvoĜení funkþního enzymu
sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci
Základní charakteristika E. coli
E coli v
E.
molekulárním
kl
klonování
á í
Základní charakteristika rĤstu E. coli
• Gram negativní tyþka
• Cirkulární chromozomem 3.106 párĤ bází
• Roste na minimálním médiu obsahujícím
• zdroj uhlíku (glukóza)
• soli jako zdroj dusíku, fosforu
f f
a stopových kovĤ
Ĥ
• Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidĤ, vitamíny atd.
roste mnohem rychleji
• Po
P naoþkování
þk á í iinokula
k l d
do obohacených
b h
ý h médií
édií
• úvodní lag fáze
• exponenciální fáze log (zdvojovací þas 20 - 30 minut)
• V log fázi setrvává dokud
• nespotĜebuje veškeré živiny
• nespotĜebuje kyslík
• zplodiny metabolismu (kyseliny) nepĜesáhnou hranici inhibice rĤstu
• nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro vČtšinu laboratorních kmenĤ
• pĤvodnČ izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se
z difterie v Palo Alto v Kalifornii
Kalifornii.
Základní charakteristika E. coli
• Jsou popsány plasmidy dobĜe se replikující v E. coli
• Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párĤ bází
(bacmidy)
• V E. coli probíhá Į komplementace
• Je známa Ĝada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin,
(
Kanamycin,
Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine)
• DobĜe popsány metody transformace E. coli
•chemická
h i ká C
CaCl
Cl2, RbCl,
RbCl CCMB80 (KOA
(KOAc+CaCl
+C Cl2+MnCl
+M Cl2+MgCl
+M Cl2)
•elektroporace
• Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli
•
Kultivace E. coli
•Minimální média
•A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g
K2HPO4; 0,5
0 5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2%
0 2% glycerol
(nebo cukr).
•Bohatá média
•Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g
kvasniþného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH).
•H
H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl
•Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl
•Obohacení nČkterými
ý nutrienty
y mĤže napĜíklad
p
usnadnit purifikci
p
nČkterých
ý
kontaminujících proteinĤ
Aseptické podmínky
manipulace s živými
organismy
i
Desinfekce sterilizace
Desinfekce,
• Sterilizace laboratorního materiálu
• horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod
• autoklávování
t klá á í 120 – 136°C,
136°C 20 - 30 min
i
• chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchĤ
• Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 Pm
• Manipulace s kultivaþními nádobami
• uspoĜádání pracovní plochy
• postup otevírání a zavírání kultivaþních nádob
• zpĤsob pipetování
• po doteku okolních povrchĤ pĜedpokládat pĜenos kontaminace
Expresní systémy
Vhodnost expresního
p
systému
y
podle velikosti rek. proteinu
Velikost proteinu
Povaha proteinu
E. coli
< 8 kDa
Fúzní
+++
> 8 kDa
Intracelulární
t ace u á
+++
8-50 kDa
Sekretované
++
kvasinky
hmyzí
buĖky
savþí buĖky
Vhodnost expresního
p
systému
y
podle velikosti rek. proteinu
Expresní
systém
+++
++
-
-
-
+
+
+
+
-
Jednoduchá,
Hmyzí buĖky bez sializace
+
+
+
+
-
Savþí buĖky
+
+
+
+
+
+++
+++
+++
> 50 kDa
Sekretované
a povrchové
VýtČžek expresních systémĤ
Chybí
Vysoce
manosilované
glykany
g
y y
Komplexní
Expresní systémy
Produkt
Koagulaþní faktory (VII, VIII, IX)
Protein
sekretovaný
[g/l biomasy]
intracelulární
rozpustný
[g/l biomasy]
intracelulární
inkluze
[g/l biomasy]
E. coli
< 0,5
kvasinky
P. pastoris
S.cerevisiae
0,2 ¹ 4
0,25
hmyzí buĖky
savþí
buĖky
0,001 ¹ 0,5 0,001 ¹ 0,1
Calcitonin
05¹5
0,5
1¹4
0,001
Spoleþnost
Systém
Novo-Nordisk/Bayer/Centeon
BHK buĖky
Genetics Baxter/Centeon/Wyeth
CHO buĖky
Unigene
E. coli
CHO buĖky
DNáza ((cystická
y
fobróza))
Roche
Erythropoetin
Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer
CHO buĖky
Darbepoetin
Amgen
CHO buĖky
Folikuly stimulující hormon
0,5 ¹ 5 0,2 ¹ 12
Acetylace Acylace Ȗ-karboxylace
-
Kvasinky
y
+++
Fosforylace
-
E. coli
+++
Posttranslaþní modifikace
N-glykozylace O-glykozylace
Serono/Organon
CHO buĖky
y
CHO buĖky
Luteinizaþní hormon
Serono
CHO buĖky
Gonadotropin
Serono
CHO buĖky
Glukagon
Novo Nordisk
Novo-Nordisk
S cerevisiae
S.
Glukocerebrosidáza (Gaucher nemoc)
Genzyme
RĤstové hormony (somatotropiny)
Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring
E. coli
S
Serono
M ší linie
Myší
li i
1¹4
CHO buĖky
Serono/Bio-Technology Gener. Corp
CHO buĖky
Eutropin
LG Chemical
S. cerevisiae
Growth factors (GCSF, GMCSF)
Novartis/Essex/Amgen/Roche
E. coli
Platelet derived growth factor (PDGF)
Chugai Pharmaceuticals
CHO buĖky
Janssen-Cilag
S. cerevisiae
Expresní systémy
Produkt
Spoleþnost
Systém
PDGF-agonista
ZymoGenetics
S cerevisiae
S.
Hepatitis B vakcína
GlaxoSmithKline
S. cerevisiae
Rhein-Biotech
H. polymorpha
Hirudin
Aventis/Novartis
S cerevisiae
S.
Insulin a muteiny
Aventis/Lilly/Berlin-Chemie
E. coli
Insulin
Bio-Technology General Corp
E. coli
N
Novo-Nordisk
N di k
S cerevisiae
S.
ii
Interferon alpha a muteins
Roche/Essex/Yamanouchi
E. coli
Interferon beta
Schering
E. coli
Biogen/Serono
CHO buĖky
Interferon gamma (mutein)
Amgen/Boehringer
E. coli
Interleukin 2
Chiron
E. coli
Oprelvekin (agonista IL-11)
Wyeth
ROMI 8866
OP-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt)
Curis/Striker
E. coli
TkáĖový aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
CHO buĖky
Aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
E. coli
Faktor kmenových bunČk (SCF)
Amgen
CHO buĖky
Tumor nekrosis faktor (TNF)
Boehringer
E. coli
Výhody E.
E coli
1 používány pro klonování DNA i pro expresi
1.
Prokaryontní
expresníí systémy
té
E coli
E.
Nevýhody E. coli
1. rekombinantní proteiny nejsou dostateþnČ posttranslaþnČ
modifikovány
2. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách
1. N-glykosylace
3. krátký zdvojovací þas E. coli desítky minut
2. O-glykosylace
4. efektivní metody transformace
ý mĤstkĤ
3. tvorba disulfidických
5. rostou v tekutých i na tuhých pĤdách
4. štČpení prekurzorových proteinĤ specifickými proteázami
6. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C do 37°C
7. nižší teplotyy umožĖujíj expresi toxických
ý rekombinantních
proteinĤ
8. výtČžek
ý
až 5 g proteinu
p
na 1 litr biomasy
y
5 skládání proteinu
5.
2. þasto dochází ke shlukování do inkluzních tČlísek
3. nutno nČkdy použít denaturaþní podmínky izolace
p
y
4. nutno þasto refoldovat izolované proteiny
5. rekombinantní protein kontaminován endotoxinem
Endotoxin
Inkluzní tČlíska E. coli
1. V cytoplasmatickém nebo periplasmatickém prostoru
2. V savþích buĖkách vznikají z virových kapsidových proteinĤ
3. Nejsou ohraniþena membránou, velikost od 0,2 do 0,6 Pm
P
4. TvoĜena nerozpustnými agregáty nesprávnČ složeného
proteinu,, bez biologické
p
g
aktivity
y ((nČkdy
y možno zvrátit))
5. Ve fázovém kontrastu jako temná tČlíska
6. ýastým
ý
problémem pĜi expresi
1. transmembránových proteinĤ obratlovcĤ (ve 30% pĜípadĤ)
2. multiproteinových komplexĤ
3 i pĜi
3.
Ĝi pouhé
hé nadprodukci
d d k i jijinak
k rozpustných
t ý h rek.
k proteinĤ
t i Ĥ
7. Možno využít pro efektivnČjší purifikaci proteinu
6 drah sekrece proteinĤ z E. coli
• typ
yp I závisí na ABC transporterech
p
((ATP-binding
g cassette))
• sekrece typu I je efektivní pro proteiny pod 200 aa
• navozena signálem
i ál
(Hl
(HlyA)
A) pĜipojeným
Ĝi j ý k C’ konci
k
i rek.
k prot.
t
• typ II je závisí na SEC (SecB), SRP (signal recognition
particle), nebo TAT (twin-arginin translocatioon)
• zodpovČdná za kumulaci mnoha rekombinantních proteinĤ
v periplasmatickém prostoru
• zde þasto tvoĜí inkluzní tČlíska
• v periplasm. prostoru jsou disulfid-izomerázy a foldázy
• v periplasm. prostoru je ménČ proteáz, než v cytoplasmČ
Sekrece typ II v E. coli
Zvýšení
ý
výtČžku
ý
a þistoty
y rekombinantního
proteinu suplementací média GlcNAc
Zvýšení
ý
výtČžku
ý
a þistoty
y rekombinantního
proteinu suplementací GlcNAc
GFAT = L-glutamine-D-fructoseg
6-phosphate aminotransferase
Výhody
ý
y kvasinkvých
ý expresních
p
systémĤ
Kvasinkové
té
1. Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris
2 levné
2.
l
é oproti
ti savþím
þí expresním
í systémĤm
té Ĥ
3. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách
4. oproti savþím systémĤm krátký zdvojovací þas
5 možno kultivovat do vysokých denzit suspenze
5.
6. známy efektivní sekretorní signály
7. rostou v tekutých pĤdách
8. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C
23 C do 37°C
37 C
9. výtČžek až 4 - 12 g proteinu na 1 litr biomasy
Nevýhody kvasinkových expresních
systémĤ
Struktura N-glykanĤ
gy
1. proteiny obsahují pouze vysoce manozylované N-glykany
• rekombinované linie p
produkující
j manosidázyy ((MI a MIIx)) a
glykosidázy
2 N
2.
N-oligosacharidy
oligosacharidy neobsahují fukózu
3. oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému
4. nutno selektovat a charakterizovat nČkolik expresních klonĤ
pro výrazné rozdíly v expresi rekombinantního proteinu
5. variabilní podíl sekretovaného proteinu z celkového množství
proteinĤ syntetizovaných buĖkou
• S. cerevisiae max 1%, P. pastoris až 10%
Struktura O-glykanĤ
gy
•Kvasinky zahajují O-glykosylaci v endoplasmatickém retikulu
•pĜenos
Ĝ
manózových
ó
ý h zbytkĤ
b tkĤ z dolichyl
d li h l ffosfát
fát D
D-manózy
ó na specifický
ifi ký serin
i
nebo treonin
•V této chvíli je již protein složen a lokální pomČry rozhodují o prĤbČhu Oglykosylace
•IGF a IL-2 zásadní rozdíly v O-glykosylaci, hGM-CSF O-glykosylován jako savþí
Manosidázy pĜi tvorbČ N-glykanĤ
N glykanĤ
Hmyzí bunČþné kultury pro
bakulovirové
ba
u ov ové eexpresní
p es systé
systémy
y
Bakulovirové
té
• TkáĖové kultury hmyzích bb. infikovaných rekombinantním
bakulovirem s cílem exprese rekombinantního proteinu
• Velmi výkonný
ý
ý expresní
p
systém
y
sp
posttranslaþní modifikací
exprimovaných proteinĤ blízkou savþím systémĤm
• Snadný pĜenos DNA do nové kultury infekce
• Snadný pĜevod adherentní kultury do suspenzních
podmínek kultivace
• NepĜítomnost endotoxinu, bezsérová média
Nevýhody hmyzích expresních
systémĤ
1. Oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému
2. NČkolikafázová p
pĜíprava
p
rekombinantního bakuloviru
3. Nutnost titrovat rekombinantní bakulovirus, plakový esej
4 Kultivace
4.
K li
h
hmyzích
í hb
bunČk
Čk vyžaduje
ž d j pravidelnou
id l
péþi
éþi
5. Zavedení bakulovirového expresního systému je pro
experimentální laboratoĜ finanþnČ nároþné
6. Do nedávna nedostupné
p techniky
y stabilní exprese
p
p
proteinu ,
dne již vyĜešeno
Bakulovirové systémy
y
y
Schéma p
pĜípravy
p y rekombinantní
bakulovirové DNA
BunČþné kultury pro bakulovirové
systémy
systé
y
Základní pravidla pro kultivaci hmyzích bb
bb. linií shodná s
pravidly pro TK
R díl
Rozdíly:
t l t 27 – 28°C
teplota
normální atmosféra
kultivace v suspenzi za trvalého míchání (stĜižné
ý minimalizoványy použitím
p
FBS,
sílyy mohou být
Pluronic, specielní média Sf-900 SFM)
striktní p
požadavek vysoké
y
životnosti >95%
%
maximální ĜedČní pĜi pasáži 1:3
PĜípravy rekombinantního
bakuloviru
ba
u ov u
systémy
systé
y
Izolace rekombinantního
bakuloviru - virionu
Rekombinantní bakulovirová DNA je transfekována do
hmyzích bunČk a ty produkují plnČ infekþní viriony
Produkce rekombinantních
proteinĤ
ST6GalNAcI ST6GalNAcII GalNAcT2 GalNAcT14
Plakový essej pro stanovení titru viru nutný pro úspČšnou
infekci
systémy
systé
y
Stabilní bakulovirový expresní systém
pĜístup zcela odlišný od
klasického bakulovirového systému
systémy
systé
y
Volba expresního systému
Savþí expresní
systémy
té
1. prĤkaz zapojení produktu transgenu a charakterizování produktu –
transientní transfekce je dostateþná
2. produkce velkého množství preoteinu – vhodná stabilní
koamplifikace
p
3. produkce toxického proteinu virové expresní vektory vakcínie,
alfaviry nebo inducibilní promotor (hsp, interferon ȕ, ionty tČžkých
kovĤ, steroidy)
VýtČžnost
ý
jednotlivých
j
ý savþích
expresních systémĤ
Využití rekombinantních proteinĤ
v savþ
savþích
c expresních
e p es c systé
systémech
ec
CV1
SV40
• identifikace genu pro urþitý protein po skríningu cílových bunČk
COS
transfekce 1 Pg/ml
• produkce
d k velkého
lkéh množství
ž t í normálnČ
ál Č dostupného
d t
éh v omezeném
é
množství
3T3
retrovirus
CHO
transfekce 0.01-10 Pg/ml
• hledání
á í fyziologických
f i
i ý následkĤ
á
Ĥ exprese urþitého
þi é proteinu
i
primáti
i áti
vakcínie
k í i
studium enzymatických drah
293T
transfekce Pg/ml
studium aktivaþních drah
In vitro
Pg/ml
studium regulace exprese
Baculo
Pg/ml
E. Coli
Pg/ml
• potvrzení efektu specifických mutací na funkci proteinu
1-10 Pg/ml
0 1 - 0.5
0.1
0 5 Pg/ml
1 Pg/ml
/ l
Exprese standard. a mutant.
proteinĤ
cDNA kihovny, mutantní proteiny
PĜenos g
genu do zvíĜat
Permanentní a intenzivní exprese
P d k ttoxických
Produkce
i ký h proteinĤ
t i Ĥ
Produkce lidských proteinĤ
Volba promotoru
Vektoryy pro
p savþí expresní
p
systémy
y
y
Zheng et al, 2005; Molecular Therapy 12(3)
Vektoryy p
pro savþí expresní
p
systémy
y
y
Vektory
yp
pro savþí expresní
p
systémy
y
y
Minicirklyy
Purifikace minicirklĤ
In vivo
o místnČ
st Č spec
specifická
c á rekombinace
e o b ace
Když
y exprese
p
nefunguje
g j
Regulace exprese v buĖce
tTA tetracyklinový transaktivátor – fúzní
produkt
d kt E.
E coli
li tetracyklinového
t t
kli
éh represoru a
1. ovČĜení struktury vektoru restrikþní analýzou, sekvenování
2. ovČĜení transfekþní úþinnosti – stejný vektor jiný transgen - reporter
3. ovČĜení transkripce – Northern hybridizace
4. použití vektoru jiného typu konstrukce
VP16 HSV
TetP - tetracyklinový promotor Tn10 pĜed
minimalizovaným promotorem CMV (' +)
PĜítomnost tetracyklinu inhibuje vazbu
tTA na TetP a tím inhibuje expresi
5 nutno zvážit
5.
áži aberantní
b
í sestĜih
Ĝih RNA
6 hledání neomutací
6.
transgenu z rekombinovaného pTet-Splice
vektoru
Nukleární lokalizaþní signál SV40
Scaffold/matrix associated replicons
Dean et al. 1999 Biotech. Bioing.
Vlastnost 366 bp dlouhého úseku SV40 obsahujícího zaþátek replikace a þasný
promotor (podobný efekt fragment obsahující 72 bp repeats)
1000 x množství DNA plasmidĤ v jádru
Scaffold/matrix associated replicons
Nezbytné vybavení TK laboratoĜe
1 OddČlená pracovní plocha - laminární box
1.
2. Humidifikovaný CO2 inkubátor
3. Kultivaþní a manipulaþní média
4. Vhodné kultivaþní a manipulaþní nádoby (jednopoužiĢový
plast)
5 Vhodná kultivaþní média
5.
6. Inverzní mikroskop
7. Lednice, mrazící box (-20°C), hlubokomrazící box, tekutý
dusík
8. Desinfekþní a sterilizaþní prostĜedky
Udržování TK bb.
bb linie v kultuĜe
Aseptické podmínky TK
1 Aseptiþnost
1.
A tiþ t práce
á
• Ochrana
O h
bb
bb. k
kultury
lt
pĜed
Ĝ d infekcí
i f k í z prostĜedí
tĜ dí a pracovníkĤ
íkĤ
2. Vhodné kultivaþní médium
• Ochrana laboratorních pracovníkĤ pĜed infekcí z TK
3. Stanovení koncentrace a životnosti bb. v kultuĜe
• kontaminace inhibuje rĤst, zabíjí bb., zpĤsobuje
inkonzistenci experimentálních výsledkĤ,
• tkáĖové kultury suspenzních bb.
bb (konfluence)
• tkáĖové kultury adherentních bb. (poþítání bb. v
jednotkovém objemu)
4. Záznam údajĤ o kultuĜe datum pasáží, koncentrace bb,
životnost
ži
5. Uchování živých bb. pro další experimenty (zamražování)
• kontaminující mikroorganismy spotĜebovávají živiny z
média,, p
produkují
j toxiny
y
1. Separace TK laboratoĜe od ostatních laboratoĜí, boxy s
laminárním proudČním (validace), pĜetlak, filtrace vzduchu
2. Ochranné pomĤcky: rukavice, plášĢ, štít
3. JednopoužiĢový plast, pipety, sterilizace médií, ošetĜení lab.
skla pro TK
Prevence kontaminace TK
• Hl
Hlavníí zpĤsob
Ĥ b prevence kontaminace
k t i
jje pravidelná
id l á kontrola
k t l
kultur zamČĜená na
• náhlé
á é zmČny
Č barvy média
é i
• pokles životnosti bunČk
• zákal kultivaþního média
Prevence kontaminace TK ATB
• Antibiotika
A tibi tik brání
b á í rĤstu
Ĥ t kontaminujících
k t i jí í h mikroorganismĤ
ik
i Ĥ
• penicillin, streptomycin, amfotericin B
Pracovní koncentrace antibiotik a antimykotik u savþích tkáĖových
kultur
ATB
Penicillin
• kontrola pod mikoroskopem
St t
Streptomycin
i sulfate
lf t
• analýza typu kontaminace
Kanamycin
• likvidace kontaminovaných kultur radČji než „léþba“
Fi ál í koncentrace
Finální
k
50-100 U/ml
50 100 mg/ml
50-100
/ l
100 mg/ml
Gentam cin
Gentamycin
50 mg/ml
Mycostatin
20 mg/ml
Amphotericin B
0 25 mg/ml
0.25
PĜi potĜebČ možno konzultovat s ATB centrem
Kultivaþní média pro TK
Kultivaþní média pro TK
• Používat
ou v ovČ
ovČĜená
e média
éd nebo
ebo p
pĜedem
ede nové
ové typy
ypy ovČĜit
ovČ
1. 5%, 10%, nebo 20% (v/v) FBS, tepelnČ inaktivované
(rĤstové faktory
faktory, hormony
hormony, MK)
2. 1% (v/v) nonesenciální aminokyseliny
3. 2 mM L-glutamin (zdroj dusíku, v Krebs. cyklu, syntéza NK, proteinĤ,
aminocukrĤ)
4. 100 U/ml penicilin
5 100 ug/ml
5.
/ l streptomycin
t t
i sulfate
lf t
• Použití médií je individuální
• Definovaná média dostupná jako prášek, koncentrát,
pracovní roztok
• Obecná formulace kompletního média záleží na použitém
základním médiu
skladovat v temnu , +4°C
+4 C max 1 mČsíc
uložit malý alikvot do CO2 inkubátoru - kontrola
tepelná inaktivace komplementu 56°C, 30 min
Základní média pro TK
• BME (Basal medium Eagle`s)
Originální Eaglovo médium pro HeLa buĖky v kultuĜe obsahuje Earleyho
balansovaný solný roztok
• MEM,, E-MEM ((Minimum essential medium))
Eaglem modifikované eho BME. Vyšší koncentrace AMK. Obsahují Earleyho
balancovaný solný roztok, nebo Hanksúv solný roztok, obohacena o Ne-AMK.
Ob h j 2 mM
Obsahuje
M L-Glutamin.
L Gl t i
• DMEM (Dulbeccos modified Eagle`s medium)
Dulbekova modifikace bazálního Eaglova média. Obsahuje 4x koncentraci
aminokyselin a vitamínĤ. DvČ modifikace: high (4.5 g/l glukózy) a low (1.0 g/l
glukózy). Dále obsahuje 4mM L-glutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného.
• RPMI 1640 (Rosswell Park Memorial institute)
1966 Moor, je modifikací McCoy-ova basálního 5A média. PĜi pH>8 rĤžová
barva a zákal - obsahuje fenolovou þerveĖ. Je to zpĤsobeno volnými bazickými AMK,
které jsou ménČ rozpustné pĜi basickém pH. PĜi neutrálním pH je þiré a má barvu jako
ostatní média (lotosový kvČt). Obsahuje 2mM L-Glutamin.
Základní média pro TK
OvČĜení identityy p
proteinu p
pomocí
Western blotování
10% SDS PAGE native / reducing
Supernatants
Non-reducing
L
S
L
S
transfected
Reducing
L
S
L
of
liver
gp120+MBL+His
and
serum
were
separated on 10% SDS-PAGE, blotted
S
and probed with sera of the HIV-positive
patients
p
kD
kDa
and
visualized
by
y
chemiluminiscence of HRP-labeled anti
human Ig Fc mAb. Predicted weight of
amino-acid backbone of gp120+MBL is
250
64 6 kDa; pI=8,13.
64,6
pI=8 13
150
100
50
37
Reducing
gp120
+ MBL
Mock
gp120
+MBL
Mock
/
nonreducing
buffers differences
possible oligomerization.
~

Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.

Transkript

Podobné dokumenty

Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. - Škola molekulárních biotechnlogií

INVESTICE DO ROZVOJE VZDELAVANi

PCR v diagnostice Lymeské borreliózy

Usenseni-RO-c.-25