Dvojí populace erytrocytů 16.10.2012

Dvojí populace erytrocytů
příčiny – problémy při stanovení – interpretace nálezů
Eliška Rýznarová
LAB-MED Systems s.r.o.
1
2
3
Dvojí populace erytrocytů
• Je termín, se kterým se setkáváme v
imunohematologických laboratořích
nejčastěji v souvislosti s
předtransfuzním vyšetřením a potřebou
zajistit pacientovi kompatibilní krev.
• Ne všechny laboratorní techniky jsou
však schopny rozlišit reakci dvojí
populace ery.
4
Laboratorní metody testování a
možnost detekce dvojí populace ery
•
•
•
•
•
5
Reakce dvojí populace ery
Srovnání s běžnými výsledky
ID-gelový systém
• Pouze systém sloupcové gelové aglutinace
umožňuje spolehlivě vizuálně rozlišit reakci
dvojí populace ery.
• Příčinou dvojí populace ery může být:
- chybný pracovní postup
- přirozený jev
• Reakci dvojí populace ery (sediment +
aglutinace v gelu) je nutno interpretovat jako
pozitivní výsledek.
na sklíčku
ve zkumavce
na mikrotitračních deskách
v gelovém systému
metodou Capture
- soustředěný terčík
- méně soustředěný terčík
- manuální testování náročné
7
6
sediment + aglutinace v gelu
8
9
1
Správná technika testování
Správné a chybné pipetování
Předpokladem pro správné vyhodnocení výsledků
testování je správné provedení testu.
• Správné pipetování ery je v úhlu 45° směrem ke
stěně rozšířené části mikrozkumavky - důvodem
je nutnost zachování vzduchové bubliny nad
gelem
• Správné pipetování séra/plazmy je vertikálně bez
doteku stěny mikrozkumavky – tím je zajištěno
smísení séra/plazmy s ery a průběh reakce mezi
antigenem a protilátkou
• Chybné pipetování může vést k falešně
negativnímu výsledku a způsobit HTR
3.
4.
5.
11
Tenká vrstva ery na povrchu gelu
Tenká vrstva ery na povrchu gelu
Není pozitivitou, vyvolává obraz dvojí populace ery.
Faktory, které způsobují částečné zadržování ery:
2.
Vzájemná kontaminace krevních vzorků
Po alogenní transfuzi krve
Po transplantaci KD, kmenových buněk
Po intrauterinní transfuzi
Fetomaternální a maternofetální inkluze
Slabé podskupiny A, B (zejména A3)
Částečná ztráta antigenu jako důsledek leukémie
Získaný antigen B u krevní skupiny A1
Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace ery)
Mozaicismus Rh při myeloproliferativních
nemocněních
11. Chimérizmus
Správné pipetování:
ery v úhlu 45°
plazmu vertikálně
10
1.
Dvojí populace ery - příčiny
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Vlákna fibrinu – u čerstvých vzorků ne zcela řádně
odebraných nebo nedostatečně zcentrifugovaných
Koagulační faktory - uvolněné do plazmy, zejména u
starých vzorků
Vysoký počet leukocytů – vytváří bariéru na povrchu gelu
Podpovrchové antigeny (kryptoantigeny), odhalené
působením bakteriálních enzymů u ne zcela čerstvých
diagnostických ery, mohou reagovat s protilátkami v séru
vzorků
Přítomnost protilátek proti tzv. senescentním
(stárnoucím) antigenům
Chybný odběr vzorku – fibrinová vlákna
Vlákna fibrinu zachycují část ery na povrchu gelu
Příklad: vyšetření aglutininů a screening protilátek
KS A (β + fibrin), protilátky pozitivní s ery I+, II++
13
• Část ery je zachycena fibrinovými vlákny
• Opakovat z nově odebraného krevního vzorku
14
5% kontaminace vzorků
(1 ml + 50µl)
1. Vzájemná kontaminace vzorků
• Mezi krevními vzorky pacientů nebo dárců
při použití stejné pastérky (typování antigenů
na ery, zkouška kompatibility)
12
15
10% kontaminace vzorků
(1 ml + 100µl)
ještě
negativní
již i zde
pozitivní
• Mezi diagnostickými ery při záměně kapátek
(vyšetření aglutininů, protilátek)
• Testování je nutno opakovat ze správně
odebraného vzorku a správnými diagnostiky
16
17
18
2
2. Po alogenní transfuzi krve
Transfuze krve 0 Rh- z vitální indikace
Reakce dvojí populace ery je „umělá“ a dočasná.
Příklad:
Pacient 0 Rh+, CcD.ee, K-
Po transfuzi AB0/D neshodných ery
• cílená transfuze 0 Rh- krve z vitální indikace
• způsobená administrativní nebo laboratorní chybou
Prověřte historii klinického obrazu a terapii, opakujte
vyšetření AB0/D, učiňte potřebná opatření (HTR)
ctl negativní
19
pacient ccEe
další příklad AB0/Rh
krev dárce 0 Rh -
Dárce krve 0 Rh -,ccddee K-
Po transfuzi neshodných ery v ostatních antigenních
systémech
• reakce dvojí populace ery je patrná i na ID-Kartách
při fenotypizaci. Fenotypizaci lze opakovat po
separaci vlastních ery od transfundovaných
Transfuze krve
Transfuze krve
pacient 0 Rh +
20
PAT a autokontrola u pacienta s
protilátkou po nedávné transfuzi
další příklad fenotypizace Rh
krev dárce ccee
Separace vlastních ery od transfundovaných
Metodou jednoduché centrifugace v zatavených
mikrohematokritových trubičkách
• Princip:
Nově se tvořící autologní ery pacienta – retikulocyty mají nižší hmotnost než ery transfundované.
Koncentrují se v horní části trubičky, kterou seřízneme,
ery uvolníme a použijeme k typizaci antigenů.
Expresivita antigenů na retikulocytech nemusí být tak
silná jako na vyzrálých ery.
• Separace je úspěšnější:
- u pacientů s normální nebo vyšší tvorbou retikulocytů
- u pacientů, kteří jsou 3 a více dní po trasfuzi
• Vytvořená aloprotilátka se váže pouze na ery
transfundované, stále kolující v organismu
• Vlastní ery poskytují reakci negativní
22
23
AB0, event. RhD inkompatibilní TKD
3. Po transplantaci KD, kmenových buněk
Transplantace KD:
• Autologní – převod vlastní KD, odebrané před zahájením
přípravného režimu. Lze u pacienta bez infiltrace základním
onemocněním nebo v kvalitní remisi.
• Syngenní – od jednovaječného dvojčete
• Alogenní – příbuzenská nebo nepříbuzenská
Transplantace kmenových buněk:
• Autologní kmenové buňky z periferní krve – opakovanými
cytaferézami před transplantací (zde nemusí maligní b. být)
• Placentární krev – po porodu z pupečníkové žíly, obsahuje
dostatek kmenových b. a funkčně nezralé lymfocyty s
významným velkým podílem naivních lymfocytů T se slabou
reaktivitou GVHD (štěpu proti hostiteli). Banky mražených PK.
• Fetální jaterní buňky – souhlas ženy po potratu (hematopoéza
v játrech od 5. týdne)
25
21
Viz AABB Technical Manual, 11TH edition, 1993, str. 637-638
24
TKD - „Velká neshoda“ - ABO major
Z praktického důvodu se obvykle ke shodě
AB0 při TKD nepřihlíží, neboť by se vyloučila
z dárcovství většina HLA shodných
sourozenců nebo HLA vhodných dárců.
Řeší předtransplantační příprava pacienta.
RhD+ příjemce může být transplantován od
dárce RhD-.
• DKD přináší „nové“ antigeny (např. dárce A, pac. 0)
• U příjemce jsou přítomny přirozené aglutininy anti-A
nebo anti-B.
Transfuze u transplantovaných pacientů:
1. Přípravky erytrocytové:
• shodné s původní AB0 KS příjemce dokud je
prokazována a trvá pozitivita PAT
• nebo trvá průkaz inkompatibilní AB0 protilátky
2. Přípravky s plazmou:
• stejné KS AB0 jako dárce KD, od dne transplantace
26
27
3
TKD - „Malá neshoda“ - ABO minor
TKD - „Kombinovaná neshoda“
• DKD přináší „nové“ protilátky (např. dárce 0, pac. A)
Transfuze u transplantovaných pacientů:
1. Přípravky erytrocytové:
• AB0 KS jako dárce s minimálním obsahem
inkompatibilních protilátek anti-A nebo anti-B, dokud
jsou detekovány ery s původní KS pacienta
2. Přípravky s plazmou:
• AB0 skupina shodná s původní KS příjemce až do
vymizení ery původní KS
TKD – „RhD+ příjemce a RhD- štěp“
• DKD přináší „nové“ antigeny i „nové“ protilátky
(např. dárce A s anti-B, příjemce B s anti-A)
Transfuze u transplantovaných pacientů:
1. Přípravky erytrocytové:
• Krevní skupiny 0 s minimálním obsahem
inkompatibilních protilátek anti-A nebo anti-B, dokud
jsou detekovány ery původní KS pacienta
RhD+ příjemce může být transplantován RhD- KD
(nehrozí tvorba anti-D protilátky)
Transfuze u transplantovaných pacientů:
Podávat RhD- ery a trombocyty
2. Přípravky s plazmou:
• Krevní skupiny AB až do vymizení ery původní KS
příjemce
28
29
Stav po transplantaci KD či kmenových b.
Dvojí populace ery u orgánové transplantace
• Současně s objevováním se antigenů
dárcovských mizí vlastní antigeny pacienta.
• Prvním průkazem přijetí dřeně je zjištění
populace ery antigenně odlišných - tzv. dvojí
populace ery.
• Imunologické změny lze zachytit 14 dní po
transplantaci, obvykle později.
• V konečné fázi po přijetí se všechny antigenní
systémy mění v dárcovské (př. svoji KS A na 0).
• Tento jev je pokládán za příznivý.
• U leukémie svědčí o remisi choroby.
Není vyloučena. Pokud je transplantace AB0, event. RhD
kompatibilní ale nestejnoskupinová a dojde k tvorbě AB0 (nebo D)
imunních protilátek u příjemce.
Příklad maternofetální inkluze
Například:
pacient KS B, s aglutininem anti-A
štěp KS 0, pokud dojde k reakci štěpu proti hostiteli, pak
imunokompetentní buňky štěpu tvoří anti-A a anti-B
Od 2. týdne a na konci 3. týdne se sleduje případná tvorba
imunních protilátek v AB0 (popř.D) NAT a PAT.
Transfuze: do 48 hod po transplantaci se dodržuje KS příjemce
následující dny kompatibilní s příjemcem i štěpem.
32
33
6. Slabé podskupiny A, B (A3,Ax)
Srovnání výsledků
z krve pupečníkové
a venózní
• Pupečníková krev
• Novorozenec O Rh+, matka A Rh +
4. Po intrauterinní transfuzi
5. Fetomaternální a maternofetální
inkluze
Dvojí populaci ery můžeme v těchto případech
sledovat podle situace.
• V krvi plodu, novorozence v souvislosti s
intrauterinní transfuzi
• V krvi matky v případě fetomaternální inkluze
• V pupečníkové krvi v případě maternofetální
inkluze
Jedná se v podstatě o reakci štěpu proti hostiteli.
31
30
Pacient KS Ax Rh+ (s anti-A neg., s anti-AB pos.)
po transfuzi 2 krví A1 Rh+ (s anti-A a anti-AB pos.)
• tentýž případ
maternofetální inkluze
z nového venózního vzorku
• novorozenec O Rh+
matka A Rh +
• venózní krev téměř bez
inkluzí mateřské krve,
pouze stopy s anti-AB
34
35
36
4
7. Částečná ztráta antigenu jako
důsledek leukémie
8. Získaný antigen B u krevní skupiny A1
37
Polyaglutinabilita ery (1)
- Transformace T a Tk je způsobena aktivitou
bakteriálních enzymů a je přechodného charakteru
(staré vzorky, chybný transport)
- Transformace Tn bývá spojena s některými
hematologickými poruchami a má trvalejší charakter
40
•
Vzorek ery, vykazující polyaglutinabilitu
při reakci se sérem dospělých osob
nemusí vždy poskytnout také falešně
pozitivní reakce při vyšetření KS s
monoklonálními reagenty lidského původu
•
Sérum pupečníkové krve obvykle
nereaguje aglutinací s polyaglutinabilními
ery
41
42
Příklad: polyaglutinabilita ery z důvodu
bakteriální kontaminace ID-Diluentu 2
Typy transformace ery
Polyaglutinabilita ery (3)
•
Další faktory, které se podílí na zjišťovaných
rozdílech v reakci transformovaných ery:
•
stárnutí ery
stupeň zředění normálního lidského séra
přítomnost a působení organických
rozpouštědel, která se používají při
výrobě diagnostik k určení KS
43
•
•
•
•
39
Polyaglutinabilita ery (2)
1. Je kvantitativně proměnný jev, závisí na
stupni transformace
2. Charakteristickým rysem může být tzv.
„aglutinace smíšeného pole“ pozorovaná na
ID-Kartách jako dvojí populace ery
3. Lze pozorovat rozdílné výsledky
4. Poměr aglutinovaných a neaglutinovaných
ery může být proměnlivý při vyšetření téže
osoby, ale odebrané v jiném časovém úseku
- Může vést k nesprávnému stanovení skupinových
systémů na ery
Poznámka: pH pod 7 (pH 6,5) zvyšuje reaktivitu anti-M a snižuje
reaktivitu pro Rh, Fy, Jk a MNS systémy
38
9. Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace)
- Je stav, kdy jsou ery narušeny takovým způsobem,
že jsou aglutinovány velkou většinou liských sér
AB0 kompatibilních
•
•
•
Získaný antigen B a vliv pH na jeho detekci
• Běžně akceptované pH pro reakci antigenu a
protilátky je okolo 7
• Při pH monoklonálních diagnostik okolo 7
reaguje „získaný antigen B“ pozitivně a pacient
A1 se jeví jako AB
• Při pH 6,0 tzv. „získaný antigen B“ nereaguje
• Pro detekci antigenu B AB0 systému je nutné
používat anti-B, které nedetekuje získaný
antigen B
• ID-Karty nedetekují získaný antigen B
Pacienti A1 se falešně jeví jako AB.
Lze pozorovat dvojí populaci ery.
Možný výskyt získaného antigenu B je u pacientů:
• s CA tlustého střeva
• u pacientů s infekcí, kdy se deacetylačním
účinkem bakteriálních enzymů mění
imunodominantní cukr KS A acetyl-galaktosamin
na galaktosamin - základní strukturu galaktosy,
která je charakteristická pro KS B
Pacient s CML KS B Rh– s částečnou ztrátou antigenu B
T – způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru
přechodného. Pozorována snížená reaktivita antigenu H u
osob KS 0 a antigenu A u KS A.
Enzymy poškozují receptory T na T transformovaných ery.
Tk - způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru
přechodného.
Enzymy aktivují receptory Tk na Tk transformovaných ery.
Tn – spojena s některými poruchami hematologickými a má
trvalejší charakter.
Cad – je dědičného charakteru. Tyto ery mají současně silně
exprimovaný antigen Sda . K silné aglutinaci s většinou
normálních lidských sér dochází proto, že ve většině sér je
přítomna protilátka anti-Sda která se může uplatnit vždy jen s
ery se silnou expresí antigenu Sda.
Th transformace
VA transformace (může být s depresí antigenu H).
44
•
Při práci na analyzátoru Techno byla pozorována dvojí
populace ery v denní kontrole kvality při testování
kontrolní plazmy s protilátkou: anti-Fya a ery Fy (a-,b+)
anti-D a ery D-
•
•
Jako příčina byla zjištěna kontaminace ID-Diluentu 2.
Erytrocyty, které byly transformovány působením
bakteriálních enzymů vykazovaly pozitivní reakci. Zbývající
erytrocyty vytvářely sediment na dně mikrozkumavek.
Po dekontaminaci analyzátoru – správné výsledky.
Citlivost ery se může lišit (stáří, složení dilučního roztoku atp.).
S tímto jevem se můžeme setkat i při manuálním testování.
•
•
•
45
5
před dekontaminací
po dekontaminaci
46
analyzátor Techno před a po dekontaminaci
47
PAT před dekontaminací
PAT po dekontaminací
49
PAT - analyzátor Techno před a po dekontaminaci
50
10. Mozaicismus
Poznámka
Při práci na ID-Kartách s polyklonálními diagn. se
ery ředí ID-Diluentem 1 (bromelinem).
V těchto případech je nutno opakovat typování
antigenů na ery na ID-Kartách s monoklonálními
diagnostiky, kde se ery ředí ID-Diluentem 2 (LISS).
52
51
Mozaicizmus
Somatický:
vzniká díky mutaci v somatické (tělesné)
buňce a nepřenáší se na potomstvo
Mozaicismus představuje dvě nebo více
buněčných linií s odlišným genotypem v
jednom organismu.
V případě polyaglutinability ery nebo výskytu
protilátek proti enzymům mohou vznikat nejasné
výsledky.
48
Všechny buněčné linie ale pochází z původně
jedné zygoty (vzniká splynutím pohlavních buněk při
oplození).
53
Germinální:
vzniká díky mutaci v germinální (zárodečné)
buněčné linii a může se přenášet na
potomstvo
54
6
Mozaicizmus Rh při
myeloproliferativních onemocněních
Mozaicismus pac. S.M. (1)
A1 CCDee + B ccddee
Mozaicismus Rh
.
u polycythaemia
vera
Myoeloproliferativní choroby, mezi které
patří především polycytémie se vyznačují
poruchou pluripotentní kmenové buňky a
abnormální proliferací erytrocytové,
granulocytové a megakaryocytové řady.
•
•
•
•
Primární polycytémie – polycythaemia vera
• zvýšený objem cirkulující krve
• zvýšená viskozita krve
KS B Rh+
fenotyp CcD.ee
zvýšená viskozita
mozaicizmus:
s anti-D
s anti-C
• Hb nad 170g/l, htk nad 0,55 l/l, počet ery nad 6,0 x 10 na 12/l
(normální hodnoty: Hb 120-160 g/l, htk 0,36-0,46 l/l, počet ery 3,8-5,5 x 10 na 12/l)
55
Mozaicismus pac. S.M. (2)
A1 CCDee + B ccddee
56
.Mozaicismus
57
11. Chimérismus
pac. S.M (3)
• Podstatou chimérismu je přítomnost
dvou nebo více buněčných linií v
jednom organismu, které ale pochází
z více původních jedinců
A1 CCDee
s anti-A1 pozitivní
s anti-H negativní
+
B ccddee
s anti-A1 negativní
s anti-H negativní
58
59
Chimérismus Rh
Chimérismus AB0 Rh
Radiační chimérismus
pacient KS 0 Rh+
• Představuje přítomnost dvojí populace buněk
po TKD a vzniká jako důsledek intenzivní
chemoterapie a ozáření před TKD
60
pacient: Cwcee K-
dárce KD KS B Rh+
dárce KD: CwcEe, K-
• Dlouhodobý chimérismus je provázen
nebezpečným „druhotným onemocněním“,
vyvolaným reakcí štěpu proti hostiteli (GVHD),
kterou zahajují T- lymfocyty KD dárce
• Klinicky se rozlišuje reakce štěpu proti hostiteli:
- akutní reakce s orgánovým poškozením
- chronická reakce s imunitní nedostatečností
61
62
poznámka: polyklonální anti-C reaguje též s antigenem Cw
63
7
Chimérismus
arteficiální
Závěrem
• Pouze metoda sloupcové gelové
aglutinace dokáže odhalit a
rozlišit reakci dvojí populace ery
a umožní snadný výběr
kompatibilní krve k transfuzi.
KS A Rh+ s β
a
KS O Rhbez alfa 1 a 2
a zeslabená β
Protilátky:
NAT negativní
64
65
66
67
68
69
70
71
72
8
Děkuji za pozornost
73
74
9