GENOMY A JEJICH FUNKCE - orion

Transkript

Masarykova univerzita v Brně
Přírodovědecká fakulta
ZPRÁVA O ŘEŠENÍ VÝZKUMNÉHO ZÁMĚRU
„GENOMY A JEJICH FUNKCE“ J07/98:143100008
za rok 1999
Řešitel: Prof. RNDr. Jiřina Relichová, CSc.
1
Obsah:
str.
1. Současný stav řešení problematiky …………………………………………
3
2. Plnění stanovených cílů ……………………………………………………..
8
3. Zabezpečení výzkumného záměru ………………………………………….
14
(a) odborné …………………………………………………………………..
14
(b) personální …………………………………………………………………
15
(c) prostorové …………………………………………………………………
16
4. Dosažené výsledky …………………………………………………………….
18
Souhrn presentace dosažených výsledků …………………………………….
34
5. Vyúčtování finančních prostředků …………………………………………..
35
6. Přílohy (zvlášť)
(a) publikace ve vědeckých časopisech (publikované nebo přijaté k publ.)
(b) rukopisy v recenzním řízení nebo připravené pro publikaci
(c) abstrakta z konferencí
2
1. Současný stav řešené problematiky
Současný stav řešené problematiky odpovídá formulacím obsaženým v návrhu Výzkumného
záměru:
Systematické programy sekvencování genomů člověka i modelových a vybraných
hospodářsky významných organismů posunují těžiště výzkumu v oblasti biologických věd od
prosté identifikace genů směrem ke zjišťování jejich funkcí. V současné době se podrobná
analýza genomů zaměřuje na modelové organismy, u kterých je z různých důvodů zajištěna
efektivnější analýza, například z důvodu jednoduché organizace příslušného genomu, snadné
manipulace s modelovým organismem apod. Takovéto modelové organismy najdeme ve
všech skupinách, u bakterií je to E. coli, Bacillus subtilis a Staphylococcus aureus, u rostlin
Arabidopsis thaliana, u živočichů pak mj. Drosophila melanogaster. V návaznosti na tuto
analýzu se získané poznatky a metodické postupy molekulární biologie využívají u
organismů významných pro člověka, atˇ již z hlediska zdravotního nebo hospodářského.
Význam analýzy genomu jako zdroje informací pro následné přiřazování funkcí jednotlivým
genům a nekódujícím oblastem v genomu jen dokresluje náročný celosvětový projekt
sekvencování genomu člověka, jehož výsledky budou zdrojem informací pro biomedicínské
obory příštího století.
Navrhovaný VZ sleduje tyto perspektivní trendy výzkumu v oblasti molekulární biologie a
genetiky a zaměřuje se na komplexní genetickou a molekulárně biologickou analýzu
zástupců hlavních skupin organismů, od bakterií přes rostliny, až po člověka. Zvláštní
pozornost je věnována výzkumu nekódujících oblastí genomů. Poněvadž problematika
molekulární analýzy genomů je velmi široká a u různých zástupců organismů rozpracovaná
do různé hloubky, bude dále současný stav problematiky i další rozbor řešení výzkumného
záměru konkretizován ve čtyřech směrech: analýza genomů u zástupců (1) bakterií, (2)
rostlin, (3) živočichů a (4) analýza nekódujících oblastí genomu. Zároveň jsou uvedeni
garanti řešení jednotlivých částí.
Problematika 1. Garant: Doc. RNDr. Jiří Doškař, CSc.
Pro léčbu a prevenci onemocnění způsobovaných bakteriálními patogeny má prvořadý
význam rychlá a spolehlivá identifikace a charakterizace původce nákazy a jeho odlišení od
nepatogenních kontaminujících kmenů. Zásadní průlom v diagnostice patogenních
mikroorganismů nastal po zavedení moderních molekulárně genetických metod,
orientovaných na analýzu genomové DNA. Oproti fenotypovým testům mají vyšší
diskriminační schopnost, menší podíl netypovatelných vzorků, vysokou reprodukovatelnost a
citlivost. Jsou proto i nenahraditelným prostředkem v epidemiologii pro zjišťování původu,
způsobů přenosu a šíření bakteriálních kmenů způsobujících nozokomiální infekce a
podstatně přispívají ke zpřesnění jejich taxonomického zařazení. Nejčastější je analýza
celkové genomové DNA pomocí elektroforetických metod, zejména pulzní gelové
elektroforézy, jejichž cílem je detekce polymorfismů v sekvencích genomové DNA různých
kmenů. Techniky založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) jsou používány k
identifikaci kmenů detekcí specifických úseků genů a sekvencí a s výhodou jsou využívány
pro identifikaci obtížně kultivovatelných druhů. Pro stanovení evoluční příbuznosti kmenů se
využívá ribotypizace a analýza 16S-rRNA a 23S-rRNA. Analýza obsahu plazmidů a
restrikční analýza plazmidové DNA mají význam zejména pro typování multirezistentních
klinických kmenů. Důležitým faktorem ovlivňujícím základní biologické vlastnosti
bakteriálních kmenů jsou bakteriofágy, z nichž některé se přímo podílejí na virulenci kmenů a
produkci toxinů. Očekává se, že získané výsledky povedou k upřesnění výskytu a vzniku
3
virulentních kmenů v přirozených populacích. Vzhledem k širokému rozmezí hostitele mají
praktický význam také bakteriofágy polyvalentní (Pantůček et al., 1998).
V molekulárně genetické analýze bakteriálního genomu navazujeme na naše předchozí práce,
které byly zaměřeny na studium genetické variability u rozsáhlého souboru sbírkových a
terénních stafylokokových kmenů (Pantůček et al., 1996), jehož výsledkem bylo podstatné
zpřesnění taxonomického postavení jednotlivých koaguláza-negativních druhů v rámci rodu
Staphylococcus (Snopková et al., 1994). Další studie se týkaly lokalizace profágů na genomu
S. aureus (Borecká et al., 1996) a sestavení genetické a fyzikální mapy S. carnosus (Wagner
et al., 1998). Z epidemiologického hlediska byly detekovány a charakterizovány fenotypové
vlastnosti kmenů stafylokoků podílející se na jejich patogenitě (Růžičková, 1994a, b).
Dalším zástupcem bakteriálních patogenů, jejichž molekulární charakterizace je důležitá z
hlediska zdravotní ochrany obyvatelstva, je spirocheta Borrelia burgdorferi, která je
původcem onemocnění lymeskou borreliózou (LB). Výskyt tohoto onemocnění se v
posledních letech dostal na jedno z předních míst mezi sledovanými přenosnými nemocemi.
Zdrojem nákazy v Evropě mohou být všechna vývojová stádia klíštěte Ixodes ricinus - larva,
nymfa a dospělec. V poslední době se studium problému nemoci LB zaměřuje zejména na
otázku možné infikace zvířat a hlavně člověka jinými hematofágními členovci než klíšťaty.
Využitím molekulámě genetických metod je možno účinněji identifikovat patogenní borrelie
nacházející se u hematofágních členovců a další nové druhy patogenních spirochet nacházející
se u známých či potenciálních vektorů.
Stav v ČR a v zahraničí: Molekulární diagnostikou a DNA-typizací stafylokoků se žádné z
pracovišť v ČR vyjma našeho v uvedené šíři nezabývá. Překryvy mohou být pouze v aplikaci
jednotlivých metod. Tento závěr z vychází ze skutečnosti, že v odborné literatuře týkající se
dané problematiky nejsou práce českých autorů (vyjma spoluřešitelů VZ). Na molekulární
diagnostiku borrelií se již některá pracoviště zaměřila. V zahraničí, zejména v Německu a
Francii, existují specializovaná pracoviště zaměřená na molekulární diagnostiku a
epidemiologii bakteriálních patogenů na národní úrovni.
Borecká P., Rosypal S., Pantůček R., Doškař J. (1996): Localization of prophages of serological group B and F
on restriction fragments defined in the restriction map of Staphylococcus aureus NCTC 8325. FEMS Microbiol.
Lett. 143: 203-210.
Pantůček R., Götz F., Doškař J., Rosypal S. (1996): Genomic variability of Staphylococcus aureus and the
other coagulase-positive Staphylococcus species estimated by macrorestriction analysis using pulsed-field gel
electrophoresis. Int. J. Syst. Bacteriol., 46: 216-222.
Pantůček R., Rosypalová A., Doškař J., Kailerová J., Růžičková V., Borecká P., Snopková Š., Horváth R.,
Götz F., Rosypal S. (1998): The polyvalent staphylococcal phage 812: Its host-range mutants and related
phages. Virology 246: 41-252.
Růžičková, V. (1994a): Characteristics of strains of Staphylococcus aureus in dairy farms. Vet. Med. (Czech),
39: 37-44.
Růžičková, V. (1994b): A Rapid Method for the Differentiation of Staphylococcus aureus Hemolysins. Folia
Microbiol. 39: 112-114.
Snopková Š., Götz F., Doškař J., Rosypal S. (1994): Pulsed-field gel electrophoresis of the genomic restriction
fragments of coagulase-negative staphylococci. FEMS Microbiol. Lett. 124: 131-140.
Wagner E., Doškař J., Götz F. (1998): Physical and genetic map of the genome of Staphylococcus carnosus
TM300. Microbiology 144: 509-517.
Problematika 2. Garant: RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
Nejvýznamnějším modelovým organismem pro řešení funkční genomiky u rostlin se stala
Arabidopsis thaliana. Základními faktory, které předurčily A.thaliana k této roli, byly (i)
malý genom (přibližně 20 000 genů rozložených na 5 chromozomech), (ii) dobře
rozpracovaná genetika, (iii) krátký životní cyklus a (iv) dobré možnosti studia všech
základních biologických problémů. V posledních 10 letech vedlo soustředěné úsilí řady
4
špičkových laboratoří k vytvoření základů pro detailní poznání všech významných životních
pochodů u této rostliny. Hlavními dosaženými výsledky jsou (i) poznání sekvence velké části
genomu (s perespektivou ukončení sekvencování genomu do konce roku 2000), (ii) saturace
genomu inzerčními mutacemi (transpozony, T-DNA) umožňující snadnou izolaci mutace v
genu známé sekvence, (iii) zavádění systémů regulovatelné exprese transgenů a (iv)
rozpracování nových metodických přístupů pro studium transkripčních profilů genomu A.
thaliana za definovaných podmínek využívající nových technologií DNA čipů.
S využitím uvedeného metodického potenciálu A. thaliana byla získána řada zásadních
poznatků jak v oblasti základního tak aplikovaného výzkumu. Zásadních pokroků bylo u A.
thaliana dosaženo mimo jiné v oblasti studia regulace vývoje rostlin pomocí rostlinných
hormonů. Studium signální dráhy hormonu etylénu poskytlo první jednoznačný průkaz
existence receptoru hormonů u rostlin (Chang et al. 1993). Byl osvětlen vztah mezi
bisyntézou a účinkem další skupiny hormonů - brasinosteroidů (Li et al. 1996). Rozmanitost
metabolických transformací a komplexita účinku jedné z nejvýznamnějších skupin
rostlinných hormonů, cytokininů (CK), jsou příčinou poměrně nízké úrovně poznání jejich
působení. V současné době jsou vytvářeny předpoklady pro rychlý pokrok v poznání vztahů
mezi metabolismem a účinkem CK, detailní analýzu signálních drah CK (Kakimoto 1996) a
pochopení role CK v kontrole metabolismu a dopovědi na stresové faktory (Taniguchi et al.
1998).
Stav v ČR: Pracoviště genetiky na PřF MU je (kromě Dr. Gichnera a Velemínského z AV
ČR) jediné, které rozvíjí genetiku Arabidopsis nepřetržitě od r. 1965 a má tudíž v této oblasti
velké zkušenosti (viz souhrn Relichová 1990). Publikační analýza ukazuje, že se domácí
pracoviště funkční analýzou exprimovaných oblastí genomu A. thaliana pro objasnění
molekulární podstaty kontroly vývoje rostlin nezabývají. V současné době používají tuto
modelovou rostlinu v ÚMBR v Českých Budějovicích, ovšem k řešení jiné problematiky
(geneticky modifikovaných rostlin). Předpoklady předkládaného VZ pro úspěšné řešení
vycházejí z výsledků dosažených v oblasti vztahu mezi metabolismem a účinkem CK
(Brzobohatý et al. 1993, 1994), udělení a úspěšného řešení stávajících grantových projektů se
zahraničními pracovišti v oblastech příbuzných VZ a dlouhodobým výzkumem v oblasti
genetiky A. thaliana.
Brzobohatý, B., et al., Science, 262, 1051 (1993)
Brzobohatý, B., et al., Plant. Mol. Biol., 26, 1483, (1994)
Chang, C., et al., Science, 262, 539 (1993)
Kakimoto, T., Science, 274, 982 (1996)
Li, J., et al., Science, 272, 398 (1996)
Relichová, J., Biologické Listy 55 (2):81-92, (1990)
Taniguchi, M. et al., FEBS Lett., 429, 259(1998)
Problematika 3. Garant: Doc. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
U živočichů se v poslední době intenzivně rozvíjí výzkum mechanismů, které řídí procesy
buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy. Správný vývoj a udržování tkání závisí na
rovnováze mezi rychlostí, s jakou buňky na jedné straně rostou a diferencují a s jakou na
straně druhé vznikají a zanikají. U poškozených tkání je tato rovnováha často porušena, což
postiženému organismu zpravidla způsobuje vážné defekty. Mezi nejvážnější z nich patří
takové poruchy, které vedou ke vzniku maligních nádorů. Poznání podstaty maligní konverze
zdravých buněk je jedním z hlavních cílů současného biomedicínsky orientovaného výzkumu
v celosvětovém měřítku a představuje také stěžejní bod této části záměru. Strategie výzkumu
vychází ze známého faktu, že podstatou nádorotvorných procesů v buňce jsou genetické
5
změny na úrovni genů i chromozomů, které postihují funkce klíčových buněčných
regulátorů. Tyto regulátory jsou napojeny na komplexní buněčnou signální síť, která
zdravým buňkám umožňuje smysluplně reagovat na měnící se podmínky v extracelulárním
prostoru. Selháním uvedených regulátorů buňka ztrácí kontrolu nad vlastním chováním,
nereaguje na běžné buněčné regulační signály, např. nepřiměřeně rychle proliferuje, je
postižena její schopnost diferenciace a apoptózy a stává se pro postižený organismus velkou
zátěží. Je zřejmé, že poznání genetické podstaty buněčného signálního systému, který o
zmíněných procesech rozhoduje, je první podmínkou zavedení úspěšných protinádorových
terapií.
Jedním ze způsobů, jak prozkoumat úlohu jednotlivých proteinů v nitrobuněčných
signalizacích je genetický přístup, založený na cíleném přenosu příslušných genů do
modelových buněk, resp. organismů, indukci jejich exprese a studiu navozených
fenotypových změn. V řešitelském kolektivu jsou pracovníci, kteří mají velké zkušenosti s
přenosem genů (resp. cDNA) do leukemických buněk (Šmarda and Lipsick, 1993, Šmarda
and Lipsick, 1994, Šmarda et al., 1995, Engelke, Šmarda, et al. 1995, Zemanová and Šmarda,
1998a, b,c) a do genomu Drosophila melanogaster (Chroust et al. 1997). Analýzou stabilních
transfektantů monoblastů transformovaných onkogenem v-myb se např. podařilo prokázat, že
receptory pro kyselinu retinovou mají funkci nádorových supresorů, které zastavují proliferaci
těchto leukemických buněk ve fázi G1 buněčného cyklu a zároveň indukují jejich
diferenciaci do konečného diferenciačního stadia makrofágů (Šmarda et al., 1995). Podobnou
funkci mají také receptory pro retinoid X (Šmarda et al., 1999). Začlenění a exprese cizích
genů do modelových organismů, jakým je v našem studiu D. melanogaster nesoucí lidské
geny pro důležité metabolizační enzymy se ukazuje jako významný způsob odhadu
mutagenního rizika chemických látek. Na těchto organismech lze relativně jednoduše
provádět testy genotoxicity, které mají velkou výpovědní hodnotu ve vztahu k člověku.
Engelke, U., Šmarda, J. (1995): By-pass of TPA-induced differentiation and cell cycle arrest by the c-Myb
DNA-binding domain. Oncogene 11: 735-741.
Chroust, K., Kuglík, P., Relichová, J., et al. (1997): Drosophila melanogaster, Vicia faba and Arabidopsis
thaliana short-term bioassays in genotoxicity evaluation of air and soil samples from sites surrounding two
industrial factories in the Czech Republic. - Folia Biol. (Praha) 43, 71–78.
Šmarda, J. and J.Lipsick (1993): Dicistronic selection for nuclear proteins in living animal cells. Gene
137: 145-149.
Šmarda, J. and J. Lipsick (1994): c-Myb prevents TPA-induced differentiation and cell death in v-Myb
transformed monoblasts. Oncogene 9: 237- 245.
Šmarda, J. et al. (1995): Retinoic acid receptor α suppresses transformation by v-myb. Mol. Cell. Biol. 15:
2474-2481
Šmarda, J., Zemanová, K., Bryja, J., Šmardová, J.. Kozubík, A., Hofmanová, J., nemajerová, A., et al. (1999):
Retinoid X receptor suppresses transformation by the V-myb oncogene. J. Leuk. Biol. 66, in press
Zemanová K. and J. Šmarda (1998a): Oncoprotein v-Myb and retinoic acid receptor α are mutual
antagonists. Blood Cells, Molecules and Diseases 24 (11): 239-250.
Zemanová K. and J. Šmarda (1998b): A possible cross-talk of retinoic acid- and TPA-driven differentiation
pathways. Folia Biologica 44: 97-106.
Zemanová K. a J. Šmarda (1998c): Onkoprotein v-Myb zabraňuje apoptóze buněk HL-60 vyvolané
působením kyseliny retinové. Klinická biochemie a metabolismus, 6: 81.
Problematika 4. Garant: RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Telomery jsou nukleoproteinové struktury tvořící konce lineárních chromozomů a chránící je
před exonukleázovou degradací a fúzí. Při každé replikaci DNA dochází ke zkrácení telomer
v důsledku neúplné replikace 3' konců výchozích DNA, což nakonec vede až ke ztrátě
funkčních telomer, zastavení buněčného dělení, popř. ke vzniku chromozomálních aberací.
Nejznámějším mechanismem stabilního udržování délky telomer je nukleoproteinový
komplex zvaný telomeráza. Jde o specializovanou reverzní transkriptázu, která syntetizuje
6
telomerovou DNA podle templátové sekvence své RNA složky. Např. u člověka je aktivita
telomerázy omezena na buňky zárodečné linie, kmenové buňky obnovujících se tkání a na
buňky nádorové. Naproti tomu u rostlin byla zjištěna aktivita telomerázy ve všech tkáních
obsahujících dělící se buňky (Fitzgerald, McKnight et al. 1996, Riha, Fajkus et al. 1998), což
je v souladu s totipotentním charakterem rostlinných buněk. Vzhledem k tomu, že rostlinné
zárodečné buňky se diferencují z meristémů dospělých rostlin, vedla by absence telomerázy a
následné zkracování telomer při vývoji rostliny k postupnému vymizení telomer během
několika generací. Studium telomer, telomerázy a proteinů vážících se k telomeře je
rozpracováno u kvasinek, některých prvoků a u lidských buněk, a to především na
pracovištích v USA, Japonsku, Velké Británii a SRN. Podstatně méně je známo o struktuře
telomer a telomerázy u rostlin. Kromě našeho pracoviště se touto problematikou zabývají
ještě dvě laboratoře v USA (s jednou z nich začínáme spolupracovat na charakterizaci
katalytické podjednotky telomerázy) a jedno pracoviště v SRN (spolupráce na charakterizaci
vazebných proteinů telomer).
Na našem pracovišti bylo studium rostlinných telomer zahájeno zkoumáním struktury
telomerového chromatinu a délky rostlinných telomer (Fajkus, Kovařík et al. 1995, Kovařík,
Fajkus et al. 1996) a charakterizací napojení telomery na subtelomeru (Fajkus, Královics et
al. 1995). Naše laboratoř získala v r. 1996 světovou prioritu v objevu rostlinné telomerázy
(Fajkus, Kovařík et al. 1996). Nezávisle byly vzápětí publikovány obdobné výsledky dvou
laboratoří v USA (Fitzgerald, McKnight et al. 1996, Heller, Kilian et al. 1996). V letošním
roce byla ukončena první fáze studia vývojové regulace telomerázy v rostlinných buňkách
(Riha, Fajkus et al. 1998, Fajkus, Fulnečková et al. 1998) a na základě získaných výsledků
nám byly nabídnuty zmíněné spolupráce ze zahraničí.
Publikační databáze ukazují, že v rámci ČR se studiu struktury telomer a telomerázy dosud
žádné další pracoviště nevěnuje. Víme pouze o dvou klinických pracovištích, které by ve
spolupráci s námi měly zájem na zavedení metod analýzy telomer a exprese či aktivity
telomerázy pro diagnostické účely.
Fajkus, J., J. Fulnečková et al. (1998): Plant cells induce telomerase activity upon transfer to callus culture
without extensively changing telomere lengths. Mol. Gen. Genet., accepted for publication.
Fajkus, J., A. Kovařík et al. (1996): Telomerase activity in plant cells. FEBS Letters 391:307-309.
Fajkus, J., A. Kovařík et al. (1995): Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant
Nicotiana tabacum. Mol. Gen. Genet. 247:633-638.
Fajkus, J., R. Královics et al. (1995): The telomeric sequence is directly attached to the HRS60 subtelomeric
tandem repeat in tabacco chromosomes. FEBS Letters 364:33-35
Fitzgerald, M. S., T. D. McKnight et al. (1996): Characterization and developmental patterns of telomerase
expression in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:14422-14427.
Heller, K., A. Kilian et al. (1996): Telomerase activity in plant extracts. Mol. Gen. Genet. 252:342-345.
Kovařík, A., J. Fajkus et al. (1996): Species-specific evolution of telomeric and rDNA repeats in the tabacco
composite genome. Theor. Appl. Genet. 92:1108-1111.
Riha, K, J. Fajkus et al. (1998): Developmental control of telomere lengths and telomerase activity in plants.
Plant Cell 10(10):1691-1698.
7
2. Plnění stanovených cílů
V této části jsou uvedeny cíle tak, jak byly formulovány v návrhu VZ. U každé problematiky
je pak stručně uvedeno plnění stanovených cílů. Podrobněji jsou dosažené výsledky
komentovány a dokumentovány pod bodem 4.
Obecným cílem je studium struktury genomu ve vztahu k normální a patologické funkci
genů a úloha nekódujících oblastí genomu u zástupců hlavních skupin organismů.
V části týkající se bakteriálního genomu budou studovány genomy patogenních druhů se
záměrem praktického využití jejich molekulární identifikace v diagnostice. U rostlin bude
výzkum zaměřen na přiřazování biologické funkce jednotlivým známým i nově izolovaným
genům metodami funkční genomiky včetně reverzní genetiky u modelové rostliny
Arabidopsis thaliana. U živočichů a člověka jde o analýzu funkce cizích genů a jejich
regulačních mechanismů v procesech maligního bujení na buněčné úrovni, dále o funkce
cizích částí genomů na organismální úrovni po transgenozi u Drosophila melanogaster a
detekci patologických stavů vlivem chromozomových mutací u člověka. Výzkum
nekódujících oblastí genomu bude zaměřen na molekulární analýzu a význam důležité
genomové domény eukaryotických chromozomů – telomer.
Konkretizace cílů:
Problematika 1. Garant: doc. RNDr. Jiří Doškař, CSc.
U bakterií bude výzkum orientován na zpřesnění identifikace patogenních a klinicky
významných druhů molekulární analýzou jejich DNA (především rod Staphylococcus a
později i dalších bakteriálních druhů). Výsledky tohoto studia budou využity při diagnostice
patogenních druhů přípravou molekulárních sond. Výzkum bude orientován zejména na
rychlou a spolehlivou diagnostiku a typizaci klinicky významných druhů r. Staphylococcus,
zejména multirezistentních kmenů S. aureus, a dále na koaguláza-negativní stafylokoky, které
se vyskytují ve stále větší míře v humánním klinickém materiálu jako infekční agens.
Výsledky analýzy budou korelovány se standardními fenotypovými testy. Výsledky výzkumu
mají přímé praktické využití, např. identifikace původce stafylokokových nozokomiálních
infekcí přispěje k jejich léčbě a prevenci, neboť zejména mnohonásobně rezistentní kmeny
podle stávajících prognóz představují a budou i nadále představovat v celosvětovém měřítku
velmi závažný zdravotnický problém. Podobně budou identifikovány pomocí druhově
specifických primerů genomy patogenních spirochet u zástupců hematofágních členovců na
území ČR, především z čeledi Ixodidae, Simuliidae, Ceratopogonidae a Culicidae.
Monitorování výskytu a molekulární charakteristika této skupiny patogenů přispěje ke
zdravotní ochraně obyvatelstva.
Při řešení VZ se počítá s úzkou spoluprací jak s tuzemskými tak i zahraničními pracovišti
(Česká sbírka mikroorganismů PřF MU v Brně, Národní Referenční laboratoř pro stafylokoky
v Praze, Univerzita v Tübingenu, Univerzita ve Vídni aj.).
Časový postup:
1999-2000: Shromáždění a otestování souboru terénních a sbírkových kmenů jednotlivých
druhů r. Staphylococcus, stanovení jejich fenotypových charakteristik (biotypizace,
fagotypizace). Postupný odchyt hematofágních členovců na jednotlivých lokalitách ČR,
izolace spirochet z různých vektorů a srovnání jejich genomu pomocí PCR, analýza
spirochetálních proteinů pomocí metody PAGE.
Plnění stanovených cílů
Stanovené cíle pro rok 1999 byly splněny, tzn.,
8
•
•
byl shromážděn reprezentativní soubor stafylokokových kmenů z klinického materiálu,
byly stanoveny jejich fenotypové charakteristiky a zahájena genotypová analýza jako
základ pro zpřesnění diagnostiky a typizace.
Dále byl proveden odchyt hematofágních členovců z různých lokalit ČR, izolovány
spirochéty z různých vektorů a bylo provedeno srovnání jejich genomu pomocí PCRmetod.
Problematika 2. Garant: RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
U rostlin bude funkční analýza genomu zaměřena na identifikaci genů účastnících se
klíčových regulačních a metabolických procesů růstu a diferenciace rostlin analýzou
příslušných sekvencí genomu modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Dlouhodobým cílem
této oblasti výzkumného záměru je přispět k porozumění molekulární podstaty kontroly
růstových a diferenciačních procesů u rostlin na komplexní úrovni propojující fyziologii a
genetiku rostlin. Dosažení vytyčeného cíle bude zahrnovat (i) vyhledávání genů kódujících
proteiny se strukturními charakteristikami typickými pro regulační proteiny a proteiny
účastnící se klíčových metabolických procesů systematickou analýzou příslušných sekvencí
genomu Arabidopsis thaliana a dalších modelových organismů, (ii) následnou molekulární
charakterizaci identifikovaných proteinů s cílem předpovědi jejich biologických funkcí a (iii)
průkaz předpovězených funkcí na organismální úrovni přístupy reverzní i klasické genetiky.
Bude k tomu využito nejen kolekce mutantních genotypů získané v minulých letech na
pracovišti genetiky PřF klasickou mutagenezí, ale především bude využito možností, které se
nabízejí u T-DNA inzerčních mutantů, tj. lokalizace, izolace a charakterizace genů,
zodpovědných za konkrétní funkce v rostlinách. Získané poznatky budou sloužit jako základ
pro experimentální vyhodnocení potenciálu kontrolované ektopické exprese odpovídajících
genů a jejich rekombinantních derivátů pro cílené modifikace vlastností a reakcí rostlin.
Časový postup:
Průběžně. Postupné vyhledávání genů kódujících proteiny se strukturními charakteristikami
typickými pro regulační proteiny a proteiny účastnící se klíčových metabolických procesů.
Průběh této etapy závisí na rychlosti uvolňování sekvencí získaných sekvencováním genomu
Arabidopsis thaliana a dalších organismů do veřejně přístupných databází. Studium vztahu
mezi strukturou a funkcí vybraných klíčových proteinů metabolismu a signálních drah u
rostlin. Řešení navazuje a částečně se překrývá s grantovými projekty ES, INCO-Copernicus,
No. PL966135 a v r. 1999 GAČR 204/97/0154. U ostatních řešených grantových projektů
úkoly navazují na jejich výsledky.
Do r. 2000. studium vlivu řízené ektopické exprese vybraných genů kódujících proteiny
klíčového významu v metabolismu a regulačních procesech rostlin na vývoj a fyziologické
charakteristiky rostlin. Lokalizace některých těchto genů na chromozomy A. thaliana
metodami klasické a molekulární rekombinační analýzy. Vytvoření předpokladů pro aplikaci
funkční genomiky pro jednoznačné přiřazování biologických funkcí vybraným regulačním
genům.
Plnění stanovených cílů
Uvedené cíle pro rok 1999 byly v části řešené mimo zahrnuté grantové projekty interně
specifikované. Tato specifikace obsahovala:
• vytvoření infrastrukturních předpokladů pro aplikaci přístupů funkční genomiky u
Arabidopsis thaliana.
• pomocí počítačové analýzy vyhledávání regulačních genů a sekvencí významných pro
studium regulačních procesů u rostlin
• klonování a analýzu vybraných regulačních sekvencí na molekulární úrovni a následně na
úrovni in planta s využitím transgenních rostlin
9
•
•
•
lokalizaci genů A. thaliana pomocí molekulárních technik
studium podmínek exprese genů pro pozdní kvetení A. thaliana
analýzu výskytu embryonálně letálních mutací v přírodních populacích A. thaliana.
Hlavní část výsledků tvoří práce realizované v rámci projektu VS96096 a projektu GA ČR
204/97/0154, které jsou součástí tohoto VZ. Tyto základní cíle byly splněny a jsou podrobně
komentovány pod bodem 4.
Nad rámec těchto překrývajících grantových projektů
• byly vytvořeny základní infrastrukturní předpoklady pro aplikace přístupů funkční
genomiky pro studium molekulárních základů regulačních procesů u A. thaliana,
• byla zavedena technika transformace rostlin A. thaliana metodou vakuové infiltrace,
• z genomové DNA A. thaliana byl získán vývojově specifický promotor, který bude dále
charakterizován a využit při studiu vybraných regulačních procesů u A. thaliana,
• byla vypracována metodika genetického mapování pomocí mikrosatelitů,
• byly studovány podmínky exprese genů pro pozdní kvetení u Arabidopsis,
• byl proveden screening embryonálně letálních mutací v přírodních populacích A.
thaliana.
.
Problematika 3. Garant: doc. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
U živočichů a člověka bude výzkum orientován na analýzu funkce cizorodých genů, jednak
na buněčné, jednak na organismální úrovni a na detekci patologických stavů v genomu
člověka. Smyslem výzkumu na buněčné úrovni je získat původní poznatky o regulačních
mechanismech určujících proliferaci, diferenciaci a smrt živočišných a lidských buněk.
Exprese cizích genů na organismální úrovni bude studována u modelového organismu
Drosophila melanogaster po transgenozi. U člověka je hlavním záměrem rozvoj nových
metod detekce strukturních poruch genomu na úrovni sekvencí, genů a chromozomů. Bude
studována korelace mezi ztrátou, zmnožením a přemístěním genetického materiálu a
variabilitou fenotypových projevů specifických patologických stavů u člověka vedoucích ke
vzniku vrozených vývojových vad a nádorových onemocnění metodami molekulární
cytogenetiky.
Tato část výzkumného záměru si klade za cíl prozkoumat funkci některých klíčových
buněčných regulačních proteinů v leukemických buněčných liniích a to především z hlediska
jejich potenciálních protinádorových účinků. Strategie je založena na přenosu relevantních
genů (resp. cDNA) do vybraných leukemických linií, jejich cílené expresi a analýze důsledků
jejich přítomnosti na morfologii a další znaky buněk. Sledována bude především proliferační
aktivita, diferenciace a apoptóza. Mezi regulátory, které chceme tímto způsobem prozkoumat
patří např. regulační proteiny Fos, Jun, RAR, RXR, Myb, Bcl-2, CBP, atd. Většina těchto
faktorů realizuje svou funkci v buněčném jádře a jejich propojení s mimobuněčným
prostorem je zajištěno důležitými signálními kaskádami. V rámci tohoto záměru chceme
výzkum orientovat k bližšímu poznání těchto signálních drah. Konkrétně se budeme zabývat
úlohou vysoce nenasycených mastných kyselin (zejména kyseliny arachidonové a jejich
metabolitů - eikosanoidů) v přenosu signálů cytokinů TNF-α a TGF-β. Tato problematika
navazuje a dále rozvíjí grantové projekty GAČR, které v minulých letech byly a dosud jsou
řešeny. Odlišuje se od nich tím, že experimenty v rámci výzkumného záměru chceme
realizovat na odlišném modelovém systému, než který jsme používali dosud. Naším hlavním
modelovým systémem se stanou lidské leukemické buňky, především lidská leukemická linie
HL-60. Naší snahou je dosáhnout takových výsledků, které by byly relevantní pro lidskou
medicínu. Zaměříme se též na použití metod molekulární cytogenetiky pro studium přímé
10
korelace mezi výskytem primárních chromozomálních změn a typem nádorového
onemocnění, které slouží ke zpřesnění diagnózy nádorového onemocnění, volbě způsobu
léčby i kontrole její účinnosti. Ve spolupráci s Oddělením lékařské genetiky FN v Brně se
zaměříme na detekci genetických změn na úrovni chromozomů v interfázních buňkách
lidských solidních nádorů. Budou rozpracovány nové techniky FISH, které umožňují pomocí
DNA sond detekci buněčných klonů obsahujících amplifikované onkogeny (např. N myc
onkogen u neuroblastomu), aneuploidní sestavy chromozomů či specifické delece
a translokace chromozomů.
V rámci tohoto záměru budeme také rozvíjet program založený na využití transgenních
organismů. V naší laboratoři již využíváme kmeny transgenních Drosophila melanogaster
nesoucích některé lidské geny pro metabolizační enzymy, k testům genotoxicity čistých
chemických látek i vzorků prostředí. Takovéto využití transgenních drozofil se ukázalo jako
velmi slibné, neboť se tím zvýšila výpovědní hodnota testování genotoxicity vzhledem k
člověku. Proto byly tyto testy navrženy do nově se formulující legislativy ČR v oblasti
ekotoxikologie. Záměrem návrhu je průběžná molekulárně genetická analýza lidských
transgenů (CYP 2E1, CYP 2D6, glutathion S-transferáza) v hostitelském organismu
Drosophila melanogaster na úrovni DNA a RNA. Výsledky posledních experimentů v naší
laboratoři naznačují, že při využívání transgenních kmenů drozofil po dobu přesahující pět
roků došlo v některých ojedinělých případech ke spontánní změně původní sekvence
lidského genu. Vedle průběžného sledování úrovně, příčin a časových závislostí možné
změny struktury transgenu bude sledován také vliv testovaných substancí (mutagenů) na
možnou indukci mutací přímo v začleněném transgenu. Vzhledem k tomu, že test na
somatické mutace a rekombinace, který v naší laboratoři používáme, odpovídá spíše
chronickému působení mutagenu (expozice asi 72 hodin) a může tudíž vyvolávat změny na
úrovni transgenu, bude jako praktický výstup této částí problematiky stanovena průměrná
doba, po kterou je možné test na transgenních kmenech využívat, aniž by byla ovlivněna
aktivita enzymů exprimovaných lidských transgenů.
1999-2000: Příprava expresních vektorů pro nadprodukci studovaných proteinů v
transfekovaných leukemických buňkách. Konkrétně budou cDNA kódující proteiny c-Fos, cJun, v-Fos, v-Jun, Bcl-2, RXRβ, CBP začleněny pod kontrolu inducibilního promotoru
odvozeného od lidského genu pro metallothionein v plazmidu pMT-IRES-CD4 a to v
orientaci "sense“ i "anti-sense“. Kontrola správnosti provedených genových manipulací
restrikční analýzou a testy inducibilní exprese daných genů v přechodně transfekovaných
fibroblastech.
Analýza spontánních mutací lidských transgenů (CYP 2E1, CYP 2D6, glutathion Stransferáza) v hostitelském organismu Drosophila melanogaster na úrovni DNA.
Rozpracování nových postupů techniky FISH umožňujících detekci genetických změn na
úrovni chromozomů v interfázních buňkách lidských solidních nádorů v závislosti na typu
nádoru a způsobu zpracování. Konkrétně budou ověřovány postupy vykazující vysokou
účinnost hybridizace na zamražených nádorech, formalínem fixovaných nádorech
a parafínových řezech.
Jedná se o úkoly, které se částečně překrývají s cíli projektu GAČR 312/98/0679.
Plnění stanovených cílů:
Práce na projektech VZ probíhaly v roce 1999 podle plánu ve čtyřech rovinách.
Na PřF MU byla zprovozněna druhá laboratoř tkáňových kultur, ve které byly ve spolupráci
s Laboratoří cytokinetiky a průtokové cytometrie BFÚ AV ČR zavedeny metody kultivace
buněk in vitro a metody detekce základních parametrů buněčného růstu (proliferace,
diferenciace a buněčné smrti). Jako experimentální systém byl zaveden model indukce
11
diferenciace buněk lidské promyelocytární linie HL-60. S využitím tohoto modelu je
sledováno postavení metabolismu kyseliny arachidonové v průběhu indukované diferenciace
a jeho vliv na proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt.
Pro zamýšlenou cílenou expresi genů, jejichž funkce je spjata s řízením procesů
diferenciace, proliferace nebo apoptózy v leukemických buňkách, byly připraveny expresní
vektory nesoucí inducibilní formy genů p53, RhoG, RhoA, CDC42, c-Fos, c-Jun, v-Fos a vJun. Přenos těchto genů do leukemických buněk BM2 a HL-60 bude předmětem prací
v příštím roce.
Byla provedena analýza transgenů v živém organismu – lidského genu pro glutathion Stransferázu v modelovém systému Drosophila melanogaster. Analýza se zaměřila na studium
mutací tohoto transgenu metodami SSCP a přímou sekvenací.
Byly zavedeny metody molekulární cytogenetiky pro detekci prognosticky významných
genetických markerů u neuroblastomu a chronické myeloidní leukémie technikou
fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Ve spolupráci s Oddělením dětské onkologie
Fakultní nemocnice v Brně byly tyto metody úspěšně zavedeny v klinické praxi.
Problematika 4. Garant: RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Samostatnou část tvoří výzkum nekódujících oblastí genomů. Tyto sekvence tvoří zpravidla
většinu celkové délky eukaryotických genomů. Fakt, že nekódují sekvenci proteinů nebo
RNA, přitom zdaleka neznamená, že jde o oblasti málo významné z hlediska funkce genomu.
Např. všechny tři základní známé funkční elementy eukaryotických chromozomů centromery, počátky replikace a telomery – jsou tvořeny nukleoproteinovými komplexy,
jejichž složkou DNA není kódující sekvence. Posledně jmenovaná genomová doména,
telomera a její metabolismus, je dominantním objektem práce na této části záměru. Bude
provedena charakterizace nukleotidových sekvencí tvořících ve spojení se specifickými
proteiny telomery a subtelomery eukaryotických chromozomů a bude analyzována
mikrostruktura konců rostlinných telomer. Dále bude provedena charkterizace vlastností
rostlinné telomerázy, zjištěna její tkáňová specifita a závislost na diferenciačním stavu buňky.
Předmětem zájmu bude také podjednotkové složení komplexu telomerázy - nukleotidová
sekvence RNA složky, charakterizace proteinových podjednotek telomerázy a jejich
interakce.
1999-2001. Charakterizace podjednotkového složení nukleoproteinového komplexu rostlinné
telomerázy: izolace RNA složky a stanovení její nukleotidové sekvence, izolace proteinové
podjednotky s aktivitou reverzní transkriptázy a příprava klonování její cDNA.
Jde o úkoly částečně se překrývající s cíli projektu MŠMT VS97032, v případě proteinové
podjednotky telomerázy se jedná o rozšíření původních cílů.
1999-2000. Stanovení mikrostruktury konců rostlinných chromozomů: určení délky a
kvantitativního zastoupení jednovláknových přesahů telomerové DNA, sekvenční
charakterizace dalších spojovníků mezi telomerou a centromerou (potenciální chromozomspecifické sondy).
Jedná se o cíle stanovené v rámci projektu MŠMT VS97032 specificky rozšířené o podrobnou
analýzu jednovláknových přesahů.
Plnění stanovených cílů:
Základní část výsledků tvoří práce realizované v rámci projektu MŠMT VS97032 „Analýza
biologicky významných molekulárních komplexů“. Díky začlenění do VZ a dodatečné
finanční podpoře bylo možno rozšířit původní cíle projektu VS97032 o studium
12
rekombinačních faktorů kvasinek a prezentaci dosažených výsledků na mezinárodních
konferencích.
V roce 1999 byly publikovány nezávisle dvě práce (japonská skupina Hideo Takahashi a
americká skupina Dorothy Shippen), v nichž byla popsána cDNA sekvence katalytické
podjednotky telomerázy Arabidopsis thaliana. Vzhledem k tomu, že s oběma pracovišti
máme spolupráci (s japonskou skupinou společný projekt financovaný japonským min.
školství „MONBUSHO“ a v americké laboratoři našeho stážistu K. Říhu), byly nám tyto
výsledky poskytnuty ještě před publikací v tisku. Vzhledem k tomu jsme práce v tomto směru
na našem pracovišti pozastavili a zaměřili se na charakterizaci telomer-vazebných proteinů.
V tomto směru jsme dosáhli významné priority – zjištění inhibice rostlinné telomerázy
telomer-vazebnými proteiny extrahovanými z rostlinných tkání negativních na telomerázovou
aktivitu. V analýze telomer-vazebných proteinů budeme pokračovat v příštím roce.
Práce na katalytické podjednotce bude dále pokračovat ve spolupráci se zahraničními
pracovišti (např. skupinou Dorothy Shippen nám budou poskytnuty klony cDNA katalytické
podjednotky telomerázy, které budou naší laboratoří použity k vyhledávání genů
interagujících proteinů). Proto byla letos dále propracovávána technika THS a zahájena
příprava cDNA knihoven modelových rostlin. K tomuto účelu, který přesahuje rámec projektu
VS97032 byly použity prostředky VZ.
Koncem roku byla dokončena ve spolupráci se skupinou D. Shippen analýza
jednovláknových přesahů rostlinných telomer u modelové rostliny Silene latifolia a vrcholí
práce na paralelní studii u A. thaliana.
13
3. Zabezpečení výzkumného záměru
(a) Odborné zabezpečení
Odborné zabezpečení bylo v návrhu VZ formulováno z hlediska obecného takto:
VZ "Genomy a jejich funkce" vychází z dlouholetých tradic výzkumu a výuky v rámci
experimentální biologie na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity v Brně. Z
tradičních oborů rozvíjených po dlouhá léta na biologických katedrách, jako je mikrobiologie,
fyziologie živočichů a rostlin, obecná genetika a molekulární biologie se v posledních letech,
v reflexi na nové trendy v biologii vyprofilovalo zaměření na molekulární a genetickou
podstatu biologických funkcí. Z této profilace vzešel i celý obor magisterského studia,
Molekulární biologie a genetika, který má na fakultě dvacetiletou tradici a neklesající vysoký
zájem ze strany studentů i praxe. V návaznosti na společenský zájem o tento obor úspěšně
probíhá i výuka v bakalářském studiu oboru Buněčná a molekulární diagnostika. Navrhovaný
VZ je v působnosti tří oborových rad postgraduálního doktorandského studia: Molekulární a
buněčná biologie, Genetika a Fyziologie a vývojová biologie živočichů. Předkládaný VZ má
tedy bezprostřední návaznost na výzkumnou a pedagogickou profilaci školy tak jako v
minulých desetiletích, tak do budoucna, neboť se jedná o oblast velmi intenzívně celosvětově
rozvíjenou.
Perspektiva rozvoje výzkumu v oblasti studia molekulární biologie a genetiky byla v poslední
době podpořena projekty v rámci programu "Posílení výzkumu na vysokých školách",
konkrétně projektem "Laboratoř molekulární fyziologie rostlin", který vznikl na PřF MU v
roce 1996 a "Laboratoř analýzy biologicky významných molekulárních komplexů" z r. 1997.
Vědecká erudice pracovníků zmíněných laboratoří a moderní přístrojové vybavení umožňují
výrazně zkvalitnit výzkum v dané oblasti.
Bylo proto účelné propojit výzkumné zaměření na stávajících katedrách a nově vzniklých
výzkumných laboratořích do komplexního výzkumného záměru Přírodovědecké fakulty
Masarykovy univerzity.
Dále bylo v návrhu VZ konstatováno, že daný výzkum je propojen se třemi výše uvedenými
obory doktorského studijního programu (DSP) na Přírodovědecké fakultě MU a každoročně
se počítá s účastí celkem asi 20 diplomantů magisterského studia a asi 20 studentů DSP.
Návrh byl podložen celkem 43 grantovými projekty řešenými od roku 1995 členy kolektivu
VZ. Z tohoto počtu bylo celkem 27 projektů vědeckovýzkumných, řešených převážně po
tříleté období, dva z programu MŠMT "Posílení výzkumu na VŠ" a 14 jednoletých vědeckopedagogických projektů.
V průběhu roku 1999 nenastaly žádné změny v tomto zabezpečení. Pouze grantové projekty,
na jejichž podkladě VZ vznikl, byly ukončeny nebo byly začleněny přímo do VZ.
Součástí VZ jsou tyto grantové projekty:
MSMT VS96096 „Laboratoř molekulární fyziologie rostlin“.
Odpovědný řešitel: RNDr. B. Brzobohatý, CSc.
Rok ukončení: 2000
MSMT VS97032 „Laboratoř analýzy biologicky významných molekulárních komplexů“.
Odpovědný řešitel: RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
GA ČR 204/97/0154 „Analýza rostlinných systémů genové regulace konstitutivní aktivací
genů“
Spoluřešitel: Prof. RNDr. J. Relichová, CSc.
Rok ukončení: 1999.
14
GA ČR 301/97/1192 „Molekulární identifikace a typizace klinicky významných stafylokoků“
Řešitel: Doc. RNDr. J. Doškař, CSc.
GA ČR 312/98/0679 „Interakce proteinů MYB, FOS, JUN a retinoidových receptorů při
antileukemických procesech“
Řešitel: Doc. RNDr. J. Šmarda, CSc.
(b) Personální zabezpečení
Personální zajištění členěné podle jednotlivých problematik uvádí následující tabulka.
V tabulce jsou uvedeni pouze vysokoškolští pracovníci. Z poznámky jsou patrné personální
změny. Tyto změny nejsou z hlediska řešení problematiky podstatné.
Vysvětlivky:
KGMB – Katedra genetiky a molekulární biologie
KFŽ – Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie
KFAR – Katedra fyziologie a anatomie rostlin
LMFR – Laboratoř molekulární fyziologie rostlin
LAMK - Laboratoř analýzy biologicky významných molekulárních komplexů
A – Akademičtí pracovníci vykonávající kromě výzkumu i výuku
N – Neakademičtí pracovníci pracující na výzkumu
Jméno a tituly
Doškař Jiří, Doc.RNDr.CSc.
Kailerová Jana, RNDr. CSc.
Pantůček Roman, Mgr. PhD.
Rosypal Stanislav, Prof.RNDr.DrSc.
Růžičková Vladislava, RNDr.CSc.
Šerý Omar, Mgr.
Žákovská Alena, RNDr. PhD.
Pracoviště Prac. zařazení
KGMB
Docent
KGMB
Výzkumný pracovník
KGMB
Odborný asistent
KGMB
Profesor
KGMB
Odborný asistent
KFŽ
Odborný pracovník 0,5
KFŽ
Odborný asistent
Brzobohatý Břetislav, RNDr.CSc.
Hejátko Jan, Mgr.
Klánová Jana, RNDr.
Konečná Hana, RNDr.
Kuderová Alena, RNDr.CSc.
Lexa Matej, Ing.PhD
Mlejnek Petr, RNDr.CSc.
Nejedlá Eliška, RNDr.CSc.
Koukalová Šárka, Mgr.
Zouhar Jan, Mgr.
Kiran Nagavalli Subbanna, MSc.
Rotkovská Julie, Ing.
Genkov Todor Nikolaev, PhD.
Bubeníčková Hana, Mgr.
Reková Alena, Bc.
Pernisová Markéta, Bc.
Lízal Pavel, Mgr.
Relichová Jiřina, Prof.RNDr.CSc.
Řepková Jana, RNDr.CSc.
Dubová Jaroslava, RNDr.CSc.
Hermanová Klára, Ing.
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
LMFR
KGMB
KGMB
KGMB
KFAR
KFAR
poznámka
A
N
A
A
A
N
A
N
N
N
N
N
N
N
N
Odborný pracovník
N
N
N
N
Odborný pracovník
N
Odborný pracovník 0,5 N
Výzkumný pracovník 0,5 A
Profesor
A
Odborný asistent
A
Odborný asistent
A
A
do 31.8.99
do 31.3.99
od 1.1.99
od 1.1.99
od 8.11.99
od 1.10.99
od 1.5.99
od 10.5.99
do 31.8.99
15
Hájková Martina, Ing.
KFAR
Odborný pracovník
N
Šmarda Jan, Doc.RNDr.CSc.
Chroust Karel, RNDr.Ing.PhD.
Kailerová Jana, RNDr. CSc.
Kuglík Petr, RNDr.CSc.
Šimek Vladimír, Prof.RNDr.CSc.
KGMB
KGMB
KGMB
KGMB
KFŽ
Docent
Odborný asistent
Odborný asistent
Profesor
A
A
N
A
A
Fajkus Jiří, RNDr.CSc.
Fajkusová Lenka, RNDr.
Fulnečková Jana, Mgr.
Horáková Mirka, Mgr. (Hulánová)
Krejčí Lumír, Mgr.
Poláčková Klára, Bc.
Skříšovská Lenka, Mgr.
Skleničková Marie, Mgr.
Sýkorová Eva, Mgr.
Krejčí Kateřina, Mgr. PhD.
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
LAMK
N
N
N
A
A
N
N
N
N
N
od 1.10.99
2.10.99MD
od 28.6.99
od 1.7.99
od 1.4.99
od 1.4.99
(c) Prostorové a materiálně technické zabezpečení
Prostorové zabezpečení není ideální a odpovídá omezeným možnostem na PřF. Na Katedře
genetiky a molekulární biologie byla po havárii provedena rekonstrukce umývárny skla.
Nadále zůstává neúnosný stav laboratoře v suterénu, který však vyžaduje úplnou a tedy
finančně nákladnou rekonstrukci. Stísněné prostorové podmínky neumožňují ve výzkumné
laboratoři LMFR zapojit více studentů magisterského studia a doktorského studijního
programu do badatelských aktivit pracoviště.
Z neinvestičních prostředků VZ a částečně i z prostředků projektu VS 96096 byla v suterénu
zbudována kultivační místnost pro kultivaci A. thaliana za dlouhého a krátkého dne a
definovaných světelných a tepelných podmínek.
Dr. Žákovská prozatím se pracuje v nouzových laboratořích, ve kterých není dostatečný
prostor a podmínky na výzkumnou práci. V současné době je však navržena rekonstrukce tří
místností na PřF pro účely molekulárně-biologického a imunologického výzkumu a pro
výuku, která je již schválena rektorátem MU a bude realizována v průběhu roku 2000. V
těchto laboratořích se bude provádět také výzkum týkající se problematiky tohoto
výzkumného záměru. Z tohoto hlediska bude nezbytné použít část finančních prostředků z VZ
na přístrojové a materiální vybavení.
Vzhledem k omezeným prostorovým možnostem na PřF je pro nás přínosem, že vedení
Biofyzikálního ústavu AV ČR poskytlo prostory pro práci kolektivu Laboratoře analýzy
biologicky významných molekulárních komplexů. V tomto roce poskytlo vedení BFÚ další
laboratoř, takže problematika výzkumu rekombinačních faktorů s příslušným vybavením
(termocykler, centrifuga, třepačka, inkubátor, lednička) byla účelně prostorově oddělena od
problematiky rostlinných a lidských telomer (zábrana možným kontaminacím a důsledné
oddělení prostor pro práci s radioaktivitou).
16
Materiálně-technické vybavení bylo doplněno plánovanými investicemi: byly pořízeny
kultivační skříně, které umožní studium vlivu mutací a exprese transgenů na regulační
procesy u rostlin A. thaliana za definovaných podmínek vnějšího prostředí. Dále byl pořízen
flow-box, který je nezbytný pro zabezpečení zvýšených požadavků na práci ve sterilních
podmínkách (transformační experimenty a rostlinné tkáňové kultury).
Z neinvestičních prostředků bylo pořízeno několik položek spadajících do kategorie „drobný
hmotný majetek“: digitální váha, automatická a digitální pipeta, zařízení pro horizontální
elektroforézu nukleových kyselin, Dewarova nádoba na tekutý dusík, mraznička, vařič, přesná
váha, paměť a mechanika k PC, rotor k centrifuze a kovové regály do nové kultivační
místnosti. Všechny tyto položky jsou a budou intenzivně využívány při řešení projektů VZ.
K řešení projektu bylo pracovníky Laboratoře analýzy biologicky významných molekul
částečně využíváno i zařízení BFÚ AV ČR (Phosphofluoroimager STORM, konfokální a
fluorescenční mikroskop, prostory skleníku aj.) a recipročně byly v rámci možností využívány
přístroje Laboratoře (sterilní box, hlubokomrazící pult, ultracentrifuga) tak, aby byla
maximálně využita kapacita těchto zařízení.
Ostatní čerpání neinvestičních prostředků nespadá do materiálně-technického vybavení a
bude rozebráno pod bodem 5 této zprávy.
17
4. Dosažené výsledky
Dosažené výsledky jsou členěny podle jednotlivých problematik. Jsou doplněny (a) citacemi
prací publikovaných nebo přijatých k publikaci, (b) rukopisy prací v recenzním řízení nebo
připravenými do tisku a (c) příspěvky na konferencích. U příspěvků na konferencích formou
abstraktu nebylo vždy možné uvést odvolávku na příslušný grantový projekt. U publikací
vzešlých ze zahrnutých grantů jsou uvedeny všechny publikace z roku 1999, i když bylo
řízení k jejich přijetí zahájeno v roce předchozím. Publikace pod těmito kódy (a) až (c) jsou
součástí přílohy. Dosažené výsledky jsou dále doplněny (d) diplomovými a dizertačními
pracemi, které bylo možno řešit nebo zadat na základě finančních a materiálních možností
získaných z VZ. Pod bodem (e) jsou uvedeny přednášky a v posledním bodě (f) jsou uvedeny
spolupráce se zahraničními pracovišti.
Problematika týkající se genomu bakterií – garant: doc. J. Doškař
Byly shromážděny a na základě fenotypových znaků (biotypizace, fagotypizace, rezistence k
antibiotikům) charakterizovány následující skupiny kmenů: 26 kmenů S. aureus MRSA
(rezistentních k oxacilinu) z LF UP v Olomouci. U těchto kmenů byla provedena SmaImakrorestrikční analýza genomových DNA, která identifikovala 11 odlišných
elektroforetických typů. Hybridizační sondou, připravenou ze SmaI-44 kb fragmentu, byla
zpřesněna typizace studovaných kmenů. Specifické sondy, připravené z DNA mírných fágů
3A, 53 a 77 prokázaly, že MRSA kmeny jsou polylyzogenní a obsahují ve svém genomu
profágy seroskupin A, B a F. Byla provedena analýza obsahu plazmidů. Polymorfismus
genomu kmenů byl stanoven taktéž metodou PCR (koaguláza, mezerníkové oblasti). Bylo
shromážděno 18 kmenů S. aureus, produkujících exfoliatiny z Národní referenční
laboratoře pro stafylokoky v Praze. Kmeny jsou testovány na citlivost k polyvalentním
bakteriofágům. Dále je u těchto kmenů prováděna analýza genomové a plazmidové DNA z
hlediska jejich příbuznosti. Pokračuje analýza 25 kmenů S. aureus produkující toxiny. Na
základě makrorestrikční analýzy genomové DNA byla stanovena příbuznost 19 TSST-1pozitivních, 4 enterotoxin-pozitivních a 3 enterotoxin-negativních kmenů S. aureus S
použitím specifických tst primerů byla ověřena možnost použití PCR-produktu (značeného
DIG-dUTP) jako sondy v tečkové hybridizaci u izolátů S. aureus ve srovnání se zástupci
jiných druhů stafylokoků. Pomocí hybridizace se značenou sondou byla zjištěna přibližná
lokalizace tst genu v genomové DNA. Byly porovnány metody RFLP a PCR, z hlediska
možnosti detekce a typizace toxinogenních izolátů S. aureus. Výsledky této části práce byly
prezentovány formou referátu (Hrstka, R. Růžičková, V., 1999).
Byly shromážděny též koaguláza negativní stafylokoky a na základě fenotypových znaků
(biotypizace, fagotypizace, rezistence k antibiotikům) charakterizovány následující skupiny
kmenů: 30 kmenů S. epidermidis a 23 kmenů S. haemolyticus z LF UP v Olomouci, 40
kmenů S. hominis subsp. hominis a S. hominis subsp. novobiosepticus z Národní referenční
laboratoře pro stafylokoky v Praze. S využitím molekulárně biologických metod (RFLP,
PFGE a PCR) pokračovala typizace všech výše uvedených skupin kmenů s ohledem k jejich
klíčovým fenotypovým vlastnostem, jakými jsou rezistence k antibiotikům (zejména MRSA,
oxacilin rezistentní koaguláza negativní stafylokoky a multirezistentní kmeny) a produkce
extracelulárních faktorů vztahujícím se k patogenitě a virulenci (koaguláza, enterotoxiny,
exfoliatiny a TSST-1 toxin).
V poslední době bylo popsáno několik nových druhů rodu Staphylococcus. Zaměřili jsme se
na Staphylococcus carnosus a blízce příbuzný Staphylococcus piscifermentans. S. carnosus je
používán v potravinářském průmyslu, kde je vzhledem ke způsobu jeho aplikace důležitá jeho
identifikace. Na základě podrobné numerické analýzy 100 fenotypových znaků byly
studované kmeny druhů S. carnosus a S. piscifermentans rozděleny do vzájemně odlišných
18
klastrů, které korespondovaly s výsledky analýzy genomu pomocí metod PFGE, ribotypizace
a RAPD-PCR. V této studii bylo modelově na příkladě dvou druhů stafylokoků prokázáno, že
DNA typizační techniky ve spojení s numerickou analýzou podstatně upřesňují klasifikaci
blízce příbuzných druhů, jelikož umožňují rozlišit např. fenotypově konvergentní kmeny na
základě jejich genomových profilů. Výsledky této práce podpořily popis dvou nových taxonů
v rámci rodu Staphylococcus, a to nový druh Staphylococcus condimenti a nový poddruh
Staphylococcus carnosus subsp. utilis. Tato práce byla publikována v IJSB (Pantůček et al.
1999).
Jelikož většina genotypových metod používaných v současné době je vhodná pro typizaci
jednotlivých kmenů daného druhu, ne však pro identifikaci druhů, přistoupili jsme k přípravě
molekulární sondy specifické pro S. aureus jako nejvýznamnějšího patogeního druhu
stafylokoků. Srovnáním spekter Eco RI genomové DNA 13ti kmenů S. aureus subsp. bylo
vybráno několik potenciálních Eco RI fragmentů na přípravu specifické sondy. Fragmenty
byly klonovány a byly z nich připraveny značené sondy. Jako specifická pro S. aureus se
ukázala 2 kb sonda, což se ověřilo hybridizací s DNA 43 dostupných druhů a poddruhů rodu
Staphylococcus. Po určení nukleotidové sekvence sondy byly navrženy primery pro rychlou
detekci S. aureus pomocí PCR. Podmínky PCR reakce byly ověřeny a optimalizovány na
vybraném souboru kmenů stafylokoků, takže identifikce druhu se zjednodušila, zrychlila a
zautomatizovala. Specifita připravené sondy byla ověřena jak hybridizací s DIG-značenou 2
kb DNA sekvencí, tak pomocí specifických PCR primerů odvozených z této sekvence na 297
kmenech. Pozitivní výsledek byl získán oběma metodami na všech 216 testovaných S. aureus
a negativní výsledek u všech z 81 testovaných druhů jiných než S. aureus.
Byla provedena komplexní charakteristika genomu bakteriofágů Mezinárodní typizační řady,
která umožnila připravit specifické sondy pro detekci profágů v genomu S. aureus (Doškař et
al. 1999). Tato část práce byla financována převážně z prostředků VZ. Navázali jsme též
na výsledky práce týkající se vztahu polyvalentních fágů ke kmenům rodu Staphylococcus a
citlivosti S. aureus k těmto fágům (Pantůček et al. 1998). Bylo stanoveno rozmezí hostitelů
polyvalentních fágů na velmi rozsáhlém souboru kmenů rodu Staphylococcus. Dále byl
ověřen na modelovém příkladu restrikčně-deficientních (r-) mutantů Staphylococcus carnosus
F2 postup izolace nových mutantů polyvalentních bakteriofágů.
Podle plánu byl prováděn pravidelný sběr klíšťat Ixodes ricinus na parkové lokalitě v Brně
Pisárkách a na lokalitě Vysoké Mýto a jejich vyšetřování na přítomnost spirochét v trávicím
traktu mikroskopickou metodou. Vzorky s mikroskopicky ověřeným průkazem přítomnosti
spirochét byly dále zpracovávány metodou PCR ke stanovení přítomnosti patogenního druhu
Borrelia sp. Z více infikovaných klíšťat byly provedeny izolační pokusy k získání
spirochetální kultury k dalšímu zpracování. Byl prováděn odchyt hlodavců jako vektorů
onemocnění lymeskou borreliózou na lokalitě Studénka a stanovení jejich kvantitativního a
druhového zastoupení. Na přítomnost spirochét byly z těchto hlodavců testovány též vzorky
z močového měchýře, ledvin a sleziny k získání spirochetálních kultur. Studium bylo
doplněno sledováním přítomnosti spirochét též u ektoparazitů. Všechny plánované cíle se tak
podařilo splnit.
Přehled publikovaných prací
(a) Publikace ve vědeckých časopisech
a1 Pantůček R., Sedláček I., Doškař J., Rosypal S. (1999): Complex genomic and
phenotypic characterization of the related species Staphylococcus carnosus and
19
Staphylococcus piscifermentans. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 941-951 (ISSN 00207713). (IF = 3,724)
(b) Rukopisy
b1 Doškař J., Pallová P., Pantůček R., Rosypal S., Růžičková V., Pantůčková P.,
Kailerová J., Klepárník K., Malá Z., and Boček P. (1999): Genomic relatedness of
bacteriophages of the International Typing Set as a basis for the preparation of
specific probes detecting prophages of serogroups A, B and F in lysogenic strains of
Staphylococcus aureus. Virology (zasláno do tisku).
b2 Štěpán J., Pantůček R., Doškař J., Rosypal S. (1999): Nucleotide sequence, accession
number
AJ132803
(SAU132803).
Submitted
(05-FEB-1999)
to
the
EMBL/GenBank/DDBJ databases.
b3 Žákovská A., Šerý O., Pejchalová K., Bašta J., Horváth R., Janouškovcová E.,
Halouzka J. Monitoring of the presence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes
ricinus ticks in the years 1996 - 1998 park Pisarky (BRNO): Dark - field microscopy
and PCR method.
(c) Abstrakta z konferencí
c1 Doškař J., Růžičková V., Pantůček R., Rosypal S. (1999): The host-range lytic
activity of polyvalent staphylophages as a basis for antistaphylococcal treatment.
Symposium on polymer-associated infections. University of Tübingen, November 5-7,
1999.
c2 Hrstka R., Růžičková V. (1999): Molekulární typizace a identifikace toxinogenních
kmenů Staphylococcus aureus. "3. pracovní setkání biochemiků a molekulárních
biologů", Přírodovědecká fakulta MU v Brně, 3. února 1999 Brno.
c3 Kašpárek P., Hobza R., Kizek R., Pantůček R., Růžičková, V., Hájek V., Rosypal S.,
Doškař J. (1999): Genotypová variabilita kmenů Staphylococcus aureus rezistentních
k oxacilinu. "3. pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů",
Přírodovědecká fakulta MU v Brně, 3. února 1999 Brno.
c4 Štěpán, J., Pantůček, R., Růžičková, V., Rosypal, S., Doškař, J. (1999): Příprava
molekulární sondy pro identifikaci kmenů druhu Staphylococcus aureus. "3. pracovní
setkání biochemiků a molekulárních biologů", Přírodovědecká fakulta MU v Brně, 3.
února 1999 Brno.
c5 Štěpán J., Pantůček R., Růžičková V., Rosypal S., Doškař J. (1999): Preparation of
species-specific molecular probe for identification of Staphylococcus aureus strains.
Sborník souhrnů a přednášek, p. 15. VIII. konference mladých mikrobiologů
Tomáškovy dny '99. 2. - 3. června 1999, Brno
c6 Bašta, J., Žákovská A., Horváth R., Pejchalová K. and Hulínská: Detection of Borrelia
burgdorferi sensu lato in Ticks Ixodes ricinus Using Dark–field Microscopy and
Subsequent Single–step PCR. VIII. International Conference on Lyme Borreliosis nad
other Emerging Tick–Borne Diseases, Munich, Germany, June 20 – 24, 1999
c7 Žákovská A., Nečasová M., Horváth R., Pechmann V., Šerý O.: The Following of
Dynamics of Antibodies against Borrelia in the Sera of wild–living Rodents. VIII.
International Conference on Lyme Borreliosis nad other Emerging Tick–Borne
Diseases, Munich, Germany, June 20 – 24, 1999.
c8 Žákovská A., Halouzka J., Janouškovcová E., Horváth R. Changes in Protein
Composition of Spirochete Isolates during the Passage with the PAGGE method. VIII.
International Conference on Lyme Borreliosis nad other Emerging Tick–Borne
Diseases, Munich, Germany, June 20 – 24, 1999.
20
c9 Žákovská A., Šerý O., Pejchalová K., Bašta J., Horváth R., Janouškovcová E.,
Halouzka J. Monitoring of presence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes
ricinus ticks in the years 1996 – 1998 in Park Pisarky (Brno): Dark–field microscopy
and PCR method. 3rdInternational conference Ticks and Tick–Borne Pathogens,
Slovakia, August 30 – September 3, 1999
(d) Diplomové a dizertační práce
Diplomové práce
d1 Jitka Faitová: Stanovení genotypové variability kmenů S. haemolyticus.
d2 Eva Zahradníčková: Analýza genomu klinických kmenů S. epidermidis.
d3 MbayeAbdou Madgib: Molekulární charakterizace toxinogenních kmenů S. aureus.
d4 Roman Hobza: Studium polymorfismu genomu kmenů S. aureus pomocí PCR.
d5 Jana Hradilová: Studium genomové variability a molekulární identifikace toxinpozitivních kmenů Staphylococcus aureus
d6 Roman Rybář: Genomová variabilita a typizace kmenů S. hominis izolovaných
z klinického materiálu.
d7 Kašpárek Petr: Chrarakterizace plazmidů kmenů druhu Staphylococcus aureus
rezistentních k antibiotikům
d8 Lenka Justinová: Zpracování výsledků 3 - letého pozorování promoření klíšťat
spirochétami na lokalitě Pisárky.
d9 Martina Stehlíková: Monitorování výskytu spirochet v klíšťatech na lokalitě Pisárky
v Brně.
d10 Kateřina Pejchalová: Dynamika výskytu a identifikace spirochet v hematofágních
členovcích.
d11 Lucie Čapková: Monitorování výskytu spirochet v hematofágních členovcích.
d12 Silvie Šikutová: Ekologie spirochet vybraných skupin hematofágních členovců.
d13 Eva Janouškovcová: Studium změn bílkovinného spektra spirochet jednotlivých pasáží.
Dizertační práce:
d14 Roman Hrstka, Mgr.: Genotypová variabilita genomu toxinogenních kmenů S. aureus.
d15 Jiří Štěpán, Mgr.: Příprava specifické sondy pro identifikaci kmenů S. aureus.
d16 Petra Pallová, Mgr.: Molekulární charakterizace genomu fága 53.
d17 Petr Kašpárek, Mgr.: Analýza genomu polyvantního stafylokokového fága.
Problematika týkající se genomu rostlin. Garant: dr. B. Brzobohatý.
Výsledky dosažené v rámci VS 96096, který byl včleněn do VZ "Genomy a jejich funkce"
Katalytické vlastnosti β-glukozidázy Zm-p60.1
Byla zavedena citlivá metodika stanovení volných cytokininů s využitím techniky
ELISA. Metodami enzymové kinetiky byly, s využitím ELISA stanovení množství
uvolněného zeatinu v reakčním prostředí, stanoveny kinetické parametry Km a Vmax βglukozidázy Zm-p60.1 vůči jejímu nejčastěji se vyskytujícímu přirozenému substrátu Oglukozidu zeatinu.
Studium vztahu mezi strukturou a funkcí β-glukozidázy Zm-p60.1
Analýza kinetických parametrů purifikovaných mutantních forem enzymu prokázala,
že karboxylové zbytky katalyzující hydrolýzu β-glukozidické vazby poskytují
aminokyselinové zbytky E188 (součást motivu NEP) a E403 (součást motivu ITENG). Tyto
21
výsledky jsou ve shodě s výsledky modelování trojrozměrné struktury Zm-p60.1, v níž NEP a
ITENG leží na smyčkách, u nichž je nejvyšší pravděpodobnost podílu na vytváření
katalytického centra enzymu. Pozoruhodným výsledkem, zjištěným u některých mutant ve
smyčce nesoucí ITENG, byla porucha v tvorbě, případně stabilizaci kvarterní formy enzymu.
Výsledek naznačuje, že uvedená oblast může, vedle podílu na samotném katalytickém kroku
enzymu, participovat v síti interakcí stabilizujících enzymaticky aktivní kvarterní strukturu
enzymu.
Aminokyselinové zbytky, které se mohou podílet na determinaci substrátové specifity
enzymu, byly určeny analýzou modelu trojrozměrné struktury β-glukozidázy Zm-p60.1.
Původní verze modelu, vytvořeného ve spolupráci s Max-Planck-Institut für
Züchtungsforschung, SRN, byla v roce 1999 dále zdokonalena ve spolupráci s Laboratoří
struktury a dynamiky biomolekul PřF MU. Na základě rozboru topologie potenciálního
aktivního centra enzymu a jeho bezprostředního okolí byl předpovězen podíl na interakcích
určujících substrátovou specificitu enzymu u F193 a M258. Byla zahájena příprava mutant
nesoucích následující záměny aminokyselinových zbytků - F193I/Y/W a M256I. Míra
správnosti predikce podílu F193 a M256 na molekulárním rozpoznání a vazbě substrátu do
katalytického centra enzymu bude studována metodami enzymové kinetiky.
Byly vytvořeny základní předpoklady pro započetí pokusů o krystalizaci enzymu a
následnou analýzu jeho trojrozměrné struktury metodou difrakce rentgenových paprsků.
Garant proto navrhuje rozšířit původní úkoly plánované pro tuto část projektu o vyhledávací
experimenty, jejichž cílem bude nalézt podmínky pro úspěšnou krystalizaci enzymu. Tím by
byl vytvořen předpoklad pro podání cílené grantové přihlášky pro vyřešení trojrozměrné
struktury enzymu metodou difrakce rentgenových paprsků. První pokusy v tomto směru byly
započaty ve spolupráci s Laboratoří struktury a dynamiky biomolekul PřF MU, která nedávno
úspěšně ukončila takovýto projekt u jiného enzymu.
Změny subcelulární lokalizace β-glukozidázy Zm-p60.1, využití systémů regulovatelné
exprese transgenů pro produkci modifikovaných forem β-glukozidázy Zm-p60.1 v
transgenních rostlinách
Byla dokončena analýza úspěšnosti přesměrování β-glukozidázy Zm-p60.1 do vakuoly
(Zm-p60.vb a Zm-p60.vc) a extracelulární matrix (Zm-p60.ex). Výsledky získané dříve
metodou subcelulární frakcionace indikovaly úspěšnost přesměrování. Úspěšnost
přesměrování byla potvrzena výsledky analýzy přesměrování metodami "pulse-chase",
fluorescenční konfokální mikroskopie a elektronové mikroskopie.
Byla ukončena konstrukce transgenních rostlin umožňujících kontrolovatelnou
produkci Zm-p60.1 a vybraných derivátů s pomocí regulovatelného promotoru. V současné
době probíhá předběžná analýza těchto rostlin.
Molekulární analýza buněčně autonomní pylové sterility spojené s akumulací βglukozidázy Zm-p60.1 v průběhu vývoje pylu
Analýza transgenních rostlin exprimujících cDNAZm-p60.1 pod kontrolou pylově
specifických promotorů vedla k závěru, že exprese cDNAZm-p60.1 v pylových zrnech sama o
sobě není příčinou CAPS.
Křížením rostlin exprimujících cDNAZm-p60.1 pod kontrolou CaMV35S, které
exprimují cDNAZm-p60.1 v prašnících mimo pylová zrna, a výše uvedených rostlin
exprimujících cDNAZm-p60.1 z pylově specifických promotrů a následnou segregační
analýzou je zkoumána případná nutnost exprese cDNAZm-p60.1 jak v pylových zrnech tak
pletivech, které je v prašnících obklopují. Vzhledem k technickým problémům při kultivaci a
křížení potřebného počtu rostlin nebyl experiment doposud uzavřen.
22
Souběžně s výše uvedenými experimenty je zkoumána možnost navození CAPS u
rostliny T7 inzercí T-DNA do genu nezbytného pro biologickou aktivitu pylu. Metodou
inverzní PCR byla klonována část rostlinné genomové DNA do níž je T-DNA inzerována.
Počítačová analýza jak nukleotidové sekvence samotné tak aminokyselinových sekvencí
kódovaných všemi šesti možnými kombinacemi otevřených čtecích rámců nevedla k
identifikaci genu případně proteinu s významným stupněm příbuznosti. Byla zahájena
charakterizace inzerčního lokusu metodami Southern a Northern blotů.
Vzhledem k odchodu pracovníka (RNDr. Petr Mlejnek, CSc.), který se zabýval
vývojem techniky DDRT-PCR v LMFR, na jiné pracoviště se nejeví reálným dosáhnout
publikační výstup spočívající na této technice do konce roku 2000. Řešitel proto navrhuje
pokračování příslušných experimentů pouze formou vyhledávacích prací, které mohou
potenciálně vyústit později v samostatnou grantovou přihlášku pro řešení této tematiky a
přesun uvolněných lidských a finančních kapacit na projekty, které vykázaly nejlepší
publikační výstupy a mají potenciál poskytnout do konce roku 2000 další významné
publikační výstupy.
Funkce homologů bakteriálních regulátorů indukovatelných dusičnany v rostlinách
Arabidopsis thaliana
V roce 1999 se nám podařilo identifikovat v databázích, které shromažďují dosavadní
výsledky sekvenování genomu Arabidopsis thaliana, 16 sekvencí vykazující charakteristiky
ARR genů. S využitím primerů specifických jak pro jedinečné tak konzervované oblasti ARR
genů, se nám podařilo amplifikovat metodou PCR z genomové DNA Arabidopsis thaliana 9
délkově odlišných PCR fragmentů. Z nich jsme doposud 5 úspěšně klonovali, sekvenovali a
přiřadili k sekvencím uveřejněným v databázích. V současné době jsou tyto fragmenty
používány jako molekulární sondy pro vyhledávání mutací v kolekci rostlin Arabidopsis
thaliana mutagenizované náhodnými inzercemi derivátu kukuřičného transpozonu v jaderném
genomu této rostliny. Na podzim roku 1999 byl pro řešení této problematiky udělen post-doc
grant Ing. Mateji Lexovi, PhD. (GA ČR 204/99/D024, garant: B. Brzobohatý).
Nad rámec zahrnutého grantového projektu bylo možné rozvinout problematiku v těchto
směrech:
Byly vytvořeny základní předpoklady pro aplikaci přístupů funkční genomiky pro
studium molekulárních základů regulačních procesů u Arabidopsis thaliana.
V badatelské oblasti lze za základní úspěch uvést etablování techniky transformace A.
thaliana metodou vakuové infiltrace.
Metodou PCR byl získán z genomové DNA A. thaliana promotor aktivní specificky v
průběhu meiotického dělení. Jedná se o promotor, který byl nedávno popsán jinou pracovní
skupinou, ale vzhledem k biotechnologické významnosti není poskytován jiným pracovištím.
Byla vytvořena transkripční fuze mezi tímto promotorem a reporterovým genem GUS, který
nám umožní ověření specificity promotoru v transgenních rostlinách A. thaliana. Získaný
promotor bude významným nástrojem pro studium regulace reprodukčních procesů rostlin.
V infrastrukturním zabezpečení VZ lze za zásadní úspěch považovat pořízení
kultivačních skříní, které umožní kultivace A. thaliana za definovaných podmínek a následně
detailní analýzy fenotypových změn u izolovaných mutant a připravených transgenních
rostlin. Vzhledem k drastické redukci finančních prostředků proti původnímu rozpočtu (o
téměř 50%) bylo nezbytné využít část prostředků VS96096 k vytvoření dodatečných
kultivačních prostor adaptací místnosti v suterénu budovy B4. Bez přispění VS96096 by bylo
nemožné zajistit plnění VZ v následujícím období v oblasti zabezpečované garantem. Pořízení
flow-boxu bylo nezbytné pro zajištění zvýšeného rozsahu práce s rostlinnými explantáty a
transformačních experimentů v následujících letech řešení VZ. Dále byly vytvořeny
23
personální a technické předpoklady pro detailní anatomickou charakterizaci procesů vývoje
pylu u A. thaliana na úrovni světelné mikroskopie.
Genetická analýza inzerčních mutantních linií A. thaliana.
Tato část byla součástí zahrnutého grantového projektu.
Do pokusů byly zahrnuty 4 embryonálně letální mutace a jedna morfologická mutace. U
všech T-DNA mutantů byl selektovatelným markerem gen pro rezistenci k hygromycinu
(hpt).
Geny determinující embryonálně letální mutace byly lokalizovány do vazbových skupin
pomocí morfologických signálních linií pro jednotlivé chromozomy. Pomocí klasického
rekombinačního mapování byly mutace VIII-41-1 a VIII-82-1 lokalizovány do 4. vazbové
skupiny, mutace VIII-111-1 do 1. vazbové skupiny a VIII-75-1 do 5. vazbové skupiny.
Genetická analýza ukázala, že v segregující generaci F2 dochází ke značnému úbytku
mutantních (transgenních) fenotypů a zvýšení počtu standardních (netransgenních) fenotypů.
Výsledky byly publikovány v Kocábek et al. 1999 a Relichová a Řepková 1999.
Gen hpt byl využit pro podrobnější molekulární analýzu jedné embryonálně letální mutace
(VIII-75-1). Byla vypracována a použita metoda PCR pro detekci transgenních rostlin
prostřednictvím genu hpt. U obou reciprokých křížení rostlin heterozygotních pro
embryonální letalitu s rostlinami standardními byla sledována přítomnost Hyg+ a Hyg- rostlin.
Bylo zjištěno, že přenos transgenu je silně redukován samčím gametofytem ve srovnání se
samičím gametofytem (Řepková, Relichová et al. 1999).
Navíc z VZ bylo možno přikročit k molekulárnímu mapování:
Pro přesnou lokalizaci nově identifikovaných mutací do genetické mapy je nezbytné použití
molekulárních markerů. V průběhu letošního roku byla vypracována metoda rekombinačního
molekulárního mapování prostřednictvím mikrosatelitů. Metoda byla aplikována u jedné
inzerční T-DNA morfologické mutace (se změnou struktury trichomů) a jedné embryonálně
letální mutace (VIII-75-1). Prozatím bylo použito 10 mikrosatelitových markerů (nga 63 a nga
280 pro první chromozom, nga 1126 a nga 168 pro druhý chromozom, nga 162 a nga 6 pro
třetí chromozom, nga 1111 a nga 1107 pro čtvrtý a nga 225 a nga 76 pro pátý chromozom)
Arabidopsis. Gen determinující vývoj trichomů byl lokalizován do 1. (marker nga 63) a do 3.
(marker nga 162) vazbové skupiny. S oběma markery byla zjištěna poměrně silná vazba
s podílem rekombinant 7,0 a 8,2 %. To svědčí o translokaci fragmentu obsahujícího
sledovaný gen. U embryonálně letální mutace je připravena izolovaná DNA z mutatntních
rostlin F2 generace a v současné době probíhá molekulární analýza. Kompletní výsledky
budou v příštím roce.
Doplňující činnost LMFR
Laboratoř molekulární fyziologie rostlin plní částí své kapacity funkci Centrální laboratoře
speciálních technik molekulární biologie Masarykovy univerzity v souladu se zněním
projektu VS96096 programu 250 „Posílení výzkumu na vysokých školách“. Dostupnost
unikátního přístrojového vybavení LMFR umožňuje využívání těchto technik nejen
biomedicínskými pracovišti MU, ale také dalšími výzkumnými a vývojovými ústavy a
laboratořemi. Intenzivní spolupráce s mnoha subjekty je podložena mj. Dohodami o vědecké
spolupráci, které uzavřela LMFR s řadou pracovišť. Předmětem spoluprací je zejména (i)
výzkum a vývoj v oblasti molekulární biologie, (ii) výzkum, vývoj a aplikace metod
spojených s novými postupy používanými v molekulární biologii, zejména se syntézou
oligonukleotidů, sekvenováním DNA, fragmentační analýzou DNA a purifikací biopolymerů,
(iii) výchova mladých odborníků v oblasti aplikací metod molekulární biologie.
24
Výzkum, vývoj a aplikace nových metod molekulární biologie se týkají především těchto
oblastí:
• Navrhování, syntéza a charakterizace oligonukleotidů
Pracoviště poskytuje kompletní systém navrhování, syntézy, purifikace a kontroly kvality
běžných i modifikovaných oligonukleotidů. V roce 1999 se dále rozšířilo spektrum pracovišt'
spolupracujících na poli syntézy a využití oligonukleotidů . Kvalitu práce této části LMFR
zřejmě nejlépe odráží dynamika nárůstu zájmu dalších pracovišt' o spolupráci v uvedené
oblasti.
• Analýza sekvence a délek fragmentů DNA
V roce 1999 byl zaveden nový postup při sekvenování DNA založený na nové generaci kitů
"Big Dye" využívající nový způsob fluorescenčního značení terminátorů. Současně jsme
přešli k separaci na delších kapilárách plněných novým dělicím polymerem POP 6. Těmito
optimalizacemi bylo dosaženo zvýšení průměrné délky spolehlivě stanovených sekvencí u
jednoho templátu o 50%. Současně se zvýšila spolehlivost sekvenování PCR fragmentů a
jiných obtížně sekvenovatelných templátů. V současné době pracoviště sekvenuje rutinně
kromě inzertů klonovaných v běžných malých vektorech také inzerty v BAC vektorech a PCR
fragmenty. Během roku 1999 byla dále zdokonalena analýza délek fragmentů (fragmentační
analýza). Zásadním přínosem ke zvýšení kvality získávaných dat byl přechod na nový dělicí
polymer POP 4. Rutinně je toto metodou prováděna analýza mikrosatelitů.
• Perfuzní chromatografie biopolymerů
Systém pro perfuzní chromatografii BioCAD je využíván pro charakterizaci a purifikaci
oligonukleotidů a rekombinantních proteinů v rámci výzkumných úkolů Laboratoře i dalších
akademických pracovišť.
Členství Centrální laboratoře speciálních technik molekulární biologie Masarykovy
univerzity v Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF)
Centrální laboratoř speciálních technik molekulární biologie MU se stala v roce 1999
členem ABRF, mezinárodní organizace sdružující obdobné univerzitní laboratoře. Posláním
této asociace je zprostředkovávat komunikaci mezi členy (www stránka, elektronický časopis,
internetové diskuzní fórum), ustavovat specializované sekce a navrhovat a realizovat
mechanismy mezinárodního hodnocení práce centrálních laboratoří. Členství v ABRF umožní
naší Laboratoři mimo jiné sladit užívanou metodiku vyhodnocování kvality a efektivnosti
práce tohoto typu pracovišt' s mezinárodními standardy a dosáhnout tak obecně platného
uznání světových parametrů dosahovaných výsledků, které jistě přispěje při integraci MU do
systému evropských univerzit.
Další organizační zabezpečení badatelské činnosti - Minisklady
Centrální laboratoř spravuje se souhlasem děkanátu PřF MU tzv. minisklady produktů
firem Roche (Boehringer), Serva a Duchefa. Cílem miniskladů je minimalizovat dodací lhůty
pro produkty potřebné pro realizaci experimentální práce tím, že zásoba standardních
produktů je neustále monitorována a doplňována tak, aby spektrum produktů zvolené lokální
akademickou komunitou bylo vždy okamžitě dostupné pro experimentální práci. Případné
ztráty spojené s prošlými expiračními lhůtami a pod. nesou výše uvedené komerční firmy.
Publikace
(a) Publikované práce:
25
a2 Kuderová, A., Nanak, E., Truksa, M., Brzobohatý, B.: Use of Rifampicin in T7 RNA
Polymerase-Driven Expression of a Plant Enzyme. Rifampicin Improves Yield and
Assembly. Protein Expression and Purification, 16, 3, 405-409. 1999. IF = 1,822
a3 Zouhar, J., Nanak, E., Brzobohatý, B.: Expression, single step purification and matrixassisted refolding of cytokinin-specific beta-glucosidase. Protein Expression and
Purification 17, 153 –162, 1999. IF = 1,822
a4 Kocábek, T., Rakouský, S., Ondřej, M., Řepková, J., Relichová, J. (1999): Identification
and mapping of a T-DNA induced flower mutation in Arabidopsis thaliana. Biol. Plant.
42(3):349-359. IF=0,413
a5 Relichová, J. and Řepková, J.: Are the T-DNA mutants amenable to standard
recombination analysis?. Biol. Plantarum. In press. IF=0,413
a6 Relichová, J. and Bolormaa, S.: Somaclonal variation and embryonic lethal mutations in
Arabidopsis. Scripta – Biology, Fac. Sci. Nat. Univ. Masarykianae Brunensis. In press.
a7 Rotrekl, V., Nejedlá, E., Kučera, I., Abdallah, F., Palme, K., Brzobohatý, B.: The role of
cysteine residues in structure and enzyme activity of a maize beta-glucosidase.
European Journal of Biochemistry, 1999. IF = 3,578
a8 Zouhar, J.: Afinitní chromatografie proteinů na vázaných kovových iontech. Chemické
listy, 1999. IF = 0,159
a9 Dubová, J., Mlejnek, P., and Brzobohatý, B.: Dynamics of beta-glucosidase Zm-p60.1
ectopic expression during transgenic pollen development: a histochemical approach.
General Physiology and Biophysics, 1999. IF = 0,259
a10 Kristoffersen, P., Brzobohatý, B., Höhfeld, I., Bako, L., Mekonian, M., and Palme, K.:
The maize Zm-p60.1 gene encodes a plastid localized cytokinin-glucoside specific betaglucosidase: Developmentally regulated expression pattern and histochemical
characterization. Planta, 1999. IF = 3,300
(c) Příspěvky na konferencích
c10 Dubová, J., Mlejnek, P., Brzobohatý, B. Dynamics of β-glucosidase Zm-p60.1 ectopic
expression during transgenic polen development: A histochemical approach. Abstracts
of the 1998 Annual Symp. of the Slovak Histochemical and Cytochemical Society.
Histochemical J. 31:270, 1999
c11 Kocábek, T., Rakouský, S., Řepková, J., Relichová, J. (1999)“ Identification and
mapping of the T-DNA tagged flower mutation of Arabidopsis thaliana revealed the
SUPERMAN epigenetic allele. Abstr. Third Symp. Ser. Recent Advances in Plant
Biotechnology, From Cells to Crops, Inst. Plant Genetics and Biotechnology Nitra,
Stará Lesná, Slovakia, 4.-10.9. 1999, p. 105
c12 Řepková, J., Relichová, J., Chytilová, E. (1999): Stability of the T-DNA insertional
embryonic lethal mutants in Arabidopsis. Abstr. Third Symp. Ser. Recent Advances in
Plant Biotechnology, From Cells to Crops, Inst. Plant Genetics and Biotechnology
Nitra, Stará Lesná, Slovakia, 4.-10.9. 1999, p.131
c13 Benková, E., Kovaleva, V., Raikhel, N.V., and Brzobohatý, B.: Targeting of a maize
plastid β-glucosidase to the vacuole and the extracellular matrix in transgenic tobacco
plants. Book of Abstracts MSU-DOE Plant Research Laboratory, US Department of
Energy Site Visit, Kellogg Biological Station, Hickory Corners, MI, 18-19. September,
1999.
c14 Dubová, J., Hermanová, K., Brzobohatý, B.: Transgenic approach in pollen
development study. Acta Biologica Cracoviensia, Vol. 41 suppl.1 - Book of Abstracts
IX. International Conference of Plant Embryologists. 20-22. September, 1999, Cracow,
Poland.
26
c15 Lexa M.: Studium lokalizace asimilace dusičnanů v rostlinách s využitím klasických a
molekulárně-biologických metod. 3. pracovní setkání biochemiků a molekulárních
biologů, Brno, 3. 2. 1999.
c16 Konečná H.: Nový typ informační molekuly: PNA. 3. pracovní setkání biochemiků a
molekulárních biologů, Brno, 3. 2. 1999.
c17 Lexa M., Cheesman J. M.: Příjem dusíku a růst recipročních štěpů hrachu odrůdy Juneau
a mutantů A317 s nízkou aktivitou nitrátreduktasy. 3. pracovní setkání biochemiků a
c18 Zouhar J., Nanak E., Brzobohatý B.: Single step purification and matrix –assisted
refolding of oligohistidine tagged cytokinine specific beta-glucosidase. 3. pracovní
setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 3. 2. 1999.
c19 Skříšovská L., Brzobohatý B.: Studium funkce evolučně konzervovaných zbytků
kyseliny glutamové a asparagové u kukuřičné beta-D-glukosidasy Zm-p60.1. 3.
pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 3. 2. 1999.
c20 Klánová J.: Zkušenosti s využitím metody fragmentační analýzy DNA na ABI PRISM
310. 3. pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 3. 2. 1999.
c21 Kuderová A., Nanak E., Truksa M., Brzobohatý B.: Použití rifampicinu při expresi
proteinů v systému řízeném TiRNA polymerázou. 3. pracovní setkání biochemiků a
c22 Hejátko, J., Grosskopf, D., Lehnen, M., Palme, K., Brzobohatý, B.: Využití metod T –
DNA inzerční mutageneze při funkční analýze genomu Arabidopsis thaliana. 3.
pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 3. 2. 1999.
Diplomové práce
d18 Skříšovská Lenka: Studium funkce evolučně konzervovaných zbytků kyseliny glutamové
a asparagové u kukuřičné β-glukozidázy Zm-p60.1.
d19 Nejedlík Jan: Konstrukce transgenních rostlin Nicotiana tabacum exprimujících chimérní
transkripční aktivátor NLhG4.
d20 Pernisová Markéta: Regulovatelné systémy exprese transgenu u Arabidopsis thaliana
d21 Šmeral Miloslav: Identifikace aminokyselinových zbytků zúčastňujících se na interakci
beta-glukozidázy Zm-p60.1 se substrátem
d 22 Reková Alena: Molekulární klonování a charakterizace integračního lokusu T-DNA u
transgenní rostliny tabáku vykazující buněčně autonomní pylovou sterilitu
d 23 Bubeníčková Hana: Hodnocení stability embryonálně letálních mutací získaných
inzerční mutagenezí u Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
d 24 Lukešová Miroslava: Genetická analýza inzerčních mutací ovlivňujících morfologii
květu A. thaliana
d25 Doležalová Heda: Lokalizace nových inzertních mutací Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
do genetické mapy
d 26 Kyjovská Zdena: Cytogenetická analýza embryonálně letálních mutací Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh.
d 27 Ryšávka Petr: Identifikace transgenních rostlin Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
d 28 Kocmánková Zuzana: Selekce nových inzerčních mutací Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh.
d 29 Komárková Tereza: Genetické mapování embryonálně letální mutace Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh.
Dizertační práce
27
d 30 Borkovcová Petra, Mgr.: Molekulární a biochemická charakterizace vybraných členů
rodiny „photorelay“ mediátorů, které se mohou účastnit přesunu signálu hormonu
cytokininu u rostlin.
d 31 Guo Jian Chun, MSc. - Čína: Regulated expression of ipt gene by pOp transcription
system in Arabidopsis
d 32 Hejátko Jan, Mgr.: Izolace a molekulární charakterizace mutantů Arabidopsis thaliana
vykazujících defekty v kontrole větvení
d 33 Kiran N.S., MSc. - Indie: Role of sub-cellular compartmentation in the regulation of
cytokinin metabolism and action.
d 34 Rotrekl Vladimír, Mgr.: Strukturní a funkční analýza kukuřičné β-glukosidasy.
d 35 Slaný Michal, Mgr.: Vliv bodových mutací na katalytické vlastnosti β-glukosidazy.
d 36 Šámalová Markéta, Mgr.: Vliv řízené lokální nadprodukce cytokininů na vývojové
procesy u tabáku.
d 37 Zouhar Jan, Mgr.: Biochemická charakterizace mutací ovlivňující strukturu a katalytické
vlastnosti kukuřičné β-glukosidasy.
d 38 Lízal Pavel, Mgr.: Studium exprese genů u Arabidopsis thaliana
d 39 Chytilová Eva, Mgr.: Aktivace genů pomocí T-DNA tagging.
(e) Přednášky
e1 Brzobohatý, B.: A tight system for regulated expression of isopentenyl transferase gene,
ipt, in transgenic tobacco. Předneseno na: Department of Plant Sciences, University of
Oxford, Oxford, Velká Británie
(f) Spolupráce se zahraničními pracovišti
f1 V roce 1999 proběhla pracovní návštěva Prof. N.V. Raikhel, vedoucí pracovní skupiny na
MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, USA, která se podílela na
analýze úspěšnosti přesměrování Zm-p60.1 do vakuoly a extracelulární matrix (viz kapitola
1.3). V průběhu návštěvy byly vyhodnoceny výsledky dosažené v průběhu spolupráce,
zahájena práce na rukopisu shrnujícím dosažené výsledky a Prof. Raikhel seznámila
akademickou obec PřF MU a dalších univerzitních a akademických pracovišt' v Brně a Praze
s výsledky práce její laboratoře a novými výzkumnými trendy, kterými se bude její laboratoř
zabývat v nastávajícím pětiletém období.
Zahraniční stáže:
f2 Brzobohatý Břetislav, RNDr., CSc., Plant Research Laboratory, MSU-DOE Michigan
State University, East Lansing, MI, USA, visiting scholar, 7-9/99
f3 Brzobohatý Břetislav, RNDr., CSc.: Department of Plant Sciences, University of Oxford,
Oxford, UK, visiting scholar, 10-12/99
f4 Lexa Matej, Ing., PhD.: Department of Plant Sciences, University of Oxford, Oxford, UK,
visiting scholar, 9,11/99
f5 Hejátko Jan, Mgr.: MPI für Züchtungsforschung, Köln, SRN, PhD student, 10-12/99
Problematika výzkumu genomu živočichů. Garant: doc. J. Šmarda
Vzhledem k tomu, že první část projektu spočívala v zavedení zcela nové laboratoře
tkáňových kultur na Katedře fyziologie živočichů a obecné zoologie a s tím souvisejících
experimentálních modelů, jsou dosažené výsledky pouze dílčí a z velké části vzniklé ve
spolupráci s Laboratoří cytokinetiky a průtokové cytometrie BFÚ AV ČR v Brně. Hlavním
výsledkem je postupné zavádění metod umožňujících postihnout základní cytokinetické
28
parametry buněčných populací in vitro, jako např. proliferaci (počty buněk, metabolická
aktivita – MTT), diferenciaci (buněčná morfologie, funkční testy diferenciace – NBT) a
buněčnou smrt (apoptóza – stanovená podle změn morfologie buněk). Osvojení těchto metod
umožňuje vlastní experimentální práci zabývající se postavením metabolizmu kyseliny
arachidonové a jejích metabolitů (eikosanoidů) v procesech ovlivňujících proliferaci,
diferenciaci a buněčnou smrt nádorových buněk.
Dalším cílem této části VZ bylo navázat na projekty GAČR 312/95/1212, 301/96/K047 a
312/98/0679, které byly (resp. jsou) zaměřeny na výzkum mechanismů řídících proliferaci,
diferenciaci a apoptózu leukemických buněk. Experimentální strategie této skupiny je
založena na přípravě inducibilních forem suspektních genů a jejich cílené expresi
v leukemické linii kuřecích monoblastů transformovaných onkogenem v-myb. Následnými
experimenty se testují fenotypové změny indukované cizorodými geny v těchto buňkách,
přičemž největší pozornost je věnována případným změnám proliferace a diferenciace.
V prvním roce řešení VZ byly připraveny inducibilní formy následujících genů: v-jun, v-fos,
c-jun, c-fos, antisense-jun a antisense-fos (v těchto případech se jedná o překryv
s problematikou řešenou projektem GAČR 312/98/0679). Navíc byly připraveny inducibilní
formy genů p53, RhoG, RhoA a CDC42 (připraveno pouze v rámci VZ). Ve všech případech
byly cDNA uvedených genů genetickými manipulacemi začleněny pod kontrolu inducibilního
promotoru odvozeného od lidského genu pro metalothionein plazmidu MT-IRES-CD4.
Přítomnost cizorodých DNA v plazmidovém vektoru byla prověřena restrikční analýzou a
následně byly provedeny testy jejich exprese v přechodně transfekovaných fibroblastech a to
buď westernovým nebo northernovým blottingem. V současné době pracujeme na přenosu
těchto DNA do monoblastů transformovaných onkogenem v-myb a purifikaci stabilních
transfektantů, ve kterých budou následně vyhodnoceny případné proliferační a diferenciační
změny vyvolané přítomností produktů exogenních genů.
V části týkající se detekce změn na chromozomech, které se exprimují jako nádorové
onemocnění byla věnována pozornost neuroblastomu, což je nádor periferního nervového
systému, který představuje druhý nejčastější pevný nádor u dětí. S prognózou těchto
onemocnění významně koreluje několik biologických markerů, jako např. stupeň ploidie
buňky, delece chromozomu 1 a stupeň amplifikace onkogenu N-myc. Znalost molekulárně
biologických a klinických parametrů umožňuje definovat podskupiny pacientů s různou
prognózou a stanovit pro ně odlišné terapeutické strategie. Pro rychlé a přímé určení
genetických markerů v preparátech připravených z otisků čerstvých nebo zamražených
nádorů a v roztěrech kostní dřeně byla metodicky rozpracována a modifikována interfázní
fluorescenční hybridizace in situ. Bylo provedeno molekulárně cytogenetické vyšetření 8
pacientů, u nichž byly sledovány specifické cytogenetické markery před i po provedení
příslušné terapie.
U pacientů s chronickou myeloidní leukémií byla technikou FISH opakovaně vyšetřována
přítomnost translokace t(9;22) vedoucí k tvorbě fúzovaného genu bcr-abl. Tato informace pak
byla využita při testování experimentální léčby a monitorování zbytkového nádorového
onemocnění.
V části zabývající se využití transgenních D. melanogaster byla provedena řada
experimentů zaměřených na detekci mutací lidského genu pro glutathion S transferázu
v hostitelském organismu D. melanogaster. Výsledky dosud provedených analýz
nukleotidové sekvence tohoto genu zatím jednoznačně neprokázaly existenci změn ve
srovnání s původní sekvencí, i když z některých experimentů lze odvodit, že ke vzniku
spontánních mutací transgenu v hostitelských kmenech drozofil skutečně dochází. Tyto
předběžné výsledky musí být ještě potvrzeny opakovanými analýzami nukleotidových
sekvencí transgenu pocházejícího z různých kmenů a také z jednotlivých individuí. Navíc
29
byla v letošním roce rovněž zahájena analýza genů GST-D1 a GST-2 endogenního původu
genomu D. melanogaster. Výsledky jsou připraveny k publikaci.
(a) Publikace
a11 Šmarda, J. Structure and function of erythropoietin. A review. Scripta .- Biology, Fac.
Sci. Nat. Univ. Masarykianae Brunensis. In press.
a12 Bryja, J., Zemanová, K., Šmarda, J.: Antileukemické účinky proteinu RXR. Klinická
biochemie a metabolismus 7: 17, 1999.
a13 Šmarda, J., Zemanová, K., Bryja, J., Šmardová, J., Kozubík, A., Hofmanová, J.,
Nemajerová, A., Ševčíková, S., Kohoutek, J., Vodička, P. Retinoid X receptor
suppresses transformation by the v-myb oncogene. J. Leuk. Biol. 66, 1999. In press.
IF=4,348
(b) Rukopisy publikací
b4 Chroust, K., Jowett, T., Farid-Wajidi, M.F., Huang, J-Y., Ryskova, M., Wolf, R.,
Holoubek, I. Activation or detoxification of mutagenic and carcinogenic compounds in
transgenic Drosophila expressing human glutathione S-transferase.
(c) Příspěvky na konferencích
c23 Horová L., Zemanová K., Bryja J., Šmardová J., Ševčíková S., Vodička P., Kohoutek J.,
Šmarda, J.: Srovnání anti-onkogenních vlastností retinoidových receptorů RAR a
RXR. Abstrakt posteru prezentovaného na konferenci III. Pracovní setkání biochemiků
a molekulárních biologů, Brno, 3.2. 1999.
c24 Ševčíková, S., Šmarda, J.: Differential effects of Fos and Jun proteins on v-mybtransformed monoblasts. Abstrakt posteru prezentovaného na 15th Annual Meeting on
Oncogenes, Frederick, MD, USA, 22.-27. 6. 1999, Sborník strana 192, 1999.
c25 Šmarda, J., Zemanová, K., Bryja, J., Ševčíková, S., Horová, L., Šmardová, J., Kohoutek,
J., Vodička, P.: Activated retinoid receptors suppress the v-myb oncogene. Abstrakt
přednášky přednesené na XV. Biologických dnech, České Budějovice, 6.-8. 9. 1999,
Sborník strana 128, 1999.
c26 Kuglík, P., Václavík, P., Oltová, A., Popelínská, E., Wernerová, V.: The dentification of
supernumerary marker chromosomes in five patients by fluorescenct in situ
hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 85, 39, 1999).
c27 Procházková, M., Kuglík, P., Štěrba, J.: Detection of prognostic genetic factors in
neuroblastoma using fluorescence in situ hybridization (FISH). Abstrakt přednášky
přednesené na 15. Biologických dnech, České Budějovice, 6.-8. 9. 1999, Sborník
strana 111, 1999.
c28 Kuglík, P., Oltová, A., Gaillyová, R.: Využití techniky fluorescenční hybridizace in situ
(FISH) v genetické diagnostice. Abstrakt přednášky přednesené na kongresu Pokroky
v lékařství a farmacii, MEFA, 3.11. 1999, Brno.
Diplomové práce
d40 Kohoutek Jiří: Optimalizace podmínek transfekce monoblastů transformovaných
onkogenem v-myb. 1999.
d41 Ševčíková Sabina: Význam genů fos a jun v myeloidní diferenciaci. 1999.
d42 Vodička Petr: Studium účinků retinoidových receptorů aktivovaných různými ligandy na
onkoprotein v-Myb. 1999.
30
d43 Hykelová Vladimíra: Sledování mutací transgenní Drosophila melanogaster
d44 Martinů Pavlína: Transgenní Drosophila melanogaster nesoucí lidský gen pro glutathion
S-transferázu na reparačně deficientním pozadí genů mei-9 a mei-41.
d45 Hamplová Jaroslava: Konstrukce reparačně deficientního kmene transgenní Drosophila
melanogaster nesoucího gen pro glutathion S-transferázu
d46 Papoušková Iva: Důkaz mutací lidského transgenu u Drosophila melanogaster na
molekulární a fenotypové úrovni.
d47 Procházková Martina: Využití metody PRINS při detekci genetických patologických
stavů v karyotypu člověka.
d48 Fialová Markéta: Sledování chromozomálních translokací u akutních myeloidních
leukémií technikou PT-PCR.
d59 Radilová Hana: Aplikace molekulárně cytogenetických a molekulárně genetických metod
při diagnostice pacientů s Prader-Willi/Angelmanovým syndromem.
d50 Schrumpfová Petra:Studium vlivu aktivovaných retinoidových receptorů na diferenciaci
leukemických buněk
d51 Skalická Kamila: Molekulární detekce mutací ve specifickém lokuse u Drosophila
melanogaster
Dizertační práce
d 52 Scheinost Ondřej, Mgr.: Nové metody detekce chromozomálních aberací u člověka.
(e) Přednášky
e2 Šmarda, J.: Retinoid X receptor suppresses transformation by the v-myb oncogene.
Přednáška na Oddělení patologie, Stanford University School of Medicine, Stanford,
USA, 13.5. 1999.
e3 Kuglík, P.: Fluorescent in situ hybridization – Some of its applications in clinical
cytogenetics. Přednáška v Centre des Sciences de l´Environnment, Universite de Metz,
France, 24.6. 1999.
e4 Kuglík, P., Procházková, M., Štěrba, J.: Naše předběžné zkušenosti s aplikací techniky IFISH u neroblastomu. Celostátní konference lékařské genetiky s mezinárodní účastí,
15.-17. 1999, Olomouc.
Problematika nekódujících částí genomu. Garant: dr. J. Fajkus
V roce 1999 pokračovaly práce na řešení projektu v souladu se specifikovanými dílčími cíli
na rok 1999 v následujících směrech:
• Bylo dokončeno mapování a sekvenční charakterizace subtelomer chromozómů Nicotiana
tomentosiformis a Nicotiana tabacum. Výsledky jsou shrnuty v práci: TAS49 - dispersed
repetitive sequence isolated from subtelomeric regions of Nicotiana tomentosiformis
chromosomes. Práce byla přijata k publikaci v časopise Genome.
• V paralelní studii subtelomer chromozómů rostliny Silene latifolia byly charakterizovány
nové nukleotidové sekvence a původní cíle byly rozšířeny o charakterizaci chromatinové
struktury i u těchto sekvencí. Tyto práce směřují do tří publikačních výstupů: a) mapování
napojení telomer a subtelomer na chromozómech S. latifolia; b) sekvenční struktura
telomer-asociovaných oblastí sortovaného chromozómu X S. latifolia; c) Specifické rysy
chromatinové struktury telomer-asociovaných sekvencí S. latifolia. Výstupy a) a c) jsou
před dokončením, analýzy uvedené v bodě b) budou předmětem práce v příštím roce. O
31
•
•
•
•
•
tyto výstupy projevila zájem dvě Japonská pracoviště a mají v tomto směru zájem na
spolupráci (Prof. Matsunaga, University of Tokyo, a Prof. Fukui, University of Osaka).
Byla dokončena studie korelace mezi aktivitou telomerázy, methylačním stavem bcr-abl
genu a progresí onemocnění u pacientů s diagnózou CML. Konečné výsledky byly
publikovány na konferenci (viz seznam) a jsou shrnuty do práce Fajkusová et al.:Detailed
Mapping of Methylcytosine Positions at the CpG island surrounding Pa Promoter at the
bcr-abl Locus in CML Patients and Two Model Cell Lines, K562 and BV173, která byla
zaslána k publikaci.
Byla dokončena první etapa výzkumu rekombinačních faktorů kvasinek ve spolupráci
s dánským partnerským pracovištěm. Dosažené výsledky byly prezentovány na
konferencích Functional Organization of the Cell Nucleus a 4th European Meiosis Meeting
(viz přiložené abstrakty) a byly shrnuty do rukopisu Krejčí et al.: Molecular dissection of
homologous recombination, který byl zaslán k publikaci.
V oblasti studia využití stanovení aktivity a exprese telomerázy v nádorových tkáních
k onkologické diagnostice bylo dosaženo optimalizace extrakčních a následných postupů
(Telomere repeat amplification protocol při detekci aktivity, RT-PCR při detekci exprese
RNA a katalytické podjednotky). Bylo zjištěno, že exprese RNA podjednotky není
specifická pro nádorové tkáně, a není proto vhodná jako diagnostický marker. Naproti
tomu dosavadní výsledky ukazují specifitu exprese katalytické podjednotky a aktivity
telomerázy pro nádorové tkáně, a tedy využitelnost těchto údajů v diagnostice. Bude však
třeba přesněji kvantifikovat aktivitu i expresi, aby údaje byly dostatečně informativní.
Dosažené výsledky byly publikovány formou přednášek a posterů na národních a
mezinárodních konferencích. V současné době připravujeme do tisku jeden přehledný
článek do domácího lékařského časopisu a jedno krátké sdělení do mezinár. časopisu, kde
budou uvedeny výsledky průběžného sledování aktivity a exprese telomerázy u 13 případů
dětských leukémií.
Vzhledem k tomu, že výsledky uvedené v předchozím bodě mohou být zkresleny
použitým extrakčním postupem, event. kontaminací, přítomností tkáňově specifických
inhibitorů apod., považujeme za perspektivní převedení detekce aktivity a exprese
telomerázy na úroveň in situ. Jedná se bohužel o oblast, na niž laboratoř nemá potřebné
vybavení (kryotom, kvalitní fluorescenční mikroskopie se software na obrazovou analýzu
aj.), toto zázemí se však podařilo zajistit spolupracemi částečně přímo na Biofyzikálním
ústavu AVČR, kde laboratoř ABVMK sídlí, a částečně na Danish Cancer Institute.
Prvními výstupy z této oblasti jsou sdělení na Second European Cytogenetics Conference
a zejména 2 publikace v tisku zabývající se podrobnou analýzou telomer in situ :
Serakinci, N., Krejčí, K. and Koch, J.: Telomeric repeat organization - a comparative in
situ study between man and rodent. Cytogenet Cell Genet, In press; Krejčí, K. and Koch,
J. Molecular cytogenetics investigation of the telomeres in a case of Philadelphia positive
B-ALL with of a single telomere expansion. Neoplasia, In press
Mezi nejvýznamnější výsledky dosažené v letošním roce patří zjištění inhibice aktivity
rostlinné telomerázy prostřednictvím telomer-vazebných proteinů extrahovaných
z rostlinných tkání postrádajících aktivitu telomerázy. Byla zjištěna tvorba komplexů mezi
jednovláknovou DNA G-bohatého telomerového řetězce, a těmito proteiny. Příčinou
inhibice telomerázy byla kompetitivní vazba proteinů na substrátový oligonukleotid,
nikoli přímá interakce s telomerázou. Afinita telomer-vazebných proteinů
k jednovláknovému G-telomerovému řetězci je přitom vyšší než afinita telomerázy, takže
tyto proteiny jsou schopny telomerázu z jejího komplexu se substrátem vytěsnit. Interakce
telomer-vazebných komplexů je sekvenčně (nikoli druhově) specifická a odolná k vysoké
koncentraci solí. V případě jediného komplexu vytvářeného extrahovanými proteiny N.
tabacum byla zjištěna jeho molekulová hmotnost (67 kDa). Zjištěná tvorba komplexů
32
s inhibičním vlivem na aktivitu telomerázy je pravděpodobným mechanismem přesné
regulace telomerázy v průběhu vývoje rostliny a časováním v průběhu buněčného cyklu.
Tyto údaje znamenají další prioritu naší laboratoře v oblasti rostlinného telomerového
výzkumu, a navazují na objev rostlinné telomerázy (1996) a zjištění přesné vývojové
regulace rostlinné telomerázy (1998a, 1998b) publikované naší laboratoří dříve. Výsledky
byly publikovány formou zvaných přednášek na Universitách v Tokyu a Osace, a jsou
připravovány k publikaci.
(a) Publikace:
a14 Serakinci, N., Krejčí, K. and Koch, J.: Telomeric repeat organization - a comparative in
situ study between man and rodent. Cytogenet Cell Genet., In press. IF=3,636
a15 Krejčí, K. and Koch, J.: Molecular cytogenetics investigation of the telomeres in a case
of Philadelphia positive B-ALL with of a single telomere expansion. Neoplasia, In
press.
a16 Horáková, M. and Fajkus, J.: TAS49 - dispersed repetitive sequence isolated from
subtelomeric regions of Nicotiana tomentosiformis chromosomes. Genome, In press.
IF=1,792
(c)Příspěvky na konferencích:
c29 Fajkus, J., Maláska J., Skleničková, M., Vyzula, R., Bajer, M. Hanke, I., Kala, Z. and
Fajkusová, L.: Using detection of telomerase activity and expression in oncology
diagnostics. The Wilhelm Bernhard’s workshop – 16th International Workshop on the
Cell Nucleus. Prague, August 23-27, 1999
c30 Krejčí, L., Damborsky, J., Thomsen, B., Duno, M. and Bendixen, C.: Dissection of
homologous recombination. EMBO workshop “Functional organization of the Cell
Nucleus”, Prague, August 9-12, 1999.
c31 Krejčí, L., Damborsky, J., Thomsen, B., Duno, M. and Bendixen, C.: Molecular
dissection of homologous recombination. 4th European Meiosis Meeting-FEBS
advanced course 99-06, September 18-22, 1999, Obertraum, Austria
c32 Maláska, J., Skleničková, M.: Telomeráza-aktivita a diagnostické použití u leukémií a
solidních tumorů. 43. Studentská vědecká konference LF MU, Brno, 12. 5. 1999.
c33 Fajkusová, L., Fajkus, J., Berková, K., Dvořáková, D., Krahulcová, E., Fulneček, J.:
Detailní mapování methylcytosinů v oblasti Pa promotoru bcr-abl lokusu u pacientů
s diagnózou CML a dvou modelových buněčných linií, K562 a BV173. XII. Český a
slovenský hematologický a transfuziologický sjezd s mezinárodní účastí. Olomouc 1.-4.
září 1999.
c34 Maláska, J., Bajer, M., Hrstková, H., Bajerová, K., Michálek, J., Fajkus, J.: Sledování
aktivity telomerázy v průběhu léčby dětských leukémií. XII. Český a slovenský
hematologický a transfuziologický sjezd s mezinárodní účastí. Olomouc 1.-4. září 1999.
c35 Krejčí, K., Koch, J.: In situ studies of human telomeres. Cytogenetics and Cell Genetics.
Second European Cytogenetics Conference July 3-6, Vienna, Austria.
Diplomové práce
d53 M. Skleničková: Stanovení aktivity telomerázy v diagnostice nádorových onemocnění.
Dizertační práce
d54 Krejčí K., Mgr.: Detection of DNA Sequence Variants on Metaphase Chromosomes by in
Situ Techniques.
(e) Přednášky
33
e5 Riha, K., Vyskot, B., Fajkus, J. and Shippen, D.E.: Telomerase activity, telomere length
and telomere structure in the dicot plant Silene latifolia. Telomeres & Telomerase - Cold
Spring Harbor Laboratory meeting, March 25-28, 1999, Cold Spring Harbor, USA.
e6 Fajkus J.: Analýza konců rostlinných chromozómů. BioTechnika99, Analýza genomu.
ÚMG AVČR Praha, 3.- 4. 2. 1998
e7 Fajkus J.: Telomery a telomeráza. Masarykova univerzita v Brně, 18. 3. 1999
e8 Fajkus J.: Rostlinné telomery a regulace jejich syntézy. LF UP a FN v Olomouci, 6. 4.
1999
e9 Fajkus J.: Detekce telomerázové aktivity a průkaz exprese telomerázových podjednotek
v onkologické diagnostice. PCR v medicíně (seminář fy Sigma Aldrich a České Spol.
pro Biochemii a Mol. Biologii). Praha, 18. 11. 1999.
e10 Fajkus J.: Regulation of telomere lengths and telomerase activity in plants. Inst. Mol.
Cell. Biosciences, University of Tokyo, 28. 10. 1999.
e11 Fajkus J.: Inhibition of telomerase by telomere-binding proteins in plants. Grad. Sch. of
Engineering, Osaka University, 2. 11. 1999.
Souhrn presentace dosažených výsledků
Výsledky řešení VZ Genomy a jejich funkce za rok 1999 byly presentovány takto:
16 publikací ve vědeckých časopisech – publikovaných nebo přijatých k publikaci,
4 rukopisy v recenzním řízení nebo připravené k publikaci,
35 příspěvků na domácích a zahraničních konferencích publikovaných formou abstraktů,
54 diplomových a rigorozních prací zabývajících se problematikou zahrnutou do VZ, které
byly řešeny v roce 1999, z nichž některé byly v tomto roce úspěšně obhájeny,
11 přednášek na domácích a zahraničních konferencích a seminářích.
34
5. Vyúčtování finančních prostředků
Přidělené institucionální finanční prostředky ze SR činily celkem
z toho investiční
neinvestiční
2 756 tis. Kč
1 436 tis.
1 320 tis.
Z neinvestičních činil plán mzdových prostředků 360 tis. Kč.
V roce 1999 byl z investičních prostředků VZ pořízen soubor kultivačního zařízení pro
funkční genomiku Arabidopsis thaliana, který je základním předpokladem pro zavedení
přístupu funkční genomiky (možnost regulace růstových podmínek, tj. teplota, osvětleni,
vlhkost vzduchu). Byly zakoupeny 3 kusy kultivačních komor firmy Percival Scientific, typ
AR-36L Arabidopsis Growth Chamber a flow-box MAC 2000 firmy BioAir pro práci za
sterilních podmínek. Celková cena souboru je 1 436 000 Kč. (Zboží bude dodáno v průběhu
prosince 1999.)
Přidělené prostředky byly uvolněny k čerpání od června tr. Od té doby byly čerpány
průběžně. Podle posledního výpisu z účtu ze dne 25.11.99 bylo čerpání jednotlivých kapitol
následující:
Drobné předměty
65 983,91
Knihy a časopisy
37 845,46
Ostatní spotř. materiál
288 610,60
El. energie
100 000,00
Spotřeba vody
20 000,00
Opravy a udržování
12 302,00
Cestovné
6 075,79
Ostatní služby (tel., poštovné, doprava)
172 893,70
Mzdové náklady a odměny
274 031,00
Zákonné sociální pojištění
95 911,00
Kursové ztráty
284,27
Jiné ost. náklady
700,00
Celkem čerpáno
1 074 637,74
Zbývající částka 245 362,24 Kč bude čerpána ve zbývajících dvou měsících na platy a
zákonné pojištění. Plánovaná částka na spotřební materiál je čerpaná, ale ještě se neobjevila
ve výpisu z účtu, případně bude dočerpána do 15. prosince tr.
35
Přílohy
ke ZPRÁVĚ O ŘEŠENÍ VÝZKUMNÉHO ZÁMĚRU
„GENOMY A JEJICH FUNKCE“ J07/98:143100008
za rok 1999
Řešitel: Prof. RNDr. Jiřina Relichová, CSc.
(a) publikace ve vědeckých časopisech (publikované nebo přijaté k publ.)
(b) rukopisy v recenzním řízení nebo připravené pro publikaci
(c) abstrakta z konferencí
36

GENOMY A JEJICH FUNKCE - orion

Transkript

Podobné dokumenty

ÚOCHB AV ČR v.v.i. - Institute of Organic Chemistry and Biochemistry

Číslo 23 - Genetická společnost Gregora Mendela

Logika vyššího ř ádu

Selektovatelné a signální geny - Biologické centrum AV ČR, vvi

Duchennova svalová dystrofie