Optika - filtry

Principy designu vícebarevných panelů
pro diagnostické účely
Mgr. Miroslav Benko Ccy.
Vedoucí oddělení Vývoje produktu
Základy vícebarevné cytometrie v diagnostice, ÚMG Krč
19.5.2015
Úvod
Co musíme od začátku brát na vědomí:
1.
2.
3.
4.
5.
Co chceme měřit
Počet antigenů = počet barev
Jaký cytometr máme k dispozici
Jakou barevnou sestavu mám k dispozici
FITC, PE, APC…
Kompenzace
Kontroly:
Poz., Komp…
≠
Co chceme měřit
Vícero možností:
1.
2.
3.
4.
5.
Běžná imunofenotypizace (CD3, CD4, CD8, CD45…)
Leukemia / Lymphoma
HIV/AIDS
Funkční testy
Další…
Od sledovaných antigenů se odvíjí i logika použitých fluorochromů
Jaký cytometr máme k dispozici
Důležité informace před měřením:
1. Optika
a. Lasery
b. Filtry
c. Zrcadla
d. Detektory
2. Elektronika
a. Převodník cytometru (jak citlivý je cytometr / dynamický
rozsah)
b. Elektronický šum
c. Baseline
Optika - lasery
Standardní laserové zdroje:
• Low-power air-cooled lasery (10-40 mW)
• 488nm argon, red He-Ne 633nm, green He-Ne 543 nm,
He-Cd UV, diode pumped solid state lasery
• High-power water-cooled lasery (> 50 mW)
• Argon, Krypton, Fluorochromové lasery
Optika - filtry
Allow to pass light with appropriate wavelength to detector
Bandpass filter
Longpass filter
Shortpass filter
Optika - filtry
Bandpass filter
% of all emitted
photons collected
530/30
47,0
530/40
60,4
525/50
71,3
Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer, http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
Optika - filtry
Bandpass filter
% of all PE emitted
photons collected
% of FITC emitted
photons collected
Ratio of photons
collected PE/FITC
585/42
70,4
20,1
3,5
575/26
55,9
17,0
3,3
580/30
61,0
16,5
3,7
Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer, http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
Optika - zrcadla
Elektronika cytometru = Rozlišení
Negativní populace
Relativně nízké pozadí pro kombinaci
fluorochrom / antigen
Populace jednoznačně oddělené
Vyšší pozadí pro kombinaci
fluorochrom / antigen
Populace nejsou jednoznačně
oddělené
Relativně nízké pozadí pro kombinaci
fluorochrom / antigen. Negativní
populace má vysoké CV (Rozptyl)
Populace nejsou jednoznačně
oddělené
Je výrazně ovlivněno nastavením
cytometru
Pozitivní populace
Barevná sestava
Excitation wavelength
R-PE
Emission wavelength
Höechst dyes
FITC
DAPI
AlexaFluor 488
R-PE
APC
PE-Cy5
Pacific Orange
DyLight 488
Pacific Blue
PE-TexasRed
PerCP-Cy5.5
Am Cyan
DRAQ-5
7-AAD
Propidium Iodide
Violet
APC-Cy7
PerCP
Cascade Blue
UV
PE-Cy7
Blue
Green
YellowGreen
Red
Jakou vybrat správnou barvu?
Úroveň značení – Stain Index
PE, excitace 488nm
laserem; SI = 305
AlexaFluor 700, excitace
635nm laserem; SI = 64
Pacific Orange, excitace
405nm laserem; SI = 20-27
Stain Index = D / W
Úroveň značení
Stain Index
Přesvity fluorochromů
Pacific
Blue
Pacific
Orange
FITC
PE
PE-Cy5
PerCPCy5.5
PE-Cy7
APC
AXA700 APCCy7
Kompenzace
3 hlavní problémy vícebarevné FC
1. Kompenzace
2. Kompenzace
3. Kompenzace
Skompenzovaná
data
Kompenzace
Kompenzace signálu z FITC v detektoru pro PE
Optimal
Over-compensated
Nekompenzovaná data
2% kompenzace fluorescence
4% kompenzace fluorescence
6% kompenzace fluorescence
8% kompenzace fluorescence
10,7% kompenzace fluorescence
15% kompenzace fluorescence
Kompenzace signálu z FITC v detektoru pro PE
Kompenzace
Před
Před
6-KOMBITEST
EXBIO Praha a.s.
ED7075
CD45 PerCP-Cy5.5
CD3 FITC
CD16+56 PE
CD19 APC
CD4 PE-Cy7
CD8 APC-Cy7
Chyby kompenzace
Kompenzace není ideální:
•Objevuje se Falešná / Vysoké pozadí – proto
používáme kontroly FMO
•Buňky mají „negativní“ fluorescenci
•Čím je populace svítivější, tím větší je po
kompenzaci „Spread“ – rozptyl
Proč to všechno…
CD3 FITC
+
CD4 PE
EXBIO
6-KOMBITEST
4 Populace:
CD3+CD4CD3+CD4+
CD3-CD4+
CD3-CD4-
15 2-barevných
značení
Něco domů…
Čím víc barev, tím je to těžší.
1.
Fluorochrom vybíráme podle exprese cílového antigenu
2.
Připravujte si kompenzační zkumavky a FMO kontroly
3.
Kompenzační zkumavky musí být připravené stejným postupem a na stejném
materiálu jako měřený vzorek
4.
Titrujte si protilátky
5.
Nebojte se zvyšování napětí na detektorech
6.
Pečujte si o svůj cytometr (pravidelná údržba a kontroly…)
Barvy nabídky EXBIO Praha a.s.
Fialový laser (405 nm):
Modrý laser (488 nm):
• Pacific Blue (403/455 nm)
• FITC (492/519 nm)
• Pacific Orange (403/551 nm)
• AlexaFluor 488 (499/519 nm)
• R-Phycoerythrin (498, 566/576 nm)
Červený laser (633 nm):
• PE-DyLight594 (498, 566/616 nm)
• APC (650/660 nm)
• PE-Cy5 (498, 566/670 nm)
• AlexaFluor 647 (652/658 nm)
• PE-Dyomics 647 (498, 566/670 nm)
• AlexaFluor 700 (696/719 nm)
• PerCP (482/672 nm)
• APC-Cy7 (650/778 nm)
• PerCP-Cy5.5 (482/696 nm)
• PE-Cy7 (498, 566/778 nm)
Děkuji za Vaši pozornost
Za Team EXBIO Praha a.s.
Miroslav Benko