Cat. No. / Kat. č.: ED7036 BasoFlowEx Kit (100 tests / testů

bridging process of IgE molecules on the basophil surface, and
also by a chemotactic peptide N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)
which activates basophils via unspecific way.
4. Precautions


Cat. No. / Kat. č.: ED7036


®
BasoFlowEx Kit
(100 tests / testů / testov)




ENGLISH
1. Intended use

The BasoFlowEx® Kit is intended for flow cytometry
examination of IgE-mediated allergic reactions via analysis
of CD63 antigen exposition on basophils in human heparinized
whole blood upon allergen stimulation. A commercially available
allergens (e.g. for prick tests) can be used for the stimulation.



For laboratory research only, not for drug, diagnostic or
other use.
Blood must be collected into a tube containing
heparin. Anticoagulants EDTA and citrate negatively
affect results of the analysis.
Blood samples should be treated within 24 hours after
collection.
Stained samples should be analyzed within 2 hours
after staining.
Do not use reagents after expiration date stated on vial
labels.
Avoid Staining Reagent (ED7036-3) prolonged exposure
to light.
Avoid contamination of reagents.
Aeroallergens (pollen, mites, dust) in laboratory may
contaminate open tubes and cause an increased
background release.
Any non-performance of staining protocol may produce
false results.
Blood samples are considered as potentially infectious
and must be handled with care.
Avoid any contact of the sample with the skin, eyes and
mucosa.
Lysing Solution (ED7036-4) contains formaldehyde.
2. Introduction
5. Reagents provided
The crucial point in allergy diagnostics is to determine the
causal allergen. Reliability of the commonly used method of
skin prick test (SPT) is low and this test can promote the
patient’s allergy disease. Hence in vitro tests, such as detection
of specific IgE in serum (sIgE), or analysis of basophil activation
markers, are advisable. Although specificity of sIgE detection is
sufficient in case of most antigens, its sensitivity is usually
about 75% only. Moreover, in case of some allergens (namely
of food and drugs) both sensitivity and specificity of sIgE
detection is much lower. On the contrary, the basophil
activation test (BAT) is noted not only for very high specificity,
but also for high sensitivity, including many problematic
allergens.




ED7036-1 Stimulation Buffer – 5 lyophilized vials, 1 vial
is intended for stimulation of 20 tubes.
ED7036-2 Stimulation Control – 2 lyophilized vials, 1
vial is intended for stimulation of 25 positive controls.
ED7036-3 Staining Reagent – 1 vial containing 2 ml of
premixed antibody cocktail: anti-CD63, FITC labeled +
anti-CD203c, PE labeled.
ED7036-4 Lysing Solution – 30 ml.
6. Necessary material not supplied


3. Principle
This assay is based on in vitro stimulation of basophils using
sensitizing allergen and subsequent flow cytometry analysis of
CD63 antigen exposition on the cell surface. If a basophil has
allergen-specific IgE molecules bound to the cell surface,
allergen bridges near IgE molecules leading to the activation of
the basophil. As a consequence, cytoplasmatic granules
containing the CD63 transmembrane protein are fused to the
cellular membrane and release inflammatory mediators.
Therefore the CD63 antigen is exposed to the extracellular
matrix as a marker of basophil activation (degranulation). The
exposition of CD63 antigen is followed by a monoclonal
antibody staining (clone MEM-259; FITC labeled). Basophil
population is identified by staining using a monoclonal antibody
to CD203c (clone NP4D6) labeled with R-phycoerythrin (PE).
Positive control sample is stimulated using a monoclonal
antibody against IgE molecule which mimics the allergen







Allergens (e.g. for prick tests)
Suitable 5ml test tubes for blood staining
(e.g. 12 × 75 mm)
PBS buffer
Ultrapure demineralized water
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex mixer
Thermostat able to incubate test tubes at 37 °C
Centrifuge with rotor suitable for test tubes
Flow cytometer - blue laser excitation at 488 nm, light
emission at 525 nm (FITC) and 575 nm (PE)
7. Storage
Store the BasoFlowEx® Kit at 2-8 °C. Expiration date is stated
on a vial labels and on the box.
1/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
8. Assay procedure
intensity in FITC channel (FL1). Using the negative control
sample set the gate for non-stimulated basophils (CD63dim).
Then calculate the percentage of activated basophils
(CD63bright) in allergen-stimulated samples and positive control
sample.
Use heparinized whole blood for examination. Prepare reagents
according to following instructions.
Preparation of reagents before assay
1. Reconstitute lyophilized Stimulation Buffer using 2 ml of
demineralized water. Unused volume of the buffer store at
2-8 °C up to 5 days. Alternatively, the buffer can be
aliquoted, frozen once, and stored at ≤ -20 °C for another
use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
2. Reconstitute lyophilized Stimulation Control using 0.25
ml of demineralized water. Unused volume of the reagent
store at 2-8 °C up to 30 days. Alternatively, the reagent
can be aliquoted, frozen once, and stored at ≤ -20 °C for
another use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
3. Other reagents (Staining Reagent, Lysing Solution) are
ready to use.
10. Interpretation of results
Individuals are considered as allergic to the tested allergens
when the percentages of activated basophils get over the cutoff value. Recommended cut-off values for allergen groups are
as follows:
Inhalant and food allergens
Hymenoptera venoms
Drugs
≥15 %
≥10 %
≥5 %
If the positive control sample shows activation of basophils
<10 %, measured results are regarded as nonevaluable.
Assay procedure
For examination of one blood sample prepare test tubes for
negative control, positive control and for samples to be
stimulated with allergens. Various commercially available
allergens may be use for stimulation, e.g. prick test allergens at
suitable dilution (1-100x). Prepare samples according to
following procedure:
11. Expected values
In theory, the number of activated basophils in allergenstimulated sample may vary in range 0-100 %. Average number
of activated basophiles measured in 20 positive control samples
is listed below.
1.
In to the tubes destined for:
 allergen-stimulated sample add 10 l of allergen,
 negative control sample add nothing,
 positive control sample add 10 l of Stimulation
Control.
2. Add 100 l of Stimulation Buffer into all tubes.
3. Add 100 l of heparinized whole blood into all tubes and
vortex gently.
4. Incubate tubes at 37 °C for 15 minutes in water bath or
25 minutes in air incubator.
5. Add 20 l of Staining Reagent into all tubes, vortex gently,
and incubate for 20 minutes at 2-8 °C or on ice.
6. Add 300 l of Lysing Solution into all tubes, vortex gently,
and incubate for 5 minutes at room temperature.
7. Add 3-4 ml of demineralized water into all tubes, vortex
gently, and incubate for 5-10 minutes at room temperature
until the red blood cells are lysed.
8. Centrifuge tubes for 5 minutes at 300 g.
9. Remove the supernatant and resuspend the pellet in 0.20.4 ml of PBS buffer.
10. Analyze samples using a flow cytometer within 2 hours
after staining.
Parameter
Activated basophils
Mean (%)
77,3
SD
19,4
CV (%)
25,1
12. Limitations





Blood sample may contain insufficient amount of
basophiles.
Basophiles of some blood samples are not susceptible to
stimulation.
Reliability of the assay depends on the quality of the
allergen.
Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
Data may be incorrectly interpreted if fluorescent signals
were compensated wrongly or if gates were positioned
inaccurately.
13. Troubleshooting
See website http://www.exbio.cz/diagnostics
9. Flow cytometric analysis
Analyze stained samples using flow cytometer. In order to
analyze sufficient number of basophils (>200), acquire 50,000100,000 events per sample. Make compensation of fluorescent
signals prior or after data acquisition.
Visualize compensated data on the side-scatter (SSC) versus
fluorescence intensity in PE channel (FL2) dot-plot. Set the gate
for basophil population (CD203c positive, SSC low) as shown in
figure 1. The gate must be positioned individually for each
sample. Then bring the gated basophils to histogram as shown
in figures 2a,b,c where the X-axis represents fluorescence
2/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
ČESKY

1. Použití soupravy

BasoFlowEx® Kit je určený pro testování alergické reakce
zprostředkované protilátkami IgE (reakce I. typu) analýzou
expozice proteinu CD63 na povrchu bazofilů po jejich stimulaci
alergenem v lidské periferní krvi s heparinem pomocí průtokové
cytometrie. Stimulaci je možné provádět pomocí komerčně
dostupných alergenů (např. určených pro kožní testy).

5. Obsah soupravy

2. Úvod

Klíčovým bodem v diagnostice alergií je co nejpřesnější
stanovení příčinného alergenu. Běžně užívaná metoda kožních
testů (SPT) se vyznačuje nízkou spolehlivostí a kromě toho
může u pacientů vyvolat zhoršení alergického onemocnění.
Proto je žádoucí využívat testy in vitro, jako je detekce
specifických protilátek IgE v séru (sIgE) či analýza aktivačních
markerů bazofilů. Specificita stanovení sIgE je v případě většiny
alergenů dostatečně vysoká, ale senzitivita bývá pouze kolem
75%, kromě toho u některých alergenů (zejména potravin
a léků) je senzitivita i specificita detekce sIgE podstatně nižší.
Oproti tomu se test aktivace bazofilů (BAT) vyznačuje nejen
velmi vysokou specificitou, ale i vysokou senzitivitou, a to
i v případě řady problematických antigenů.











Principem testu je vyvolání aktivace bazofilů in vitro
v přítomnosti senzibilizujícího alergenu a následné měření
expozice aktivačního znaku bazofilů (proteinu CD63) na
buněčném povrchu pomocí monoklonálních protilátek metodou
průtokové cytometrie. U jedinců vnímavých k danému alergenu
je na povrchu bazofilů vysokoafinitní receptor pro IgE obsazen
specifickým IgE, jehož prostřednictvím kontakt buňky
s alergenem vyvolá aktivaci bazofilu spojenou s procesem vylití
obsahu cytoplazmatických granulí vně buňky (degranulaci).
Degranulace má mimo jiné za následek expozici
transmembránového proteinu cytoplazmatických granulí CD63
na povrchu bazofilů. Ten je následně detekován monoklonální
protilátkou MEM-259 konjugovanou s FITC. Populace bazofilů
je identifikována monoklonální protilátkou NP4D6 (anti-CD203c)
konjugovanou s PE. Pozitivní kontrolu představuje vzorek, ve
kterém jsou bazofily aktivované monoklonální protilátkou antiIgE, která zastupuje stimulační účinek specifického alergenu,
a chemotaktickým peptidem N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP),
který aktivuje bazofily nespecifickou cestou.



Alergeny (např. pro kožní testy)
Vhodné 5ml zkumavky pro barvení buněk
(např. 12 × 75 mm)
Fosfátový pufr (PBS)
Ultračistá demineralizovaná voda
Sada automatických pipet s jednorázovými špičkami
Vortex
Termostat umožňující inkubovat zkumavky při 37 °C
Centrifuga s rotorem pro zkumavky
Průtokový cytometr - excitace modrým laserem 488 nm,
emise záření při 525 nm (FITC) a při 575 nm (PE)
7. Skladování soupravy
BasoFlowEx® Kit skladujte při teplotě 2-8 °C. Doba
použitelnosti je vyznačena na jednotlivých reagenciích i na
krabici soupravy.
8. Postup testu
Vyšetření se provádí v plné krvi odebrané do zkumavky
s heparinem. Reagencie připravte podle následujících instrukcí.
4. Upozornění




ED7036-1 Stimulation Buffer – 5 kusů vialek
obsahujících lyofilizovaný stimulační pufr, jedna vialka je
určená pro stimulaci 20 zkumavek.
ED7036-2 Stimulation Control – 2 kusy vialek
obsahujících lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly,
jedna vialka je určená pro stimulaci 25 pozitivních
kontrolních vzorků.
ED7036-3 Staining Reagent – 1 vialka obsahující 2 ml
koktejlu protilátek: anti-CD63 značená FITC + antiCD203c značená PE.
ED7036-4 Lysing Solution – lahvička s lyzačním
roztokem, 30 ml.
6. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván
3. Princip


Pracujte výhradně v ochranných rukavicích a při práci
dodržujte správné postupy pro zacházení s potenciálně
infekčním materiálem.
Vyvarujte se kontaktu vzorků s pokožkou, očima
a sliznicemi.
Lysing Solution (ED7036-4) obsahuje formaldehyd.
Příprava reagencií před měřením
1. Lyofilizovaný stimulační pufr (Stimulation Buffer) před
použitím rekonstituujte pomocí 2 ml demineralizované
vody. Nespotřebované množství stimulačního pufru je
možné skladovat v lednici (2-8 °C) nejdéle 5 dní,
případně zamrazit při ≤ -20 °C po vhodných alikvotech
pro další použití. Vyvarujte se opakovaného zamrazování
a rozmrazovaní roztoku.
2. Lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly (Stimulation
Control) před použitím rekonstituujte pomocí 0,25 ml
demineralizované vody. Nespotřebované množství
stimulantu je možné skladovat v lednici (2-8 °C) nejdéle
30 dní, případně zamrazit při ≤ -20 °C po vhodných
alikvotech pro další použití. Vyvarujte se opakovaného
zamrazování a rozmrazovaní roztoku.
Souprava je určena pouze pro výzkumné účely.
Krev musí být odebrána do zkumavky s heparinem.
Antikoagulanty EDTA a citrát ruší stanovení.
Vzorky krve zpracujte nejdéle do 24 hodin po odběru.
Vzorky analyzujte nejpozději do 2 hodin po obarvení.
Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti.
Staining Reagent (ED7036-3) nevystavujte dlouhodobému
působení světla.
Chraňte obsah vialek soupravy před kontaminací.
Během barvení vzorků chraňte obsah zkumavek před
kontaminací vzdušnými alergeny (pyly, prachové částice),
které mohou falešně zvýšit počet aktivovaných bazofilů.
Nedodržení postupu měření může ovlivnit výsledky testů.
3/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
3.
10. Vyhodnocení testu
Ostatní reagencie (Staining Reagent, Lysing Solution)
jsou připravené pro okamžité použití.
Při hodnocení testu je třeba brát v úvahu hranici pozitivity testu
pro jednotlivé skupiny alergenů, kterou by si měla ustanovit
každá laboratoř. Hraniční hodnota pozitivity testu bývá obyčejně
nastavena následovně:
Postup testu
Pro vyšetření jednoho vzorku krve je třeba připravit negativní
kontrolu, pozitivní kontrolu a potřebný počet zkumavek
stimulovaných testovanými alergeny. Pro stimulaci je možné
použít různé komerční alergeny, např. vhodně ředěné (1-100x)
alergeny používané pro kožní testy. Vzorky připravte podle
následujícího postupu:
inhalační a potravinové alergeny
jed blanokřídlého hmyzu
léky
1.
Do zkumavek určených pro:
 alergenem stimulovaný vzorek napipetujte
10 l alergenu,
 negativní kontrolní vzorek nepipetujte nic,
 pozitivní kontrolní vzorek napipetujte 10 l
rekonstituovaného stimulantu (Stimulation Control).
2. Do všech zkumavek napipetujte 100 l rekonstituovaného
stimulačního pufru (Stimulation Buffer).
3. Do všech zkumavek napipetujte 100 l krve s heparinem
a zkumavky promíchejte pomocí vortexu.
4. Zkumavky inkubujte při teplotě 37 °C po dobu 15 minut ve
vodní lázni nebo 25 minut v inkubátoru.
5. Poté do všech zkumavek napipetujte 20 l koktejlu
protilátek (Staining Reagent), zkumavky promíchejte
pomocí vortexu a inkubujte 20 minut v lednici při 2-8 °C
nebo na ledu.
6. Poté přidejte 300 l lyzačního roztoku (Lysing Solution),
zkumavky promíchejte pomocí vortexu a inkubujte 5 minut
při laboratorní teplotě.
7. Do zkumavek přidejte 3-4 ml demineralizované vody,
promíchejte pomocí vortexu a inkubujte přibližně 5-10
minut při laboratorní teplotě, dokud nedojde k lyzi
červených krvinek.
8. Centrifugujte zkumavky 5 minut při 300 g.
9. Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment pomocí
0,2-0,4 ml pufru PBS.
10. Vzorky změřte průtokovým cytometrem nejpozději do
2 hodin od obarvení.
≥15 %
≥10 %
≥5 %
Hodnocení testu není možné provést, pokud pozitivní kontrola
vykazuje méně než 10 % aktivovaných bazofilů.
11. Očekávané hodnoty
Počet aktivovaných bazofilů u vzorků stimulovaných alergenem
se může teoreticky pohybovat v rozmezí 0-100 %. Průměrná
hodnota počtu aktivovaných bazofilů změřených v pozitivních
kontrolách 20 krevních vzorků je uvedena v následující tabulce.
Parametr
Aktivované bazofily
Průměr (%)
77,3
SD
19,4
CV (%)
25,1
12. Omezení metody





Některé vzorky krve nemusí obsahovat dostatečné
množství bazofilů.
Bazofily některých krevních vzorků není možné aktivovat
stimulantem pozitivní kontroly.
Spolehlivost testu závisí na kvalitě použitého alergenu.
Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
Data mohou být špatně interpretována, pokud jsou
fluorescenční signály špatně kompenzované, případně
pokud jsou regiony buněk špatně umístěné.
13. Řešení problémů (troubleshooting)
Najdete na webové stránce: http://www.exbio.cz/diagnostika
9. Analýza průtokovým cytometrem
Obarvené vzorky analyzujte průtokovým cytometrem. Jelikož by
mělo být analyzováno minimálně 200 bazofilů, změřte
cytometrem 50.000-100.000 událostí od každého vzorku.
Proveďte kompenzaci fluorescenčních signálů naměřených dat.
Naměřená data zobrazte v grafu side-scatter (SSC) versus
intenzita fluorescence v PE kanálu (FL2) a ohraničte vhodným
regionem populaci bazofilů, které jsou CD203c pozitivní, jak je
znázorněno na obrázku 1 (kvůli odlišné expresi CD203c
u nestimulovaného a stimulovaného vzorku je třeba umístění
regionu upravit pro každý vzorek zvlášť). Poté zobrazte
ohraničené bazofily v histogramu, kde na ose X je vynesena
intenzita fluorescence ve FITC kanálu (FL1), jak je znázorněno
na obrázcích 2a,b,c. Pomocí negativní kontroly nastavte region
odpovídající CD63dim populaci, která představuje neaktivované
bazofily. Poté spočítejte procentuelní zastoupení aktivovaných
bazofilů, které jsou CD63bright, v jednotlivých alergenem
stimulovaných vzorcích a u pozitivní kontroly.
4/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
SLOVENSKY


1. Použitie súpravy
BasoFlowEx® Kit je určený na testovanie alergickej reakcie
sprostredkovanej protilátkami IgE (reakcia I. typu) analýzou
expozície proteínu CD63 na povrchu bazofilov po ich stimulácii
alergénom v ľudskej periférnej krvi s heparínom pomocou
prietokovej cytometrie. Bazofily je možné stimulovať pomocou
komerčne dostupných alergénov (napr. určených na kožné
testy).




2. Úvod
Chráňte obsah fľaštičiek zo súpravy pred kontamináciou.
V priebehu značenia vzorky chráňte obsah skúmaviek
pred kontamináciou alergénmi prítomnými vo vzduchu
(pele, prachové častice), ktoré môžu falošne zvýšiť počet
aktivovaných bazofilov.
Nedodržanie postupu merania môže ovplyvniť výsledky
testov.
Pracujte výhradne v ochranných rukaviciach a pri práci
dodržujte správne postupy pri zaobchádzaní s potenciálne
infekčným materiálom.
Vyvarujte sa kontaktu vzorky s pokožkou, očami
a sliznicami.
Lysing Solution (ED7036-4) obsahuje formaldehyd.
Kľúčovým bodom pri diagnostikovaní alergií je čo najpresnejšie
stanovenie príčinného alergénu. Bežne používaná metóda
kožných testov (SPT) sa vyznačuje nízkou spoľahlivosťou,
a okrem toho môže u pacienta vyvolať zhoršenie stavu
alergického ochorenia. Preto je dôležité využívať možnosť
testovania in vitro, ako je detekcia špecifických protilátok IgE
v sére (sIgE), či analýza aktivačných markerov bazofilov.
Špecifičnosť stanovenia sIgE je v prípade väčšiny alergénov
dostatočne vysoká, ale senzitivita býva zväčša iba okolo 75%,
okrem toho u niektorých alergénov (hlavne u potravín a liekov)
je senzitivita i špecifičnosť detekcie sIgE podstatne nižšia.
Oproti tomu test aktivácie bazofilov (BAT) sa vyznačuje nielen
veľmi vysokou špecifičnosťou, ale aj vysokou senzitivitou, a to
aj v prípade množstva problematických antigénov.
5. Obsah súpravy
3. Princíp
6. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva





Princípom testu je vyvolanie aktivácie bazofilov in vitro
v prítomnosti senzibilizujúceho alergénu a následná analýza
expozície aktivačného znaku bazofilov (proteínu CD63) na
bunkovom povrchu pomocou monoklonálnych protilátok
metódou prietokovej cytometrie. U jedincov citlivých
voči danému alergénu je na povrchu bazofilov vysokoafinitný
receptor pre IgE obsadený špecifickým IgE, prostredníctvom
ktorého vyvolá kontakt bunky s alergénom aktiváciu bazofilu
spojenú s procesom „vyliatia“ obsahu cytoplazmatických granúl
von z bunky (degranulácia). Degranulácia má okrem iného za
následok
expozíciu
transmembránového
proteínu
cytoplazmatických granúl CD63 na povrchu bazofilov. Ten je
následne detekovaný monoklonálnou protilátkou MEM-259
označenou FITC fluorochrómom. Populácia bazofilov je
identifikovaná monoklonálnou protilátkou NP4D6 (anti-CD203c)
označenou PE fluorochrómom. Pozitívnu kontrolu predstavuje
vzorka, v ktorej sú bazofily aktivované monoklonálnou
protilátkou anti-IgE, ktorá zastupuje stimulačný účinok
špecifického alergénu, a chemotaktickým peptidom N-formylMet-Leu-Phe (fMLP), ktorý aktivuje bazofily nešpecifickou
cestou.













Alergény (napr. na kožné testy)
Vhodné 5ml skúmavky na značenie buniek
(napr. 12 × 75 mm)
Fosfátový tlmivý roztok (PBS)
Ultračistá demineralizovaná voda
Sada automatických pipiet s jednorázovými špičkami
Vortex
Termostat umožňujúci inkubovať skúmavky pri 37 °C
Centrifúga s rotorom pre skúmavky
Prietokový cytometer - excitácia modrým laserom 488 nm,
emisia žiarenia pri 525 nm (FITC) a pri 575 nm (PE)
7. Skladovanie súpravy
BasoFlowEx® Kit skladujte pri teplote 2-8 °C. Doba
použiteľnosti je vyznačená na jednotlivých reagenciách a na
krabici súpravy.
8. Postup testu
4. Upozornenie


ED7036-1 Stimulation Buffer – 5 kusov fľaštičiek
obsahujúcich lyofilizovaný stimulačný roztok, jedna
fľaštička je určená na stimuláciu 20 skúmaviek.
ED7036-2 Stimulation Control – 2 kusy fľaštičiek
obsahujúcich lyofilizovaný stimulans pozitívnej kontroly,
jedna fľaštička je určená na stimuláciu 25 pozitívnych
kontrolných vzoriek.
ED7036-3 Staining Reagent – 1 fľaštička obsahujúca
2 ml koktailu protilátok: anti-CD63 označená FITC + antiCD203c označená PE.
ED7036-4 Lysing Solution – fľaštička s lyzačním
roztokom, 30 ml.
Vyšetruje sa v plnej krvi odobratej do skúmavky s heparínom.
Reagencie pripravte podľa nasledujúcich inštrukcií.
Súprava je určená len na výskumné účely.
Krv musí byť odobratá do skúmavky s heparínom.
Antikoagulanty EDTA a citrát rušia stanovenie.
Vzorky krvi spracujte najneskôr do 24 hodín od
odberu.
Vzorky analyzujte najneskôr do 2 hodín od značenia.
Nepoužívajte reagencie po uplynutí doby použiteľnosti.
Staining Reagent (ED7036-3) nevystavujte dlhodobému
pôsobeniu svetla.
Príprava reagencií pred značením
1. Lyofilizovaný stimulační roztok (Stimulation Buffer) pred
použitím rozpustite pomocou 2 ml demineralizovanej
vody. Nevyužité množstvo stimulačného roztoku je možné
skladovať v chladničke (2-8 °C) po dobu 5 dní, poprípade
zamraziť pri ≤ -20 °C v alikvotných množstvách na ďalšie
5/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
2.
3.
použitie. Vyvarujte sa opakovanému zamrazovaniu
a rozmrazovaniu roztoku.
Lyofilizovaný stimulans pozitívnej kontroly (Stimulation
Control) pred použitím rozpustite pomocou 0,25 ml
demineralizovanej vody. Nevyužité množstvo stimulans je
možné skladovať v chladničke (2-8 °C) po dobu 30 dní,
poprípade zamraziť pri ≤ -20 °C v alikvotných množstvách
na ďalšie použitie. Vyvarujte sa opakovanému
zamrazovaniu a rozmrazovaniu roztoku.
Všetky ďalšie reagencie (Staining Reagent, Lysing
Solution) sú pripravené na okamžité použitie.
je to znázornené na obrázkoch 2a,b,c. Pomocou negatívnej
kontroly nastavte región odpovedajúci CD63dim populácii, ktorá
predstavuje neaktivované bazofily. Potom spočítajte
percentuálne zastúpenie aktivovaných bazofilov, ktoré sú
CD63bright, v jednotlivých alergénom stimulovaných vzorkách
a u pozitívnej kontroly.
10. Vyhodnotenie testu
Pri hodnotení testu je nutné brať v úvahu hranicu pozitivity testu
pre jednotlivé skupiny alergénov, ktorú by si malo ustanoviť
každé laboratórium zvlášť. Hraničná hodnota pozitivity testu
býva obyčajne nastavená nasledovne:
Postup testu
Na vyšetrenie jednej vzorky krvi je nutné pripraviť negatívnu
kontrolu, pozitívnu kontrolu a potrebný počet skúmaviek
stimulovaných testovanými alergénmi. Na stimuláciu je
možné použiť rôzne komerčné alergény, napr. vhodne
nariedené (1-100x) alergény používané na kožné testy. Vzorky
pripravte podľa nasledujúceho postupu:
inhalačné a potravinové alergény
jed blanokrídleho hmyzu
lieky
≥15 %
≥10 %
≥5 %
Test nieje možné hodnotiť v prípade, že pozitívna kontrola
vykazuje menej ako 10 % aktivovaných bazofilov.
1.
Do skúmaviek určených pre:
 vzorku stimulovanú alergénom napipetujte
10 l alergénu,
 negatívnu kontrolnú vzorku nepipetujte nič,
 pozitívnu kontrolnú vzorku napipetujte 10 l
rozpusteného stimulans (Stimulation Control).
2. Do všetkých skúmaviek napipetujte 100 l rozpusteného
stimulačného roztoku (Stimulation Buffer).
3. Do všetkých skúmaviek napipetujte 100 l krvi
s heparínom a skúmavky premiešajte pomocou vortexu.
4. Skúmavky inkubujte pri teplote 37°C po dobu 15 minút vo
vodnom kúpeli alebo 25 minút v inkubátore.
5. Potom do všetkých skúmaviek napipetujte 20 l koktailu
protilátok (Staining Reagent), skúmavky premiešajte
pomocou vortexu a inkubujte 20 minút v chladničke pri
2-8°C alebo na ľade.
6. Potom pridajte 300 l lyzačného roztoku (Lysing
Solution), skúmavky premiešajte pomocou vortexu
a inkubujte 5 minút pri laboratórnej teplote.
7. Do každej skúmavky pridajte 3-4 ml demineralizovanej
vody, premiešajte pomocou vortexu a inkubujte približne
5-10 minút pri laboratórnej teplote, pokým nedôjde k lýze
červených krviniek.
8. Centrifugujte skúmavky 5 minút pri 300 g.
9. Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 0,2-0,4 ml tlmivého roztoku PBS.
10. Vzorky analyzujte prietokovým cytometrom najneskôr do
2 hodín od označenia.
11. Očakávané hodnoty
Počet aktivovaných bazofilov sa môže u vzoriek stimulovaných
alergénom teoreticky pohybovať v rozmedzí 0-100 %.
Priemerná hodnota počtu aktivovaných bazofilov nameraných
v pozitívnych kontrolách 20 krvných vzoriek je uvedená
v nasledujúcej tabuľke.
Parameter
Aktivované bazofily
Priemer (%)
77,3
SD
19,4
CV (%)
25,1
12. Obmedzenia metódy





Niektoré vzorky krvi nemusia obsahovať dostatočné
množstvo bazofilov.
Bazofily niektorých krvných vzoriek nieje možné aktivovať
pomocou stimulans pozitívnej kontroly.
Spoľahlivosť testu závisí od kvality použitého alergénu.
Prietokový cytometer môže poskytovať nepresné hodnoty,
ak nieje správne nastavený a udržiavaný.
Dáta môžu byť zle interpretované v prípade, že signály
z fluorescenčných kanálov nie sú správne
skompenzované alebo ak sú regióny buniek zle
umiestnené.
13. Riešenie problémov (troubleshooting)
Nájdete na webovej stránke: http://www.exbio.cz/diagnostika
9. Analýza prietokovým cytometrom
Označené vzorky analyzujte prietokovým cytometrom.
Vzhľadom k tomu, že počet analyzovaných bazofilov by mal byť
minimálne 200, je nutné cytometrom analyzovať 50.000100.000 udalostí z každej vzorky. Vykompenzujte signály
nameraných udalostí z jednotlivých fluorescenčných kanálov.
Namerané dáta vyobrazte v grafe side-scatter (SSC) proti
intenzite fluorescencie v PE kanálu (FL2) a ohraničte vhodným
regiónom populáciu bazofilov, ktoré sú CD203c pozitívne, tak
ako je to znázornené na obrázku 1 (kvôli odlišnej expresii
CD203c u nestimulovanej a stimulovanej vzorky je nutné
upraviť umiestnenie regiónu pre každú vzorku zvlášť). Potom
vyobrazte ohraničené bazofily v histograme, kde na ose X je
vynesená intenzita fluorescencie vo FITC kanále (FL1), tak ako
6/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
Example data / Vzorové vyhodnocení / Vzorové
vyhodnotenie
Fig. 1 Delimitation of basophil population (CD203cpos/ SSClow).
Obr. 1 Ohraničení populace bazofilů (CD203cpos/ SSClow).
Obr. 1 Ohraničenie populácie bazofilov (CD203cpos/ SSClow).
Fig. 2a Histogram of allergen-stimulated basophils.
Obr. 2a Histogram populace bazofilů po stimulaci alergenem.
Obr. 2a Histogram populácie bazofilov po stimulácii alergénom.
Fig. 2a Histogram of negative control basophils.
Obr. 2a Histogram populace bazofilů negativní kontroly.
Obr. 2a Histogram populácie bazofilov negatívnej kontroly.
.
Fig. 2c Histogram of positive control basophils.
Obr. 2c Histogram populace bazofilů pozitivní kontroly.
Obr. 2c Histogram populácie bazofilov pozitívnej kontroly.
7/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025
References / Literatura / Literatúra
Sainte-Laudy J, Sabbah A, Vallon C, Guerin JC (1998) Analysis
of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by
flow cytometry. Comparison with histamine release. Inflamm
Res. 47(10): 401-408
Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C, Chazot M,
Diéguez I, De Weck AL (2001) Allergen-induced basophil
activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in
patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and
Lolium perenne. Clin. Exp. Allergy 31(7): 1007-1013
Erdmann SM, Heussen N, Moll-Slodowy S, Merk HF, Sachs B
(2003) CD63 expression on basophils as a tool for the
diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and
specificity. Clin. Exp. Allergy 33(5): 607-614
Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De
Clerck LS, Stevens WJ (2004) In vitro allergy diagnosis: should
we follow the flow? Clin. Exp. Allergy 34(3): 332-339
Valent P, Hauswirth AW, Natter S, Sperr WR, Bühring HJ,
Valenta R (2004) Assays for measuring in vitro basophil
activation induced by recombinant allergens. Methods 32(3):
265-270
Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů /
Vysvetlenie symbolov
h
2 °C
Catalog number
Katalogové číslo
Katalógové číslo
M
Manufacturer identification
Výrobce
Výrobca
l
Store within temperature limits
Rozmezí skladovacích teplot
Rozmedzie skladovacích teplôt
8 °C
g
H
Batch code
Číslo šarže
Use by
Použitelné do
Použiteľné do
Manufacturer / Výrobce / Výrobca
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
8/8
ED7036_EN_CZ_SK_101025