6 - oddělení molekulární biologie crh

Principy a využití qPCR
KBC/BAM Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D.
UP‐PŘF‐CRH Oddělení molekulární biologie
Úvod do PCR
• PCR - 1984 Kary Mullis (Nobelova cena za chemii, 1993)
Úvod do PCR
PCR – jednotlivé fáze:
y
Exponenciální
◦ Jestliže je efektivita reakce 100% – produkt se
přesně zdvojnásobí
◦ Specifická a precizní
y
Lineární
◦ Vysoká variabilita
◦ Jsou spotřebovávány reakční komponenty a PCR
produkty začínají degradovat
y
Plateau
◦ End-point analýzy - reakce je ukončena, PCR
produkty degradují
Úvod do PCR
PCR phases in linear view
Oblast detekce
konvenční PCR
Plateau
Linear
[DNA]
Exponential
Oblast detekce
Real-time qPCR
Cycle #
Konvenční PCR
Izolace
DNA/RNA (přepis)
• DNA-polymeráza
• standardní termocyklér
• detekce na gelu
PCR - Amplifikace
Elektroforéza
Konvenční PCR
Výhody
• Efektivní metoda
• Rychlá analýzy (od 30 min do 2 h)
• Vysoká specifita a citlivost
• Relativně levná
Nevýhody
• Nemožnost automatizace
• Nízká přesnost
• Obtížná kvantifikace
• Rozlišení pouze na základě velikosti produktu
• Výsledky těžko interpretovatelné v číslech
• Stejný end-point u různého počátečního množství templátu
• Různý end-point u stejného počátečního množství templátu
• Malé dynamické rozmezí
Real-Time PCR
• Real-time PCR monitoruje fluorescenci emitovanou v průběhu
reakce jako indikátor tvořeného amplikonu v každém cyklu PCR
(v reálném čase)
• Speciální real-time PCR termocykléry s detektory umožňují
kvantifikaci v reálném čase a díky sběru dat i automatizaci
AB StepOnePlus Real-time PCR thermal cycler
Princip metody
•
•
Kvantifikace: detekce fluorescence, která se uvolňuje v přímé
úměře na množství amplifikované DNA při použití fluorescenčního
substrátu v PCR reakci
Fluorescence:
- barvivo interkalující s dvouřetězcovou DNA (např. SYBR® Green)
- hydrolýza specifické fluorescenční sondy komplementární
k amplikonu (např. TaqMan)
- hybridizace specifické fluorescenční sondy (FRET)
Fluorescence
SYBR Green:
TaqMan:
SYBR Green
• barvivo, které po vazbě na dsDNA
emituje silný fluorescenční signál
• nevýhodou je nespecifita vazby
• nutná optimalizace
• nutná analýza křivky tání
• neúměra signálu u různě dlouhých
produktů
• omezené použití pro multiplex
TaqMan próby
• sekvence o velikosti primeru komplementární k specifickému místu
templátu
• kovalentně vázaný fluorofor na 5´ konci próby
• kovalentně vázaný zhášeč (quencher) na 3´ konci póby
• princip založen na využití 5´-3´ exonukleasové aktivity Taq DNA
polymerázy
• množství detekované fluorescence je přímo úměrné množství
fluoroforu uvolněného z DNA přítomné v PCR reakci
• vysoká specifita detekce
5' exonukleasová aktivita Taq DNA polymerasy
Mocellin et al. Trends Mol Med 2003
TaqMan – používané fluorofory a zhášeče
NFQ – non fluorescent quencher (TaqMan MGB próby)
Nutné ověřit kompatibilitu páru fluorofor-zhášeč!
Při multiplexu je nutné vybrat páry s minimálním překryvem spekter!
www.giagen.com
Reference dye
• Pro normalizaci PCR-nezávislých kolísání fluorescence
• Pomáhá tvořit stabilní baseline pro kvantifikaci
• Používáním referenčních barviv se eliminuje re-kalibrace cykléru a jeho
nastavení
ROX – konjugát glycinu s 5-carboxy-X-rhodaminem, sukcinimidyl esterem
• bez přirozené autofluorescence – nižší fluorescence pozadí
• zvyšuje se poměr signál:šum – zvyšuje se citlivost
• maximalizuje se překryv spekter – zvyšuje se efektivita zhášení
• umožňuje širší výběr reportérových barviv pro multiplexing
www.sigmaaldrich.com
TaqMan Primery
• Tm (58 - 600 C)
• délka 15 - 30 bp
• obsah G+C 30 - 80%
• ideálně žádné opakování G nad 4
• ne víc než 2 G+C na 3’ konci
• žádný G na 5' konci
• velikost amplikonu 50 - 150 bp
• pokrytí přechodu exon-exon v cDNA
Další typy prób používané v qPCR
Wong & Medrano (2005) BioTechniques 39:75-85
Terminologie Real-time qPCR
•
Matematické vyjádření amplifikace PCR
•
Amplifikační křivka
- baseline, mez detekce, CT, ∆Rn
•
Kinetika Real-time qPCR
- kvantifikace, efektivita, dynamické rozpětí
Log fluorescence (Rn)
Amplifikační křivka
Baseline – fáze obsahující amplifikaci pod mezí detekce přístroje
Threshold – práh detekce vznikající fluorescence (v místě protnutí amplifikační
křivkou je definováno CT)
CT – (cycle threshold) počet cyklů, který vznikající fluorescence potřebuje k překročení
prahu detekce
Rn – podíl intenzit emisí fluorescence reportérového barviva a pasivního barviva
∆Rn – (Rn-baseline), je počítáno jako rozdíl Rn hodnot vzorků a negativní kontroly
nebo pozadí, čímž vyjadřuje množství signálu generovaného v PCR reakci
CT
•
Hodnota CT udává cyklus, ve kterém dojde poprvé k
významnému vzestupu ∆Rn, což koreluje s počátečním
množstvím templátu v reakci
•
Základní parametr používaný v kvantifikaci
•
Hodnota CT nad 40 znamená žádnou amplifikaci a nemůže být
použita k výpočtům pro kvantifikaci
•
Teoreticky jediná kopie cílové molekuly by měla vytvořit CT
hodnotu 40 za předpokladu 100% efektivity reakce
∆Rn
•
Rn+ je hodnota Rn reakce obsahující všechny komponenty,
hodnota Rn- je hodnota Rn slepé (negativní, bez templátu, NTC)
reakce (hodnoty baseline)
•
∆Rn hodnota představuje rozdíl mezi Rn+ a Rn-, zároveň je tedy
indikátorem velikosti síly signálu tvořeného během PCR
•
∆Rn je vynášeno proti počtu cyklů PCR, čímž jsou tvořeny
amplifikační křivky a stanoveny hodnoty CT
Matematické vyjádření PCR
Xn
A
Xn = X0(1 + E)n
X0
Počet cyklů
Xn = množství PCR produktu po n cyklech
X0 = počáteční počet kopií
E = efektivita amplifikace
n = počet cyklů
Efektivita qPCR (%)
• Je dána směrnicí lineárního vynesení CT vůči logaritmu počtu kopií
E = 10(-1/směrnice) -1 (x100 pro %)
• Exponenciální amplifikace: E = 10(-1/směrnice)
• Efektivita reakce:
- 100% (2 kopie v každém cyklu) dělá směrnici -3,3219
- ideálně v rozmezí 90-110%
• Efektivitu reakce snižuje:
- délka amplikonu
- sekundární struktura
- vlastnosti primerů,…
Stanovení efektivity Real-time PCR
Příklad: stanovení efektivity PCR pro referenční gen (Gst), analyzovaný
gen 1 (TyrA) a 2 (TyrB). Směrnice přímek vypočítány z CT (v průsečících s
regresní přímkou) vůči počátečnímu množství DNA (průměr ze tří měření)
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res 2001
Matematické vyjádření PCR
Xn
Xn = X0(1 + E)n
A
Xn = PCR produkt po n cyklech
X0 = počáteční počet kopií
E = efektivita amplifikace
n = počet cyklů
X0
Počet cyklů
Rozdíl 0.1 v efektivitě amplifikace představuje pětinásobný
rozdíl ve finálním množství PCR produktů po 30 cyklech.
Xn = X0(1+E)n
Situace 1: E = 0.9
Situace 2: E = 0.8
Xn = 100 (1+0.9)30
Xn = 2.3 x 1010
Xn = 100 (1+0.8)30
Xn = 4.6 x 109
Dynamické rozpětí
• Slouží k stanovení efektivity qPCR – demonstruje možnou matematickou
variabilitu směrnice (efektivity), přesný výpočet efektivity PCR závisí na
rozmezí množství templátu použitého pro série ředění
• Analýza dynamického rozpětí se provádí ve 3 opakováních s minimálně
5 stupni ředění koncentrace templátu
• Směrnice = -3,3±10% znamená efektivitu 100% ±10%, PCR s nižší
efektivitou mají nižší citlivost
www3.appliedbiosystems.com
Kvantifikace – absolutní vs. relativní
Absolutní
• Přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul
• Založena na existenci lineárního vztahu mezi logaritmem startovního počtu
templátových kopií a CT příslušné amplifikační křivky
• Amplifikuje se vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií
standardů o známé koncentraci, vzniká kalibační přímka (standard curve), ze
které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku
• Využití v detekci specifických mikroorganismů
www.generi-biotech.com
Kvantifikace – absolutní vs. relativní
Relativní
• Porovnává se relativní změna genové exprese (relativní expresní poměr) v
testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku
• CT amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti
CT housekeeping genu
• Použití referenčního vzorku (endogenní, interní kontroly)
• Ideální pro stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení
kalibrační přímky
Srovnávací
• Matematické stanovení
• Kalibrační vzorek použit jako 1 standard
• Ideální v případech, kdy stačí vyjádření v podobě poměrů, k ověřování trendů
Endogenní kontrola (Normalizace)
• Pečlivý výběr genů pro endogenní kontrolu
Sabek et al. Transplantation 2002
• Obvykle provozní geny (housekeeping, vysoce abundantní s konstantní expresí)
• Ideální použití kombinace endogenních kontrol
• Nutná validace vybraných endogenních kontrol
Relativní kvantifikace s použitím endogenní kontroly
• CT hodnoty endogenních kontrol by měly být nižší než 22
Relativní kvantifikace
• Ct je nepřímo korelováno s počátečním počtem kopií, v každém cyklu se
zvojnásobuje množství amplikonů (při 100% E), rozdíl v 1 cyklu je tedy
dvojnásobek kopií
Metody pro stanovení relativní kvantity exprese genů
- Založeno na porovnání Ct hodnot mezi sledovanými geny a geny kontrolními
(provozními)
„Metoda ∆∆Ct“
- Model bez korekce efektivity
RQ = 2-∆∆Ct
∆∆ Ct = ∆ Ct vzorek - ∆ Ct kontrola
∆ Ct = Ct sledovaný gen - Ct gen provozní
• Liší-li se CT:
• Množství kopí je tedy
∆CT = 3,31
23,31 = 9,9 x
Relativní kvantifikace
• Ct je nepřímo korelováno s počátečním počtem kopií, v každém cyklu se
zvojnásobuje množství amplikonů (při 100% E), rozdíl v 1 cyklu je tedy
dvojnásobek kopií
Metody pro stanovení relativní kvantity exprese genů
- Založeno na porovnání Ct hodnot mezi sledovanými geny a geny kontrolními
(provozními)
„Pfafflova metoda“
- Bere se v úvahu možný rozdíl mezi rychlostí-efektivitou amplifikace u
jednotlivých genů, pro každý gen se stanovuje E = 10(-1/směrnice)
- Výpočet poměru množství cílového ku referenčnímu genu:
RQ = Etarget∆Cttarget(kontrola-vzorek) / Ehousekeeping∆Cttarget(kontrola-vzorek)
- Na rozdíl od metody ∆∆Ct se ∆Ct počítá pro geny (stanovované a kontrolní)
rozdíl (od kontrolních) u jednotlivých experimentálních vzorků
Příprava experimentu qPCR
•
•
Příprava vzorků:
- správný odběr vzorků
- izolace nukleových kyselin (DNA, RNA – reverzní transkripce)
Kvantitativní Real-time PCR:
- příprava reakcí pro SYBR ® Green nebo TaqMan
- kvantitativní PCR v Real-time termocykléru
- analýza a vyhodnocení dat
Správný odběr vzorků
•
•
DNA:
- DNAsy!
RNA:
- RNAsy!
- flash freeze -80°C!
- kontaminující materiál (jiná pletiva, tkáně, látky inhibující následný
proces izolace NK)
Příprava reakcí pro analýzu
•
SYBR vs. TaqMan chemismus
SYBR Green – kdy ANO a kdy NE
• Detekce nízkých hladin patogenů
• Analýzy nevyžadující specifické rozlišení
• Diskriminace alel
• Screening transkriptů před analýzou s próbami
• Multiplex analýzy
• Při plně optimalizovaném PCR systému (žádná diverizace primerů,
nespecifické amplikony)
• Amplifikace neobvyklých amplikonů
• Navržení primerů, prób:
- validované vs. vlastní design
Příprava reakcí pro analýzu
Reakční komponenta
• SYBR Green x TaqMan premix
• Primery
• Próby
• Templát
Finální koncentrace
1x
300 (50-900) nM
250 (50-500) nM
100 ng/10µl
Nastavení cyklování
- počet cyklů, teploty
Step
Temp.
Time
Cycles
Initial denaturation
95°C
7 min
1
Denaturation
95°C
5s
Annealing/extension
60°C
30 s
- analýza křivky tání (60-95°C)
40 cycles
Kontrola lineárního průběhu
exponenciální fáze
Linear view
log view
Analýza disociační křivky
• Fluorescence se snižuje se vzrůstající teplotou
• DNA vlákna se začínají oddělovat
• SYBR green se uvolňuje z DNA
• Fluorescence se snižuje
• Jednoduchá detekce teploty tání amplikonu
• Kontaminující DNA, dimery primerů nebo nesprávné vazby primerů jsou
detekovány jako další peak
• Detekce disociační křivky umožňuje detekci nespecifických produktů
www.generi-biotech.com
Vyhodnocení - výsledky
Průběh amplifikace
(křivky Ct)
Srovnání koncentrací vzorků
(podle endogenní kontroly)
cDNA
Míra exprese analyzovaných genů
RNA
(neg. kontr.)
Kontrola denaturačních křivek
Logaritmické zobrazení amplifikace
(stanovení společné meze detekce)
Aplikce Real-time qPCR - I
• Kvantifikace exprese genů
• Ověřování a validace metod
• Quality control
•Testování genetické stability a bezpečnosti pro životní prostředí
• Stanovování účinnosti léčiv různých terapií / monitoring léčiv
•Kvantifikace virů
• Detekce patogenů
Aplikace Real-time PCR - II
• Stanovení míry poškození DNA (nestabilita mikrosatelitů)
• Hodnocení stupně ozáření
• In vivo zobrazování buněčných procesů
• Studie mitochondrialní DNA
• Detekce metylací DNA
• Detekce inaktivací na chromozomu X
• LATE-PCR (linear-after-the-exponential): nová metoda pro analýzu
počtu cílových molekul v extra malých vzorcích, což je použitelní pro
rutinní analýzy ve velkých objemech (klinické diagnózy, DNA
sekvenování, forenzní medicína)
Real-time PCR Applications - III
• Identifikace vysoce polymorfních úseků antigenů lidských
leukocytů (HLA loci)
• Monitorování vývoje po transplantacích orgánů
• Monitorování chimerismu po transplantaci hematopoetických
kmenových buněk (HSCT)
• Monitorování minimální residuální choroby po HSCT
• Genotypizace (alelická diskriminace)
- Trizomie a stanovení variability v počtu kopií
- Mikrodelece v genotypech
- Haplotypizace
- Kvantitativní analýza mikrosatelitů
- Prenatální diagnostika z fetálních buněk krve matky
- Preoperační diagnostika nádorových onemocnění
Real-time qPCR ve forenzní medicíně
Wikimedia Commons/German National Archive
DNA analýza úlomků kostí exhumovaných na Urale v roce
2007 potvrdila totožnost dvou dětí posledního Ruského
cara Mikuláše II Alexandroviče popravených v r. 1918.
Alelická diskriminace s TaqMan próbami
Stanovení počtu kopií
• stanovení počtu kopií na základě rozdílů v hybridizaci prób
Barrois M et al. Clin Genet 2004
Real-time qPCR - nevýhody
• Není úplně vhodá pro multiplexing (ale je možná)
• Nastavování analýz vyžaduje značné technické zkušenosti
• Relativně vysoká pořizovací cena zařízení
• Intra- a inter- variace mezi analýzami
RNA labilita
• DNA kontaminace (u mRNA analýz)