Full text

TRANSFORMATION OF CHLOROBENZOIC ACIDS BY PLANT CELLS
TRANSFORMACE CHLORBENZOOVÝCH KYSELIN ROSTLINNÝMI BUŇKAMI
Blanka Vrchotová 1, 2), Martina Macková 1), Jan Tříska 3), Tomáš Macek 2)
1) Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Fakulta potravinářské a biochemické technologie,
Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, 166 28 Praha 6, e-mail:[email protected]
2) Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, 166 10 Praha 6
3) Institut systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i. Branišovská 5, 370 05 České Budějovice
Abstract:
Chlorobenzoic acids (CBAs) can release in to the environment by using pesticides in agriculture or they
are intermediate in manufacture of some drugs and colors. CBAs are also products of upper bacterial PCB
degradation pathway. Degradation of CBAs depends on organisms living in contaminated area,
concentration and structure of CBA.
The transformation of the chlorobenzoic acids was tested using plant cells of three species cultivated in
vitro. Embryogenic morphologically differentiated culture of Armoracia rusticana (horseradish),
amorphous callus culture of Nicotiana tabacum (tobacco) and hairy root culture of Solanum nigrum (black
nightshade).
Plant cells were able to transform CBAs. Effectiveness of this process depends, similarly lake in
microorganisms, on specie, number of chlorine atoms and their position in CBA molecule.
Methylester and hydroxyderivate of added CBA were identified by GC-MS analysis in medium after
cultivation. Possible enzymatic system responsible for formation of identified intermediates can be
cytochrome P450 localized in microsomes. Microrsomes isolated by differential centrifugation were able
to catalyze conversion of CBAs.
Acknowledgement: The work was sponsored by the grants Centrum 1M06011and a FRVŠ 1157/2008.
Keywords:
Chlorobenzoic acid, metabolisation, plant cells, cytochrome P450
Abstrakt
Chlorbenzoové kyseliny se mohou uvolnit do životního prostředí v důsledku použití herbicidů
v zemědělství, jsou meziproduktem při výrobě některých barviv a léků. V neposlední řadě vznikají jako
produkty horní bakteriální dráhy odbourávání PCB. Možnost jejich odstranění a další osud v životním
prostředí závisí na jejich struktuře, koncentraci a také na organismech vyskytujících se v daném
ekosystému.
Metabolisace chlorbenzoových kyselin byla testována na modelu rostlinných tkáňových kultur tří
rostlinných druhů pĕstovaných in vitro. Embryogenní morfologicky diferencovaná kultura křenu selského
(Armoracia rusticana), kalusová kultura tabáku viržinského (Nicotiana tabacum) a diferencovaná kultura
typu “hairy root“ lilku černého (Solanum nigrum).
Bylo prokázáno, že rostlinné buňky metabolisují chlorbenzoové kyseliny. Účinnost tohoto procesu je
závislá podobně jako u mikroorganismů na množství a poloze chlorů v molekule chlorbenzoové kyseliny
a použitém rostlinném druhu.
Analýza produktů transformace rostlinnými buňkami prokázala vznik methylesteru a hydroxyderivátu
přidané chlorbenzoové kyseliny.
Jedním z možných enzymů zodpovĕdných za jejich vznik je cytochrom P450 lokalizovaný
v mikrosomech. Mikrosomy izolované difernciální centrifugací z biomasy lilku černého byly schopné
katalyzovat přemĕnu chlorbenzoových kyselin.
Úvod
V minulém století s rozvojem průmyslu došlo k výrobě mnoha sloučenin, které byly uměle vytvořeny
člověkem. Tyto produkty byly, díky svým fyzikálním a chemickým vlastnostem, využívány v mnoha
průmyslových odvětvích. Vzhledem k širokému využití těchto chemikálií došlo k jejich
nekontrolovanému uvolnění do životního prostředí, kde díky své odolnosti přetrvávají. V dnešní době
území kontaminovaná xenobiotiky představují závažný problém. Mezi xenobiotika, látky vytvořené
člověkem a v přírodě se přirozeně nevyskytující, patří například polychlorované bifenyly, DDT, dioxiny,
dibenzofurany,TNT,TCE a další.
V současnosti jsou k odstraňování xenobiotik z životního prostředí nejvíce využívány fyzikálně-chemické
metody. Tyto techniky znamenají vytěžení kontaminované půdy a její skládkování nebo spálení při
vysoké teplotě. Celý proces je velice finančně náročný a vede k devastaci zasaženého území.
Ve snaze najít méně destruktivní a levnější způsoby dekontaminace se výzkum zaměřil na možnost
přeměny xenobiotik přímo na zasaženém území s využitím biologických systémů (rostlin a
mikroorganismů).
Některé druhy mikroorganismů a rostlin jsou schopné žít a rozmnožovat se na plochách s poměrně
vysokou koncentrací xenobiotik. Bylo zjištěno, že některé z těchto organismů jsou schopné degradovat
nebo akumulovat kontaminanty ve svých tkáních.
Chlorbenzoové kyseliny se mohou v přírodě vyskytovat v důsledku použití herbicidů v zemědělství, jsou
meziproduktem při výrobě některých barviv a léků a v neposlední řadě vznikají jako produkty horní
bakteriální dráhy odbourávání polychlorovaných bifenylů.
Další osud a možnost jejich odstranění z životního prostředí závisí na koncentraci, struktuře a také na
organismech vyskytujících se v daném ekosystému. Bakteriální metabolismus chlorbenzoových kyselin je
již poměrně dobře prostudován a popsán, v případě rostlin byla určitá pozornost věnována osudu
dichlorfenoxyoctové kyseliny (herbicid), avšak metabolisace dalších chlorbenzoátů popsána nebyla.
Experimentální část
Jako modelový systém pro studium rostlinného metabolismu vybraných chlorbenzoových kyselin byly
zvoleny rostlinné tkáňové kultury tří rostlinných druhů pěstované in vitro. Rostlinné tkáňové kultury lze
pěstovat za sterilních podmínek, tedy bez vlivu dalších organismů. Důležité také je, že poznatky získané
z pokusů s tkáňovými rostlinnými kulturami lze díky podobnosti detoxifikačních metabolických procesů
převést na celé rostliny [1]. Jednalo se o embryogenní morfologicky diferencovanou kulturu křenu
selského (Armoracia rusticana K 54), diferencovanou kulturu typu “hairy root“ lilku černého (Solanum
nigrum SNC 9O) a amorfní kalus tabáku viržinského (Nicotiana tabacum WSC 38), u kterých byla
primárně prokázána schopnost degradace PCB [2].
Kultivace tkáňových rostlinných kultur probíhala při počáteční koncentraci chlorbenzoové kyseliny
200 a 50 mg/l média [3]. Na začátku pokusu bylo do 250 ml Erlenmayerovy baňky inokulováno 5 g
rostlinné tkáňové kultury a pěstováno při 24 °C a 110 ot/min.
Po třídenní předkultivaci byla do média přidána chlorbenzoová kyselina (do výsledné koncentrace 200 mg/l
nebo 50 mg/l) a kultivace probíhala 14 dní při 24 °C a 110 ot/min. Baňky s kulturami, které byly
připraveny a kultivovány stejně, jen před přidáním chlorbenzoové kyseliny byly 20 minut povařeny na
vodní lázni, sloužily jako kontrola při měření úbytku chlorbenzoové kyseliny v médiu a koncentrace v biomase.
Jako kontrola pro srovnání nárůstu biomasy sloužily kultury pěstované za stejných podmínek bez přídavku
chlorbenzoové kyseliny.
Pravidelně byly odebírány vzorky média (1,5 ml), odstředěny při 11 000xg a v supernatantu byla měřena
koncentrace chlorbenzoové kyseliny pomocí HPLC s DAD detektorem (HP 1100, USA). Eluce byla
prováděna izokraticky na koloně Phenomenex LUNA C18(2) (150 mm x 2,00 mm x 5μm). Pro měření byl
použit průtok mobilní faze 0,4 ml/min o složení methanol: voda s obsahem 1% (v/v) H3PO4 v objemovém
poměru 60:40 pro trichlorbenzoové a 55:45 pro dichlorbenzoové a monochlorbenzoové kyseliny.
Typ a koncentrace chlorbenzoové kyseliny byly určovány při λ = 205 nm na základě srovnání retenčních
časů a ploch píků odpovídajících příslušné chlorbenzoové kyselině s hodnotami kalibrační křivky. Ta byla
sestrojena na základě měření koncentrace kalibračních roztoků příslušné chlorbenzoové kyseliny.
Pro měření koncentrace chlorbenzoové kyseliny v rostlinné biomase byla použita biomasa z jedné baňky.
Biomasa byla zvážena, promyta destilovanou vodou, homogenizována v tekutém dusíku, extrahována do
metanolu, odstředěna (11 000xg) a zbytková koncentrace chlorbenzoátů v supernatantu byla měřena na
HPLC s DAD detektorem za stejných podmínek jako vzorky média.
Dále byly zjišťovány produkty v médiu a v biomase po kultivaci tkáňové rostlinné kultury s chlorbenzoovou
kyselinou. V další části práce byly pomocí GC-MS identifikovány produkty rostlinného metabolismu
chlorbenzoových kyselin v médiu a v rostlinné biomase po čtrnáctidenní kultivaci rostlinné tkáňové
kultury s chlorbenzoovou kyselinou.
Výsledky:
Chlorbenzoové kyseliny byly rostlinnými tkáňovými kulturami metabolisovány s různou účinností v závislosti
na rostlinném druhu, počáteční koncentraci chlorbenzoové kyseliny, poloze a počtu chlorů v molekule
chlorbenzoové kyseliny.
Tab 1 Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v médiu při počáteční koncentraci 200 mg/l po 14 dnech
kultivace. CBA – chlorbenzoová kyselina, K 54 - křen selský (Armoracia rusticana), SNC 9O - lilek černý (Solanum
nigrum), WSC 38 - tabák viržinský (Nicotiana tabacum)
Zůstatek při počáteční koncentraci 200 mg/l po 14 dnech kultivace [%]
2 CBA
3 CBA
4 CBA
2,3 di CBA
2,4 di CBA
2,5 di CBA
2,6 di CBA
3,4 di CBA
3,5 di CBA
2,3,5 tri CBA
2,4,6 tri CBA
K-54
5±3
90 ± 3
82 ± 3
77 ± 5
65 ± 2
77 ± 5
66 ± 10
93 ± 3
92 ± 6
95 ± 7
90 ± 2
SNC 90
13 ± 5
91 ± 8
99 ± 6
58 ± 10
61 ± 10 65 ± 8
80 ± 5
89 ± 12
95 ± 12
88 ± 11
95 ± 2
WSC 38
88 ± 7
95 ± 6
94 ± 5
99 ± 6
79 ± 9
98 ± 2
98 ± 6
100 ± 5
96 ± 9
99 ± 3
85 ± 4
Nejmenší schopnost transformace chlorbenzoových kyselin prokázala tkáňová kultura tabáku viržinského
(tab 1), oproti nim buňky lilku černého prokázaly nejvyšší aktivitu ze zkoumaných druhů s mono a
dichlorbenzoovými kyselinami. Při počáteční koncentraci 50 mg/l došlo při kultivaci s 2-,3-,4-, 2,3-di a
2,5-dichlorbenzoovou kyselinou k jejich úplnému vymizení z média (tab 2).
Tab 2 Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v médiu při počáteční koncentraci 50 mg/l po 14 dnech
kultivace. CBA – chlorbenzoová kyselina, K 54 - křen selský (Armoracia rusticana), SNC 9O - lilek černý (Solanum
nigrum), WSC 38 - tabák viržinský (Nicotiana tabacum)
Zůstatek při počáteční koncentraci 50 mg/l po 14 dnech kultivace [%]
2 CBA
3 CBA
4 CBA
2,3 di CBA
2,4 di CBA
2,5 di CBA
2,6 di CBA
3,4 di CBA
3,5 di CBA
2,3,5 tri CBA
2,4,6 tri CBA
K-54
0±0
76 ± 1
41 ± 9
8±2
2±1
4±2
65 ± 8
76 ± 4
74 ± 1
57 ± 4
36 ± 4
SNC 90
0±0
0±0
0±1
0±1
2±2
0±1
68 ± 3
86 ± 4
99 ± 2
6±1
88 ± 1
Tkáňové kultury prokázaly různou účinnost při metabolizaci chlorbenzoových kyselin (obr. 1). 2-chlorbenzoová
kyselina byla rostlinnou tkáňovou kulturou křene selského z média plně zmetabolisována v devátém dni, v
rostlinné biomase byla maximální koncentrace v prvním dni kultivace a po čtrnáctidenní kultivaci byla
koncentrace chlorbenzoové kyseliny 0,03 µg na gram biomasy.
Obr. 1 Závislost koncentrace 2-, 2,5 di- a 2,3,5-trichlorbenzoové kyseliny v mediu a biomase tkáňové kultury lilku
černého a křene selského na době kultivace při počáteční koncentraci chlorbenzoové kyaseliny 50 mg/l
Oproti tomu při kultivaci s tkáňovou kulturou lilku černého byla nulová koncentrace 2-chlorbenzoové
kyseliny už ve třetím dni kultivace. V tomto dni byla také maximální koncentrace chlorbenzoové kyseliny
v rostlinné biomase. U 2,5-dichlorbenzoové kyseliny byl pozorován podobný efekt. Metabolisace
tkáňovou kulturou lilku černého byla rychlejší než kulturou křenu selského. Při kultivaci tkáňové kultury s
2,3,5-trichlorbenzoovou kyselinou došlo k úplné metabolisaci kyseliny jen u kultivace s lilkem černým.
Při kultivaci s křenem selským došlo k poklesu z počáteční koncentrace 50 mg/l na 21,6 mg/l.
V médiu po kultivaci 2,3-dichlorbenzoové kyseliny a 2,4-dichlorbenzoové kyseliny s kulturou lilku
černého byl identifikován methylester těchto kyselin a v rostlinné biomase po kultivaci s 2,5dichlorbenzoovou kyselinou byl vedle 2,5-dichlorbenzoové kyseliny identifikován hydroxyderivát
dichlorbenzoové kyseliny.
Poděkování
Tato práce byla financována z grantů Centrum 1M06011 a FRVŠ 1157/2008, GACR 203/06/0563 a MSM
6046137305.
Použitá literatura
[1] ESTIME, L., RIER, J. P. (2001): Disappearance of polychlorinated biphenyls (PCBs) when incubated with tissue
cultures of different plant species. Buletin of Contamination and Toxicology 66: 671-677
[2] MACKOVÁ, M., MACEK, T., OTČENÁŠKOVÁ, J., BURKHARD, J., DEMNEROVÁ, K., PAZLAROVÁ, J.
(1997): Biodegradation of polychlorinated biphenyls by plant cells. International Biodeterioration and
Biodegradation 39/4: 317-325
[3] MURASHIGE, T., SKOOG, S. (1962): Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum 15: 473-497