ZYMUTEST PAI-1 Antigen

ZYMUTEST PAI-1 Antigen
# RK012A
Kompletní ELISA souprava pro Inhibitor tkáňového aktivátoru
plazminogenu, typ I
Poslední revize 30.01.2008
Pouze pro použití „In Vitro“
POUŽITÍ:
Souprava ZYMUTEST PAI-1 Ag je jednokroková sendvičová imunoassay pro
měření inhibitoru lidského tkáňového aktivátoru plazminogenu typ 1 v plazmě nebo
v jakékoliv tekutině, ve které může být přítomen.
PRINCIP TESTU:
Do jamky mikrotitrační destičky, na jejíž stěně je navázána monoklonální protilátka
specifická proti PAI-1 Ag je pipetován imunokonjugát, což je jiná monoklonální
protilátka specifická proti PAI-1 Ag, s navázanou křenovou peroxidázou (HRP).
Ihned potom se do jamky pipetuje ředěný vyšetřovaný vzorek a tím se zahájí
imunologická reakce. Pokud je přítomen, PAI-1 Ag se váže na monoklonální
protilátku vázanou na stěně jamky přes jeden epitop a prostřednictvím jiného
epitopu váže monoklonální protilátku s HRP. Následuje promývací krok. Poté se
přidá peroxidázový substrát – 3,3',5,5' – tetramethylbenzidine (TMB) s peroxidem
vodíku H2O2, který v přítomnosti peroxidázy vytvoří modré zbarvení. Po zastavení
reakce kyselinou sírovou se vytvoří žluté zbarvení. Intenzita zbarvení je přímo
úměrná koncentraci lidského PAI-1 Ag v testovaném vzorku
VZOREK:
Lidská citrátová plazma nebo jiná biologická tekutina, ve které může být PAI-1 Ag
přítomen.
REAGENCIE:
1. Mikro-ELISA-destička: 12 proužků po 8-mi jamkách, na jejichž stěně je
s navázaná monoklonální protilátka specifická pro lidský PAI-1 Ag. Destička je v
aluminiovém pouzdře, hermeticky uzavřeném v přítomnosti desikantu.
2. SD. 2 lahvičky s obsahem 50 ml F-diluentu vzorku, připraveného k použití.
3. STD: 3 lahvičky PAI-1 standardu, lyofilizovaného. Po rozpuštění s 2 ml F-diluentu
vzorku získáme roztok, obsahující zhruba 10 ng/ml rekombinantního PAI-1
Ag.Přesná koncentrace PAI-1 Ag je uvedena na letáku, přiloženém k soupravě.
4. CI: 1 lahvička obsahující 1 ml lyofilizované plazmy PAI-1 Control High (lidská
plazma)
5. CII: 1 lahvička s obsahem 1 ml lyofilizované plazmy PAI-1 Control II Low (lidská
plazma)
Pozn.: PAI-1: Ag koncentrace a akceptabilní rozmezí pro kontroly mohou kolísat od
šarže k šarži a jsou uvedeny na letáku přiloženém ke kitu.
6. IC: 3 lahvičky Anti-(h)-PAI-1-HRP immunokonjugátu s obsahem monoklonální
protilátky s navázanou HRP, lyofilizovaný.
7. CD: 1 lahvička s 25 ml diluentu konjugátu, připravená k použití.
8. WS: 1 lahvička s 50 ml 20x koncentrovaného promývacího roztoku.
9. TMB: 1 lahvička 25 ml peroxidázového substrátu: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
obsahující peroxid vodíku. Připraven k použití.
10. SA: 1 lahvička s obsahem 6 ml 0,45M Kyseliny sírové (Zastavovací roztok).
Připraven k použití.
Pozn.: Užívejte komponenty pouze ze stejné šarže kitu. Nezaměňujte komponenty
z různých šarží při použití kitu.
REAGENCIE AMATERIÁL POTŘEBNÝ, V KITU NEPŘÍTOMNÝ
8 - kanálová pipeta 50 – 300 µl
1 – kanálová pipeta s nastavitelnými objemy od 0 do 20 µl, 20 až 200 µl
a 200 – 1000 µl
Promývačka mikrotitračních destiček a míchačka
ELISA reader s vlnovou délkou 450 nm
Destilovaná voda
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ, SKLADOVÁNÍ a STABILITA:
Ve svém originálním balení, před použitím, pokud je skladován při 2-8°C jsou
neotevřené reagencie stabilní až do data expirace, vytištěného na obalu.
1. Mikro ELISA destička: otevřete plastové pouzdro a vyjměte potřebný počet 8-mi
jamkových proužků. po vyjmutí z pouzdra musí být proužky použity do 30 minut.
Nepoužité proužky mohou být skladovány při 2-8°C po dobu 4 týdnů ve svém
originálním hliníkovém pouzdru za přítomnosti desikantu, hermeticky uzavřené a
chráněné před jakoukoli vlhkostí a umístěné v přiloženém skladovacím pouzdru.
2. F-Diluent vzorku: Je připraven k použití. Po otevření může být použit po 4 týdny,
při skladování v teplotě 2-8°C a při zabránění bakteriální kontaminaci během
použití. Tato reagencie obsahuje 0,05% Kathon CG.
3. PAI-1 Standard: rozpusťte každou lahvičku 2 ml F-Diluentu vzorku. Získáte tak
roztok s obsahem kolem 10 ng/ml. Tento roztok je stabilní nejméně 8 hodin při
pokojové teplotě.
4. PAI-1 kontrolní plazma CI (lidská plazma, vysoká): rozpusťte 1 ml destilované
vody
5. PAI-1 kontrolní plazma CII (lidská plazma, nízká): rozpusťte 1 ml destilované
vody.
Pozn.: Po rozpuštění jsou PAI-1 kontroly stabilní 8 hodin při pokojové teplotě, 24
hodin při teplotě 2-8°C nebo 2 měsíce při =20°C nebo nižší.
Upozornění: Kontrolní plazmy I a II (4+5) a standard (3) jsou vyrobeny z normální
lidské plazmy. Tyto plazmy byly testovány registrovanými metodami a shledány
negativními pro anti HIV protilátky, HBsAg a anti HCV protilátky. Přesto, žádný test
nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních agens. S každým produktem lidského
původu musí být zacházeno s veškerou opatrností, jako s potenciálně infekčním.
6. Anti-(h)-PAI-1-HRP immunokonjugát: každá lahvička musí být rozpuštěna 4 ml
diluentu konjugátu. Nechte částečky kompletně rozpustit a před použitím lahvičku
promíchejte, aby byl obsah homogenizován. Rozpuštěný konjugát je stabilní 24
hodin při pokojové teplotě, 4 týdny při teplotě 2-8°C.
7: Diluent konjugátu: Je připraven k použití. Po otevření může být použit po 4 týdny,
pokud je skladován při teplotě 2-8°C a je zabráněno bakteriální kontaminaci během
používání. Tato reagencie obsahuje 0,05% Kathon CG.
8. Promývací roztok: Inkubujte lahvičku 15-30 minut ve vodní lázni při 37°C, dokud
se případné pevné částečky nerozpustí. Promíchejte lahvičku a nařeďte v poměru
1:20 destilovanou vodou (50 ml obsahu lahvičky postačí pro přípravu 1 litru
promývacího roztoku). Promývací roztok musí být skladován při 2-8°C ve své
originální lahvičce a použit do 4 týdnů po otevření. Ředěný promývací roztok může
být použit do 7 dnů, pokud je zabráněno kontaminaci roztoku a pokud je skladován
při teplotě 2-8°C. Tato reagencie obsahuje 0,05% Kathon CG.
9: TMB substrát: Je připraven pro použití. Po otevření může být použit po dobu 4
týdnů, pokud je skladován při teplotě 2-8°C a je zabráněno jakékoliv kontaminaci
během používání.
10. Zastavovací roztok: Je připraven k použití.
Upozornění: Kyselina sírová, ačkoliv je ředěné na 0,45M, je žíravá. Jako se všemi
podobnými chemikáliemi, zacházejte s kyselinou sírovou s opatrností. Vyvarujte se
kontaktu s kůží a očima. Používejte ochranný oděv, rukavice a brýle během
manipulace.
Pozn.: Přeneste kit do pokojové teploty nejméně 30 minut před použitím. Nepoužité
reagencie skladujte při 2-8°C
Studie stability prokázaly, že reagencie mohou být přepravovány při pokojové
teplotě bez poškození.
PROVEDENÍ:
Odběr vzorku:
Krev (9 dílů) musí být odebrána přímou venepunkcí, aby se zabránilo aktivaci, do
0,109M citrátu sodného (1 díl) nebo do CTAD (Citrát-Theofylline-AdenosinDipiridamol) zkumavek. Plazma se oddělí centrifugací po 20 minut při 2500g. Aby
se zabránilo aktivaci trombocytů, je doporučeno odebrat 1:3 supernatantní plazmy
Distributor: Diagnostica a.s., Za Tratí 686, Praha 9, Česká republika, tel. 283 109 137, Fax. 283 109 132, e-mail: [email protected]
za pomoci špičky pipety ze středu supernatantu. Citrátová plazma může být
testována do 8 hodin nebo skladována zmrazená při teplotě -20°C nebo nižší po
dobu 6 měsíců. Těsně před testováním rozmrazujte plazmu 15 minut při 37°C.
Rozmrazená plazma musí být testována do 4 hodin.
PAI-1 Ag může být uvolněn z trombocytů během jejich aktivace nebo poškození.
Aby se zabránilo takto vzniklému navýšení PAI-1, musí být trombocyty pečlivě
odstraněny. Doporučuje se použití CTAD odběrových zkumavek, které zabraňují
aktivaci trombocytů. K vyloučení vlivu denního kolísání hladin PAI-1 se doporučuje
odebírat vzorky ráno a nalačno.
Může být použita i lidská EDTA plazma. Podmínky skladování jsou stejné, jako u
citrátové plazmy
Testovaná plazma, vzorky, kontroly:
Vzorky musí být testovány v pětinásobném ředění (1:5) v F-Diluentu vzorku.
Pro očekávané koncentrace PAI-1 > 50 ng/ml mohou být vzorky nebo plazmy
testovány ve vyšším ředění 1:10, 1:20 nebo větším.
Kontrolní plazmy I a II musí být testovány v ředění 5x (1:5) v F-Diluentu vzorku.
Kalibrace:
Za použití „C ng/ml“ PAI-1 standardu, který je součástí kitu, připravte následující
koncentrace standardu
PAI-1 koncentrace
(ng/ml)
Objem PAI-1 standardu
C
C/2
C/4
C/10
C/20
1
0,5
0,25
0,1
0,05
ml
ml
ml
ml
ml
Objem F-Diluentu vzorku
0
0,5
0,75
0,9
0,95
ml
ml
ml
ml
ml
Opatrně promíchejte pro homogenizaci.
Takto připravené ředěné standardy jsou stabilní po dobu 6 hodin při pokojové
teplotě.
0
0
ml
1
ml
Provedení testu:
Vyjměte požadovaný počet proužků z aluminiového pouzdra. Proužky vložte do
přiloženého rámečku. Do jamek destičky potom pipetujte reagencie podle
následující tabulky:
Reagencie
Objem fáze testu
Konjugát anti-(h)-PAI-1100 µl Pipetujte Anti-(h)-PAI-1-HRP
HRP (rozpuštěný 4 ml
immunokonjugát do jamek destičky
diluentu kojnugátu)
PAI-1 standard nebo
100 µl Pipetujte ihned standardní roztoky, nebo
testované vzorky nebo Ftestované vzorky do odpovídajících jamek
Diluent vzorku (blank)
destičky
Opatrně promíchejte na třepačce destiček nebo manuálně a inkubujte 1 hodinu za
pokojové teploty
Promývací roztok (20x
300 µl Proveďte 5 postupných promytí za pomoci
ředěný destilovanou
promývačky (a)
vodou)
TMB/H2O2 Substrát
200 µl Okamžitě po promytí pipetujte do jamek
substrát.
Pozn.: pipetování substrátu, řádek po
řádku, musí být přesně ve stejných
intervalech (b,c)
Inkubujte přesně 5 minut za pokojové teploty (18-25°C) (c)
0,45M Kyselina sírová (5)
50 µl
Pipetujte ve stejných časových intervalech
jako substrát. Napipetováním 0,45M
Kyseliny sírové se zastaví vývoj zbarvení
(b)
Počkejte 10 minut, aby se zbarvení stabilizovalo a měřte absorbanci při 450 nm
(A450). Odečtěte hodnotu blank.
Pozn.:
a – Nikdy nenechejte destičky prázdnou bez přidání následující reagencie nebo po
promytí. Následují reagencie musí být přidána do 3 minut, aby se zabránilo
poškození destičky vyschnutím. Vyschnutí může poškodit na stěně jamky navázané
komponenty. Pokud je nezbytné, nechejte destičku naplněnou promývacím
roztokem a vyprázdněte před přidáním následující reagencie. Promývačka musí být
nastavena tak, aby byla destička promyta jemně, a aby nebyla příliš razantně
odsávána – mohla by snížit reaktivita destičky.
b – Pro pipetování TMB substrátu – časové intervaly mezi jednotlivými řádky musí
být stejné a přesně určené. Zastavovací roztok se pak pipetuje ve stejných
intervalech
c – Vyvarujte se ponechání destičky na slunečním světle během inkubace a
zejména během rozvoje zbarvení. Může být použita mikroELISA míchačka.
d – Pro bi-chromatický odečet je referenční vlnová délka 690 nm nebo 620 nm.
Dvoukroková metoda:
Test může být též proveden dvoukrokovou metodou. Kalibrační křivka je od 0 do C
ng/ml (jako pro jednokrokovou metodu), PAI-1 standard se rozpustí ve 2 ml FDiluentu vzorku (SD).
Immunokonjugát (IC) musí být rozpuštěn 7,5 ml Diluentu konjugátu (CD).
Testovaná plazma musí být vyšetřena v pětinásobném (1:5) ředění nebo vyšším
v F-Diluentu vzorku (SD).
Do každé jamky se pipetuje 100 µl SD a potom okamžitě 100 µl kalibračního
roztoku (připraveného stejně jako pro jednokrokovou metodu) nebo 100 µl ředěné
testované plazmy. Následuje 1 hodina inkubace za pokojové teploty (18-25°C) a
promytí. Potom se pipetuje 200 µl/na jamku immunokojugátu (IC). Následuje
inkubace 1 hodinu při pokojové teplotě a opět promytí. Rozvoj zbarvení po přidání
200 µl TMB po dobu 5 minut, zastaví se 50 µl 0,45M Kyseliny sírové (SA).Měří se
absorbance při 450 nm.
Pokyny pro promývání a provedení, stejně tak interpretace výsledků, jsou stejné,
jak u jednokrokové metody.
VYJÁDŘEDNÍ VÝSLEDKŮ:
Na lineární grafický papír vyneseme na jednu osu koncentrace PAI-1 Ag (ng/ml), na
druhou korespondující absorbance. Uživatel musí sestrojit kalibrační křivku
získanou měřením ředěného standardu.
Ze takto získané kalibrační křivky se odečítají koncentrace PAI-1 Ag pro testované
vzorky. Pro obdržení koncentrace PAI-1 Ag v těchto vzorcích musí být hodnoty
odečtené z kalibrační křivky násobeny dilučním faktorem (tedy 5, 10, 20...) – viz
model na přiloženém letáku.
Pro kontroly I a II musí být koncentrace změřené násobeny 5x.
Alternativně lze použít ELISA software (např. Dynex, Biolise atd.) pro kalkulaci
výsledných koncentrací.
OČEKÁVANÉ ROZMEZÍ:
Normální meze pro koncentraci PAI-1 Ag použitím testu ZYMUTEST PAI-1 Ag jsou
od 1 do 25 ng/ml.
Pozn.:V nepřítomnosti referenčního materiálu pro PAI-1 Ag testy je významná
heterogenita PAI-1 koncentrací stanovených různými komerčními testy. Normální
rozmezí musí být vztaženo k použitému setu (6).
Koncentrace PAI-1 Ag stoupá s věkem a v souvislosti s metabolismem lipidů –
zejména s koncentrací triglyceridů. Kolísá během dne – nejvyšší koncentrace jsou
ráno.
Koncentrace PAI-1 Ag stoupá během gravidity.
BIOCHEMIE:
PAI-1 je jednořetězcový glykoprotein syntetizovaný endoteliemi a jaterními
buňkami. Jeho molekulární hmotnost je 50 000 D. V plazmě je stabilizován vazbou
na Vitronektin, nebo cirkuluje jako inaktivní komplex s tPA nebo uPA. PAI-1 je též
přítomen v trombocytech, ale v latentní formě.
PAI-1 reguluje fibrinolýzu inhibicí tPA nebo urokinázy.
PATOLOGIE:
PA-1 Ag stoupá při tromboze, maligních onemocněních,u jaterních poruch, po
chirurgických zákrocích, při sepsích.Je též zvýšený v extraktech z maligních tkání.
Současné studie ukazují souvislost mezi zvýšenou koncentrací PAI-1 a
kardiovaskulárními rizikovými faktory (obezita, hyperinzulinemie,
hypertriglyceridemie, aterotromboza...)
APLIKACE:
Testování PAI-1 Ag v klinických vzorcích, měření PAI-1 jako kardiovaskulárního
rizikového markeru.
CHARAKTERISTIKA TESTU:
Tento test je založen na monoklonální protilátce a má homogenní reaktivitu pro
různé formy PAI-1 – latentní, aktivní, vázané na vitronektin, vázané v komplexu
s tPA nebo uPA, nebo inaktivní formy.
Detekční rozhraní je 0,5 ng/ml
Intra-assay 3-8%
Inter-assay 5-10%
Žádné signifikantní interference s heparinem do 2 IU/ml.
REFERENCE:
1. Declerck P.J., Alessi M.C., Verstreken M., Kruithof EK.O., Juhan-Vague I., Collen
D. : Measurement of Plasminogen Activator Inhibitor 1 in biologic fluids with a
murine monoclonal antibody based enzyme-linked-immunosorbent assay. Blood ;
1998, 71, 220-25.
2. Loskutoff D.J., Samad F. : The adipocyte and hemostatic balance in obesity.
Studies on PAI-1.Artherioscl. Thromb. Vasc. Biol., 1998, 18, 1-6.
Distributor: Diagnostica a.s., Za Tratí 686, Praha 9, Česká republika, tel. 283 109 137, Fax. 283 109 132, e-mail: [email protected]
3. Fujii S. : PAI-1 in Thrombosis and Arteriosclerosis. Fibrinolysis and Proteolysis,
1997, 11, 137-140.
4. De Maat MPM, De Bart A.C.W., Hennis BC, Meijer P., Havelmaar AC, Mulder
PG, Kluft C. :Interindividual and Intraindividual variability in plasma Fibrinogen, tPA
antigen, PAi-1 Activity and CRP in healthy, young volunteers and patients with
angina pectoris. Arterioscl. Thromb.
Vasc. Biol., 1996, 16, 1156-62
5. Smith F.B., Lee A.J., Rumley A., Fowkes G.R., Lowe G.O.R. : TissuePlasminogen-Activator, Plasminogen Activator Inhibitor and risk of peripheral
arterial disease. Artheriosclerosis, 1995, 115, 35-43.
6. Declerck PJ et al., Multicenter evaluation of commercially available methods for
the immunological determination of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1),
Thromb. Haemost.,
1993, 70(5), 858-63.
Distributor: Diagnostica a.s., Za Tratí 686, Praha 9, Česká republika, tel. 283 109 137, Fax. 283 109 132, e-mail: [email protected]