Metody studia proteinu I

METODY STUDIA PROTEINŮ I
Vlasta Němcová
[email protected]
OBSAH PŘEDNÁŠKY
1. Organizace praktik z Buněčné a molekulární biologie
2. Obecné principy specifické detekce molekul
3. Vizualizace proteinů pomocí mikroskopických technik
4. Stanovení koncentrace proteinu
5. Stanovení míry exprese proteinu
•
SDS-PAGE + Western blot
1) ORGANIZACE PRAKTIK Z BMB
• 2 části (á 4 vyučovací hodiny)
• povinná : pro udělení zápočtu nutná 100% účast a úspěšné
absolvování výstupního testu (součástí druhé části praktik)
• případnou neúčast lze v odůvodněných případech nahradit s jinou
skupinou po domluvě s vedoucím praktik
• nutné mít s sebou: laboratorní plášť, kalkulačka
• nutno znát teorii z přednášky „Metody studia proteinů I“
(možnost vyloučení z praktik při neznalosti)
• 2 praktické úlohy: 1) detekce cytoskeletárních struktur pomocí
fluorescenční mikroskopie
2) porovnání exprese aktinu v různých tkáních
pomocí metody Western blot
2) OBECNÉ PRINCIPY SPECIFICKÉ
DETEKCE MOLEKUL
(nejen proteinů)
„Přeplněnost“ cytosolu: červená-proteiny, modrá-RNA, zelená-ribosomy
 Jak najít to, co nás zajímá, mezi tisíci dalších typů molekul ?
(nutno zajistit specifičnost detekce)
 Jak „zviditelnit“ výsledek této specifické detekce?
( nutno vybrat vhodný systém detekce signálu pro danou situaci)
ZAJIŠTĚNÍ SPECIFICKÉ DETEKCE
 „nalezení“ detekované molekuly ve vzorku – na základě známé a
specifické interakce jiné molekuly s detekovanou molekulou
Touto molekulou umožňující detekci může být:
1. malá organická molekula – molekula, která se specificky váže k
cílovému proteinu
(např. phalloidin k F-aktinu, DAPI a ethidium bromid k DNA)
2. protein, o kterém je známo, že interaguje s detekovaným proteinem
( např. DNáza I s G-aktinem)
3. protilátka specificky rozpoznávající detekovaný protein
=IMUNODETEKCE
- nejčastěji používaný systém pro detekci proteinů, protože protilátku
lze připravit proti jakémukoliv proteinu
PROTILÁTKY
 imunoglobuliny produkované imunitním systémem (Ig třídy A, D, E, G, M)
Fc fragment
 Fc fragmenty protilátek jedné třídy stejného živočišného druhu jsou stejné
PROTILÁTKY
 rozpoznávají specifické epitopy na molekule antigenu
 antigen = látka, která navozuje produkci protilátek imunitním systémem
(obvykle cizorodá molekula)
 epitop = specifický povrchový rys antigenu, který může být vázán
protilátkou
 teorie „zámku & klíče“: interakce protilátky s antigenem na základě
komplementarity povrchů a slabých vazebných interakcí
(antigen = svazek klíčů , epitop = konkrétní klíč ze svazku, každý klíč má
jiný zámek)
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU
 s detekovanou molekulou specificky interagující molekula
(např. protilátka) obvykle není schopna produkovat
detekovatelný signál  konjugována s jinou molekulou
umožňující vizualizaci nebo vznik detekovatelného signálu
Touto molekulou umožňující detekci může být:
1. těžký kov
2. fluorofor
3. enzym, jehož enzymová aktivita umožňuje vizualizaci
detekované molekuly
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU: TĚŽKÝ KOV
 nejčastěji koloidní zlato („imunogold labeling“)
 Somatostatin v D buňkách pankreatu
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU: FLUOROFOR
fluorofor = molekula schopná absorbovat
záření určité vlnové délky (=být excitována) a
vyzářit (=emitovat) záření jiné
vlnové délky (=detekovaný signál)
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU: ENZYM
 zviditelnění detekované molekuly po reakci enzymu se substrátem
 intenzita signálu může být měřena  kvantifikace detekované molekuly
 chemiluminiscence – jako enzym se obvykle používá křenová
peroxidáza (= horse radish peroxidase = HRP) – štěpí luminol za
vzniku světla, které je detekováno (speciální přístroj nebo fotografický
film)
 chromogenní (barevná reakce) – vzniká barevný produkt
- např. enzym alkalická fosfatáza (= AP), HRP
• produkt musí být nerozpustný,
pokud chceme vidět lokalizaci
detekované molekuly
• produkt musí být rozpustný,
pokud chceme měřit intenzitu
vzniklého zabarvení v roztoku
(kvantifikace detekované molekuly měřením absorbance)
PŘÍMÁ A NEPŘÍMÁ IMUNODETEKCE
Přímá detekce
Nepřímá detekce
detekovatelný
produkt
detekovatelný
produkt
substrát
substrát
amplifikace signálu
enzym
enzym
sekundární protilátka
primární protilátka
 značená primární protilátka
 neznačená primární protilátka
+ značená sekundární protilátka
 sekundární protilátka interaguje s Fc fragmentem primární protilátky
 váže se na všechny protilátky jedné třídy vytvořené určitým živočišným druhem
3) VIZUALIZACE PROTEINŮ POMOCÍ
MIKROSKOPICKÝCH TECHNIK
 imunohistochemie
 fluorescenční mikroskopie
 elektronová mikroskopie
IMUNOHISTOCHEMIE
 detekce v mikroskopickém preparátu (obvykle tenký řez tkáně)
 obvykle pomocí specifických protilátek a barevné reakce za
vzniku nerozpustného produktu
FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE
 excitační filtr umožňuje výběr vlnové délky pro excitaci fluoroforu, světlo jiné
vlnové délky je emitováno fluoroforem a je propuštěno bariérovým filtrem do
okuláru
 lze detekovat signál vždy jen od jednoho fluoroforu, při vícenásobném značení se
musí obraz do vícenásobného skládat počítačově
FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE
 při použití různých fluoroforů – možnost sledování více typů
molekul, případně jejich kolokalizaci (výskyt na stejné buňce nebo
stejném místě v buňce)
 praktika: barvení cytoskeletárních struktur (aktin, tubulin) a DNA
 DNA: DAPI
 tubulin: protilátka proti tubulinu konjugovaná s fluoroforem FITC
 aktin: phalloidin konjugovaný s fluoroforem TRITC
ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
 protilátka obvykle značená koloidním zlatem
 Somatostatin v D buňkách pankreatu
3) STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ
V ROZTOKU
 založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance)
A = koncentrace . optická dráha . extinkční koeficient
• metoda podle Bradfordové (bude použita v praktiku)
• BCA metoda (Bicinchoninová metoda)
• stanovení z UV spektra
• atd.
METODA PODLE BRADFORDOVÉ
(Bradford assay)
 princip: kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova
(Bradfordové) činidla s roztokem obsahujícím proteiny
 Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue váže se na bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech
(Arg, Phe, Try, Pro)
 změna barvy roztoku z hnědé na modrou
 měření absorbance při 595 nm
(absorbance přímo úměrná koncentraci proteinů)
Blank
Koncentrace proteinu
BCA METODA (BCA assay)
 detekční činidlo obsahuje BCA (bicinchoninic acid)
 kolorimetrická reakce založena na interakci činidla přímo s
peptidovou vazbou
(a ne pouze na interakci s určitými AMK)
 purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm
Blank
Koncentrace proteinu
PRINCIP STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ
 nutno vytvořit kalibrační křivku ze série roztoků o známé
koncentraci proteinu
Absorbance (A595 nm)
 nejčastěji je používán bovinní sérový albumin (=BSA)
0,500
y = 0,2286x + 0,0008
R² = 0,9996
0,400
Změřená hodnota absorbance
0,300
0,200
0,100
Zjištěná koncentrace proteinu
0,000
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
BSA (ug/ul)
1,4
1,6
1,8
2
2,2
STANOVENÍ Z ABSORBANCE
V UV OBLASTI
 proteiny přirozeně absorbují v UV spektru (260 - 280 nm) díky
přítomnosti aromatických aminokyselin
(tyrosin a tryptofan, méně cystein)
 není nutná kalibrační křivka

výpočet dle rovnice
[Protein] (mg/mL) = 1.55*A280 - 0.76*A260
 všechny metody založené na stanovení přítomnosti pouze určitých
aminokyselin předpokládají stejné zastoupení těchto AMK v
porovnávaných vzorcích !!!
4) STANOVENÍ MÍRY EXPRESE
PROTEINŮ
 ELISA
(bude vysvětleno v přednáškách Ústavu imunologie)
 SDS-PAGE + Western blot
 Průtoková cytometrie
(bude vysvětleno v přednáškách Ústavu imunologie)
 metody založené nejčastěji na použití
specifických protilátek
SDS-PAGE
 separace proteinů podle molekulové hmotnosti
 = sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
 stanovení (porovnání) exprese určitého proteinu v různých vzorcích
 vzorek ve formě roztoku obsahujícího proteiny, např. lyzát tkáně,
buněk , …
 před vlastní analýzou je nutná dezintegrace (lýza) buněk –uvolnění
buněčného obsahu do roztoku
 lýza buněk a tkání: různé chemické, mechanické a fyzikální přístupy,
příp. jejich kombinace
SDS-PAGE
 gelová elektroforéza - gel s vhodnou velikostí pórů
 taková velikost, aby se molekuly s různou velikostí pohybovaly
rozdílnou rychlostí
 proteiny: obvykle polyakrylamidový gel
(elektroforéza DNA, RNA: obvykle agarózový gel – větší velikost pórů)
SDS-PAGE
 separaci podstupují jednotlivé polypeptidové řetězce proteinů
 proteiny nutno před separací denaturovat pomocí denaturačních činidel
• SDS – rozvolnění proteinu do vláknité podoby
• merkaptoethanol, dithiotreitol redukce S-S můstků
• teplo – povaření
 zachovaná pouze
primární struktura
proteinu
SDS-PAGE
 SDS dává proteinům homogenní záporný náboj
(stejný na jednotku délky proteinu)
 separace proteinů víceméně pouze podle molekulové hmotnosti
 proteiny jsou záporně nabité – pohyb v elektrickém poli ke kladné
elektrodě (ANODA)
SDS-PAGE
_
+
 záporně nabité proteiny taženy ke
kladné elektrodě
 čím delší polypeptidový řetězec, tím více
inhibován při průchodu gelem
 menší proteiny doputují dále než
větší
SDS-PAGE
 jednotka molekulové hmotnosti
používaná pro proteiny je
Dalton
(1 000 Da = 1 kDa)
 1 Da odpovídá hmotnosti
atomu vodíku
 molekulová hmotnost detekovaného proteinu jde zjistit porovnáním
jeho velikosti s markerem molekulových hmostností =
komerčně dostupná směs proteinů o známých velikostech
SDS-PAGE
 proteiny po separaci lze zviditelnit např. pomocí Coomassie
Brilliant Blue – nespecificky se váže na všechny proteiny v gelu
 pro specifickou detekci konkrétního proteinu je nutné
pokračovat metodou Western blot
WESTERN BLOT
 použití nejčastěji pro porovnání míry exprese proteinů pomocí
imunodetekce
 název vznikl jako slovní hříčka dle metody SOUTHERN blot (technika
detekce DNA) zavedené Edwinem Southernem (1975)
 analogicky byl vytvořen také název pro metodu NORTHERN blot
(technika detekce RNA)
WESTERN BLOT
 přenos proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE na povrch
nespecificky vázající proteiny (nitrocelulózová nebo PVDF membrána)
 pohyb záporně nabitých proteinů v elektrickém poli z gelu na membránu
 membrána umožňuje snadný přístup protilátek k proteinům na
membráně a jednoduchou manipulaci
 proteiny přeneseny na
membránu ve stejné vzájemné
pozici –vzniká „otisk“ (blot) gelu
na mebráně
 blokace membrány (obvykle
BSA nebo odtučněné mléko) 
obsazení všech proteinvazebných míst na membráně
 detekce proteinu na membráně
pomocí imunodetekce
WESTERN BLOT
 detekce konkrétních proteinů obvykle pomocí specifických protilátek a
chemiluminiscence (příp. fluorescence) nebo barevné reakce za vzniku
nerozpustného produktu
WESTERN BLOT - příklady klinických aplikací
 detekce protilátek (např. pro potvrzení diagnózy)
• infekční borelióza, EBV, HIV, HSV, Helicobacter pylori
• autoprotilátky: antinukleární protilátky (ANA), protilátky proti neuronálním
antigenům, profil autoimunitních chorob jater, …
Klinické aplikace - princip detekce
• Na proužky membrány byly po
elektroforéze metodou WB
„nablotované“ příslušné antigeny.
Pozice proteinu (antigenu) odpovídá
jeho molekulární hmotnosti.
• Jestliže je vzorek séra pacienta
pozitivní, naváží se specifické
protilátky ze séra na odpovídající
antigen na membráně.
• Navázané protilátky reagují s
anti-humánními protilátkami
značenými alkalickou fosfatázou (AP).
Klinické aplikace - princip detekce
• Navázané protilátky jsou následně
inkubovány s roztokem obsahujícím
chromogenní substrát, což umožní
barevnou reakci. V případě, že
vzorek séra obsahuje specifické
protilátky, objeví se v pozici
odpovídající příslušnému antigenu
tmavý proužek.
• Vyhodnocení proužků
(přítomnost/nepřítomnost) na
membráně nám určí zda je vzorek
pozitivní/negativní (pacient
nemocný/zdravý).
EUROLINE ANA-Profile 3
Line immunoassay for
confirmation and
discrimination of
antibodies HIV-1 and
HIV-2
EUROLINE-WB: detection of
antibodies against Borrelia
STUDIJNÍ LITERATURA & UŽITEČNÉ ODKAZY
Základní literatura:
Alberts B. et al: Molecular Biology of the Cell, 5. vydání, str. 517-519, 585589, 606-607
Další materiály k fluorescenci a průtokové cytometrii pro zájemce:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html