unlimitedmuscle

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Stacionární fáze/sorbenty
Příprava předmětu byla podpořena
projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
2.3. Sorbenty pro HPLC
Historie - současnost:
Plně porézní materiály (Totally porous beads) –
silikagel, alumina ~ 20-40 µm: malá účinnost vzhledem
k pomalému přenosu hmoty ve stagnantní mobilní fázi
Pelikulární sorbenty (Pellicular packings, porous layer
beads) – pevné neprostupné jádro ~ 20-40 µm – sklo,
ocel, na povrchu porézní tenká vrstva – silikagel, alumina,
měnič iontů apod.: nebotná, vyšší účinnost – snížený vliv
přenosu hmoty ve stagnantní fázi, ale nízká kapacita
sorbentu
Mikroporézní sorbenty (Microparticular, microporous
particles) – malé plně porézní sférické částice, silikagel,
alumina ~3-10 µm, vysoká účinnost, snížení negativních
vlivů stagnantní mobilní fáze a odporu proti přenosu hmoty
v mobilní fázi, velký povrch ~100-500 m2g-1, velikost porů
~ 6-10 nm
Současné trendy ve vývoji sorbentů
Totally porous sub-2 µm particles
Superficially porous particles
(Povrchově porézní částice)
5 µm, 0.25 um, 300 Å
suitable for separation
of macromolecules
http://www.phenomenex.com
/
Hybridní sorbenty
XTerra™ Particle Technology
O
RSi(OR’)3
R Si
+
Si(OR’)4
O
O
O
Si
SiO2(RSiO1.5)n
O
O
Unger et al J. Chromatogr. 125 (1976), 115 (“bulk modification”)
Perfusion sorbents
(developed for the separation of macromolecules)
F. Regnier, Nature, 350 (1991) 634
• Designed for Bio-applications, polymeric backbone
• In "classical" chromatography, sample molecules are
carried to binding sites on the particle surface by
convective flow through the column. However, transport of
sample molecules to binding surfaces inside the particle
occurs by diffusion - a slow process, especially for large
molecules such as proteins and peptides
• For capacity and resolution to be maximized, interaction
with as many of the binding sites as possible must take
place. However, as flow rate past the particles increases,
there is less time for molecules to diffuse the necessary
distance to reach interior binding sites; resolution and
capacity both suffer. As a result, conventional media has
always required trade-offs between speed, resolution,
and capacity
• Diffusion into the stagnant mobile phase pools
of the long internal pores is the rate-limiting factor
with conventional media. This slow diffusion process
leads to peak broadening and loss of capacity if flow rates
are increased
• POROS Flow-through Particles Overcome Mass
Transport Barriers
• In contrast to conventional chromatography media,
POROS Perfusion Chromatography particles are
engineered to have two discreet classes of pores.
Large "throughpores" allow convection flow to
occur through the particles themselves quickly
carrying sample molecules to short "diffusive"
pores inside
• POROS Perfusion Chromatography media is
manufactured by inter-adhering microspheres into
particle clusters. The process is carefully controlled to
create throughpores of 6000-8000 Å and diffusive
pores of 800-1500 Å.
• By reducing the distance over which diffusion needs to
occur, the time required for sample molecules to
interact with interior binding sites is also reduced.
Diffusion is no longer limiting and flow rates can be
dramatically increased - without compromising
resolution or capacity. Separations can be achieved
at 1,000 to 5,000 cm/hr compared to 50 to 360 cm/hr
for conventional media
Advantages of Perfusion Chromatography
Technology:
• Develop Better Separations Methods in a Shorter Time
Frame
• Improve Recovery of Biologically Active Product
• Reduce Time-consuming Sample Prep
You can replace many sample preparation steps with high
speed Perfusion Chromatography technology. For instance,
dialysis of large volumes of material can be replaced by high
flow rate processing of the dilute sample. Elution in a small
volume of new buffer accomplishes both buffer exchange
and concentration. Similarly, ultrafiltration and other
concentration techniques that can lead to product loss
through extra handling can potentially be replaced.
• Monitor Process-Scale in Real-Time
• Create Novel Assays for More Efficient Analysis
Perfusion Chromatography technology is not limited to
standard modes of separation. Both enzymes and affinity
ligands can be immobilized on POROS media. By combining
rapid on-column protein digestions with rapid on-column
immunoassays and chromatographic separations, you can
create entirely new assays with unlimited potential
PerSeptive Biosystems Inc.
Monolitická média
Historický úvod
Původ slova monolit
- µονολιτηοσ
Webster’s College Dictionary defines the noun monolith as
(i)
(ii)
(iii)
a large block of stone,
something, such a column, made from one large block, and
something suggestive of a large block of stone.
the adjective monolithic is explained as
(i) constituting a monolith,
(ii) massive, solid, and uniform, and
(iii) constituting or acting as a single, often rigid, uniform whole.
Nevýhody “klasických” makroporézních sorbentů
-poměrně pomalá difúze (zejména makromolekulárních) analytů
do stagnantní mobilní fáze => malá separační účinnost, nutnost
pracovat při poměrně nízkých průtocích
-velký intersticiální prostor mezi částicemi sorbentu
=> Možná řešení
- částice malých rozměrů
- pelikulární a neporézní částice
- perfúzní částice
-monolitické stacionární fáze – přirozený výsledek vývoje sorbentů
Hydrogely
Ústav makromolekulární chemie v Praze
=>polymerní monolit na bázi HEMA-co-EDMA pro užití v SEC
- snaha nahradit zesítěné polysacharidové sorbenty
- poměrně velký tlakový spád a malá účinnost
M.Kubín, P.Špaček, R.Chromeček; Coll. Czechosl. Chem. Commun. 32 (1967) 3881.
uvedený koncept byl úspěšně oživen o mnoho let později pro CEC:
A.Vegvari, A.Foldesi, C.Hetenyi, O.Kocnegarova, M.G.Schmid, V.Kudirakaite, S.Hjertén;
Electrophoresis, 21 (2000) 3116.
Novější vývoj
1. Stlačitelné monolity
2. Rigidní monolity
(a) válcového tvaru
(b) monolitické disky
(c) monolitické trubice s radiálním tokem
3. Anorganické monolity
1. Stlačitelné monolity
Prof. Hjertén - University of Uppsala
- experimenty s měkkými deformovatelnými částicemi sorbentů již v 60. tých letech
=>podobné zkušenosti jako Kubín a spol., tj. nízká průtoková rychlost
- koncem 80. tých let experimenty s částicemi neporézní agarózy, za vyšších průtoků
došlo k deformaci částic, ale přitom byla průtoková rychlost dostatečná a separace
se zlepšila
S.Hjertén, Y.Konguan, J.L.Liao, Macromol. Chem. Macromol. Symp., 17 (1988) 349.
- kombinace výše uvedených znalostí a zkušeností s vysoce zesítěnými polyakrylamidovými
gely => úplně nový koncept, publikace v roce 1989
chemická podstata stlačitelného monolitu: N,N’-methylenbisakrylamid a akrylová kyselina
při separaci stlačení na ~17% původního objemu
velmi pěkná separace bílkovin v iontově-výměnném uspořádání
1.alcohol dehydrogenase, 2.horse skeletal muscle myoglobin, 3.whale myoglobin,
4.ribonuclease A, 5.cytochrom c
3 x 0.6 cm, lineární gradient NaCl
S.Hjertén, J.L. Liao, R.Zhang, J. Chomatogr., 473 (1989) 273.
- následně další zdokonalení lože => komercializace monolitů
tohoto typu
UNO® BioRad Laboratories (Hercules, CA)
- další zdokonalení technologie pro potřeby aplikací v CEC
(polovina 90. tých let)
S.Hjertén, D.Eaker, K.Elenbring, C.Ericson, K.Kubo, J.L.Liao, C.M.Zeng, P.A.Linstrom,
C.Lindh,A.Palm, T.Srichiayo, L.Valcheva, R.Zhang, Jpn. J. Electrophor., 39 (1995) 105.
Bio-Rad, Hercules, California, USA
UNO Q and S Ion Exchange Columns
2. Rigidní polymerní monolity
Válcového tvaru
- vývoj na Cornell University, počátek 90. tých let
- poly(glycidyl-methakrylát-co-ethylen-dimetakrylát)
- poly(styrene-co-divinylbenzene)
- narozdíl od disků příprava přímo ve vhodné trubici/koloně
- první monolit tohoto typu byl využit pro úspěšné dělení bílkovin
v iontově-výměnném modu
- monolity uvedeného druhu byly komercializovány
firmou ISCO Inc., dnes součást DIONEX, s označením Swift®
F.Svec, J.M.J. Fréchet, Anal. Chem., 54 (1992) 820.
Příprava
rigidních monolitů na bázi organických polymerů
Polymerizační
směs
Promývací roztok
1) Utěsnění
1) Připojení
k čerpadlu
2) Teplota
2) Promytí
Forma
Termostatovaná
lázeň
Čerpadlo
Typické vlastnosti monolitu
- příprava přímo v koloně
- přítomnost mesopórů i makropórů, jejichž velikost je “laditelná”
vhodnou volbou podmínek při přípravě
- možnost velmi rychlých separací při relativně malém tlaku na koloně
- vysoká chemická odolnost
- poměrně vysoká tepelná odolnost
- možnost přípravy stacionárních fází pro různé chromatografické mody
cestou funkcionálních monomerů
nebo
modifikací reaktivních monolitů
Velmi rychlá separace polystyrenových standardů
A
B
A: Monolitická kolona 50x8 mm, poly(styren-co-divinylbenzen),
B: Konvenční porézní sorbent na bázi poly(styren-co-divinylbenzenu), 50x8 mm,
průtok 20ml/min, gradient THF v metanolu, (a) trvání gradientu 30s, (b) trvání gradientu 12s
analyty: polystyren Mr 9200, 34000, 980000.
Rozpouštěcí/srážecí chromatografie PS standardů na monolitu
versus SEC na klasickém sorbentu
Separace oligonukleotidů na monolitické koloně
na bázi modifikovaného poly(glycidyl-methakrylátu-co-ethylen-dimethakrylátu)
a
kolona 50x8 mm, průtok 4 ml/min
analyty: (a) pd(A)12-18, (b) pd(T)12-24, gradient NaCl
Speciální aplikace monolitu
- on/off ventil
- kontrolovaný průtok
- speciální mód hydrofobně-interakční chromatografie
NIPAAm: N-isopropylacrylamide
MBAAm: methylenebisacrylamide
Teplotou řízená hydrofobně-interakční chromatografie (HIC)
(1) Carbonic anhydrase, (2) soybean trypsin inhibitor
Grafted monolith 10x10 mm, isocratic elution, flow 1ml/min
E.C.Peters, F.Svec, J.M.J. Fréchet, Adv. Mater., 9 (1997) 630.
Monolitické disky
prof. Belenkii a spol., Ústav makromolekulární chemie, Sankt-Petěrburg
studium gradientové separace bílkovin v 80. tých letech
+
Ústav makromolekulární chemie v Praze
příprava tenkých polymerních vrstev na bázi glycidyl-methakrylátu-co-ethylen-dimethakrylátu
=>spolupráce od r. 1987 => monolitické disky pro dělení proteinů
Ale: při snaze o publikování velké problémy, nakonec publikace přijata až v roce 1990
(podobné zkušenosti i prof. Hjertén)
T.B.Tennikova, F.Svec, B.G.Belenkii, J. Liquid Chromatogr., 13 (1990) 273.
•hned velký ohlas, více než 300 žádostí o reprint
•potenciál monolitických disků byl paradoxně dříve rozpoznán průmyslovou sférou,
•dnes výroba firmou BIA (Lublaň, Slovinsko), CIM® Disks
Monolitické trubice s radiálním tokem
•snadná disipace tepla při přípravě
•možná syntéza velkých monolitů s vysokou separační kapacitou
A.Podgornik, M.Barut, A.Štancar, D.Josic, T.Koloini, Anal. Chem., 72 (2000) 5693.
A.Podgornik,, M.Barut, A.Štancar, Anal.Chem. 72 (2000) 5693.
3. Anorganické monolitické materiály
•první silikagelový monolit byl připraven prof. Nakanashi a Soga, Kyoto University,1991
K.Nakanashi, N. Soga, J. Am. Ceram. Soc., 74 (1991) 2518.
•prof. Tanaka, Kyoto Institute of Chemistry
•povrchová modifikace C18
•zatěsnění monolitu do teflonové trubice
•radiální komprese
•separace polypeptidů
•velmi úspěšná komercializace, Chromolith®, Merck (Německo)
N.Tanaka, N.Ishizuka, K.Hosoya, K.Kimata, H.Minakuchi, K.Nakanashi, N.Soga,
Kuromatogurafi, 14 (1993) 50.
H.Minakuchi, K.Nakanashi, N.Soga, N.Ishizuka, N.Tanaka, Anal. Chem., 68 (1996) 3498.
- příprava:
tetramethoxisilan/tetraethoxysilan, hydrolytická polymerizace ve vodném
roztoku kyseliny octové v přítomnosti PEG
- výhody: jen mesopóry a makropóry nastavitelných rozměrů
- nevýhody: objemová kontrakce, omezené rozměry, obtížné zatěsnění
do pláště
UPLC/UHPLC
M. Gilar