Biologické dny Brno 2014

VOLNÁ CIRKULUJÍCÍ DNA (cfDNA) PŘI MONITORINGU LÉČBY ONKOLOGICKÝCH
PACIENTŮ – KAZUISTIKA
Spiros Tavandzis (a), Arpád Bóday (a), Veronika Krhutová (a), Barbora Roszková (a), Pavla Vaníčková (a), Veronika Hodslavská (a), Kateřina Horká (a), Barbara
Donociková (c), Adam Wendrinski (c), Martin Baník (b), Daniela Galiová (b), Ivo Kasperčík (b), Petra Mariančíková (b)
a – Laboratoř lékařské genetiky – úsek molekulární biologie
b - Laboratoř patologie
c – Komplexní onkologické centrum Nový Jičín a.s., Oddělení radioterapie a onkologie
ÚVOD
V séru onkologických pacientů se kromě volně cirkulujících DNA (cfDNA – cell free DNA) se standardními sekvencemi, které jsou uvolňovány z buněk podléhajících apoptóze či nekróze, mohou vyskytovat
také fragmenty DNA nesoucí stejnou somatickou mutaci jako buňky primárního nádoru. V tomto sdělení demonstrujeme na třech klinických případech možnost využití analýzy somatických mutací v cfDNA
ke sledování progrese onemocnění.
MATERIÁL A METODY
Pro toto sdělení byly vybráni tři onkologicky léčení pacienti, jedna pacientka s karcinomem prsu a dva pacienti s kolorektálním karcinomem (CRC). Pacienti byly řádně seznámeni s účelem vyšetření a do
analýzy zařazeni po podepsání informovaného souhlasu.
U pacientky se sporadickou formou nádoru prsu jsme měli k dispozici 2 vzorky bioptického materiálu z primárního nádoru a čtyři vzorky tkáně po ablaci (kterou předcházela neoadjuvantní chemoterapie) a
séra získaná před a po operací.
U dvou pacientů s CRC jsme měli k dispozici primární nádorovou tkáň, séra odebírána pravidelně po operaci a u jednoho pacienta také metastatickou tkáň.
Izolace DNA byla provedena podle standardních laboratorních postupů pro jednotlivé typy biologického materiálu (tkáň - QuickGene DNA tissue kit S - Kurabo; sérum FitAmp Plasma/Serum DNA Isolation Kit
- Epigentek). V následujícím kroku byly vyhledávány mutace v genech KRAS, PIK3CA, BRAF. Na základě pozitivního záchytu v primární nádorové tkáni byly potom cíleně analyzovány vzorky cirkulující volné
DNA získané ze sér pacientů.
Detekce somatických mutací v genech KRAS (kodony 12, 13, 61), PIK3CA (p.E542K,p.E545K, p.E545G, p.H1047R, p.H1047L) nebo BRAF (p.V600E) v nádorové tkáni a séru pacientů byla provedena metodami
real-time PCR nebo reverzní hybridizací na stripech (TibMolBiol, Viennalab, ROCHE).
VÝSLEDKY
U všech tří pacientů jsme v DNA izolované z tkáně primárního nádoru zjistili přítomnost aktivačních mutací genu KRAS.
Stejné mutace pak byly u dvou pacientů s CRC detekovány také v cfDNA. Zachycené mutace včetně použitých režimů
léčby a klinického stavu jsou zobrazeny na obr.č.2a-2c. Přítomnost mutací v ostatních sledovaných genech (PIK3CA,
BRAF) nebyla zjištěna a proto nemohly být využity pro analýzu cfDNA.
U pacienta č.1 s CRC, který nereagoval na léčbu preparátem Xeloda, byla mutovaná cfDNA zjištěna již 9 měsíců před
odhalením metastázy v játrech (20 měsíců po odstranění nádoru). Tento záchyt může mít přímou souvislost se vznikem
metastázy, protože přibližně 70% buněk v ložisku neslo stejný genotyp jako mutovaná cfDNA (obr.č.1. a č.2a)
U pacienta č.2 s CRC léčeného neoadjuvantní radio-chemoterapií byla rok po operaci zjištěna metastatická ložiska v
játrech (nebylo dostupné sérum pro analýzu cfDNA). V době, kdy byla ložiska stacionární (cca 11 měsíců po zjištění
recidivy) již byla v cfDNA detekována mutace genu KRAS. Následné vymizení a znovuobjevení se mutace genu KRAS v
cirkulaci pacienta souvisí pravděpodobně se vznikem rezistence na léčbu irinotecanem a/nebo na opakovanou léčbu v
režimu Xelod + Avastin (obr.č.2b).
U pacientky č.3 s karcinomem prsu byla prokázaná mutace genu KRAS v jednom ze dvou vzorků bioptického materiálu z
primárního nádoru. Tento výsledek potvrzuje vysokou genetickou heterogenitu nádorových buněk – somatický
mozaicizmus. Následně, tato mutace nebyla zachycena ani v jednom vzorku z ablace a ani v cfDNA získané pravidelně
během pozorování (obr.č.2c). Nepřítomnost mutované cfDNA může souviset s dobrou odezvou pacientky na léčbu.
Operace
Xeloda
2011 Leden
cfDNA - sérum (real-time PCR)
- negativní
- negativní
- POZITIVNÍ
Metastáza – tkáň, játra
- POZITIVNÍ
- 2013 duben
S1
S2
S3
Irinotecan
M1
Stacionární ložiska játra
Stacionární ložiska játra
K-ras GGT>GTT (p.Gly12Val)
(>70% buněk pozitivních)
Recidiva + metastáze – játra
- 2011 září
cfDNA - sérum (real-time PCR)
- 2012 únor
- negativní
- 2012 květen - negativní
- 2012 srpen
- 2012 říjen
M1
MK
S3
SK
S1
S2
Obrázek č.1: A. Výsledek analýzy somatických mutací metodou real-time PCR u pacienta č.1 (primární nádor, cfDNA,
jaterní metastaza) – LC2 (TibMolBiol). S1- S3 odpovídají výsledkům analýzy cfDNA ze séra: S1 a S2 – negativní výsledek,
S3 – záchyt mutace KRAS; M – metastáza s pozitivním záchytem KRAS; MK a SK – interní kontroly amplifikace. B.
Výsledky analýzy mutací v primárních nádorech jednotlivých pacientů metodou reverzní hybridizace na stripech –Bee20
(Viennalab). 1. – pac. č.1; 2. – pac. č.2; 3.- pac. č.3
NEOADJUVANCE –
Xeloda + radioterapie
- POZITIVNÍ
- negativní
Primární nádor – biopsie (strip assay/ real-time PCR)
- 2012 říjen
- POZITIVNÍ K-ras c.34G>A (p.Gly12Ser)
- 2012 říjen
- negativní
Xeloda + Avastin
cfDNA – sérum (real-time PCR)
- 2012 říjen
- negativní
Irinotecan + Avastin
Ablace prsu
2013 březen
cfDNA – sérum (real-time PCR)
Xeloda + Avastin
- 2013 březen
- negatitní
- 2013 květen
- negatitní
NEOADJUVANCE –
adriamycin +
cykofosfamid
Herceptin
- 2012 prosinec - POZITIVNÍ
-2013
Obrázek č.2a: Pacient č.1 (63 let) s CRC byl léčen preparátem Xeloda,
na který přestal po určité době reagovat. Byla zvažována anti-EGFR
léčba preparátem Cetuximab, avšak z důvodu pozitivního záchytu
aktivační mutace genu KRAS, nemohla být aplikována. Proto byla
použitá terapie Irinotecanem po stanovení genotypu UGT1A1 .
Přítomnost KRAS mutace v primárním nádoru umožnila pravidelně
sledovat její výskyt v cfDNA. Mutace KRAS byla u pacienta v séru
prvně detekována ve 20. měsíci po operaci. Tento nález poskytl
časnou informaci o možném riziku vzniku metastáze, která byla
následně potvrzena z biopsie jater.
3
B.
2010 září
- 2012 listopad - negativní
Progrese ložisek
2
Pacient č.3
Primární nádor -tkáň (strip assay)
- 2010 červenec - POZITIVNÍ
K-ras c.35G>A (p.Gly12Asp)
Primární nádor – tkáň (strip assay)
- 2011 srpen
- POZITIVNÍ
K-ras c.35G>T (p.Gly12Val)
- 2012 leden
- 2012 květen
- 2012 srpen
A.
Pacient č.2
Pacient č.1
Operace
1
úmrtí
Obrázek č.2b: U pacienta (64 let) se středně diferencovaným adenokarcinomem
kolorekta byla zahájena neoadjuvantní radio-chemoterapie preparátem Xeloda
(Capecitabin) + 45Gy/25 frakcí. Po ukončení léčby a operaci do doby recidivy
následovala léčba kombinací léků Xeloda + Avastin® (Bevacizumab). Rok po
operaci byla zjištěna metastatická ložiska v játrech. V době, kdy byla ložiska
stacionární (cca 11 měsíců po zjištění recidivy) již byla v cfDNA detekována
mutace genu KRAS, režim léčby byl v tomto období změněn na Irinotecan +
Avastin. Po opětovné změně léčby zpět na kombinaci Xeloda + Avastin vymizela
mutovaná cfDNA na cca 4 měsíce z cirkulace, ale poté došlo k jejímu opětovnému
výskytu, což korespondovalo s progresi ložisek v játrech a úmrtím pacienta.
Obrázek č.2c: U pacientky (53 let) s lokoregionálním pokročilým
karcinomem pravého prsu byla provedena core cut biopsie z ložiska,
která odhalila invazivní duktální karcinom s grade III, s těmito
imunohistopatologickými charakteristikami: ER-, PR- HER2/neu+.
Pacientka dobře reagovala na léčbu a během šesti cyklů
neoadjuvantní chemoterapie došlo k regresi nádoru. Po následné
ablaci prsu a exenteraci axily byla zahájena léčba Herceptinem
(Trastuzumab). Paralelně bylo zahájeno vyhledávání aktivačních
mutací ve dvou bioptických vzorcích, kde byla nalezena KRAS mutace
v mozaice (jeden vzorek pozitivní, druhý ne). Následně byla
provedena detekce této mutace v sérech pacientky odebraných
jednou před a dvakrát po operací, v obou případech s negativním
výsledkem. Vyšetření bylo ještě doplněno vzorky tkáně z resekčních
okrajů, které byly rovněž negativní.
DISKUSE A ZÁVĚR
V této práci jsme na uvedených třech případech onkologických pacientů ukázali možnost využití metod molekulární biologie (real-time PCR, reverzní hybridizace) při sledování progrese onemocnění analýzou
cfDNA. Jedná se o velice komplexní přístup, který vyžaduje úzkou a dobře organizovanou spolupráci klinického a laboratorního personálu. Používané metody vykazují vysokou citlivost k zachycení
molekulárních změn jak v nádorové tkáni, tak i ve volně cirkulující DNA. Tato vysoká citlivost je však omezována samotnou biologií nádoru tj. vývojovým stádiem nádoru, přítomnosti / nepřítomností mutace,
frekvenci jejího zastoupení a vysokou genetickou heterogenitou (somatický mozaicismus), ale také technickými a metodickými postupy odběrů a zpracování vzorků (od chirurgického sálu, přes patologii k
laboratoři molekulární biologie). Tyto techniky umožňují nejen detekci mutací ve volně cirkulující DNA, ale také genetických změn v resekčních liniích nádoru. Přestože výše uvedené faktory limitují široké
využití těchto metod, v individuálních případech jsou tyto analýzy použitelné.
Práce byla finančně podporována interní grantovou agenturou společnosti AGEL a.s.