Sovková Věra

STIMULACE BUNĚK NA NANOVLÁKENNÝCH
NOSIČÍCH Z POLY-ε-KAPROLAKTONU
PROSTŘEDNICTVÍM TROMBOCYTÁRNÍCH
DERIVÁTŮ
Sovková
1,2
V. ,
Benešová J.
1,2,
Buzgo M.
1,2,
Královič
3
M. ,Amler
1,2,3
E.
1 - Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i., 2 – Ústav biofyziky, 2. lékařská fakulta UK Praha , 3 - Fakulta biomedicínského inženýrství, ČVUT, Kladno
Úvod a cíl:
Trombocyty jsou ideálním přírodním zdrojem růstových faktorů z důvodu snadné dostupnosti (autologní, i alogenní), nízkému riziku možné imunitní odpovědi příjemce, relativně
nízké ceny a širokým zastoupením jednotlivých typů růstových a mitogenních faktorů. Jejich velkou nevýhodou je krátká doba skladovatelnosti. Metoda lyzace a následná lyofilizace
trombocytů umožňuje dlouhodobou prezervaci růstových faktorů. Trombocytární deriváty mohou být v kombinaci s vhodnými nanovlákennými nosiči využity jako kryty na hojení
kožních defektů.
Cílem této studie bylo vytvoření trombocytárních lyzátů a lyofilizátů, vyhodnocení zastoupení některých růstoých faktorů a jejich následné testování s nanovlákennými nosiči
z poly-ε-kaprolaktonu(PCL) in vitro na primárních prasečích mezenchymálních kmenových buňkách (pMSC) a XB2 myších keratinocytech.
Materiál a metody:
Trombocytární lyzáty (HPL) byly vytvořeny z trombocytů směsných deleukotizovaných v náhradním roztoku (TBSD) metodou opakovaného mrazení a rozmrazování. Následně byla část
vytvořeného lyzátu lyofilizována (TL). XB2 keratinocyty (7800buněk/cm2) a pMSC (62500buněk/cm2) byly nasazeny na PCL nanovlákenný nosič vytvořený metodou elektrospinningu. Bylo
porovnáváno 5 typů médií. První typ obsahoval 10% fetální bovinní sérum (FBS), další typy se lišily zastoupením lyzátu nebo lyofilizátu v médiu a jejich koncentracemi (viz tab.1). Buňky
byly hodnoceny 1,3,9 a 14 den po nasazení.
Koncentrace růstových faktorů: Koncentrace zvolených proteinů byla stanovena prostřednictvím imunoenzymatické analýzy (ELISA) (absorbance při 450nm).
Viabilita: Viabilita buněk byla stanovena pomocí MTS testu. Doba inkubace s činidlem byla 2 hodiny. Byla měřena absorbance média při 490 nm. Byla provedena korekce hodnot na
vlnovou délku (690 nm) a médium.
Proliferace: Pro určení míry proliferace buněk byla zvolena metoda PicoGreen (fluorescenční barvivo dsDNA). Byla měřena fluorescence (λex= 485 nm, λem= 528 nm).
Tab.1: Složení jednotlivých médií
Typ média
pMSC
XB2 Keratinocyty
1
2
10%FBS+MEM+ATB 5%HPL+MEM+A
TB
10%FBS+DMEM+ATB 5%HPL+DMEM
+ATB
3
10%HPL+MEM+ATB
4
5%TL+MEM+ATB
5
10%TL+MEM+ATB
10%HPL+DMEM+ATB
5%TL+DMEM+ATB
10%TL+DMEM+ATB
Výsledky
Statistické vyhodnocení:
Před samotným statistickým hodnocením byl proveden Shapirův- Wilkův test normality pro zjištění rozložení dat. Protože data neměla normální rozdělení, vše bylo hodnoceno pomocí
neparametrických testů. Data zahrnující dvě skupiny byla porovnávána pomocí Mann Whitneyho testu, data zahrnující tři nebo více skupin byla porovnávána pomocí Kruskal-Wallisova a
Dunnova vícenásobného porovnávacího testu. Statistická významnost byla přijata na 5% hladině.
Graf 3: Viabilita keratinocytů
Graf 1: Viabilita MSC
MTS test keratinocyty
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Absorbance (490nm)
1.den
3.den
9.den
14.den
5%Lyzát
10%Lyzát
5%Lyofilizát 10%Lyofilizát
Typ suplementu
10%FBS
1d/10%FBS vs 1d/5%lyzát
1d/10%FBS vs 1d/10%lyzát
3d/10%FBS vs 3d/10%lyzát
9d/10%FBS vs 9d/5%lyzát
9d/10%FBS vs 9d/10%lyzát
*
*
***
**
**
14d/5%lyzát vs 14d/10%lyofilizát
**
PicoGreen test keratinocyty
60
40
20
0
10%Lyzát
5%Lyofilizát
Typ suplementu
1d/10%FBS vs 1d/10%lyofilizát
1d/5%lyofilizát vs 1d/10%lyofilizát
3d/10%FBS vs 3d/10%lyzát
9d/10%FBS vs 9d/5%lyzát
9/10%FBS vs 9d/10%lyzát
14d/10%FBS vs 14d/5%lyzát
14d/5%lyzát vs 14d/10%lyzát
Graf 5-11: Koncentrace
růstových faktorů
10000,2
0,2
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
BMP-4
Koncentrace proteinu
(pg/ml)
Koncentrace proteinu
(pg/ml)
20000,2
10%Lyofilizát
40
30
20
10
0
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
**
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
1.den
3.den
9.den
14.den
50
0
10%FBS
5%Lyzát
2,5
2
1,5
1
0,5
0
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
10%Lyzát
5%Lyofilizát 10%Lyofilizát
Typ suplementu
SDF-1
Keratinocyte growth factor
500
400
300
200
100
0
100
*
*
*
**
*
*
**
Koncentrace proteinu
(ng/ml)
5%Lyzát
1.den
3.den
9.den
14.den
150
Basic fibroblast growth factor
0,8
0,6
0,4
0,2
0
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
1d/10%FBS vs 1d/5%lyzát
*
1d/5%lyzát vs 1d/10%lyofilizát
***
3d/10%FBS vs 3d/5%lyzát
3d/10%FBS vs 3d/10%lyzát
9d/10%lyzát vs 9d/5%lyofilizát
9d/10%lyzát vs 9d/10%lyofilizát
9d/5%lyzát vs 9d/5%lyofilizát
14d/10%lyzát vs 14d/5%lyofilizát
14d/10%lyzát vs 14d/10%lyofilizát
14d/5%lyzát vs 14d/5%lyofilizát
***
**
**
*
*
***
*
*
Hepatocyte growth factor
500
400
300
200
100
0
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
Epidermal growth factor
Koncentrace proteinu
(pg/ml)
Množství DNA (ng/nosič)
80
Koncentrace proteinu
(pg/ml)
Množství DNA (ng/nosič)
100
30000,2
**
**
**
**
**
***
*
Graf 4: Proliferace keratinocytů
PicoGreen test MSC
Platelet-derived growth
factor
10%Lyzát 5%Lyofilizát 10%Lyofilizát
Typ suplementu
1.den
3.den
9.den
14.den
3d/10%FBS vs 3d/10%lyofilizát
3d/5%lyzát vs 3d/10%lyofilizát
9d/10%FBS vs 9d/10%lyzát
9d/10%lyzát vs 9d/5%lyofilizát
14d/10%FBS vs 14d/5%lyofilizát
14d/10%lyzát vs 14d/5%lyofilizát
14d/10%lyzát vs 14d/10%lyofilizát
Graf 2: Proliferace MSC
10%FBS
5%Lyzát
KOncentrace proteinu
(pg/ml)
10%FBS
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Koncentrace proteinu
(ng/ml)
Absorbance (490nm)
MTS test MSC
1050
850
650
450
250
50
lyzát
lyofilizát
Typ trombocytárního derivátu
Výsledky a závěr:
Buňky které byly kultivovány na nosičích s médiem suplementovaném trombocytárními lyzáty vykazovaly rychlejší proliferaci a lepší viabilitu než buňky s médiem suplementovaném FBS a to u
obou buněčných typů. U jednotlivých typů buněk byla ideální koncentrace trombocytárního lyzátu různá. Lyzáty po lyofilizaci vykazovaly nižší účinnost na stimulaci buněk in vitro, ačkoliv se jejich
koncentrace téměř nezměnila.
Trombocyty a jejich deriváty mají velký potenciál na poli regenerativní medicíny. Společně s vhodným nosičem by mohly být využity např. pro hojení chronických i akutních kožních defektů. Pro
tyto potřeby je nutné hledání vztahu mezi množstvím aplikovaných trombocytů, typu použité metody prezervace trombocytů a výsledkem regeneračního procesu. Tato práce přináší nové
výsledky, které pomáhají objasnit efekt lyofilizace trombocytů a vliv rozličné koncentrace trombocytárních derivátů na stimulaci buněk.
Podpora projektu: Práce vznikla za podpory grantů Grantové agentury Univerzity Karlovy č. 1246314, 424213 a 1262414