Multiplex detection of potato viruses with magnetic beads

Workshop
„Luminex´s xMAP multiplexing technology for detection
of biological markers“
ČeskéBudějovice, 2.2.2012
Multiplex detection of potato viruses with
magnetic beads
P. Dědič, Potato Research Institute Havlickuv Brod
Výchozí informace
-Publikace 2008
J. H. W. Bergervoet et al.
– Katalog
Primediagnostics 2009
(nabídka komerčního
využití)
Osobní diskuse:
-René van der Vlugt
- Willem Stol
Pozvání pracovníků
PRI Wageningen a seminář březen 2010
v ÚEB AVČR Praha
J. H. W. Bergervoet et al
Kongres Vídeň 2010
2011
Kompletní přístrojové vybavení - zapůjčeno na dobu jednoho
měsíce (únor 2011), fy BIOMEDICA CS.
Pilotní projekt – pracovníci PRI Wageningen J. H. W. Bergervoet a
Willem Stol ve VÚB Havlíčkův Brod
Společné experimenty 14.2. – 19.2. 2011 ve VÚB – a dále samostatně
Originál
Primediagnostics
Beads
(043,044,046,053,054,056)
Y L
A X M S
2nd biotinylated antibodies
Positive controls
Streptavidin – R- Phycoerythrin
Buffers
SEB (PBS, ovalbumin, PVP, Tween)
Microsphere working solution
(PBS, milk powder, Tween)
Wash Buffer
(PBS, milk powder, Tween)
know how a akomodace (optimalizace) postupu.
Magnetická podložka
- Optimální ředění jednotlivých komponentů
- Možnost záměny pufrů
- Inkubace – třepačka Biosan (RPM, čas, teplota)
- Vymývání (počet opakování)
Izoláty jednotlivých virů (rostlinky in vitro, skleníkové rostliny)
Reactivity of diffrent potato virus isolates in multiplex Luminex xMAP
PVY
Treshold :
PLRV
162
PVA
140
298
M
F
I
PVX
PVM
PVS
M
F
I
Treshold:
320
488
230
Reactivity of different PVX isolates in Luminex xMAP and DAS ELISA
PVX isolates Luminex (T 320)
MFI
16320
14320
12320
10320
8320
6320
4320
2320
320
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13
14 15
16
17 18
19
20 21
22
23
24 25
26
27
1800
DAS ELISA (T 200) 30 min.
A405
1600
x 1.000
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Reactivity of different PVY isolates in Luminex xMAP and DAS ELISA
MFI
Luminex (T 260)
Serotype:
N O N O O
A405 3000
x 1.000
O N O O O C O N O
N N N H O N
DAS ELISA (T 200) 30 min
2500
2000
1500
1000
500
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
3500
Luminex PVY II. (T 214)
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85
3000
ELISA PVY II. (T 200) 30 min.
2500
2000
1500
1000
500
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85
Reactivity of different PLRV isolates in Luminex xMAP and DAS ELISA
MFI
3400
Luminex (T 400)
2900
2400
1900
1400
900
400
1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
1200
A405
x 1.000
DAS ELISA (T 200) 60 min
1000
800
600
400
200
0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Reactivity of different PVA isolates in Luminex xMAP and DAS ELISA
6500
MFI
Luminex (T 500)
5500
4500
3500
2500
1500
500
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
DAS ELISA (T200) 60 min
A405
x 1.000
Reactivity of different PVM isolates in Luminex xMAP and DAS ELISA
25820
Luminex (T 820)
20820
MFI
15820
10820
5820
820
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
2000
1800
DAS ELISA (T 200) 30 min.
1600
A405
x 1.000 1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
P
V
M
Izolát
PVY
PLRV
1
144
2
131
3
152
4
148.5
5
150
6
143.5
7
141.5
8
152
9
133
10
139
11
133
12
136
13
142
14
170
15
126
16
122
17
129
18
140
19
137.5
20
144
21
134
22
138
23
132
24
132
25
139
26
139
27
167.5
28
130
29
212
30
132
31
120
32
131
33
133
34
147
35
138.5
36
136
37
134
38
134
39
124.5
201
202.5
234
200.5
239
197
202
242
187.5
191
199.5
194.5
201.5
373.5
192
180
192
192
203.5
193.5
190
196
182.5
199
212
208
307
183
300
206
183
178
193
208.5
1073
186.5
745.5
197
177
PVA
252
245
266.5
252
267.5
249
239.5
245
237.5
248
249
250
248
280
226
227
238
249
244
251
248
254
221.5
235
237
245
271
240
325.5
236
217
235
231
247
234
243
242.5
243
236
PVX
265.5
250
285.5
282
267.5
279.5
292
281
271.5
263
254
280
278.5
307
247
246
256
281.5
251.5
266
265
276
260
256
266.5
263
276
268
325
261
239
270
246
297
239
283
265
269
267.5
PVM
14811.5
3809
5222
12429.5
20252
5431
9490
22409.5
12953
11527
11930
4661
3277
13631
11368
1906.5
8061
5117
11955
19234
14696
8840
3581
9195.5
12108
22709.5
12752
5761.5
10756
8039.5
24133.5
22831.5
8074.5
16235
15899.5
17389.5
13202
11972
12922
PVS
16444
204.5
180.5
210
998
177
189.5
187.5
4536
5626.5
174.5
163.5
166
210
5616.5
3212.5
7952
178
1930
9939
193.5
5735
1616
15294
267
8881.5
12656.5
7575.5
6538
17417
229
15149
5042.5
7633
13044
231.5
159
169
165
Elisa
PVM
1420
1211
1089
1241
958
1229
1241
1393
1283
1060
1142
672
1266
1082
1068
371
1048
856
1338
883
1212
1042
898
1221
1327
1225
1216
807
865
1785
1210
1281
932
1119
1295
1189
1004
1123
1155
Připravena prezentace na Triennial conf. EAPR Oulu, Finsko, 2011.
a publikace do Vědecké práce VÚB (2011) - v tisku
DĚDIČ,P. :
Nové racionální postupy laboratorní diagnózy virů bramboru –
Multiplex ELISA a Luminex-xMAP.
Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 2011,
19: 00-00
a pokud bude přijat návrh projektu podaného na NAZV,
chceme s technologií Luminex pokračovat zejména na
úseku multiplex diagnózy virů a bakterií u brambor
Děkuji za pozornost