Molekulární diagnostika infekční bronchitidy v České republice a na

Molekulární diagnostika infekční bronchitidy v České republice a na

Molekulární diagnostika
infekční bronchitidy
v České republice
a na Slovensku
Richard J W Currie
Virus infekční bronchitidy
RNA (nukleová kyselina) uvnitř
Proteiny (spike proteiny S1 a S2) na vnější straně
Sérotyp x genotyp
Viry IB jsou klasifikovány podle struktury spike proteinu
S1
Sérotypy IB jsou skupiny virů, které způsobují běžné
protilátkové reakce u ptáků
Protilátky proti spike proteinům reagují zkříženě
Genotypy jsou viry IB, které mají identický nebo velmi
podobný genetický kód spike proteinu
V RÁMCI JEDNOHO SÉROTYPU MOHOU BÝT RŮZNÉ
GENOTYPY
Jak provést molekulární
diagnózu?
….AGGTACCT..
….KLINRHQHF….
1 Sekvenovat nukleovou kys.
2
Jaké jsou změny
v porovnání s vakcínou?
3
Ze sekvence nukleové
kyseliny určit sekvenci
aminokyseliny
4
5
Jaké jsou rozdíly aminokyselin
ve srovnání s vakcínou?
Analyzovat, jak rozdíly
v aminokyselinách
predikují vakcinační strategie
2010-2011
Not Specified
8%
Broiler
48%
Layer
41%
Broiler
Breeder
3%
2010-2011
Italy-02
1%
H120
8%
4/91
30%
Untypeable
21%
M41
1%
Ark
15%
QX
14%
CR88
4%
D274
6%
4/91 je dodnes nejběžnější nález následovaný variantními ARK a QX.
terénní viry D274 existují, ale v Evropě jsou poměrně vzácné
výsledky, které nelze klasifikovat, jsou zjištěny většinou u vzorků s velmi
malým množstvím RNA, u nichž je prezentovaná kvantita pod dolním limitem
detekce sekvenční reakce
Jak odlišit vakcínu od terénního viru?
Určete sekvenci vakcíny a porovnejte sekvence
nukleové kyseliny a aminokyseliny daného
vzorku.
Terénní virus 4/91
Terénní virus 4/91– sekvence
nukleové kyseliny
XXXX SAMPLE SEQUENCE
XXXX SAMPLE SEQUENCE
2010-2011 – 100% NA pozitivní
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
Ark
CR88
D274
H120
100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou
sekvencí z lahvičky s vakcínou
Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je
aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB.
2010-2011 – 100% NA pozitivní
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
Ark
CR88
D274
H120
100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou
sekvencí z lahvičky s vakcínou
Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je
aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB.
Terénní viry 4/91 (modrá šipka) nadále cirkulují
2010-2011 – 100% NA pozitivní
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
Ark
CR88
D274
H120
100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na ARK je heterologních (bodová mutace ARK
979) se sekvencí hlavní vakcíny.
Většina výsledků pochází z chovů vakcinovaných virem ARK.
ARK979 v lahvičce s vakcínou není, ale zdá se, že se jedná o konečný
bod pro kolonizaci ptáků a může přervávat na farmě „crop to crop“
2010-2011 – 100% NA pozitivní
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
Ark
CR88
D274
H120
100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Výsledky pozitivní na QX pochází (s jedinou výjimkou) z farem bez živé vakcíny
QX.
Ve vzorcích analyzovaných během posledních 2 let byl zjištěn jediný pozitivní
PCR výsledek na terénní virus QX získaný z chovu vakcinovaného virem QX
2010-2011 – 100% NA pozitivní
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
Ark
CR88
D274
H120
100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Pozitivních výsledků na D274 je méně než loni, a to kvůli klesající tendenci
pořizovat vzorky z chovů vakcinovaných pouze proti D274.
Počet záchytů terénního viru D274 je extrémně nízký.
Jsou některé genetické změny důležitější
než jiné?
Ano – substituce nukleové kyseliny mohou být „tiché“
(nemající vliv na sekvenci aminokyseliny), anebo vést ke
změnám sekvence aminokyseliny
Jsou některé změny sekvence
aminokyseliny důležitější nebo jiné?
Ano – substituce aminokyselin mohou být „tiché“ (nemající
vliv na terciární strukturu proteinů), anebo významně mění
terciární strukturu proteinů
Záleží na změně tvaru proteinu
S1 …………..
Tichá mutace nukleové kys.
Mutace nukleové
kyseliny vede k
substituci stejné
aminokyseliny
-jiný vzhled, stejný
tvar
Významná změna aminokyseliny = dramatický odlišný tvar
Hydrofilní a hydrofobní
aminokyseliny
Ze sekvencí aminokyselin lze
dedukovat, jak se změnil tvar
proteinu po různých substitucích
aminokyselin.
Hydrofobní aminokyseliny častěji
směřují dovnitř proteinu.
Hydrofilní aminokyseliny směřují
častěji k vodnímu vnějšímu
prostředí.
Substituce dvou aminokyselin
může změnit terciární strukturu a
tudíž i imunologické vlastnosti
terénního viru v porovnání s virem
z vakcíny.
Index hydrofobnosti
Numerická škála, která vyjadřuje tendenci aminokyselin orientovat se vůči
vnitřnímu prostředí (HYDROFOBNÍ) nebo vnějšímu prostředí
(HYDROFILNÍ).
Změny aminokyselin mohou být
Hydrofilní na hydrofobní
Hydrofobní na hydrofilní
Hydrofilní na více nebo méně hydrofilní
Hydrofobní na více nebo méně hydrofobní
Sledováním indexu hydrofobnosti lze vyvodit relativní potenciál pohybu
aminokyseliny
Hydrofobní – Hydrofilní
Hydrofobní –> více hydrofobní
Rozdíly v indexu hydrofobnosti
Z výpočtu absolutního rozdílu mezi hodnotami indexu hydrofobnosti
můžeme určit kvantitativní tendenci, zda substituce aminokyseliny povede k
jejímu posunu.
Čím větší absolutní rozdíl, tím větší posun.
Větší posun může vést k významnější strukturální změně proteinu S1.
Větší změna může vést k tomu, že se terénní virus etabluje v prostředí a
unikne prostředkům imunitní ochrany hostitele.
Tato data lze vizualizovat tak, že vypočítáme absolutní rozdíl indexu
hydrofobnosti mezi jednotlivými změnami aminokyselin, seskupíme
pozorování do kategorií a do grafu zaneseme procento celkových změn
aminokyselin, které se vyskytují v jednotlivých kategoriích.
Rozdíl indexu hydrofobnosti v
případě viru 4/91
Hydrophobicity Difference - 13 March 2012
%
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Závěr
Tyto údaje odpovídají
velkému počtu virů s relativně nízkými rozdíly hydrofobnosti vzhledem k
viru 4/91 z vakcíny.
Výsledná podobnost terciárních struktur S1 naznačuje, že ochranu
poskytuje samotná vakcinace 4/91.
Existuje také velký počet terénních virů, jejichž stupeň hydrofobnosti se
v porovnání s vakcínou významně liší.
Tyto viry by mohly být kandidáty rozšíření vakcinační ochrany, a to v
souladu s vakcinačními strategiemi ‘Protectotype’ – v tomto případě
se jedná o přidání Ma5 do vakcinačního programu 4/91.
Rozdíl v indexu hydrofobnosti
v případě izolátů typu QX
Hydrophobicity Difference - 13 March 2012
%
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Rozdíl v hydrofobnosti
4/91 - 13 March 2012
%
QX - 13 March 2012
%
40
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Závěr
Tyto údaje jsou v souladu s následujícími fakty:
Většina terénních virů je jen vzdáleně příbuzná s vakcinačním
kmenem QX.
Většinová populace terénních virů vykazuje hodnoty relativní
hydrofobnosti , které naznačují mimořádný potenciál změny
terciární struktury S1 vzhledem k vakcinačnímu kmeni .
Stupeň variability je obtížné sladit s vakcinační strategií, pokud
se používají monovalentní živé vakcíny bez adjuvans
Zatímco se předpokládá, že před blíže spřízněnými terénními kmeny
ochrání jedna živá vakcína, početná populace vzdáleněji příbuzných
kmenů je kandidátem na vakcinační program typu ‘Protectotype’
Česká republika a Slovensko 2012
Skladba vzorků
Analýza výsledků
Czech Republic - Type 09/08/2012
Czech Republic - Results 09/08/2012
48%
50%
36%
64%
2%
Postive
Broiler
Broiler GP
Layer
Negative
Genotypy detekované v České republice
a na Slovensku k srpnu 2012
Genotype of Results - Czech Republic
- 09/08/2012
QX
10%
Ma5
6%
SU
10%
4/91
39%
H120
19%
D274
10%
4/91
CR88
D274
H120
CR88
6%
Ma5
QX
SU
Mezi nejčastěji detekované genotypy IBV v České republice patří 4/91, a
dále H120, D274 a typ QX.
Česká republika a Slovensko 2012 –
100% Homologie nukleové kyseliny
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
4/91
CR88
D274
H120
100%
Ma5
QX
SU
< 100%
Všechny záchyty 4/91 byly terénní viry 4/91, které se vyskytovaly pouze na
farmách vakcinovaných virem 4/91 v období nejméně 30 týdnů před odběrem
vzorků
Možnost zavedení vakcinace typu „in-lay spray“
Všechny výsledky typu QX jsou geneticky heterologní (tj. méně než 100%
homologní) vůči sekvenci QX z lahvičky s vakcínou
Terénní viry D274 byly zjištěny jen v malých počtech a byly identické s genotypy
pozorovanými v dalších zemích EU
Proti terénním virům 4/91 v České republice
a na Slovensku je třeba použít obecnou
homologní vakcinaci
Hydrophobicity Difference - 4/91 Results as at 09/08/2012
%
50
40
30
20
10
0
Proti terénním virům typu QX v České
republice je třeba použít obecnou vakcinaci
typu „Protectotype“
Hydrophobicity Difference - QX Results as at 09/08/2012
%
50
40
30
20
10
0
O čem vypovídá rozdíl
v hydrofobnosti
Lze jej využít při předpovědi umístění a složení epitopu
Část peptidového řetězce, na který se zaměřují protilátky
Predikce Hopp-Woodsovy antigenní determinanty
Určuje, zda změny aminokyselin vedou ke změně
epitopů vzhledem k epitopům vakcinačního kmene
BEZE ZMĚNY
HOMOLOGNÍ VAKCINACE PRAVDĚPODOBNĚ FUNGUJE
VÝZNAMNÉ ZMĚNY
MŮŽE BÝT NUTNÉ POUŽÍT VAKCINAČNÍ STRATEGIE TYPU
„PROTECTOTYPE“
Predikce shody epitopů – epitopy
jsou znázorněny červeně
Terénní virus QX – Česká republika – kloakální
výtěry – nosnice ve věku 64 týdnů: D274/H120 (X3)
plus vakcína CR88 – vše v období odchovu
Sekvence aminokyseliny
Pozice
Sekvence z
lahvičky s vakcínou
Index hydrofobnosti
Sample
Sequence
Index hydrofobnosti
Změna hydrofobní/hydrofilní
88
92
96
117
120
121
128
131
140
141
143
158
Leucin
Alanin
Serin
Serin
Serin
Glycin
Methionin
Arginin
Glutamát
Lysin
Fenylalanin
Fenylalanin
3.8
1.8
-0.8
-0.8
-0.8
-0.4
1.9
-4.5
-3.5
-3.9
2.8
2.8
Histidin
Threonin
Glutamin
Threonin
Alanin
Lysin
Glutamin
Asparagin
Glycin
Arginin
Serin
Valin
-3.2
-0.7
-3.5
-0.7
1.8
-3.9
-3.5
-3.5
-0.4
-4.5
-0.8
4.2
Ano
Ano
NE
NE
Ano
NE
Ano
NE
NE
NE
Ano
NE
Terénní aplikace údajů
Trendy rozvoje terénních virů je možné sledovat
průběžným vzorkováním a pořizováním dat
Mezi jednotlivými zeměmi se vyskytují rozdíly co se týká
terénních virů
Geografické dělení
Rozdíly podle různých veterinárních praxí
Tyto údaje je možné použít při výběru vakcinačního
programu a průběžném hodnocení jeho účinnosti
Následující údaje pochází z Velké Británie z let 20112012
Praxe A
Praxe B
Practice D
Praxe C
Praxe D
Praxe A
Practice B
Praxe B
Praxe D
Praxe C
Praxe A
Practice
A
Praxe D
Praxe B
Practice B
Practice D
Praxe C
Shrnutí
Molekulární analýza klinických vzorků na přítomnost IB může
diagnostikovat terénní kmeny ve vztahu k živým vakcinačním kmenům;
prokázat rozdíly v chování dvou hlavních virových genotypů;
identifikovat změny aminokyselin, které souvisí s klinickou chorobou ;
indikovat aplikaci vakcinačních programů typu ‘Protectotype’, pokud se
aminokyselinové charakteristiky terénních virů výrazně liší od
vakcinačních kmenů (což vede ke změně epitopů ve srovnání s
vakcinačními kmeny).