Morfologické změny kvasinek Torulopsis ethanolitolerans při

Morfologické změny kvasinek Torulopsis ethanolitolerans při

KvA s N Ý
P R ÚMY s L
roč. 36/1990_ číslo 7
199
skúmaviek, z ktorých kaŽdá mÓže byt použitelná na 1
Článok je prehladom metód pouŽívaných pri šIachteaŽ 4 transformačné reakcie. Z buniek hostitelského
ní kvasiniek Iselekcia, indukovaná mutagenéza, kríŽekmeňa sa pripravia protoplasty vyššie uvedeným postu.
nie, fúzÍa protoplastov, technika rekombinantnej DNAJ
pom a resuspendujúv 0,2ml roztoku 1,2 mol .dm-3 sor.
a moŽností ich aplikácie pri získavaní nových kmeňov
bitolu v 0,01 mol . dm-3 cacl2. K suspenzii sa pridá
vhodných pre vinárske pouŽitie. Detailne sú charakterio,-J'aŽ 1'pg plazmidovej DNA nesúcej zabudovaný gén, zované predovšetkým selekčné techniky umožňujúce
zmes sa inkubuje 15 min pri laboratórnej teplote' Potom
získat kmene rezÍstentnék medi a etanolu, ale tieŽ po.
sa pridá 1,8ml roztoku PEG 4000 IPEG 400 8' CaCI21',478,
stupy mutačnéhošlachtenia a fúzie protoplastov vedúce
TRIS. H Cl 7, 28, pH 8, 0 v 1d m3 rl o d y J, su sp e n z í as a pr e.
k príprave respiračne deficitných mutantov a smrtiaj
mieša a nechá stát 5 min pri laboratórnej teplote. Proto.
cich vÍnnych kvasiniek.
plasty sú potom oddelené centrifugáciou [5 min pri
1000g1, sediment sa resuspenduje v 0,2m1 roztoku sorMnxalqaxosa, C' . lllryp4ux, 9.: Ce,nexqucBttHHb|xÁpoxbitolu v CaCl2 a k suspenzii sa prÍdá 0,1 ml sorbitolu
xreř' IIJ. ÍIprrrrreHqemHe
cnocodut. Knac. npvna. 36, 1990.
v \vasničnom extrakte Isorbitol 218'6g' glukóza 20 g,
Ns 7, crp. 196-199.
kvašničný extrakt 10g v 1dm3 vody). Po 30 min inkubácii pri 30 "C sa k suspenzii pridá 0,3 ml roztoku sorCrartx llpllBoÁIlT.oóeop no MeToAaM'npI,IMeHfleMbIM
bitolu, 0,15 ml vzniknutej suspenzie sa napipetuie do .
npI-I
ce"ireKllllnÁpoxxeň (cenexqna, HHÁyqÍIpoBaHHr,Iů
skúmaviek s 10 ml rozvareného regeneračného agaru
uyrarene.
3nc, cKpellll'Barrue,$ysnn npoTonJ'IacToB,
o teplote 44"C a po premÍešanÍ
vyleJe na povrch selek.
cnocod pexollón.
garuarroůAHA) l.I tto Bo3MoxHocT'M I'x npl{MeHeHfi'ilpu
tívneho osmoticky stabilizovaného minimálneho agaru,
na ktorom regeneruiú a rastú len transformanty obsa.
noJlyqeulln HoBbIx IuTaMMoB' fioAxoÁílltrux ÁJIr. qeneii su.
hujúce plazmidovú DNA. Po 3 aŽ 5 dňoch sa vyhodnotÍ
HoAeJ'IJlfi.
[Io4poóno xapaKTepr-I3yloTc'npexÁe Bcero cnofrekvencia transformácie a vzniknuté kolónie sa podrocoót,l cenexqul{' no3BoJríIo[lfienoJlyllnTb urravrust, ycroltbia genetickej a biochemickej analýze. Popísaná technÍ. q}lBb|eB oTHoIIIeHI,IH
K MeÁI-Í
n 3TaHo"'Iv.a Taxxe cnoco6st
ka je v našom laboratóriu využívanápre zavedenie génov MyTaIII{oHHoúceJreKquH u Qysul,I nporonnacroo, [p!Ikódujúcich rezistenciu voči mednatým iónom do vhod.
BoÁflultle K IIo"lIyqeHI,l}o
pecnfi.paquoHHo4eQzqnrnslx MyTaHných aplikačne významných kmeňov vínnych kvasiniek.
ToB I{ cMepToHocublxBHHHbIX4poxxeů'
o získaných poznatkoch budeme referoVat v niektorom
z budúcich čÍsielnášho časopisu.
Michalěáková, S. . ŠturdÍk,E.: Improvement of Wine.
.Making Yeasts. ItI. Techniques Used. Kvas. prům., 36,
LiteratúIa
1990,No. 7, pp. 196-199.
[ 1 ] MIc HA LČ Á Ko v Á , s', ŠTURD IK, E.: Kvas. pr ům.34' 1988 , s.2 9 3 .
[ 2 ] MIC HA LČ A Ko VA , s., et al.: Kvas. pr ům., 36, 1990, s. 5 .
E.: K vas.
[ 3 ] MA piK' F. , v o LLEK, v., H RoNčEK, J.' MoRvAYovÁ,
prům., 36, 1989 s. 141.
[ 4 l S PEN o ER ' J. Ť . F.' SP ENCER' D . M.: Ann' RCv. Micr obi ol ., 3 7 '
1983, s. 121,
v': Genetická analýza mikťoor8anizmov
I. Tetrá.
[5] KovÁčovÁ.
dová analýza kvasiniek. Bratislava, skripta PFUK t983.
[6l KovÁČoVÁ, V.: 11989,nepublikované výsledky.
t7 l Ko v Á č' L. , BEDN ÁRoVÁ, H ., GREKSÁK, M': Biochim. B i op h ys.
Acta, 133, 1968, s. 32.
tB } s U Lo , P. : Št ú dium pr enosu mitochondr iálnsho
8enÓ mu , í úz í €
a transíormácie pomocou cytoplazmatickýcb
mutantov s. ce.
rev is Í a e' IKa ndidátska diz er tačná pr áca]. ÚFH z sAv I ván ka
llri Duna ii 1 9 8 7 .
s.: construction
of wine yeasts
[9] sULo, P., MIcHALČÁKovÁ,
with killer pťoperties. In: zbornÍk hterbíotech
88' Bratisla.
va t988, s. 106.
K.
l
P
r
ocess
Es
s
ER
'
KÁ
M
PE
R,
Biochem.,
23'
1988,
s. 3 6 .
[10]
J.:
I] '1 l Mlc HA LČ Á Ko V Á , s., ŠTURD IK. E.' ŠUBIK, J.: tabor a tÓr i u m
o dbo ru I. G enet ika mikr oor ganizmov
gé n ový ch
a základy
m anipu|á c iÍ . Bra t islava. skr iptá svŠT 1989.
R.: Microbial Genetics Apptied
[12} SAUNDERS' v. Á.' sAuNDERs'
to Biotechnolo8y. Í' vyd'
croom Helm 1987.
'.
-london,
[ 1 3 ] VR AN Á ' D. {ed'] : Kvasinky ve výzkumu a pr axi, 1. vyd . Aca.
demia, praha 1996.
.
Lektoroual doc. Ino, E. MaIík. CSc'
Michalčáková, S. . Šturdík, E.: Šlachtenie vínnych kva.
siniek. III. Používané techniky. Kvas. prům., 36, 1990'
č. 7t s. 196_199.
The methods for yeast improvements IselectÍon,
induced mutagenesis' hybridÍzation, protoplast fusion'
technique of recomblnant DNA) and their applicatíons
Íor an obtainÍng of new strains suitable in a wine.
-making are outlined in the article. The selection techniques permitting to obtain strains resistent to copper
and ethanol and the mutation procedures and the protoplast fusions resultlng in a pfeparation of respiratory
deficÍent mutants and the.killers of wine.making yeasts
are discussed in details.
Michalčáková, S. . Šturdík, E.: Ziichtung der Wein.
hefen. III. Angewandte Techniken. Kvas. piům., 36,1990,
Nr. 7, S. 196-199.
Der Artikel brin8t eine Úbersicht der bei der zÍichtu'ng
der Hefen angewandten Methoden Iselektion, induzierte
Mutagenese, Kreuzung, Fuslon der protoplaste, Technik
der DNA.Rekombination]
und befaÍ]t sich mit den
MÓglichkeiten ihrer Applikation bei der Gewinnung
neuer stámme fiir die Weinindustrie. Detailliert werden
vor allem die Selektionstechniken charakterisiert. die
zu Kupfer. und Athanol.resistenten stámmen fiihren; es
v/erden aber auch die Verfahren der Mutationszuchtung
und der Protoplasten-Fusion behandett, die zur
Gewinnung Respirations.defízienter Mutanten und Killer.
-Weinhefen frihren.
Morfologickézměny kvasinek Torulopsis ethanolitolerans
při kontinuálnÍ ku,ltivaci
579.663.72
Ing' JoHANNA RYBÁŘovÁ, CSc., Výzkumný ústav potravinářského průmyslu, Praha, In8. JITKA ŘEŽÁBKoVÁ'
Pražsképivbvary, s. p., Praha
Kiíčová slova: mor|ologické změny, kontinuáIní kul1iDace,Iimit kyslÍku, poměr cléIky a šíř,ky,Torulopsis ethanolitolerans.
ÚvoD
Morfologické změny při růstu mikroorganismů v podmÍnkách kontlnuální kultÍvace byly popsány Již v prv.
ních studiÍch této kultÍvačnÍmetody, a to jak u bakte.
rÍálních' tak u kvasinkových kultur. Prodlužování buněk
Saceharomyces eereuisiae ťostoucÍch na melase pozoto.
val Beran [1J' který $tanovil, Že Boměr dé]ky k šířce
1.'46 oválných buněk na začátku ku]tivace se poměrně
rychle zvýšil na hodnotu 2,1. Podobné změny zjistil při
všech zkoušených růstových rychlostech a při různérn
sloŽenÍ melasového médía.Herber' [2] stanovil v kultu.
Íe Enteťobacter aerogenes, že se vzrůstajÍcÍ růstovou
rychlostÍ [od 0'1 do 0'9 h-]J se buňky zvětšovaly, hlav1
ně v délce' ťostla průměrná hmota buněk a současněse'
značně zvyšova}obsah RNK. PřÍčinouprodlqžovánÍkva-
K V AS NÝ
žoo
Tabutka i, vElnaty
tinuáIních kultiuacÍ
Pokue
č.
I
3*
4
5
6
't
8**
* pokus ě. 3 navmval
** koncentrace kyslíku
d/š
N
Y
p
_
-
PRÚMY S L
roč . 36/1. 990 -
č í slo 7
sledouání mor|ologie kDasinek, obsah N-Iótek u kuasÍnkách a uýtěžnost a prod'uktiDita kon.
Doba kultivace
(h)
43
30 (73)
68
44
47
70
233
14Ď (37B)
r20 (498)
s3 (55r)
o' v mérliu
< %)
0
0
o
0
0
0
4-6
3-5
G-8
t2-t4
0'L0'í
d/š
2,48 + 4,50
2,70 + 3,93
3,93
2,49 ->4,12
2,41+4,22
2'6í +4'35
3,r5
3,32
3,O7 .
2,54
s'3ó
v
(r,m'')
47 ->33
5 l +4 0
40
5 l >3 2
5 3 +3 6
4 & +3 2
62
í4
6l
3l
N
Y
(%)
(c.c*')
5r,3
47,O
44,2
50,9
í2'
52,O
58,r
o,70
0,73
o,73
o,70
o,7í
O,76
o,7B
o,74
0,?3
0,68
o,75
í4,s
56,0
59,4
íB'2
(s.l -r . h - , )
3,8
3,4
3p
3,1
4,O
4,O
3,r
3,0
2,9
2,1
3'B
no přerlchírejici
v záyorce ce|ková dobo kontinuálni
Lultivace
byla měněna v průběhu kultivaceo t závotce celková tloba kultivace
po m ěr dé lky k šíř ce buňky
objem buňky
dus Ík a t é látky v kvasničnó sušině
v ý t ěžno s t sušiny z dodaného ethanolu
pro duk t iv ita
sinek s. cereDisiae V kontinuální kultuře se blíže zabýa stopových prvků podle 'očekávanéprodukce kvasničné
vali Broan a IIough [3]' kteří zjistili záVislost mezi změbiomasy. Jako substrát byl používán syntetický ethanol
nou tvaru buněk a obsahem dusíku V médlu. Při limitaci
s obsahem 91,530/o,obj.abs. ethanolu, pH bylo regulorůstu dusíkem se kvasinky prodluŽovaly a při dodání Váno na hodnotu 4,0 amoniako\'/ouvodou' slouŽícízárodusíku se jejich tvar změnii na původníoválný. Uvedené veň jako hlavní zdroj dusíku a teplota kultivace byla
změny byly zaznamenány při dvou odlišných.zředova.
u1ržováirana 37.c. Kultivačnípokusy probíhaly při zře.
cích rychloste c h [0, 05 a o 22 h - l )'
dovacÍ rychlosti 0 22 h-1 většinlu v limitu kyslíku, pouze
Zmenšování objemu buněk Torulopsis utilis popsali
dva pckusy V limitu substrátu. Podrobný popis zařízení,
Button a GarDer [4]' kteří uvedli, že při sníŽenírůstové Složení základního média a médií s přídavky různých
rychlosti z o,40 na 0,15 h-1 se zmenš.] objem buněk
biostimulátorů, uspořádání kontÍnuáIních procesů, ana.
z 60 na 41'um3.Podrobnou Studii objemových změn kva.
lytické metody a další náležitosti jsou podrobně popsánrr rl iilró
nrÁ.i
t11l
sinek Candida utilis pub]íkova]iBroun a Rose [5]. KultÍvace byly vedeny za firznÝCh podmínek: V limítu subStrátu IglukosaJ nebo dusíku, při teplotách 30, z5,, 20
Sledování morfologie kvasničných buněk
a 15.c a při růstovérychlosti od 0,35 do 0,05 h-1. Buňky' rostoucí přÍ různých růstových rychlostech při l]mi.
Součástísledování a hodnocení pokusů byla mikroskopická kontrola kvasničnékriltury, prováděné V průběhu
taci dusíkem, zvětšovaly svůj objen při snižováníteplooC,
ty pod 30
v médiu s glukosovou limitací tyto změny
kultÍ.;acíV intervalech 1.2 a 24 hodin' popř. v kratších.
nenasta]y. Z dosažených výsledků byl mimo jiné od.ro' Byl zaznamenáván tvar a uspořádání buněk, měřeny
.buněk
zen přímý vztah mezi zvětšovánÍmobjemu
a stou.
rozměry mín' 50 buněk a stanoveno procentní zastoupe.
paiÍcímobsahem RNi( a proteinu v buňkách'
ní pučícícha mrtvých buněk rnin. v 50 políčkách BůrkeVraná' a Beran [6] studova]imorfo]ogii kvasÍnek S. ce.
roVy komůrky po obarvení preparátu methylenovou
TeDisiae a C' utilis v kontinuá]ní kultivaci při růStových modří. z rozměr'ů buněk byl počítán objem za předpo.
rychlostech 0.05, 0'1' 0'25 a 0'35 h-1. Se zvyšováním kladu, Že buňky 7. ethanolitole|ans jsou podobné' jako
rychlosti růstu Se V kultuře s. cereÚŽsicezvětšoval objem
kvasink1' C, utilis, rotu]ícím e]ípsoidům [8]. Přehled
dceřiných buněk' ale velikost rnateřských buněk se ne.
hodnot Stanovených měřenÍm rozměrů buněk spolu
změ'nila. Při kultivaci kvasinek C. utilÍs se zvyšoval se
s h]avními výsledky ku]tivačníchp.okusůje uveden v Íastoupající růstoVou rychlostí objem jak dceřiných, tak
bul c e 1 .
mateřských buněk. Autoři prokázali, že čímvíce se blíží
růstová rychlost maximálnÍ růstovérychlosti' tím 'Ýíce
VÝSLEDKY A DISKUSE
jsou dceřiné buňky fyzio1o8icky VyspělejšÍ.
HiIl a Robinson [7] stanovili, že při kontinuální kulVliv podmínek kontiuuální kultivace na morfologii kva.
tivaci kvasinek s' ceře,isiae dochází k drastickým mor.
sinek
fologickým změnám. Největší zméÍIy,resp. pfodluŽování
buněk' charakterizované hodnotami poměru délky a šÍř.
Kultivace č. l až 7 byly krátkodobé kontinuální poku.
ky 4'74 aŽ 5,32 a snÍŽeníobjemu kvasinek na 37,g až sy v syntetickém médiu ['č.1J a v médiÍchs přídavky
30,3plm3,byly zjíštěnypředevšímpři středních růstových různých biostimulátorů (č. 2 aŽ 6), prováděné v limitu
rych]ostech [0'1- 0'3h - 1). P ř i n i ž š ía V y š š Í r ů s t o v é r y c h. kyslíku. Kultivace Č.7 by|a vedena v syntetickém médiu
lostÍ byl poměr délky k šířce menší než 2,0 a obíem v limitu substťátu,stejně jako dlouhodobý pokus č. 8, ve
brrněk větší než 50 ,.jm3.K těmto změnám, souvisejícím} kterém1'bylaměněna koncentrace rozpuštěnéhokyslíku'
S růstovorr.ťychlostí,
nedocházélo při batch kultivaci, coŽ' Pro všechny kultivacé'je společnýmznakem změna tvaru
dokumentovaly výsledky zÍskané v l-.atch pokusech při
a rozměrů,"kvasničnÝchbuněk' Původně oválné. mírně
protáhlé buňký še tlcnerrr.kulti.vace píodluŽovaiy a v porůstovérychlosti 0'31, resp. 0'1 h-1' přÍ nichž hodnota
délkošířkovéh'opoměru byla 1,15, resp. 1,08 a objem
kusech č. 1. až 6 se současněvýrazně ztenčovalv.DéIlro.
buněk 62, resp. 55 pm3.
šířlrový poměr se téměř plynuÍe s dobou kultiíace zvyšoval z 2,4t aŽ 2'70 na 3'9 až 4.5 a současně se měnil
obje.m buněk, který z hodnot 47 až 53 pm3, zjištěných
EXPERIMENTÁINÍ čÁsT
na začátku pokusů č. 1 aŽ 6, postupně kiesal na 32 až
Kontinuální kultivace kvasinek Torulopsis ethanolito.
40 pm3; plynulé změny rozměrů buněk jsou v tabulce
lerans
naznačeny šipkou. Výjirnkou z uvedeného isou hodnoty
délkošÍřkového
Doměru a objemu buněk, stanovenév ňej.
v řadě kontinuálních ku]tivací kulturý Torulopsis lrratšírnpokusu č. 3. Tato kultivace však nezačalav nu]té
ethanolitolerans v médiu s.etbanolovým substráte-Ír'r
byl
,lňdině' ale naváza]ái na přé"Qpházejlcí
[č. 2] ve 43. ho.
studován vliv..lůzných podmÍnek'na'hodnotý'ekÓhómic'dihě' kdy .by]a proy'édénazměna sloŽení média.
kých parametrů a. na jakost finátn'íhii prodúkťu''krďqých
'. Při hqltiYaci' č,17..v'které.k'yasinky rostly na rozdÍl od
kvasnic. Kúltivhce býly' vedeny''ve sklelrě.nérň
3l ]feŤmen- i)fBdph.ážreiícíchpoE(lsú v . }imítu ''s.qbŠtrátu.
' se buňky
.pftJdlouži!y;
.avšak
'toru s 2, 3 l mé d i a. z á k l ad n í s y n te ti c k é . i ri é d i umby l o bři .
změny V,.s-lřce.'bylynrnohem
ír.vněŽ
-mírnější.ir
ptavováno.'ředěním zásotiních toztoků minérálnÍchživin
v objemu byly'menší. DalšÍroz.
také.-uin'ěny
pnÚM Y Si ,
Kv AS u Ý
roč. 36/1990_ číslo 7
201
díllod pokusů vedených v limitu'xyitixu b}'I ,ř tom, Že
pozorované morfolo8ické zrněny neprobÍhaly v.závislosti
'na době kultivace, ale :měnily se nepravidelně; v tabulpoku.
ce jsou::Proto, uvedeny průměrné hodnoty 'sy č. 7, a 8.
Při dlouhodobé kontinuálnÍ ,]tultivacÍ,č. 8 [551 hodin]
v syntetigkém médiu .se substrátovou limitací byla v urči.tých.'časgvých odstupec.h;zvyšována,.koncentr.acerozpušlÍěnébokyslÍku od 3 až 5% do 72 až 14 % a,v.'pcsled.
nÍch,.53hodinách byl .obsatrkyslíku prudce:snížen' téměř
k iimitu, na 0,3 aŽ 0,5 0/ooz. Poměr oélky k šířce a objem
buněk se měnil podobně jako v pokusu č.7, tzn., že hod.
noty kolÍsaly v uŽším tozmez7 bez závislosti na době
ktrltivace. Přitom průměrnéhodnoty z jednotlivých čacharakterizovaných různou konsových úseků.-kultÍv.ace,
centrací rczpuštěného'kyslí.ku' vykázaly závisiost'na
této k.f,ncentraci. ,Se stoupajícím obsahem kyslíku klesal
délkošířkovýpoměr, kvasinky byly méně protáhlé a zvět.
šoval se jejich objem' V poslednÍ fázi' kdy byla kultura
převedena téměř do limitu kyslíku, nastala rychlá změna tvaru buněk, které se opět prodloužily a ztenčily
I
a objem klesl na 31 pm3.
Se změnou tvaru buněk byl v pokusech v limÍtu kys.
Iíku (č. 7 aŽ 6| pozorován zhruba od'k'bnce'prvnÍhodne
kultivace větší výskyt buněk, které zůstávaly po vypučenÍneoddělené.Buňky vytvářely dvojice stejně velkých
jedinců, které nenestý' záaic žnámky dalšího púčeni.
Pcdobný jev popsaly ve svých pracích . PozmogoDa a
Mecuěděua Í9) a PozmogoDa et a{. [10] ' při- kultivaci
kvasinek C. utilis 'při teplotách 40 a 4|,4 "C. ŘetizkujÍcí
'kvasink7 ani myceliáIní:tvary buněk nebyly po"3rovány
'ani nedccházelo ke shlukování k.vaqínek.M'nožstvípučí.
cích buněk se v krátkodobých pokusech pohybovalo
,mP7I 40 až 5:30/o
,a počet Živých kvasinek' byl většinou
vvššÍnež 90 0/o.
Při dlouhcdobé kontinuální kultivaci č' 8, vedeirév li.
,'niitu
rbsp. Ži.
substrátu, byl piůměrný počet pučícÍch,.
vých bunÚk 51'3,'resp. 96,6 0/o.Myceliální útvary ani'shlu. kování kvasničných buněk nebylc pozorováno' ale Vedle
pretáhlých buněk produkčních kvasinek 7. ethanolitoIerans se vyskytovaly buňky odlišného tvaru a velikosti,
kuláté,-drobnějšía občas řetízkujÍcíoválné, menší buň.
ky. Tyto odltšné buňky se ndc'házely především v horní
zpěněné vrstvě kultÍvačního.
ňé0ia a zavedéním vrchnitro odtahu bylo - jejich mň'c.žstvÍzň,áčne zredukováno.
Izolace a pozdější idéntifikace ukázala, Že tyto kvasinky
patřily ke kontaminaci a jejích rozvoJ byl pravděpodobně
umoŽněn přítomriostÍ rozpuštěného kyslíku v' médiu.
Porovnání morfologických zňěh
s výsledky kontinuálníeh ltultivacÍ
kvasničných
buněk
.gické změny kvasinek T. ethanolitole|ans, pozorované
v kontinuálních kulturách a projevující se prodluŽová.
ním a ztenčovánÍm buněk a snÍžcvánÍmobjemu' jsou
způsobeny podmínkarni růstu v Jimitu kyslíku. Ekonomické parametry kultivace, v]ijádřené výtěŽnostÍE produktivÍtou, ne jsou morf ologickými změnami ovlivňovány. Jinak je tomu u obsahu dusíkatých látek v kvasničné biomase, jejichŽ tvorba je zjevně závislá na koncentraci kyslíku v médiu a tím je i:;vlkorelaci, s morfo]o8ic'kýni zněnami kvasničnýchbuněk.
Literatura
[1 ] B ERAN , K .: Con ti n u ou s l l ow cu l ti vati on oI b ake r s ye as t o n
rjeat molasses wort. In Málek t.; Continuous cultivation
of
mi cr oor 8 an i sms. A symp osi ' u m. ČsAv, P r ah a 1 9 l 8 '
some
[2 ] HERB E RT , D .: Con ti n u u u s cu l tu r c of r yi cr oor tan i sms,
theoretical
aspects. In Málek l.: continuous
cultivation
of
mi cr oor óan i sms. A. symp osi u m, ČsÁV , í 9 6 8 .
[3 ] B ROW N , C. M., HOU G H, J . S.; N atu r e , 2 0 5 ; 1 9 8 5 , s. 6 7 6 .
l 4 l B U T T ON , D . K ., G ARV ER, J .. C.: . l . ce n . Mi cr ob i ol ., 4 i , 196i,
s.1 9 5 .
[5 ] B ROW N , C. M., ROSE , A. H.: J . B acte r ., 9 7 , 1 9 6 9 , s. 2 6 1 .
1 9 7 7 , ' s. 1 61.
Lb ] V RAN Á' D .' B E RAN ; K .: Mi kr ob i ol oti ja,i x LvI ,
[7 ] HI LL, G . A., ROB I N SON , C. W .: B i ote ch n ol . Le tts., 1 0 , 1988,
::
,i i I l ' Csi I soN '
r al
]. t,l .: n x p . ce l l Re s., 1 í ' 1 9 5 8 , S.' i 1 !.
I . N ., ME D V Ě D Ě V A,
G ' A.:
Mi kr ob i ol o t iia ,
l 9 ] P oz MocovA,
XLV I I , 1 9 7 8 , s. 5 3 4 .
[1 0 ] P oz MoG oV A, I . N ., Š U LG ovsK A]A, E . M., MED V Ě D Ě V Á; G. A . ,
AN D REI EV A. E. A.: Mi kr ob i ol osi i a.
XLV !I .1 9 7 8 . s.3 0 6 .
u .,' Š r n ci s, F.: T e c h n o l r r ] Š E sT r x ovÁ' u .. RY B ÁŘovÁ, t.l .n Úr ,
tog i e ' ' ve l kový r ob y kr mn ý ch kvasn i c z e syn te tÍckéh o e t a n o lu
s p r od u kcí j1 0 0 kt/r ok' [z p r áva) vÚK P s, P r áh a, 1 9 8 2
.i
.|
Lektorouala V, Kurzouá, prořn;,biol.
I
Rybířová, l. . Řežábková, J.: Morfoiogické změny kvasinek Torulopsis etharrolitolerans při kontinuální kulti.
vaci. Kvas. prům.,3E' 199c' č. 7, s. !99_202.
Morfologické změny kvasničné kultury Torulopsis
éthanolitolerans,které "byly pozorovány při kontinuálnÍ
ku1tivaci, jsou ovlivňovány přÍtomností rozpuštěného
kyslíku v médiu. Největší změny' projevujÍcí se prodluŽÓváním a ztenčováňÍm buněk a zmenšováním jejich
objemu'-.byly zaznamenány při kultivagích'v podmínkách
]imitaÓe kyslíkem. Při zÝyšování,"koncentrace kyslíku
v médiu nabývaIy kvasinky tvar a rózměÍy' které jsou
.o5vyklé při batch kultivacÍch. Byla stanovena souvislost
'mezÍ mořťolo8ickýmÍ' ziněnami a obsahem dusÍkatých
látek v kvasničné biomase.
fr.: Moptpo,norilqecKre
Pu6aprxona, fr. - Pxexadrona,
npI{
E3MeHeHr|qÁpoxxeů Torulopsis ethanolitolerans
HenpepblBHoMKyJrbrxBnpoBannu.Knac. . npyM., 36, 1990,
JrIo7, crp. 199-202.
V pokusech č. I aŽ 6, které probíhaly v lÍmitu kyslíku
tl.méaiÍch různéhos|ÓŽenÍ,byly dosaŽeny růzňé,hodnoty
ekonomic'l(ýCh paraÍietrů v závislosti na přidan.ýčh.bio.
i_
stimulátorech, přičemŽ morfologie kvasinek se měnila ve
MopQoaoruuecKlle I{3MeHeHI{Í
ÁpoxxeBoň rynstypu Tovšech těchto pokusech stejným způscbem. Buňky sé prorulopsÍs ethanolitolerans, KoTopble HaónrcÁa"rucl npI,IHe.
"IOABepraIoTc' BJ'II-{f
tahovaly a ztenčovaly a jejich objem Se zrnenšovalúměr- npepl'lBHolvl KyJ'IbTuBlÍpoBaHI.rI,Í,
H}In pac.ně
s dobou kultivace a kcnečné hodnoty délkošířkového TBopeHHoIo KucJlopoAa B cpeÁe. .Hauóonlurne I'3MeHeHIq'
poměru'a objemu nejsou v relaci ani š obsahem dusíka. npOffB"'IflOulueCfi B ,
Kd'IeTOK
YAJIUHeHUfi II yToHqeHlrli
tých látek v.kvasničné bioma'se ani s výtěžnostÍnebo
I-IB yMeHb[IeHlru ux oóteMa 6r,I'r,Norueqeirbl npx Ky.!ř'TuBaprodukťivitou
uI]llx B yc"'IoBI-,l'lxJruMI.tTlIpoBaHHÍ KI-rcJlopoÁoM. flpu noJiné souvislosti vyplynuly z,r4ýsledkůpokusu č.,8, ve
cTeneHHoM noBbllueH}Il.l KoHueHTpaI{u}I KI{cJ'IopoÁa B cpeÁe
kterém byly kvasinky ku]tivované při různé koncentraci . Ápoxxn
np'noópera.rru Qoptuty t.I pa3Mep, KaKi{e BcTpe.
rozpuštěného kyslílcu v médíu. |ak morf'clogíe buněk,
qaloTcí npr-t .batbh {yJrbTuBaII.l.Iqx.Bbl"Ta onpedeneHa crres
tak obsah dusíkatých látek, výtěžnbst a Broduktivita se
MeX(Áy MopQoJoruqeCKI{MI,I I.l3MeHeHH'MI.l}1. coÁepxaHileM
měir.ly úměrně s -koncentrací kyslÍku a nezávisle na
a3oTI,ÍcTbIX
Beule.TB a 4poxxenoů dtloltacce.,
dob5 kultivace. se snižirjÍcíse.kcncentracÍ kys!íku se
obje:n
kvasinek
také
dusí.
sniŽoýal
a snižoval se
obsáh
katých látek a naopak hodnoty ekonomických pábametrů Ryb ářová, :} . .
Ř e žáb ková,
Morpholog ical
C hanges of
kuitivace vykázaly vzestup. Zvyšováníobsahri dusíkatých Torulopsis ethanolitolerans J . :During. Continuous
Gulture.
látek v kvasničné biomase se zvyšováním objému buněk
Kvas. prům., 35' 1990' No. 7' pp. t99_202.
stanovil Broa;n a Rose [5]' kteřÍ zjÍstili,.žetoto zvýšenÍ
'bylo způsobenopře-devším
vzrůstem množstvíRNK a jen
T he morp holog ical
change s of the . ye ast . popul ation
malým zvýšením otjsahu proteinu. U kvasinek.T. ethaT orulop sis e thanolifole rans
that wJ re ob se rve d d uring
no:litoleransse-obsah R.NK výrazně neřtěn.l, ale zvyšo.
a continuous
culture
re sult fr. om change s in oxy g en
val se obsah bílkovÍn podle Ba'"nsÍeina [11.l,
conc:ntrations
in the medium.
The highest
changes
we re I obse rve d unde r cond itions of ox yg e n llmitation.
:These changes manifest' theirself Ín the cell elonsation
. and the lowering
of the cell, volume. Eliminating.
the
ox yte n lÍmitation the ye ast ce lls obtain the ir typ lcal
Z našich výsledků vyplývá konstatovánÍ,že morfolo-
zÁvÉR
K vA sŇÝ
2gŽ
pnŮ M Ý s i
roč. 36/1990. -
form and ii"e as ln batch cultures. The plot between
the morphological changes and the content of nÍtrogen
compounds Ín the cell bÍomass was proved.
Rybářová, }. - Řežábková, t.: Morphologische Ánderungen
der Hefen Torulopslc ethanolltolerans
bei kontlnulerlicher xultlvatlon. Kvas. prům. 36, 1990, Nr. 7, s.199202.
Die morphologtschen Ánderungen der HeÍekultur
Torulopsls ethanolitolerans, dle bel der kontinuierllchen
Kultivation
beobachtet wurden. werden durch die
čÍslo 7
Anwesenheit des im Medlum gellsten Sauerstoffs beeÍn.
fluBt. Dte grÓBten Ánderungen, die sÍch durch dle Ver.
lángerung und Verengung der zellen und . durch die
ihres Volumens bemerkbar . machen,
Verminderung
wurden bei Kultivationen
mlt Sauerstoff.Limitatlon
beobachtet. Bei der Erhlhung der sauerstoff-Konzentration im Medlum nahmen dÍe Hefen Formen und
Dtmensionen an. welche bei den Batch-Kultivationen
Ublich sind. Es wurde der Zusammenhang zwischen den
und dem Gehalt. der
Ánderungen
morphologlschen
stickstoffhaltigen Substanzen ln der Hefeblomasse ermlttelt.
Fernr_entačná
surovÍn
výroba ethanolu zo Škrobnatých
664.22
634.2
t. Literórnyp]ehrod
In8. ZUZANA cIEsARovÁ,
Ing. DANIELA
ŠMoGRovIčovÁ, csc., Doc. In8. LUDovÍT PoLÍvKA, csc.
Katedra biochemickej technotógie CHTF sVŠT, 81237 BratÍslava
Ktúěové slová: eÍanol, Škrob, klasinkv,
ÚvoD
Íe':mentócia šk|obu, hydrotýza
Škrobu.
getickej náročnosti procesu výroby alkoholu zo škrobnatých materiálov sa stalo predmetom výskumu v [tÍlo:
Vzhladom k tomu, Že surovinové zdroje pre rozvoJ bÍo. hých laboratóriách.
cbemických technológiÍ sú lÍmitované, je velmi dÓleŽité
Zaáma je extrúzna metóda úpravy škrobu krátkodobým
hladat obnovitelné suroviny, ktoré sú prakticky nevyčer- pÓsobením vysokej teploty v špeciálnych extrudéroch.
patelné. Práve tieto zdroje, ich výber a selekciE pre
Takto upravený škrob nevyŽaduje enzýmovú hydrolýzu
efektívnu výrobu, sa závaŽnou mierou podielajú na roz.
a je pouŽitelný ako substrát pre etanolovú fermentáciu
voji lÍehovarnÍckeho prÍgmyslu. Medzi takéto zdroJe
[6,7].
patria aj suroviny rastlÍnného pÓvodu s obsahom škrobu.
V Japonsku bola úspešne oveiená alkoholová fermentácia na zemiakovom škrobe bez tepelného spracovania
s pouŽÍtím Black-koJi amylázy zÍskanej z Aspergillus
L.rLzY FERMENTAcNEHo sPosoBU vÝRoBY ETANoLu
ntger |8l v laboratórnom meradle. V preyádzkovom meradle však pokusy neboli úspešné,vyskytovala sa bak' výrobu etanolu íermentačnou cestou možno rozdelit
teriálna kontaminácia. Ako substrát bola tieŽ pouŽitá kuna tri fázy [1"]:
kurica a ryŽa.
Ueda a kol. Í9,10l vyvÍnult proces výroby etanolu zo
I.. Biochemická Íáza - zahÍňa úpravu a hydrolýzu suškrobnatých
surovín Ikassava, zemiaky). Na sacharifikároviny na fermentovatelný substrát.' (stekucovan1e
ciu pouŽÍli glukoamylázu z Aspergtllus nige| a Rhžzopus
a scukorňovanie obilného škrobu, mlqtÍe a enzýmo.
species. Dosiahnuté výtažky etanolu sa pohybovalÍ od
vá hydrolýza kukurice atd.).
82'3 do 99,6 0/oteoretického výťažku.PouŽité čerstvéze2. Metabolická alebo fermentačná Íáza _ proces alkomÍakovéhluzy alebo kassava rezky neboli suchým škroholového kvasenia glukózy v kvasinkách prebieha.
bovým materiálom, celá fermentácia trvala olrolo 5 dnÍ.
júci Embden-MeyerhofÍovou dráhou. Teoreticky
Suendsky a kol. [tll premývali surový škiob roztomÓŽe vzniknúť 0,51 g etanolu z 1 g glukózy, pričom
kom
0,2 0/oH2Soa za účelom sterilizácie á pouŽili macevýtaŽky v praxi dosahujú 90_95 0/oteoretickej hod.
račný enzým Cellulosin IUeda chem. Industry co. IapanJ
notY.
na zvýšenie plsobenia glukoamylázy z Rhizopus niueus
3. Fáza pofeťmentačnej úpravy produktu'- {filtrácia,
prÍ 25"C. Cellulosin
je enzýmový preparát získaný
.:
destilácia, riedeniď atď' J.
z A. nige| obaahujúci ako hlavnú zloŽku .pektíndepolymerázu {E.c. 3.2.1'15J a taktiež nÍzku aktivitu pektín.
2.PREDFERMENTAčNÁ
ÚpRAvA šKRoBU AMYLoLYTIC.
esterázy a iných hemicelulolytických ěnzýmov. Po 5
KÝMI PRÍPRAVKAMI
dňoch bola fermentácia ukoilčená s výtaŽkom etanolu
74 o/0.
výroba priemyselného a palivového etanolu zo škrobChemapec Inc. v New Yorku vyvinul proces výroby
natých substrátov vyžaduje pred samotnou fermentáciou
bezvodého etanolu zo škrobu bez jeho predchádzajúcej
glukózy na etanol úpravu suloviny, a to [2]:
tepelnej úpravy, ktorý vyŽaduje približne polovičné náklady oproti klasickému postupu. Poloprevádzka bola
- stekutenié škrobu pomocou endoamylázy, Id.amy.
realizovaná vo Švajčiarsku I12]' Proces sa odlišuje od
|áza, E.C. 3.3.1.1),
klasickej výroby etanolu tÝm, že pred procesom sa od.
_hydrolýzu
{scukornenie) stekuteného prodúktu stráni vela neškrobového materiálu v zrnách
Izárodky,
Idextrínov) s nÍzkou molekulovou hmotnostou na
tuky aj.J a surovina Je spracovávaná použitím špecÍálglukózu pomocou glukoamylázy ÍE.c. 3.2.1.3).
neho enzymu' ktorý nie je blÍŽšiedefinovaný. Požiadav.
V priemyselneJ produkcÍi alkoholu zo škrobnatých
ky na energiu v tomto procese sú iba 4,2M|.dm-r bezmateriálov sú vysoké výrobné náklady spÓsobené velkou
vodého etanolu oproti 16,7_23,3 M].
. dm-3 v klasickom
spotrebou ener8ie pri tepelnom spracovanÍ suroviny, ste.
fermentačnom- procese. VýtaŽok etanolu je 9,8 dm3
produktu. Napr. bežne pouŽÍvaná
rilizácii a destilácii
z 25,4 kg kukurice.
metóda výroby alkoltolu Ž kukuričných zfn zahíňa tepelAlltech Inc. [12] použit v pnocesě kombináciu enzýmov
_ alkoholáza |. z Bactllus subtiiis a alkoholázá
né spracovanie zápary pri teplote 140.C v jednorázovom
II.
a asi 180"c v kontinuálnom procese [3]. Vysoká teplota
z Aspergillus niger alebo Rhizopus nÍDeus.Proces mÓŽe
spÓsobuje zmenu štruktury zfn a zlepšuje tým pÓsobenie
prebiehat kontinuálne AlCoN-ferňentáciou
[12].
stekucujlicich a scukorňuJúcich enzýmov na škrob azáro.
Iný prÍstup k hydrolýze surového škrobu na fermento.vatelné
,veň prébieha sterÍlizácia zápary. Lee [4l a Mikuni |5|
sacharidy zvoli|í A'zhai, a Hamdy [1.3]. Hydroly.
uvádzajú, Že spotreba energie pri tepelnom spracovanÍ zovali zemiaky pií vysokej teplote (1.54.c]' nízkej konsurového škrobu (energÍa na zahriatie a udrŽanie t€ p lo.
centrácÍi HcI [0'034 mol dm:3) a za pomerne krátky čas
ty 120"C počas 2h) predstavuJe.asi 400/o celkovej, ener[24 min) získali maximum r€ d ukuJúcich sacharÍdov. Nepotťebnej
pri
prinieslo to však očakávané výsledky v etanolovej feralkoholovel fermentácii. zníženi€ ' ener8ie