Přednáška 7: Neuropřenašeče: neurotrofické faktory

Přednáška 7: Neuropřenašeče: neurotrofické faktory
Představa o tom, že extracelulární signály mohou zprostředkovávat růst a diferenciaci
nervových buněk, je více než půl století stará. Nicméně až v posledních cca 20 letech vědci
začali rozkrývat značnou molekulární diverzitu růstových faktorů a jejich signálních kaskád.
Pochopení signálního působení růstových faktorů zásadně změnilo naše chápání způsobů,
jakými se nervový systém ontogeneticky vyvíjí a jak se adaptuje během dospělého života
organismu. Tyto poznatky nám pomáhají chápat i mechanismy zodpovědné za přežití
neuronu, jejichž selhání podmiňuje vznik různých neurodegenerativních chorob jako
Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntigtonova choroba nebo amyotrofická
laterální skleróza. Růstové faktory a jejich signální proteiny jsou tedy zajímavým
farmakologickým cílem v terapii nejen těchto neuropsychiatrických onemocnění.
V rámci diskuse o neurotrofických faktorech bychom si měli vymezit pojmy
neurotrofické faktory
a cytokiny. Kanonicky pojato, neurotrofické faktory jsou látky
ovlivňující růst, diferenciaci a přežívání neuronů. Příbuzný termín cytokiny je zapůjčen od
imunologů, kde popisuje molekuly uvolňované aktivovanými lymfoidními buňkami a
sloužícími k modulaci aktivity dalších buněk. Někteří autoři používají termín cytokiny na
všechny látky nějakým způsobem spojené s růstem populace nervových buněk (tj. mezi
cytokiny zahrnují i neurotrofické faktory), jiní popisují termínem cytokiny látky ovlivňující
růst toliko gliální populace a pod. My budeme jako neurotrofické faktory označovat ty
molekuly, které v rámci nervového systému ovlivňují růst, diferenciaci a buněčný cyklus
neuronů i glií. Pod tímto termínem jsou sdruženy proteiny, které slouží v uvedeným funkcím,
takže si je odlišíme od mnoha non-peptidových molekul (jako např. steroidní hormony,
kyselina retinová a neuropřenašeče, které také ovlivňují růst a integritu nervového systému).
Ačkoliv neurotrofické faktory byly původně dávány do souvislosti s vývojem
nervového systému a neuropřenašeče do souvislosti se synaptickým přenosem v dospělém
CNS, v mnoha rolích se překrývají a hranice mezi nimi není v moha případech vůbec jasná.
Podobně jako neuropřenašeče, i neurotrofické faktory jsou syntetizovány v neuronu a
ovlivňují funkci dalších neuronů, za některých okolností mohou být i vylévaný jako důsledek
neuronální aktivity. Mohou také vyvolávat rychle změny v cílovém neuronu, které jsou
v podstatě neodlišitelné od odpovědí vyvolaných „klasickým“ neuropřenašečem uvolněným
v rámci synaptického přenosu. A podobně, mnoho neurotransmiterů může ovlivňovat růst a
přežití neuronů a diferenciaci jejich adultních fenotypů. Od např. neuropeptidů ovšem
neurotrofické faktory odlišují přinejmenším dvě charakteristiky:
•
•
jsou větší: např. z mozku odvozený neurotrofický faktor (brain-derived neurotrofic
factor, BDNF) je protein velikosti 14 kDa, zatímco neuropeptidy jsou malé peptidické
molekuly;
fungují regulací proteinkinas, nikoliv cestou G-receptorů a klasických kaskád druhých
poslů.
Funkční charakteristiky neurotrofických faktorů
O životním cyklu neurotrofických faktorů se ví podstatně méně než o osudech
neuropřenašečů. Jsou syntetizovány v tělech některých neuronů a glií jako proteiny. Některé
jsou v těchto buňkách i skladovány, nejspíše ve velkých denzních váčcích, a jsou
transportovány do nervových zakončení nebo do dendritických větví. Mechanismus
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
kontrolující výlev neurotrofických faktorů není plně objasněn. Mnoho těchto látek, jako IL-1,
BDNF a neurotrofické faktory pocházející z gliální linie (GDNF) jsou produkty časných genů,
jejich syntéza je podmíněna aktivitou neuronu a limituje jejich výlev. Výlev dalších
neurotrofických faktorů může spouštět depolarizace. Hlavním mechanismem ukončení účinku
neurotrofických faktorů je patrně jejich proteolytická degradace, nicméně např. BDNF jsou
sekvestrovány s funkčně inaktivními receptory, což limituje jejich difusi a nejspíše i dobu
účinkování.
Zajímavou otázkou je místo působení neurotrofických faktorů. Před cca 60 lety (!) bylo
vytvořeno schéma „klasické“ syntézy a aktivity neurotrofického faktoru, konkrétně prvního
popsaného neurotrofického faktoru NGF (nerve growth factor).
Paní profesorka Rita Levi-Motalciniová ukázala na sympatetických
gangliích kuřecích embryí, že množství a růst jejich nervových
vláken závisí na přítomnosti specifického růstového faktoru. Na
myších sakrkomech implantovaných do 11denních kuřecích
embryí detekovala charakteristické „hallo“ vláken rostoucích
z ganglia v přítomnosti nádoru (vpravo), části jeho tkáně nebo
alespoň extraktu. Vlákna velmi intenzivně inervovala nádor. Látku
se jí ve spolupráci se Stanley Cohenem podařilo identifikovat, purifikovat a prokázat, že růst
nervových vláken je závislý na koncentraci této látky – tedy NGF. Rita Levi-Montalcini (* 22.
dubna 1909 v Turíně) je italská neuroložka židovského původu. Je považována za jednu z nejvýznamnějších
neuroložek 20. století, obdržela ta nejprestižnější ocenění ve svém oboru, včetně Albert Lasker Award for Basic
Medical Research a Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství (obě v roce 1986 spolu se Stanleym Cohenem). Je
členkou Papežské akademie věd (nominována v roce 1974) a Národní akademie věd Spojených států (od 1968) a
doživotní senátorkou Itálie (od 2001). Je nejstarší žijící nositelkou Nobelovy ceny. Ukázali také, že
produkce NGF cílovým inervačním orgánem daného neuronu je nezbytná pro to, aby neuron
přežil a cílový orgán inervoval. Neuron musí také na NGF správně odpovídat. Produkce NGF
je omezená, takže nervová vlákna mezi sebou kompetují. Tato pozorování bývají také
shrnována pod termín neurotrofická hypotéza. Ačkoliv její (a NGF) typické projevy jsou
dobře stopovatelné zejména na periferii, určité její podoby se vyvinuly i v CNS. V mozku a
páteřní míše může neuron produkovat neurotrofické faktory zásobují jiný neuron, který ho
inervuje, nicméně produkuje celou řádku neurotrofických faktorů, které na něj samotný
působí autokrinně. Některé neurotrofické faktory mohou být dokonce anterográdně
transportovány do terminál, kde po výlevu působí na somata a zakončení jiných nervových
vláken. Stejně tak komplex neurotrofický faktor – jeho receptor zformovaný na plasmatické
membráně terminály může být retrográdně transportován do těla neuronu, kde má další
biologické funkce.
Část neurotrofických faktorů dále produkují glie. Některé faktory jsou produkovány
gliemi i neurony a jejich receptory jsou rovněž exprimována na obou buněčných typech. Mezi
gliemi a neurony se tak formuje velmi složitá intercelulární komunikace.
RODINY NEUROTROFICKÝCH FAKTORŮ
S klasifikací neurotrofických faktorů to není snadné, neboť je částečně poznamenána
jejich historií. Jména mnoha neurotrofických faktorů byla odvozena od účinku, se kterým byli
primárně spojováni. Např. interleukiny dostaly své jméno podle toho, že modulují komunikaci
mezi elementy bílé krevní linie – ačkoliv jsou produkovány i gliemi. Podobně, GNDF byl
původně identifikován jako faktor odvozený z gliální buněčné linie, ačkoliv jeho producenty
jsou i mnohé neuronální populace; FGF (fibroblast growth factor) dostal jméno jako růstový
faktor fibroblastů, ačkoliv jej produkují i glie a CNTF (ciliary neurotrophic factor), který je
produkován i gliemi a několika typy neuronů, dostal své jméno podle toho, že podporuje růst
a udržování neuronů ciliárního ganglia oka.
2
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
Dnes jsou neurotrofické faktory kategorizovány na základě své homologie a podle
toho, jaký sdílejí transdukční mechanismus, kterým navozují své biologické odpovědi. Mezi
všemi rodinami neurotrofických faktorů jsou nejlépe charakterizovány tři: neurotrofiny,
GNDF a příbuzné faktory a CNTF-příbuzné faktory. Důležité jsou samozřejmě i ty zbylé,
neboť také regulují funkce neuraxis za fyziologických a patofyziologických stavů.
Přehled častého členění rodin neurotrofických faktorů máte v následující tabulce.
Rodina
neurotrofických
faktorů
Neurotrofiny
GDNF rodina
CNTF rodina
Typičtí zástupci
NGF, BDNF, NT-3,
NT-4
GDNF, neurturin,
persephin
Další růstové
faktory
Interleukiny a
příbuzné cytokiny
TGF rodina
Jiné cytokiny
Chemokiny
Typičtí zástupci
jejich receptorů
Trk (R-PTks)
TrkA, TrkB, TrkC
spojené s Ret
spřažené s Janus
kinasami (JAK)
EPH (R-PTKs)
CNTF, LIF, IL-6
Ephriny
EGF rodina
Jejich receptory
EGF, TGFα,
neureguliny
insulin, IGF, FGF,
PDGF
GFRα1, GFRα2,
neznámé
GP130, CNTFRα,
LIFRα
ErbB (R-PTKs)
R-PTKs
IL-1 R spřažený
s PS/TK, R-PTK, R
IL-1, IL-2, IL-3, ILspřažené s JAK, R
5, TNFα, TNFβ
se vztahem k p75
(„receptory smrti“)
TGFβ
R-PS/TK
interferony
spřažené s JAK,
(IFNα, β, γ), mR-PTKs
CSF, gm-CSF
CC chemokiny (IL8), CXC chemokiny
receptory spřažené
(MIP, MCP), CX3C
s G-proteiny
chemokiny
(neurotactin)
CC1-CC8 R
CXC1-CXC4 R
CX3C1 R
R-PTK, receptor-associated protein tyrosine kinase; R-PS/TK, receptor-associated protein
serine/threonine kinase; m-CSF, macrophage colony stimulating factor; gm-CSF;
granulocyte-monocyte CSF; MIP, macrophage inflammatory protein; MPC, monocyte
chamoattractant protein
3
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
NEUROTROFINY
Rodina neurotrofinů zahrnuje NGF a následně identifikované neurotrofické faktory,
které s ním sdílejí stejný signalizační mechanismus: BDNF (brain-derived neurotrophic
factor), neurotrophin-3 (NT-3) a neurotrophin-4 (NT-4; také známý jako neurotrophin4/5). V rybách byl také popsán neurotrophin-6. Mezi jejich klasické charakteristiky patří
malá velikost (BNDF má např. 14 kDa) a signalizace cestou Trk receptorové rodiny.
Neurotrophiny působí na širokou škálu neuronů. Dobře popsána je jejich role
v přežívání neuronů na periferii vzhledem k ustavení funkční synapse s cílovým orgánem.
NGF je také přítomen v malých neuronech sympatiku a sensorických neuronech, které se
účastní nocicepce a vnímání teploty. BDNF je produkován v kosterní svalovině
inervované motoneurony. BDNF, NT-3 a NT-4 jsou zodpovědné za přežívání
specifických sensorických neuronů na periferii.
Ačkoliv neurotrofiny podobnými způsoby podporují přežívání neuronů na periferii,
jejich role v mozku a prodloužené míše není detailně objasněna. NGF pravděpodobně
podporuje přežití cholinergních neuronů jader septa (na bázi koncového mozku), které
inervují hippokampální neurony.Acetylcholin uvolňovaný z terminál neuronů jader septa
nejspíš aktivuje neurony hippokampu a zvyšuje jejich produkci NGF. Ten pak zpětně
působní na septální neurony a umožňuje jejich přežití (pozitivní zpětná vazba). BDNF,
NT-3 a NT-4 napomáhají přežívání motorických neuronů kůry a hippokampálních
neuronů,a působí i na noradrenergní, dopoaminergní a serotoninergní neurony mozkového
kmene.
Jak přesně neurotrophiny přispívají j vývoji mozku není zatím detailně popsáno. Zda
je jejich primární funkcí target-derived podpora aferentních neuronů, podpora neuronů
eferentních nebo udržování diferenciálních rozdílů mezi neuronálními subtypy a
populacemi, je předmětem intenzivního výzkumu.
Trk receptory
Všechny neurotrofiny se váží na třídu vysoce homologických receptorových
tyrosinkinas označovaných jako Trk receptory. Jsou známy tři podtypy těchto receptorů:
TrkA, TrkB a TrkC. Jde o transmembránové glykoproteiny o molekulární hmotnosti 140145 kDa.Každý z typů Trk Rs váže -s určitým překryvem- specifický neurotrofin:
TrkA – NGF, NT-3
TrkB – BNDF, NT-3 a NT-4 a
TrkC – NT-3.
Trk Rs mají charakteristickou strukturální doménu. Extracelulární část obsahuje
vazebné místo pro ligand a je bohaté na segmenty hojně tvořené leucinem (důležitý pro
interakci protein-protein), klastry bohaté na cystein a dvě imunoglobulinům podobné domény.
Vazba neurotrofinu na Trk receptor aktivuje jeho katalytickou doménu. Neurotrofiny
se váží jako dimery, což vede k dimerizaci Trk receptorů a jejich následné autofosforylaci na
vybraných aminokyselinových zbytcích tyrosinu. Fosforylovaný tyrosin formuje
rozpoznávací sekvenci pro SH2 domény některých typů buněčných proteinů. Např. SH2
domény proteinů Shc a Grb2 spojují aktivaci Trk receptorů s aktivací malého G-proteinu Ras,
který obratem aktivuje s mikrotubuly asoiciovanou proteinkinasovou kaskádu (MAPKkinasovou kaskádu). Genetické abnormality v oblasti Ras proteinů vedou u lidí
k neurofibromatóze, což je choroba zahrnující např. nadměrný růst Schwannových buněk.
4
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
Dalším biologickým projevem aktivace Trk receptorů je fosforylace různých
signálních proteinů na tyrosinu. Z nich nejdůležitější jsou fosfolipasy Cγ (PLCγ) spouštějící
fosfatidylinositolovou kaskádu, a substrát inzulínového receptoru (IRS), který vede k aktivaci
fosfatidylinositol-3-kinasové kaskády. Mutace v genu ATM, který kóduje jeden ze subtypů
fosfatidylinositol-3-kinasy, vede k ataxii-telangiectasii. To je choroba vyznačující se
progresivní degenerací a atrofií určitých mozkových oblastí, zejména mozečku.
Trk receptory vykazují různé sestřihové varianty. Nejlépe prozkoumané jsou TrkB a
TrkC isoformy, které obsahují normální vazebnou doménu, ale postrádají katalytickou
doménu tyrosinkinasovou. Zkrácené isoformy Trk receptorů mohou snižovat aktivitu
neurotrofnů.
p75 receptor
První naklonovaný receptor pro neurotrofiny nebyl Trk receptor, ale receptor p75. Je
to 75 kDa velký protein s nízkou afinitou k neurotrofinům. Všechny neurotrofiny váže se
zhruba stejnou afinitou a může modulovat i signalizaci Trk receptorů – zvyšuje afinitu
vysokoafinitních vazebných míst pro NGF na TrkA. TrkA receptor může zprostředkovat
funkční odpověď i bez p75 receptoru, nicméně tato odpověď je výrazně nižší a přežití
některých neuronálních populací vyžaduje až několikanásobně vyšší hladiny NGF a jiných
neurotrofinů. Vzhledem ke kompetici neuronů o NGF je funkce p75 receptoru často klíčová
pro osud určitého neuronu. exprese p75 receptoru ovlivňuje také přežití neuronů při nemocech
či traumatickcýh stavech. Typy neuronů a patofyziologické stavy, do kterých je p75 receptor
zapojen u různých buněčných typů neuraxis, jsou v následující tabulce.
Na následujícím obrázku vidíte schematické modely aktivace Trk a p75 receptorů.
5
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
Z Neurotrophins and their receptors: A convergence point for many signalling pathways , Moses V. Chao,
Nature Reviews Neuroscience 4, 299-309 (April 2003)
Malé ligandové molekuly, agonisté i antagonisté, obvykle nejsou pro farmakologické
studie funkcí receptorů pro neurotrofiny dostupné. Často jsou proto tedy využívány
zvířecí modely knoc-outované pro vybranou molekulu. Myši knock-outované pro NGF a
TrkA receptor vykazovaly ztrátu neuronů sympatiku i sensorických neuronů zadních
kořenových ganglií trigeminu, stejně jako částečnou ztrátu cholinergních neuronů
septálních jader projikujících do hippokampu. V případě posledně jmenovaných neuronů
by snad agonisté TrkA receptorů mohli najít uplatnění v podpůrné léčbě Alzheimeovy
choroby.
Studium zvířat knock-outovaných pro TrkB receptory je trochu komplikovanější,
neboť ty váží kromě NGF i NT-4 a BDNF, a v nižší míře i NT-3. Takto upravená zvířata
nicméně také vykazovala ztráty kraniálních motorických neuronů či neuronů ganglií
trigeminu. Myši knock-outované pro BDNF se projevovaly ztrátou specifických populací
6
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
motorických neuronů (kortikálních), která může být spoje s chorobami jako amyotrofická
laterální skleróza (ALS).
TrkC knock-outované myši se projevovaly ztrátou propriorecepčních neuronů ganglií
zadních kořenů míšních a defekty v pohybu a koordinaci polohy končetin. Typická pro ně
byla také ztráta myelinizace Ia aferentních sensorických nervových vláken.
Neurotrofiny a synaptická plasticita
Role neurotrofinů v synaptické plasticitě byla primárně studována při vývoji
zrakové kůry. Jak axony z ncl. geniculatus laterlis thalamu (LGN) rostou a formují
synapse na primárních zrakových neuronech okcipitálního kortexu, seskupují se tyto
neurony do specifických sloupců v korové vrstvě IV. Vznik těchto sloupců je spojen
s dominancí levého nebo pravého oka a aktivitou jeho fotoreceptorů. Pokud
pokusnému zvířeti zašijete oční víčko a jeho fotoreceptory tak nejsou stimulovány,
LGN neurony obdrží z deprivovaného oka slabší signály. Vznik sloupců oční
dominance ve zrakové kůře je pak zbržděn a omezen. Ve zrakové kůře se nachází
BDNF a NT-4. Je možné, že neurony LGN kompetují o ligandy TrkB receptorů a tato
kompetice může být ve tvorbě zrakových sloupců zásadní. Pokud do vizuálního
kortexu infúzně podáváme BDNF nebo NT-4, nemusí neurony kompetovat a vznik
sloupců je zablokován.
Neurotrofiny regulují synaptickou plasticitu i v dospělém diferencovaném
mozku. V dospělých neuronech reguluje jejich vzruchová aktivita velmi výrazně
expresi některých neurotrofinů a jejich receptorů. Po křečích byla např. pozorována
zvýšená exprese BDNF a Trk receptorů v hippokampu. Podobné změny v expresi
některých neurotrofinů a jejich receptorů byly pozorovány i v hippokampálních
neuronech po stimulační salvě spojené s LTP nebo v neuronech locus coeruleus
reagujících na nedostatek opiátů u závislých jedinců. Naopak, exprese BNDF může
být snížena vystavení inhibičním stimulům, jako jsou agonisté GABAA receptorů.
Rychlost regulace hladiny BNDF odpovídá rychlosti regulace systémů spojených
s jinými časnými geny, jako je c-fos; ostatně i indukce BNDF je zprostředkována
aktivací preexistujících transkripčních faktorů jako CREB.
Neurotrofické faktory mohou ovlivňovat synaptický přenos a regulovat vznik synapsí.
Např. NT-3 rychle zvyšuje synaptický přenos na nervosvalovém spojení (typicky do 10
min). Děje se tak cestou zvyšování pravděpodobnosti výlevu acetylcholinu z terminály,
neboť NT-3 zvyšuje frekvenci synaptických proudů, ne jejich amplitudu. Tento efekt NT3 může být zablokován nespecifickým inhibitorem Trk receptorů známým jako K252a.
Neurotrofiny rovněž regulují synaptický přenos v hippokampu. BNDF a NT-3 (ne
NGF) zvyšují excitační postsynaptické potenciály Schaefferových kolaterál CA1 neuronů
až po dobu 2-3 hodin. Myši knock-outované pro BNDF naopak vykazují nižší bazální
aktivitu těchto oblastí a např. deficienci v LTP.
Na obrázku vidíte interakci Trk Rs s některými iontovými kanály – možnou cestu
synaptické modulace.
7
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
GDNF RODINA
GDNF je glykosylovaný protein o velikosti asi 18 kDa. Prvně byl izolován v tkáňových
kulturách z gliální buněčné linie podporující přežívání dopamiergních neuronů středního
mozku. Následně bylo prokázáno, že tyto neurony chrání i před toxickým poškozením in vivo.
S degenerací dopaminergních neuronů je spojena Parkinsonova choroba, a proto byla GDNF
následně věnována nemalá pozornost.
GDNF ovšem působí protektivně i na přežití jiných neuronálních populací, např. neuronů
myenterického plexu střeva. Zdá se, že je zásadním růstovým faktorem mimo nervový
systém. Pozoruhodná je jeho role ve vývoji ledvin – myši knock-outované pro GDNF umírají
krátce po narození díky selhání ledvinových funkcí. Při poškození genu pro GDNF se jim
nevětví močovody a nebo se v rámci růstu ledviny vůbec nevyvíjejí.
Ureteric bud growth is dependent on GDNF and its receptor. (A) The ureteric bud from a 11.5-day wild-type
mouse embryonic kidney cultured for 72 hours has a characteristic branching pattern. (B) In embryonic mice
heterozygous for the genes encoding GDNF, the size of the ureteric bud and the number and length of its
branches are reduced. (C) In mouse embryos missing both copies of the gdnf gene, the ureteric bud does not
form. (Scale bars = 100 µm.) (D) The receptors for GDNF are concentrated in the posterior portion of the
nephric duct. GDNF secreted by the metanephrogenic mesenchyme stimulates the growth of the ureteric bud
from this duct. At later stages, the GDNF receptor is found exclusively at the tips of the ureteric buds. (A-C from
Pichel et al. 1996, photographs courtesy of J. G. Pichel and H. Sariola; D after Schuchardt et al. 1996.)
GNDF_ledviny_2: The effect of GDNF on the branching of the ureteric epithelium. The ureteric bud and its
branches are stained orange (with antibodies to cytokeratin 18), while the nephrons are stained green (with
antibodies to nephron brush border antigens). (A) 13-day embryonic mouse kidney cultured 2 days with a control
bead (circle) has a normal branching pattern. (B) A similar kidney cultured 2 days with a GDNF-soaked bead
shows a distorted pattern, as new branches are induced in the vicinity of the bead. (From Sainio et al. 1997;
photographs courtesy of K. Sainio.)
Podobně jako neurotrofiny funguje i GDNF cestou aktivace proteinové tyrosinkinasy.
Této aktivace je ovšem dosaženo nepřímo pomocí intervenujícícho receptorového proteinu.
Dimer GDNF se váže na specifický receptor o velikosti asi 40 kDa, označovaný jako GFR1α.
GFR1α R je v membráně zakotven glykofosfatidylinositolovou (GPI) kotvou. Je členem
rodiny GFRα receptorů (GFRα1-4) se specifickou afinitou k ligandům. Navázání GDNF na
GFRα1 R spustí asociace GFRα1 s membránovou proteinovou tyrosinkinasou Ret, což je
protein o velikosti asi 150 kDa. Byly identifikovány 3 isoformy Ret kinas (Ret 51, Ret 43 a
Ret 9), s 51, 43 a 9 aminokyselinovými zbytky na svém C-konci. In vivo je nejlépe
prostudována role Ret 51 a Ret 9, které jsou nejčastější. Asociace Ret a GFRα1 R
s navázaným GDNF vede k fosforylaci mnoha biologických substrátů a změnám
v MAPkinasové signalizaci. Poruchy funkce Ret kinasy vedou u lidí k Hirschprungově
nemoci, což je porucha charakterizovaná neobvyklou střevní motilitou, zvětšením colon a
obstukcí ampula rectis. Jiné typy mutací vede např. k mnohočetným endokrinním neoplasiím
nebo k míšním karcinomům.
I další dva členové rodiny neurotrofinů, neurturin a persephin, působí přes navázání na α
podjednotky intervenujícícho receptoru a s ním následně na Ret kinasu. Neurturin podporuje
přežití dopaminergním neuronů středního mozku, které vykazují vysokou expresi Ret kinas a
GFRα1 receptoru, ale ne GDNF. GDNF exprimují dopaminergní neurony striata, které tak
zásobují dopaminergní kolegy středního mozku – systém podobný jako na periferii, kde
cílová tkáň produkuje NGF pro svá inervující vlákna. Regulace těchto dopaminergních
okruhů středního mozku a striata by mohla být užitečná v léčbě parkinsonismu.
8
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
CNTF RODINA
Ciliární neurotrofický faktor patří do rodiny růstových faktorů, která zahrnuje i LIF
(leukemia inhibitory factor), interleukin-6 (IL-6), prolaktin, růstový hormon, leptin,
interferony nebo např. onkostatin-M. Většina členů této rodiny působí hlavně mimo CNS a
jsou často označovány za cytokiny. S poměrně dramatickou regulací přežití neuronů a jejich
diferenciace jsou spojeny zejména CNTF, LIF a IL-6, které mohou být označovány i
rigorózněji jako neurotrofické faktory.
CNTF je protein velikosti zhruba 24 kDa. Primárně byl studován v ciliárních gangliích
kuřat a je známo, že zvyšuje hladinu cholinacetyltransferasy. Reguluje přežití a diferenciaci
mnoha neuronálních typů, jako jsou např. pregangliové neurony sympatiku, sensorické
neurony, motorické neurony dopaminergní neurony středního mozku nebo neurony
hippokampu v tkáňových kulturách. Velmi zajímavá je jeho role na motorických neuronech:
nejen že podporuje jejich přežití in vitro, ale zabraňuje jejichdegeneraci po axotomiii nebo
zmírňuje některé motorické defekty na myších modelech chorob motorických neuronů. Byl
testován i terapeuticky, ale vyvolává velmi vážné vedlejší účinky.
Axokin, modifikovaná verze lidského CNTF, zkrácená oproti CNTF o 15 aminokyselin a
nesoucí dvě zaměněné aminokyseliny, je v in vitro i in vivo esejích 3-5 × účinnější než CNTF
a je stabilnější. V 90. létech začal být testován v léčbě amyotrofické laterální sklerózy (ALS),
kde sice nepůsobil na kosterní svalovinu tak, jak se očekávalo, ale ukázal se jako agens
navozující ztrátu chuti k jídlu.
LIF a IL-6 regulují podobným způsobem neuronální růst a diferenciaci. IL-6 napomáhá
přežití cholinergních neuronů septa, katecholaminergních neuronů mesencefala nebo
hypothalamických neuronů, a v tkáňových kulturách spouští neuronální diferenciaci PC12
buněk. Účinek LIF je in vivo nejlépe prozkoumán v hypothalamu. In vitro, LIF a CNTF
potlačují adrenergní fenotyp neuronů symaptiku a indukují v nich fenotyp choilnergní.
V mozku jsou za primární zdroj CNTF, LIF a IL-6 považovány glie, ačkoliv se nevylučuje
ani jejich neuronální původ. Jejich receptorová signalizace je ovšem dobře popsána v gliích i
neuronech.
Signální dráhy CNTF
Signální dráhy CNTF a dalších členů CNTF rodiny se poněkud liší.
Komplex CNTF receptoru se skládá ze tří složek:
•
•
•
přenašeče signálu známého jako LIF receptor (LIF R),
glykoproteinu o hmotnosti 130 kDa (gp130) a
vlastního proteinu vážícího CNTF (CNTF Rα).
CNTF Rα je asi 80 kDa protein zakotvený v membráně GPI kotvou. Vazba CNTF na
CNTF Rα způsobí jeho asociaci s gp130 a následné spojení tohoto subkomplexu s LIF R. Až
vznik tohoto tříčlenného komplexu spustí vlastní signalizační krok – aktivaci Janus kinasy
(JAK) a příbuzných tyrosinkinas (Tyk aj.), které následně vyvolají patřičnou biologickou
odpověď, a to nejčastěji aktivací transkripčních faktorů rodiny STAT.
Přenos signálu dalšími členy CNTF rodiny je podobný. IL-6 se váže na specifický protein
IL-6Rα, který obratem asociuje s dimerem glykoproteinu gp130. Vzniklý komplex aktivuje
JAK kinasy a následné signální kaskády.
9
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
LIF se váže na dimer LIFR a gp130. Tento komplex opět aktivuje JAK kinasy. Jak je
vidět, určité části signálního komplexu jsou unikátní pro určitý neurotrofický faktor (CNTF
Rα, ΙL−6Rα) a jiné slouží více různým ligandům (gp130, LIFR).
Signální kaskády CNTF rodiny nejsou zcela objasněny. Překvapivě, myši knock-outované
pro CNTF se vyvíjejí normálně a vykazují v dospělosti jen mírný motorický deficit.
V japonské populaci je asi 2.5% jedinců homozygotních pro inaktivující mutaci CNTF – jsou
tedy lidskými „knoc-outy“ pro CNTF podobně jako myší model CNTF knock-outů. I tito
jedinci se vyvíjejí bez zjevných defektů. A naopak, myši knock-outované pro CNTF Rα
umírají do 24 hodin po narození. Tato pozorování naznačují, že pro CNTF Rα exituje ještě
nějaký další endogenní ligand.
CYTOKINY IMUNITNÍCH ODPOVĚDÍ A CNS
Odpovědi na cytokiny jsou nejlépe prostudovány v prostředí imunitního systému.
Nicméně některé z cytokinů prokazatelně zprostředkují odpovědi CNS na imunologické
změny. Mezi tyto cytokiny patří např. IL-1 a IL-6, tumor-nekrotizující faktor α (tumor
necrosis factor-α, TNFα) nebo transformující růstový faktor β (transforming growth factor-β,
TGFβ).
Cytokiny zapojené do imunitních funkci jsou kritické pro systémovou homeostázu. Každé
narušení homeostázy (nemocí, strese ap.) vede k obranné reakci směřující ku znovuustavení
homeostázy. Tato obranná reakce je zčásti zprostředkovaná i CNS, zejména její části jako
horečka, pokles chuti k jídlu, kardiovaskulární změny, poruchy spánku a neklid.
Účinek cytokinů imunitního systému na mozek je velmi dobře ilustrován na příkladu
horečky. Horečku lze vyvolat ve zdravém jedinci periferním injikováním IL-1.
Hematoencefalická bariéra sice do značné míry limituje průchod cytokinů do mozkového
parenchymu, nicméně je umožněn v cirkumventrikulárních orgánech.Cytokiny mohou také
v endotelových buňkách indukovat lipofilní signály (např. prostaglandiny) a následně
difundovat z vaskulatury do mozkového paremchymu.
I mozek může syntetizovat cytokiny imunitních odpovědí, a to zejména z mikroglích.
Částečně je syntéza cytokinů možná i v astrocytech a zcela není vyloučena ani v neuronech.
Receptory těchto cytokinů jsou primárně exprimovány v gliích. Téměř po všech
nefyziologických událostech (mozkové infekce, poranění, hypoxie, toxiny nebo kraniotrauma)
produkují aktivované mikroglie a astrocyty řadu cytokinů včetně IL-1, IL-6, TNFα nebo
TGFβ. Jejich účinek může spočívat v další aktivaci gliových buněk a v gliosis (vzniku nových
mikroglií a astrocytů). Aktivované glie také mozku pomáhají obnovit tkáňovou homeostázu.
Vysoké hladiny cytokinů imunitních odpovědí mohou ovšem přispívat k neuronálnímu
poškození. Myši nadměrně produkující IL-1 a/nebo IL-6vykazují výraznou neurodegeneraci.
Vysoké hladiny těchto cytokinů jsou pozorovány i při Alzheimerově chorobě nebo
roztroušené skleróze, autoimunitním onemocnění vedoucím k degeneraci myelinových
pochev axonů. Kupodivu, jiný cytokin imunitních odpovědí interferon-β (INF-β) je z hlediska
léčby roztroušené sklerózy slibný.
V některých případech vyvolávají cytokiny imunitních odpovědí efekty podobné těm,
které vyvolává CNTF. IL-6 podporuje přežívání některých neuronálních typů, IL-1 podporuje
přežívání neuronů páteřní míchy, předního mozku a v tkáňových kulturách hippokampu.
TGFβ je zřejmě podobně jako CNTF důležitý pro diferenciační procesy vývoje nervové lišty.
Receptory pro IL-1, IL-6, TNFα a TGFβ jsou nejhustěji koncentrovány v oblasti hippokampu
a hypothalamu, kde se jejich ligandy mohou podílet na procesech synaptické plasticity – IL-1
např. zeslabuje hippokampální LTP. Cytokiny imunitních odpovědí mohou rovněž ovlivňovat
rychlost neurogenese a přežití nově vniklých neuronů v gyrus dentatus hippokampu.
10
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
CHEMOKINY
Chemokiny jsou rychle rostoucí rodina malých (8-10 kDa) proteinů, prvně popsaných
v rámci imunitních odpovědí. Jejich vzájemná homologie se pohybuje mezi 20-50%.Byly
např. zkoumány v souvislosti s atraktcí leukocytů do místa zánětu, studována byla i jejich role
ve vlastním zánětlivém procesu. Chemokiny a jejich receptory (všechny spřažené s Gproteiny) jsou ovšem exprimovány i v mozku. Predominantně se vyskytují v mikrogliích,
v menší míře v astrocytech a některých neuronech.
Chemokiny se dělí do několika skupin podle toho,
kolik aminokyselinových zbytků obsahují mezi
dvěma určitými cysteiny své primární struktury.
Většinou obsahují cysteiny v molekule 4, což formuje
jejich typickou 3D strukturu (někdy přirovnávanou k
řeckému písmenu kappa). Disulfidické můstky
obvykle spojují první a třetí resp. druhý a čtvrtý tento
cystein. První dva cysteiny bývají obvykle u N-konce,
třetí cystein uprostřed a poslední na C-konci
molekuly.
CC chemokiny
CC chemokiny (nebo též ß-chemokiny) obsahují dva přilehlé cysteiny bez další
vmezeřené aminokyseliny. U savců jich zatím bylo identifikováno 27. Označují se jako CC
chemokiny 1-28 (CC chemokiny 9 a 10 jsou identické). Chemokiny této skupiny obvykle
obsahují 4 cysteiny, ale některé jích ve své primární struktuře mohou nést až šest (CC
chemokiny CCL1, CCL15, CCL21, CCL23 a CCL28). Indukují migraci monocytů a dalších
buněčných typů jako NK buňky nebo dendritické buňky. Jejich typickým zástupcem je
monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1 nebo CCL2), díky kterému opouštějí monocyty
krevní řečiště, invadují do periferní tkáně a stávají se z nich makrofágy. CCL5 (RANTES)
chemokin atrahuje T-buňky, eosinofily a basofily nesoucí receptor CCR5.
CXC chemokiny
Dva N-koncové zbytky cysteinu jsou u této skupiny chemokinů odděleny jednou
aminokyselinou, reprezentovanou v jejich názvu písmenem „X“. U savců jich zatím bylo
identifikováno 17. Dělí se do dvou skupin: jedna obsahuje specifický aminokyselinový motiv
kyselina glutamová-leucin-arginin (neboli ELR), který leží před prvním cysteinem CXC
motivu , druhá pak ELR sekvenci neobsahuje. .ELR pozitivní CXC chemokiny specificky
indukují migraci neutrofilů. Typickým zástupcem této podskupiny je IL-8.
C chemokiny
Třetí skupina chemokinl je označována jako C nebo také γ chemokiny. Oproti ostatním
chemokinlm obsahují jen dva N-koncové cysteiny a jeden cystein níže položený. V této
skupině byly zatím pospány dva chemokiny, XCL1 (lymphotactin-α) a XCL2 (lymphotactinß). Atrahují prekurzory T-buněk do brzlíku.
11
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
CX3C chemokiny
Čtvrtá chemokinová skupina obsahuje mezi dvěma cysteinovými zbytky tři jiné
aminokyseliny. Zatím byl popsán jen jeden zástupce této podskupin, fractalkin (nebo též
CX3CL). Je secernován na povrch buňky, kde pravděpodobně slouží jako adhezní molekula i
jako atraktant. Role chemokinů v mozku není příliš prozkoumá. Účastní se nejspíše odpovědí
známek zánětu navozeném mukopolysacharidy buněk stěn grampozitivních bakterií.
Co si pamatovat z dnešní přednášky:
⇒ neurotrofické faktory vs. neuropeptidy
⇒ neurotrofické faktory: klasifikace
⇒ neurotrofické faktory: NTF rodina
⇒ neurotrofické faktory: GDNF rodina
⇒ neurotrofické faktory: CNTF rodina
⇒ neurotrofické faktory: cytokiny imunitních odpovědí a CNS
⇒ neurotrofické faktory: chemokiny
⇒ u rodin zástupce a mechanismus působení
12
[email protected]