Praktická cvičení z biologie - ZS - Ústav biologie

Univerzita Palackého v Olomouci
Ústav biologie, Lékařská fakulta
Praktická cvičení z biologie
Zimní semestr
Olomouc 2014
Podpořeno projektem EU:
Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci,
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0088
© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc
2
v20140903
Obsah
1.
2.
3.
4.
5.
Úvodní praktické cvičení ........................................................................................................... 5
1.1
Náplň předmětu ................................................................................................................................. 5
1.2
Bezpečnostní pokyny......................................................................................................................... 5
1.3
Organizační pokyny........................................................................................................................... 5
1.4
Studijní materiály .............................................................................................................................. 5
Mikroskopická technika ............................................................................................................ 6
2.1
Základy pozorování mikroskopických objektů ................................................................................. 6
2.2
Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně) .................................................................. 8
2.3
Měření výšky mikroskopických objektů ........................................................................................... 9
2.4
Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu........................................................................................ 9
2.5
Fluorescenční mikroskopie (demonstračně) ...................................................................................... 9
Mikroorganismy ....................................................................................................................... 10
3.1
Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek .................................................................... 10
3.2
Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek ..................................................................... 10
3.3
Bakterie ústní dutiny........................................................................................................................ 11
3.4
Prokaryontní buňka v nativním preparátu ....................................................................................... 12
3.5
Prokaryontní buňka v trvalém preparátu ......................................................................................... 12
3.6
Lidský vlas napadený dermatofytem ............................................................................................... 13
Struktura buněk, kultivace savčích buněk ............................................................................ 14
4.1
Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových kulturách ........................................... 14
4.2
Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace s buněčnou kulturou ............................ 15
4.3
Pozorování suspenzní buněčné kultury ........................................................................................... 15
4.4
Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu ............................................................... 16
Genetická informace a její změny .......................................................................................... 17
5.1
Replikace ......................................................................................................................................... 17
5.2
Transkripce ...................................................................................................................................... 17
5.3
Translace.......................................................................................................................................... 18
5.4
Transkripce a translace .................................................................................................................... 18
5.5
Komplementarita tripletů................................................................................................................. 18
5.6
Alfa a beta globinový gen ................................................................................................................ 18
5.7
Beta globinový gen .......................................................................................................................... 19
5.8
Genové mutace ................................................................................................................................ 19
5.9
Mechanismus účinku chemomutagenu ............................................................................................ 20
5.10
Hemoglobin srpkovité anémie ......................................................................................................... 20
5.11
Patologický hemoglobin HbC ......................................................................................................... 20
5.12
Posunová mutace ............................................................................................................................. 20
5.13
Spontánní mutace v kultuře bakterií ................................................................................................ 20
3
v20140903
5.14
6.
Mutace a kancerogeneze.................................................................................................................. 21
Proteiny ..................................................................................................................................... 22
6.1
Pozorování precipitovaného patologického hemoglobinu na trvalém preparátu............................. 23
6.2
Demonstrace: Detekce hemoglobinopatie pomocí gelové elektroforézy ........................................ 23
6.3
Imunohistochemická detekce buněčně specifického proteinu ......................................................... 23
6.4
Důkaz hemoglobinu......................................................................................................................... 24
7.
Enzymy ...................................................................................................................................... 25
7.1
Stanovení pH optima aktivity kyselé fosfatázy ............................................................................... 27
7.2
Průkaz slinné amylázy člověka........................................................................................................ 28
7.3
Průkaz peroxidázy v krvi ................................................................................................................. 29
8.
Biomembrány a osmóza........................................................................................................... 30
8.1
Rozpad plazmatické membrány erytrocytů – chemická hemolýza ................................................. 32
8.2
Změna tvaru krvinek v hypertonickém prostředí............................................................................. 33
8.3
Průběh plazmolýzy a deplazmolýzy ................................................................................................ 33
8.4
Vznik nadmolekulární struktury autoorganizací ............................................................................. 34
8.5
Traubeho měchýřek ......................................................................................................................... 35
Buněčný cyklus, mitóza ........................................................................................................... 36
9.
9.1
Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie ............................................................... 37
9.2
Odhadování obsahu jaderné DNA pomocí světelného mikroskopu ................................................ 40
9.3
Mitóza rostlinné buňky .................................................................................................................... 40
9.4
Dělení buněk pučením ..................................................................................................................... 41
10.
Meióza a gametogeneze ........................................................................................................ 42
10.1
Meióza a spermatogeneze u sarančete ............................................................................................. 43
10.2
Spermatogeneze u člověka .............................................................................................................. 45
10.3
Vliv cytostatika na spermatogenezi ................................................................................................. 45
11.
Buněčná diferenciace a apoptóza......................................................................................... 46
11.1
Rýhování zygoty a vývoj zárodku ................................................................................................... 47
11.2
Měření aktivity kaspázy-3 ............................................................................................................... 47
11.3
Pozorování morfologických změn u apoptotických buněk.............................................................. 48
12.
Biologie krve. Krevní elementy ............................................................................................ 49
12.1
Odečet krevního diferenciálu........................................................................................................... 50
12.2
Krevní nátěry ................................................................................................................................... 50
12.3
Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu ............................................................... 50
12.4
Indukce diferenciace nádorových buněk linie K562 ....................................................................... 51
13.
Onkogeny a tumor-supresorové geny (prezentace studentů) ........................................... 52
4
v20140903
1. Úvodní praktické cvičení
1.1
Náplň předmětu
Náplní zimního semestru je buněčná biologie – stručná charakteristika mikroorganismů, dále
biologie živočišné buňky. Učivo navazuje na gymnaziální biologii.
1.2
Bezpečnostní pokyny
Studenti jsou povinni dbát pokynů vyučujícího, s elektrickými vodiči a přístroji zapojenými do
elektrické sítě je nutno manipulovat se zvýšenou opatrností.
Mimořádné události – poranění, rozbití jakéhokoli skla (včetně preparátu), rozlití roztoku, poruchu
přístrojů atd. – studenti neprodleně nahlásí vyučujícímu.
Rozbité sklo se vyhazuje do označené nádoby – mimo běžný odpad.
V učebně pro praktická cvičení je zakázáno jíst a pít.
V učebně se chováme tak, abychom předcházeli případným nehodám. Batohy a tašky na stůl ani do
uličky mezi stoly nepatří.
1.3
Organizační pokyny
Do učebny přicházejí studenti přezuti, v bílém ochranném plášti a včas.
Studenti jsou povinni nastudovat téma pro příslušné cvičení.
Student je osobně odpovědný za svěřené přístroje, nástroje, preparáty a další pomůcky.
Každý student má své stálé pracovní místo.
Z každého cvičení student vypracuje protokol, který obsahuje:
1. název tématu cvičení a datum
2. pro každou úlohu zvlášť protokol obsahuje:
a. název úlohy
b. materiál, pomůcky
c. postup (stručně, heslovitě)
d. výsledek
e. závěr
Nahrazení zameškaného praktika je možné ve stejném výukovém týdnu po domluvě s vyučujícím,
případně na konci semestru. Na konci semestru lze nahradit nejvýše 5 cvičení. Náhradu více než 5
cvičení na konci semestru musí schválit studijní oddělení.
1.4
Studijní materiály
Jako studijní materiály pro zimní semestr slouží toto skriptum, dále prezentace ze cvičení a
prezentace z přednášek (vše je průběhu semestru dostupné na webu Ústavu biologie). Kromě těchto
výukových materiálů je doporučeno nastudovat příslušné kapitoly z učebnice Alberts, Bray,
Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter: Základy buněčné biologie.
5
v20140903
2. Mikroskopická technika
Cíl cvičení
Seznámit se s ovládáním mikroskopu, osvojit si základy správného mikroskopování, správného
záznamu pozorování v mikroskopu, pochopit souvislosti nastavení jednotlivých parametrů
mikroskopu s kvalitou obrazu u různých druhů pozorovaných objektů.
2.1
Základy pozorování mikroskopických objektů
Materiál
Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) nebo akvarijní rostlina Elodea
canadensis nebo Egeria densa, suspenze fixovaných buněk linie K562, nůžky, pinzeta, Pasteurova
pipeta, automatická pipeta, špičky.
Postup
1) Příprava nativního preparátu
Na čisté podložní sklo nakápněte kapku vody. Z lodyžky mechové rostlinky utrhněte jeden
lístek, pomocí pinzety nebo preparační jehly ho ponořte pod hladinu kapky a překryjte
podložním sklem. Odstraňte přebytečnou tekutinu ústřižkem buničiny, aby krycí sklo
„neplavalo“, ale ne příliš, aby pod krycím sklem nevznikly prázdné plochy bez vody.
2) Zaostření objektivem 10× zvětšujícím
a) Zapněte osvětlení mikroskopu, otáčením šroubu pro hrubý posuv („makrošroub“) snižte
stolek a zařaďte do optické osy objektiv 10× zvětšující. Na stolek upevněte preparát
a nastavte ho tak, aby byl lístek v ose paprsků, vycházejících z kondenzoru. Lístek lépe
uvidíme, když zesílíme jas žárovky. Nastavte aperturní clonu na kondenzoru do přibližné
pozice pro příslušný objektiv.
b) Otáčením šroubu pro hrubý posuv posuňte stolek mikroskopu úplně nahoru. Pozorujte
obraz v okulárech mikroskopu a zároveň postupně otáčejte šroubem pro hrubý posuv
(stolek se bude pomalu posouvat dolů) až do chvíle, kdy přibližně zaostříte. U objektivu
10× zvětšujícího je vzdálenost mezi objektivem a preparátem větší a nemusíte se obávat,
že byste při zaostřování poškodili preparát nebo objektiv vzájemným nárazem.
c) Šroubem pro jemný posuv („mikrošroub“) doostřete. Pokud je obraz příliš jasný
(přezářený), ztlumte jas žárovky točítkem v noze stativu. Posunem stolku upravte polohu
preparátu tak, aby obraz buněk lístku zcela vyplňoval zorné pole.
3) Plynulý přechod na vyšší zvětšení
a) Pozorovaný objekt nastavte do středu zorného pole a můžete postupně přecházet na jiná
zvětšení (objektivy 20× a 40× zvětšující; případně imerzní objektiv 100× zvětšující).
Všechny objektivy jsou plynule zaměnitelné, takže při přechodu na jiná zvětšení pouze
otáčíte revolverovým měničem a tím měníte objektiv. Při zařazení objektivu do optické
osy mikroskopu revolverový měnič jemně zacvakne v této pozici. Imerzní objektiv zatím
nepoužívejte.
b) Uvědomte si, že více zvětšující objektiv poskytuje obraz s menší hloubkou ostrosti. Při
přechodu na vyšší zvětšení je třeba následně doostřit obraz šroubem pro jemný posuv.
Upravte nastavení clony na kondenzoru podle použitého objektivu. Pokud je obraz příliš
jasný nebo tmavý, upravte jas žárovky točítkem v noze stativu mikroskopu.
4) Význam správného nastavení mikroskopu pro optimální zobrazení
6
v20140903
a) Zařaďte do optické osy mikroskopu objektiv 40× zvětšující, doostřete a nastavte správně
clonu na kondenzoru, upravte jas žárovky. Nyní si všimněte obrazu v mikroskopu – jak
vypadají jednotlivé chloroplasty, jak vidíte buněčnou stěnu.
b) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 4× zvětšující) a úbytek světla
kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz s předchozím (správným)
zobrazením.
c) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 100× zvětšující) a přebytek
světla kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz se správným zobrazením
buněk. Zapište pozorované rozdíly.
d) Nativní preparát mechu sundejte ze stolku mikroskopu (stolek nechejte v posledně
nastavené poloze, nesnižujte ho) a tento preparát si zatím odložte. Nyní místo nativního
preparátu mechu použijeme suspenzi fixovaných buněk buněčné linie K562. Na čisté
podložní sklíčko naneseme automatickou pipetou 10 µl buněčné suspenze fixovaných
nebarvených buněk. Kapku překryjte krycím sklíčkem. Stolek mikroskopu nesnižujte ani
jej nezvedejte. Použijte objektiv 10× nebo 20× zvětšující pro zaostření – pokud jste
stolek mikroskopu neposunuli dolů nebo nahoru, stačí doostřit šroubem pro jemný posuv.
Upravte správně clonu kondenzoru (na hodnotu odpovídající použitému objektivu) a jas
žárovky. Všimněte si, jaké struktury jste schopni rozeznat v nebarvené buňce. Nyní
nastavte clonu kondenzoru postupně do obou krajních poloh a změny v intenzitě
osvětlení kompenzujte regulací jasu žárovky stejně jako v bodech 4b), 4c). Zapište
výsledky pozorování.
5) Do protokolu zodpovězte tyto otázky:

Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením barevných objektů (lístek
mechu)?

Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením nebarevných objektů
(nebarvené buňky linie K562)?

Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a kontrastem obrazu?

Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a hloubkou ostrosti? Pozn.: pro správné
posouzení změn hloubky ostrosti je nutné pozorovat dostatečně „silný“ objekt při
zvětšení 40×.

Jaký vliv má zesílení nebo zeslabení zdroje světla na všechny výše zmíněné
parametry obrazu (zobrazení barevných a nebarevných objektů, kontrast a hloubku
ostrosti)?

Jaký je vztah mezi použitým zvětšením a částí preparátu, která je zobrazena
v zorném poli okuláru?
6) Výstižný a nezkreslený záznam pozorování
Vezměte opět nativní preparát mechu a na základě souvislostí poznaných v bodě 4) nastavte
optimální zobrazení pozorovaného objektu (rostlinného pletiva lístku) a zakreslete do
protokolu. Respektujte následující zásady pro výstižný a nezkreslený záznam pozorování:
 pokud se objekt pozorování skládá ze stejných objektů (např. pletivo z buněk),
zaznamenávejte obraz jen jednoho objektu
 obraz kreslete dostatečně velký (na formátu A4), využijte celou šířku stránky
 protože se zobrazení objektu mění se změnou parametrů optického systému,
zaznamenávejte jen charakteristické vlastnosti, které jsou málo závislé na nastavení
mikroskopu
př.: nemá smysl zachycovat vzhled buněčné stěny stínováním, vystihujícím momentální
7
v20140903
kontrast obrazu; smysl má jednoduchá čára (resp. dvojčára) jako reprezentativní obraz
buněčné stěny (jde nám o záznam schematicky věrného obrazu, nikoli o přesnou
reprodukci nebo uměleckou impresi)
 při záznamu sledujte a zachovávejte správné proporce – má-li např. v obraze kulovitý
chloroplast průměr cca dvojnásobný oproti tloušťce buněčné stěny, musí být tento
poměr správně reprodukován i ve schematickém nákresu; je-li např. při okrajích buňky
více chloroplastů než ve středu, zachovejte tuto distribuci i ve svém nákresu (přesná
poloha jednotlivých chloroplastů samozřejmě nemusí být reprodukována, v každé buňce
je jiná)
 není nutné zaznamenávat objekty barevně; stačí černobílý nákres se slovní poznámkou
o barevnosti objektů
 je správné zaznamenat ke každému obrázku celkové zvětšení mikroskopu (uvědomte si
však, že jste obraz dále sekundárně subjektivně zvětšili při záznamu na papír)
2.2
Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně)
Materiál
Optický mikroskop s digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, podložní a krycí skla, mech
měřík (Mnium sp.)
Postup
Moderní mikroskopy mohou být vybaveny digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, které
umožňují zaznamenávat obraz skládající se z jednotlivých obrazových bodů (pixelů). Podle
rozlišení tohoto systému se obraz skládá z většího či menšího počtu obrazových bodů. S použitím
vhodného software pak můžeme určit velikost struktur i jejich plochu (software zaznamená počet
obrazových bodů – na délku nebo plošně). Skutečná velikost obrazového bodu je relativní – závisí
na použitém zvětšení mikroskopu.
Pro každý objektiv je nutné po instalaci software provést kalibraci pomocí objektivního měřítka
(jako měřítko slouží podložní sklo s vyrytými vrypy o rozestupech 10 µm). S použitím konkrétního
objektivu zobrazíme pomocí software obraz tohoto měřítka na monitoru počítače. Dále pomocí
myši označíme vybraný počet dílků měřítka (např. 40 dílků; každý dílek měří 10 µm) a jako údaj
pro kalibraci objektivu uvedeme, že délka zvoleného „objektu“ je 400 µm (40×10). Systém
zaznamená počet obrazových bodů, odpovídající při daném zvětšení a rozlišení např. vzdálenosti
úsečky 400 µm. Přepočtem poté program určí relativní velikost obrazového bodu (při použití tohoto
konkrétního objektivu) a přepočítá velikost struktur při vlastním měření na hodnotu uvedenou v µm
podle toho, kolika obrazovým bodům odpovídá velikost určitého objektu. Tento postup je třeba
zopakovat pro všechny objektivy mikroskopu.
Pokud již máme celý systém nakalibrovaný, můžeme jednoduchým způsobem měřit velikost
objektů pozorovaných v mikroskopu pomocí software – myší klikneme na ikonu měření objektů,
dále ve vyfotografovaném obrazu označíme počátek a konec měřeného objektu a do objektu se
automaticky vloží úsečka s údajem o délce měřené struktury. Je však třeba vždy před měřením
zkontrolovat, zda jsme v software správně zvolili použitý objektiv.
8
v20140903
2.3
Měření výšky mikroskopických objektů
Materiál:
Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.)
Postup:
a) Na stolek mikroskopu znovu umístěte nativní preparát mechu měříku. Zaostřete nejprve
objektivem 10× zvětšujícím a poté otáčením revolverového měniče vyměňte za objektiv 40×
zvětšující. Nastavte správné osvětlení (nastavením clony a regulací jasu žárovky). Doostřete
obraz mikrošroubem.
b) Několikrát mikrošroubem otáčejte v obou směrech a všímejte si, které chloroplasty vidíte
zaostřeně a které vidíte rozostřeně. Chloroplasty, které zaostříte jako první a poslední, jsou
chloroplasty na úplném vrchu a spodu buňky (záleží na směru otáčení mikrošroubu, zda
nejprve zaostříte chloroplasty na vrchu nebo na spodu buňky).
c) Mikrošroubem zvedněte stolek mikroskopu právě tak, aby byl ostře zobrazen povrch buňky.
Obraz buněčné stěny je rozmazaný, ostře jsou zobrazeny chloroplasty ve svrchní části buňky.
Odečtěte polohu mikrošroubu podle stupnice na pravém mikrošroubu a rysky na pravém
makrošroubu.
d) Nyní pomocí mikrošroubu zaostřete na spodek buňky. Znovu odečtěte polohu mikrošroubu.
Spočítejte, o kolik dílků jste pootočili mikrošroubem. 1 dílek odpovídá zdvihu/snížení stolku
o 2,5 µm. Počet dílků vynásobte koeficientem 2,5 a získáte výšku buňky v µm.
Praktický význam
Všimněte si, že při spodním, středním a horním zaostření určité buňky získáte o této buňce různý
obraz, tedy nestejné informace. Mluvíme o horní, střední a spodní rovině ostrosti. Jsou to tři hlavní
optické roviny z velkého počtu možných optických rovin „protínajících“ objekt při zvedání a
snižování stolku mikroskopu. Při pozorování preparátu stále doostřujte (jemně pohybujte
mikrošroubem), jinak by byla vaše informace o objektu neúplná. Nahrazujete tím akomodaci
lidského oka; optická soustava mikroskopu sama akomodovat „neumí“.
2.4
Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu
Cíl úkolu
Definovat konkrétní omezení rozlišovací schopnosti používaného mikroskopu.
Určete konkrétní rozlišovací schopnost mikroskopu při použití „suchých“ objektivů 10× a 40×
zvětšujících a imerzního objektivu 100× zvětšujícího (imerzní objektiv se používá s imerzním
olejem – index lomu cca 1,5).
2.5
Fluorescenční mikroskopie (demonstračně)
9
v20140903
3. Mikroorganismy
Studijní příprava
Hierarchie živých soustav podle složitosti jedinců. Buňky prokaryontní a eukaryontní. Biologie virů
– virion, virový genom, reprodukce virů. Virogenie.
Cíl cvičení
Seznámíme se s charakteristickými znaky vybraných mikroorganismů.
Kontrolní otázky:
1. Jaké jsou hlavní rozdíly mezi prokaryontní a eukaryontní buňkou?
2. Jak rychlé může být dělení bakterií? Jaké jsou důsledky? (množství buněk, evoluce)
3. Mohou se viry množit v mrtvých buňkách? Zkuste vysvětlit váš závěr.
3.1
Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek
Materiál
Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem (SGA nebo krevní agar), které byly před týdnem
ponechány 5-15 min. odkryté (na různých místech).
Příprava SGA (studenti neprovádějí): 40 g glukózy/l; 10 g peptonu/l; 0,4 g kvasničného lyzátu/l;
15 g agaru/l. Po rozmíchání se vše autoklávuje (sterilizace v páře; 15 min při 121°C). Po částečném
zchladnutí (na cca 60-80°C) se médium rozlije do sterilních Petriho misek (ve sterilním prostředí).
Příprava krevních agarů (studenti neprovádějí): složení vychází ze ztužených kultivačních médií; po
autoklávování a částečném ochlazení (na cca 50°C) je přidáno cca 5-10 % defibrinované krve.
Postup
Petriho misky s kultivačním médiem byly odkryty na 5-15 min a ponechány na různých místech
(např. na lavici, na parapetu, na podlaze). Po odkryvu byly misky zavřeny, popsány a loženy
v termostatu s teplotou nastavenou na 37°C. Po nárůstu kolonií mikroorganismů ze achycených
buněk a spor byly misky přemístěny do pokojové teploty nebo do lednice (podle míry nárůstu
kolonií). Při hodnocení misky neotvíráme, hodnotíme pouze pohledem přes víko.
Výsledek
Zapíšeme, jaké typy kolonií mikroorganismů jsme pozorovali v miskách (např. kolonie vláknitých
hub, kolonie solidní; popíšeme velikost, barvu kolonií). Snažíme se spočítat nebo alespoň
odhadnout počet kolonií na misce.
3.2
Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek
Materiál
Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla roztěrem naočkována bakteriální
kultura (například Escherichia coli); Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla
roztěrem naočkována kultura kvasinky rodu Candida.
Postup
Naočkování bakteriální nebo kvasinkové kultury se provádí ve sterilním boxu na sterilní kultivační
médium v Petriho misce. Sterilní kličku lehce otřeme o bakteriální (kvasinkovou) kolonii narostlou
na kultivačním médiu a touto kličkou provedeme několik souběžných tahů po povrchu nového
sterilního média. Kličku sterilizujeme ožehnutím v plameni kahanu a po jejím vychladnutí
10
v20140903
provedeme opět několik souběžných tahů kličkou tak, že vycházíme přibližně z místa, kde jsme
skončili první tahy kličkou. Posléze ještě můžeme postup jednou nebo dvakrát zopakovat. Petriho
misku zavřeme a necháme kultivovat v termostatu při vhodné teplotě (E. coli při teplotě 37°C)
několik dní (zpravidla 2-5).
Komentář
Zmíněný postup je užíván v mikrobiologii pro přípravu tzv. bakteriálních nátěrů; obdobně se
zpracovávají i některé kvasinky (např. rodu Candida). Cílem může být např. získání jednotlivých
kolonií na konci stopy nátěru. Tak můžeme dále odebrat bakterie (kvasinky) pouze z jediné kolonie
a dále je kultivovat, získáváme tak bakteriální (kvasinkový) klon pocházející z jediné původní
buňky.
3.3
Bakterie ústní dutiny
Materiál a chemikálie
Sterilní vatový tampon na špejli, sterilní fyziologický roztok (0,9% roztok NaCl), roztok
karbolfuchsinu (0,025 %), mikroskopické potřeby, mikroskop.
Příprava roztoku karbolfuchsinu (studenti neprovádějí): do 10 ml 70% etanolu přidáme 0,5 g
krystalického karbolfuchsinu, rozdrtíme jej skleněnou tyčinkou a zamícháme. Přidáme 90 ml
destilované vody. Získáme 0,5 % zásobní roztok karbolfuchsinu. Tento zásobní roztok naředíme
20× destilovanou vodou (získáme tak 0,025% pracovní roztok karbolfuchsinu). Místo krystalického
karbolfuchsinu lze použít také krystalický zásaditý fuchsin; potom bychom ale při přípravě
zásobního roztoku museli použít místo destilované vody 5% vodný roztok fenolu.
Postup
Tampon namočíme do fyziologického roztoku. Jemně (ale dostatečně) jej přitlačíme na bukální
sliznici ústní dutiny a táhlým pohybem provedeme stěr. Setřené částečky sliznice přeneseme na
suché podložní sklo otiskem tamponu: tampon lehce přitlačíme k podložnímu sklu a valivým
pohybem jej otáčíme tak, aby se otisknul po celém obvodu na sklo. Pozor: buňky jsou ploché
a snadno se deformují. Přikápneme 0,025% roztok karbolfuchsinu. Přikryjeme krycím sklem
a necháme preparát probarvit. Je třeba dát pozor na vysychání preparátu (můžeme na podložní
sklíčko k okraji krycího sklíčka přikápnout kapku barviva).
Pozorujeme nejdříve za půl hodiny (případně i za hodinu, podle stáří připraveného roztoku barviva),
kdy začíná být dostatečné i probarvení bakterií. Při pozorování nejprve najdeme s objektivem 10×
zvětšujícím oblast, kde se nachází nejvíce epiteliálních buněk zbarvených růžově až červeně;
vyměníme objektiv za 40× zvětšující a pozorně prohlédneme jednotlivé epiteliální buňky.
Nespěcháme při pozorování, pozorně si prohlížíme buňky v preparátu a současně jemně
proostřujeme mikrošroubem; neustálé proostřování je důležité, abychom mohli vidět bakterie na
povrchu buněk (bakterie jsou zbarveny temně fialově). Máme-li zaostřeno např. na jádro epiteliální
buňky, nejsou již bakterie na jejím povrchu zaostřené (leží mimo hloubku ostrosti) a můžeme se
mylně domnívat, že na povrchu buňky žádné bakterie nejsou.
Výsledek
Zakreslíme a popíšeme epitelovou buňku bukální sliznice (pokud možno nedeformovanou) i jádrem
a viditelnými organelami; zakreslíme také schematicky bakterie kolonizující povrch této buňky
(podle našeho pozorování). Při zhotovení nákresu dbáme na zachování poměru velikostí bakteriální
buňky a epitelové buňky včetně jejích organel.
11
v20140903
3.4
Prokaryontní buňka v nativním preparátu
Materiál
Kultura bakterií (nepatogenních), např. Clostridium butyricum (bakterie máselného kvašení);
mikroskopické potřeby, mikroskop.
Příprava kultury bakterií (studenti neprovádějí): Nakrájíme neloupané a nemyté brambory na
kostičky (o velikosti cca 0,5 cm) a naplníme jimi asi 1/3 Erlenmeyerovy baňky (250 ml). Přidáme
1 g CaCO3 a přelijeme vodou (do 2/3 baňky). Baňku zahřejeme na teplotu 80°C (10 min) – tím
usmrtíme méně odolné spory jiných druhů mikroorganismů. Baňku opatříme zátkou z buničiny a po
vychladnutí kultivujeme ve tmě při pokojové teplotě. Po 2-3 dnech by mělo být přítomno
dostatečné množství bakterií. V kultuře dominují bakterie Clostridium butyricum.
Postup
Z kultury bakterií si připravíme nativní preparát. Preparát orientačně prohlédneme menším
zvětšením (objektiv 20× zvětšující), podrobněji si bakterie prohlédneme větším zvětšením (objektiv
40× zvětšující). Ke kapce bakteriální suspenze je také možno přikápnout 0,025% roztok
karbolfuchsinu. Bakterie přidáním roztoku karbolfuchsinu usmrtíme a přestanou se pohybovat,
můžeme tak lépe pozorovat jejich tvar. Optimálně by byly probarveny až po 20-30 min.
Výsledek
Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti.
3.5
Prokaryontní buňka v trvalém preparátu
Materiál
Trvalé preparáty bakterie Escherichia coli a Staphylococcus sp. obarvené podle Grama; imerzní
objektiv a olej, papírky na čočky, benzin (etanol), mikroskopické potřeby, mikroskop.
Postup
Pro orientační prohlédnutí preparátu použijeme nejprve objektiv zvětšující 20×, dále objektiv
zvětšující 40× a s tímto objektivem doostříme. Ve výrazně obarveném bakteriálním nátěru se
snažíme najít slabší vrstvu (bude se při pozorování v mikroskopu jevit jako nejsvětlejší) anebo
okraje silnější vrstvy.
Následně prohlížíme bakterie imerzním objektivem:
 pootočíme revolverový měnič objektivů, ale objektiv 100× zvětšující nezařadíme do
optické osy – necháme jej mírně vychýlený
 na krycí sklíčko kápneme 1 kapku imerzního oleje; dbáme na to, abychom olejem
neznečistili objektiv 40× zvětšující
 nyní dokončíme zařazení imerzního objektivu do optické osy mikroskopu – opatrně
pootočíme revolverovým měničem objektivů tak, abychom měli imerzní objektiv
ponořený do kapky oleje (revolverový měnič jemně zacvakne)
 nastavíme clonu na kondenzoru
 velmi opatrně zaostříme obraz šroubem pro jemný posuv; imerzní objektiv má velmi
krátkou pracovní vzdálenost (cca 0,1 – 0,2 mm) !!!
Nyní již nepoužívejte pro pozorování stávajícího preparátu objektiv zvětšující 40× (tento objektiv
byste díky jeho krátké pracovní vzdálenosti namočili do imerzního oleje)
12
v20140903
Po ukončeném pozorování vychýlíme imerzní objektiv na stranu a suchým čtverečkem buničiny
velmi jemně setřeme olej z objektivu (na objektiv netlačíme). Pro dokonalé setření zbytku oleje
nový kousek buničiny mírně navlhčíme etanolem a opět otřeme; nakonec čočku utřeme do sucha
čistým čtverečkem buničiny.
Výsledek
Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti.
Komentář
Bakterie E. coli jsou gramnegativní (G-), bakterie rodu Staphylococcus jsou grampozitivní (G+)
bakterie. Toto barvení pouze rozlišuje bakteriální buňky na tzv. G- nebo G+ podle biochemického
složení buněčné stěny.
3.6
Lidský vlas napadený dermatofytem
Materiál
Trvalý preparát normálního lidského vlasu a vlasu napadeného in vitro dermatofytem Microsporum
gypseum nebo Trichophyton ajelloi; mikroskopické potřeby.
Postup
Při slabém a středním zvětšení prohlédneme preparáty zdravých lidských vlasů a vlasů napadených
dermatofyty. Popíšeme rozdíly mezi normálním a napadeným vlasem. Zakreslíme část normálního
a destruovaného vlasu při středním zvětšení.
Výsledek
Do protokolu zakreslíme vlas napadený dermatofytem.
13
v20140903
4. Struktura buněk, kultivace savčích buněk
Teoretický úvod
Kultivace buněk a tkání in vitro (tj. tzv. „ve skle“, tedy ve zkumavce, mimo živý organismus) se
stala rutinní a důležitou metodou v medicínském výzkumu i v diagnostické praxi. Ve výzkumu se
kultivace buněk in vitro používá např. ve farmakotoxikologii, při vývoji a testování nových léčiv.
V klinické praxi se např. kultivací krevních kmenových buněk standardně vyhodnocuje kvalita tzv.
štěpu pro transplantaci kostní dřeně.
Co jsou buněčné (příp. tkáňové) kultury?
V buněčných kulturách kultivujeme buňky mimo organismus v kultivačních médiích.
V tkáňových kulturách kultivujeme mimo organismus část tkáně (tzv. tkáňový explantát).
V buněčných kulturách již buňky nejsou dále organizovány do podoby tkáně a rostou jednotlivě.
Buňky rostou ve speciálních plastových miskách nebo lahvích buď volně v roztoku (např. různé
krevní buňky) nebo se přichycují (adherují) k povrchu plastikové misky či láhve (např. fibroblasty,
tj. buňky vaziva).
Primární buněčná kultura je tvořena buňkami, které byly odebrány z orgánů nebo tkání a byly
přímo nasazeny do kultivačního média. Takovéto buňky mohou v kulturách přežívat jen krátkou
dobu (dny, max. týdny), během které se mohou dělit a diferencovat, poté zaniknou. Jako každá
savčí buňka mají totiž omezený potenciál dělení, jsou „smrtelné“. Naopak „nesmrtelné“
(imortalizované) buněčné linie se mohou neomezeně dlouho dělit a proto je lze tzv. pasážovat
(přenesením části buněk z jedné kultivační nádoby do druhé), mají neomezený potenciál dělení.
Imortalizace buněk lze dosáhnout chemickými nebo fyzikálními karcinogeny, příp. virovou infekcí.
Někdy může dojít k tomuto jevu spontánně. Transformované buněčné linie jsou imortalizované
a navíc vykazují vlastnosti nádorových buněk .
Co obsahují kultivační média?
Savčí, tedy i lidské buňky rostou in vitro v médiích, která svým složením napodobují vnitřní
prostředí organizmu, a proto obsahují: zdroj energie (glukózu), minerální látky, aminokyseliny,
vitamíny a některé doplňkové látky (glutathion, lipidy, aj.), sérum (nejčastěji hovězí) jako zdroj
stimulačních růstových faktorů a hormonů, pufr na bázi uhličitanu a barevný indikátor citlivý na
změnu pH. Do kultivačních médií také většinou přidáváme antibiotikum a antimykotikum,
abychom buněčnou kulturu ochránili před bakteriální nebo plísňovou infekcí.
Standardní vybavení laboratoře tkáňových kultur:
Sterilní boxy s laminárním prouděním vzduchu: slouží k dodržení aseptických podmínek při
manipulaci s buněčnou kulturou.
CO2 inkubátory: savčí buňky jsou kultivovány při teplotě 37°C v 5-10% CO2 atmosféře (pro
udržení neutrálního pH) a při vysoké vlhkosti prostředí.
Centrifugy, sady pipet, inverzní mikroskop pro tkáňové kultury.
4.1
Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových
kulturách
Životaschopnost buněk je jedním ze základních parametrů, které se posuzují při práci s buněčnými
nebo tkáňovými kulturami. Například při zakládání buněčných kultur by viabilita buněk měla
dosahovat minimálně 90 %. Jako kritérium životaschopnosti buněk se nejčastěji používá
neporušenost jejich cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají neporušenou (intaktní)
cytoplazmatickou membránu, která volně nepropouští ani malé molekuly nesoucí kladný nebo
záporný náboj. Pro posouzení intaktnosti se proto používají různá barviva s nízkou molekulovou
hmotností, jež nesou aspoň jeden kladný nebo záporný náboj a barví buď bílkoviny, nebo DNA.
14
v20140903
Takové barvivo pak „obarví“ pouze buňky, do kterých může vniknout, tj. mrtvé buňky s porušenou
membránou. Podle povahy barviva lze viabilitu buněk posuzovat buď ve světelném, nebo
fluorescenčním mikroskopu.
Chemikálie, biologický materiál:
2% (w/v) roztok eosinu ve vodě, dvě buněčné suspenze (buněčná linie K562 nebo HL60) – jedna
s viabilními buňkami, druhá ovlivněná látkou, která indukuje buněčnou smrt.
Postup:
1. Do mikrozkumavky napipetujeme 200 µl buněčné suspenze a přidáme 10 µl 2% eosinu
a protřepeme.
2. Po 5 min stání při laboratorní teplotě naneseme 10 µl obarvené suspenze na podložní sklíčko,
překryjeme krycím sklíčkem a přebytek tekutiny odsajeme.
3. Pozorujeme pod mikroskopem (zvětšení 100× až 200×) alespoň 200 buněk. Živé buňky se
nebarví (zeleně opaleskují), mrtvé buňky jsou zbarveny červeně.
4. Spočítáme živé a mrtvé buňky a vyjádříme procentový podíl živých buněk.
4.2
Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace
s buněčnou kulturou
Buňky adherentních buněčných linií mají typicky protáhlý nebo cípatý tvar. V kulturách takto
rostou např. fibroblasty (buňky vaziva), endoteliální buňky (buňky vnitřní výstelky cév) nebo buňky
hladkého svalstva. Z krevních buněk adherují k povrchům monocyty. Buňky, které neadherují
k povrchům a rostou v médiu volně, mají zaoblený tvar a jsou většinou odvozeny z krevních
lymfocytů nebo myeloidních krevních buněk.
Přichycení buněk k povrchu je zprostředkováno extracelulárními proteiny (tzv. adhezivními
proteiny) a ionty vápníku. Přichycené buňky se od plastu uvolní buď mechanicky nebo enzymaticky
pomocí roztoku trypsinu a EDTA. Trypsin je proteolytický enzym ze slinivky břišní, který štěpí
různé typy proteinů včetně povrchových buněčných proteinů. EDTA je chelatační činidlo, které
váže ionty vápníku, což vede k narušení vazby adhezivních buněčných molekul k povrchu.
Chemikálie, biologický materiál
Roztok trypsinu/EDTA v kultivačním médiu, plastové misky s kulturami savčích buněk.
Postup
1. Savčí buňky rostly na miskách v kultivačním médiu, v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2
atmosféře. Budeme pozorovat dva různé typy buněčných linií: volně v médiu rostoucí buňky
(nepřichycené k povrchu) a buňky přichycené k povrchu plastikové misky (adherentní).
2. Odejmeme vrchní díl plastové Petriho misky a pozorujeme buňky v růstovém médiu při
zvětšení 100× (10× objektivem) a při téměř úplném zaclonění. Dbáme na to, abychom objektiv
nesmočili v médiu. Popíšeme a zakreslíme morfologický typ pozorovaných savčích buněk.
3. U misky s adherentní buněčnou linií odsajeme médium buničitou vatou (přiložíme ji ze strany
kapky) a místo s přichycenými buňkami zakápneme 50 μl roztoku trypsinu, vyhřátého na 37°C.
Po 2-5 min pozorujeme v mikroskopu jako v bodě 2. Po 5 min můžeme reakci zastavit přidáním
100 μl 1% roztoku hovězího (bovinního) sérového albuminu (BSA).
4.3
Pozorování suspenzní buněčné kultury
K562 je příkladem neadherující buněčné linie. Jedná se o první lidskou imortalizovanou
leukemickou linii odvozenou již v roce 1975 z krevních buněk pacientky s chronickou myeloidní
15
v20140903
leukémií (CML). Buňky linie K562 mají kulatý tvar a rostou volně v médiu. Tato buněčná linie má
rozsáhlé použití v buněčné a molekulární biologii, např. v testech tumorigenicity a cytotoxicity
nebo pro testování protinádorových léčiv, atd.
4.4
Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu
Dělící se buňky v polotuhém médiu mají omezený pohyb, dělící se buňky vytvářejí kolonie (kolonie
= potomstvo jedné dělící se buňky, klon). U krevních buněk můžeme pozorovat hemoglobinizované
kolonie červených krvinek a kolonie různých typů bílých krvinek.
Chemikálie, biologický materiál
Metylcelulozové kultivační médium, hematopoetické (= krvetvorné) růstové faktory, prekurzory
lidských krevních buněk
Plastové misky s kulturami lidských krevních buněk
Postup
Prekurzory lidských krevních buněk byly smíchány s metylcelulozovým médiem a do kultury byly
přidány hematopoetické růstové faktory, které umožnily růst a diferenciaci krevních prekurzorů do
jednotlivých krevních buněčných typů. Kolonie krevních buněk rostly na miskách v polotuhém
kultivačním médiu v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2 atmosféře po dobu 10 až 14 dnů. Při
zvětšení 100× (použití 10× zvětšujícího objektivu) budeme pozorovat různé typy kolonií krevních
buněk. Zakreslíme.
Otázky
1. Co obsahuje kultivační médium?
2. Jaký typ buněčných kultur se jednalo v dnešním cvičení (primární buněčné kultury nebo
imortalizovaná buněčná linie)?
3. Můžeme na základě morfologického tvaru buněk odhadnout buněčný typ, příp. tkáň, ze
kterého byla příslušná buněčná linie odvozena?
4. Proč jsme použili k uvolnění adherentních buněk trypsin?
Literatura
Vachtenheim J., Duchoň J.: Molekulární biologie pro mediky a lékaře. Karolinum Praha, 1992.
16
v20140903
5. Genetická informace a její změny
Studijní příprava
Paměťový systém buňky. Exprese genetické informace. Transkripce. Translace. Replikace DNA.
Genetický kód. Šum v genetické informaci – mutace. Mutagenní faktory. Genové mutace, jejich
molekulární podstata a důsledky. Detekce mutací v molekulách DNA.
5.1
Replikace
Níže uvedený obrázek znázorňuje replikační vidlici (část replikačního oka):
T - G - G - C - A - T 3´
A
C
A
G
T
A
5´ A - G - T - T
3´ T - C - A - A
T
A
C
T
G
T
A - C - C - G - T - A 5´
Přiřaďte příslušné nukleotidy (označené písmeny) k odděleným polynukleotidovým řetězcům
replikující se molekuly DNA. Určete, který řetězec je starý a který nový.
Může replikace DNA v buňce probíhat takovým jednoduchým přiřazováním nukleotidů? Uveďte,
jak se liší skutečná replikace od našeho modelu.
5.2
Transkripce
a) Zařazení aminokyseliny cysteinu do bílkovinné molekuly je v nekódujícím (matričním,
templátovém) vlákně DNA určeno tripletem ACA. Určete odpovídající triplet v mRNA.
b) Triplet TTC na nekódujícím vlákně DNA určuje aminokyselinu lysin. Určete lysinový triplet v
mRNA.
Proč se asi sekvence genu uvádí (publikuje) v podobě přítomné na kódujícím vlákně, když se při
transkripci kopíruje vlákno protější (nekódující vlákno = matriční)?
17
v20140903
5.3
Translace
Polypeptidový řetězec obsahuje v jednom úseku pět aminokyselin:
- arginin - glycin - fenylalanin - histidin - tyrosin a) Jaké jsou odpovídající triplety (kodóny) v mRNA, když víme, že arginin je na úrovni
kódujícího vlákna DNA určen tripletem AGA, glycin GGA, fenylalanin TTT, histidin CAT a
tyrosin TAC?
a) Kolika molekul tRNA je zapotřebí k zařazení těchto aminokyselin? Určete antikodóny, které
obsahují.
5.4
Transkripce a translace
Část polypeptidového řetězce obsahuje tuto sekvenci aminokyselin:
- valin - cystein - glycin - kys. glutamová
Valin je v mRNA kódován tripletem GUA, cystein UGU, glycin GGC, kys. glutamová GAA.
a) Jaké triplety odpovídají těmto aminokyselinám v chromozomové DNA? Vezměte v úvahu
existenci obou komplementárních vláken – kódujícího a nekódujícího.
5.5
Komplementarita tripletů
Část molekuly inzulínu obsahuje sekvenci aminokyselin, které jsou spolu s odpovídajícími kodóny
mRNA uvedeny v tabulce. Uveďte, jaké triplety těmto aminokyselinám odpovídají v tRNA a obou
vláknech DNA.
aminokyselina
mRNA
leucin
CUU
tyrozin
UAU
leucin
CUA
valin
GUA
cystein
UGU
glycin
GGU
k. glutamová
GAA
arginin
CGU
glycin
GGC
fenylalanin
UUU
5.6
antikodon tRNA
nekódující
vlákno DNA
kódující vlákno
DNA
Alfa a beta globinový gen
Alfa globin (součást lidského hemoglobinu) je polypeptid obsahující 141 aminokyselin. Je kódován
genem v chromozomu 16. Jak veliký je tento gen? (uveďte počet nukleotidů) Beta globin lidského
hemoglobinu je polypeptid obsahující 146 aminokyselin. Je kódován genem v chromozomu 11. Jak
veliký je tento gen? Uveďte počtem nukleotidů.
18
v20140903
Odpovídá údaj o délce genu, který jste vypočítali, skutečnosti? (Záleží na definici genu –
rozeberte.)
5.7
Beta globinový gen
Začátek beta řetězce hemoglobinu obsahuje tuto sekvenci aminokyselin:
1
NH2 - val
2
3
4
5
6
7
8
his
leu
thr
pro
glu
glu
lys
S použitím tabulky genetického kódu určete odpovídající sekvenci tripletů v genu pro beta globin
v 11. lidském chromozomu. Je možná jenom jediná sekvence?
Mutageneze
Mutace je dědičná změna genotypu, která není podmíněna rekombinací ani segregací či jinými
zákonitými procesy v rámci životního cyklu. Může se týkat jednoho genu (genová mutace),
chromozomu (chromozomová mutace čili aberace) nebo celé chromozomové sady (genomová
mutace). Mutageneze je proces vzniku mutace. Mutagenizace je vystavení živé soustavy účinkům
mutagenu. Mutagen je chemická látka nebo fyzikální faktor vyvolávající mutaci. Mezi mutageny
vyskytující se v přírodě patří např. aflatoxiny produkované toxigenními kmeny plísně Aspergillus
flavus (http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/aflatox.php). Mutanta, mutant je organismus
nesoucí mutantní alelu. Alela standardní je varianta genu (čili alela) početně převládající
v přirozené populaci. Alela mutantní je varianta genu vzniklá ze standardní alely mutací.
5.8
Genové mutace
Určete, jaké následky způsobí následující genové mutace ve stavbě a funkci nově syntetizované
bílkoviny (jsou uvedeny triplety v kódujícím vlákně DNA):
a) mutace tripletu
TGT → AGT
b) mutace tripletu
CTG → CTA
c) mutace tripletu
GTG → CTG
d) mutace tripletu
GTG → GAG
e) mutace tripletu
CTG → CGG
Postup
Uvedené triplety přepište na kodóny v mRNA a podle tabulky genetického kódu k nim přiřaďte
odpovídající aminokyseliny.
Následky
a) záměnou aminokyseliny se ztrácí možnost tvorby S-S můstku (odůvodněte)
b) jedná se o tichou mutaci – vysvětlete.
c) jedná se o záměnu dvou neutrálních aminokyselin.
d) záměna neutrální za kyselou aminokyselinu.
e) záměna neutrální za bazickou aminokyselinu.
Otázka
Jak mohou uvedené změny ovlivnit stavbu a funkci bílkoviny a proč?
19
v20140903
5.9
Mechanismus účinku chemomutagenu
a) 5-bromuracil (BU) je analogem thyminu. Je-li přidán k buňkám, u nichž probíhá replikace,
začleňuje se do DNA a nahrazuje thymin, takže páry bází A-T jsou zaměněny za A-BU. BU
v normální laktamové formě (párující se s adeninem) se vzácně spontánně mění v laktimovou
formu BU+, párující se s guaninem. Znázorněte schématem, jakou mutaci BU+ vyvolává.
Odůvodněte, proč je mutační účinek závislý na replikaci.
b) Aminopurin (AP) se páruje normálně s thyminem, ale ve své iminoformě AP+ se váže
s cytosinem. Znázorněte schematicky, jakou změnu AP+ vyvolává.
5.10 Hemoglobin srpkovité anémie
Hemoglobin srpkovité anémie u člověka se vyznačuje tím, že oproti hemoglobinu normálnímu má
na šesté pozici beta globinového řetězce místo glutamové kyseliny valin (viz sekvenci v úkolu 5.7).
Tripletem v mRNA pro glutamovou kyselinu je GAG, pro valin GUG. Určete odpovídající kodóny
(triplety) na úrovni obou vláken DNA. Jak lze vysvětlit vznik této choroby a proč je dědičná?
5.11 Patologický hemoglobin HbC
U pacienta byl zjištěn výskyt abnormálního hemoglobinu HbC. Tento se od normálního
hemoglobinu liší tím, že má na šesté pozici svého beta globinového řetězce glutamovou kyselinu
nahrazenu lysinem (srovnej sekvenci v úkolu 5.7). Předpokládejme, že zařazení glutamové kyseliny
určuje na úrovni mRNA triplet GAG, zařazení lyzinu triplet AAG. Určete odpovídající triplety na
úrovni DNA (na obou vláknech). Na které úrovni proběhla původní mutace – v mRNA nebo
v DNA?
Jaká mutace by mohla způsobit opět syntézu normálního hemoglobinu a vyléčit tuto
hemoglobinopatii na genové úrovni? Co soudíte o reálnosti takové možnosti?
5.12 Posunová mutace
Úsek DNA v určitém genu kóduje část bílkoviny, která je složena ze 7 aminokyselin:
část proteinu:
cys
úsek DNA (nekódující vlákno):
ACG GCA AAA CCA GGA CAT TTA
arg
phe
gly
pro
val
asn
Mutací při replikaci vypadla 3. báze v tripletu pro cystein (G). Jaký následek bude mít tato mutace?
Postup
Napište nové (posunuté) triplety v DNA.
Vyjádřete jim odpovídající transkripty v mRNA.
Přiřaďte k nim odpovídající aminokyseliny podle tabulky genetického kódu.
Porovnejte sekvenci aminokyselin se sekvencí původní, uvedenou v zadání úkolu. Vysvětlete, co
způsobila delece jednoho nukleotidu. Co by způsobila adice nukleotidu? Co způsobí delece (adice)
dvou nebo tří nukleotidů?
5.13 Spontánní mutace v kultuře bakterií
Kultura získaná kultivací hnisu obsahuje mnoho miliard bakterií citlivých k penicilínu. Jak byste
dokázali, že jsou mezi nimi také bakterie k penicilínu rezistentní? Bylo by možné zjistit jejich počet
v určitém objemu bakteriální kultury?
20
v20140903
5.14 Mutace a kancerogeneze
Vlivem mutace se zvýšila transkripční aktivita genu pro jaterní arylhydroxylázu (enzym katalyzující
přeměnu uhlovodíku benzpyrenu z cigaretového kouře na kancerogenní epoxidy). Co lze říci
o dispozici nositele této mutace k rakovině plic způsobené kouřením?
21
v20140903
6. Proteiny
Cíl cvičení
Pochopit vztah mezi strukturou a funkcí proteinu na příkladu molekuly hemoglobinu.
Hemoglobin (Hb), červené krevní barvivo, je z funkčního hlediska nejdůležitější bílkovina
obsažená v červených krvinkách. Jeho hlavní funkcí je přenos kyslíku (O2) z plic do tkání;
hemoglobin se také částečně podílí na přenosu oxidu uhličitého (CO2) z tkání zpět do plic.
Teoretický úvod
Struktura Hb
Hb je tvořen bílkovinou globinem a prostetickou skupinou, hemem. Funkční Hb molekula je
tetramer, sestávající ze dvou různých párů globinových řetězců alfa a beta. Pár alfa globinových
řetězců je kódován genem na chromozomu 16 a pár beta řetězců je kódován genem na chromozomu
11 (viz obr.). Každý řetězec váže jednu hemovou skupinu uloženou v kapsových dutinách. Hem je
protoporfyrin, jehož základem je čtveřice pyrolových jader (tetrapyrol). Ve středu tetrapyrolového
jádra je šestivazný iont železa Fe2+. Čtyřmi vazbami je iont železa vázán v tetrapyrolovém kruhu,
jednou vazbou na globinový řetězec a zbylá vazba je určena pro kovalentní interakci s molekulou
kyslíku. Jedna molekula Hb tedy může vázat 4 kyslíkové molekuly; železo je schopno reverzibilně
vázat molekuly kyslíku jen je-li dvojmocné (Fe2+).
Bodové mutace v α nebo β-globinových genech vedou k aminokyselinové záměně v α nebo βglobinových řetězcích a ke vzniku abnormálních hemoglobinů, což se manifestuje jako onemocnění
zvané hemoglobinopatie. Jedná se o nejrozšířenější genetické choroby na světě, postihující miliony
lidí, zvláště v malarických oblastech.
Některé záměny aminokyselin (tj. poruchy na úrovni primární struktury) mohou vést i k porušení
sekundární, terciární a kvarterní struktury Hb molekuly. Dochází k tvorbě nestabilní Hb molekuly –
vznikají tzv. nestabilní hemoglobiny. V červených krvinkách takto postižených jedinců nestabilní
Hb precipituje za vzniku tzv. Heinzových tělísek. Precipitát přisedá na vnitřní stranu erytrocytů.
Takové erytrocyty při průchodu krevními kapilárami praskají – dochází k hemolýze, jejím
výsledkem je anémie.
22
v20140903
Nestabilní hemoglobinopatie jsou dominantně dědičné. Vyskytují se v Čechách i na Slovensku
a jsou příčinou tzv. „hemolytické anémie s Heinzovými tělísky“.
6.1
Pozorování precipitovaného patologického hemoglobinu na
trvalém preparátu
Materiál
Trvalé preparáty – krevní nátěry barvené briliant kresylovou modří.
Postup
Budeme pozorovat trvalé preparáty zdravého jedince (normální kontroly) a nemocného
s hemoglobinopatií. Pro nalezení vhodné části krevního nátěru použijeme objektiv zvětšující 10×;
pro pozorování erytrocytů použijeme objektiv zvětšující 40×. Zakreslíme erytrocyty s precipitáty
nestabilního hemoglobinu.
Otázky
1. Kde se v rámci globinových řetězců pravděpodobně nacházejí aminokyseliny, jejichž
záměna vede k rozpadu Hb molekuly?
2. Proč dochází k hemolýze u nemocných s nestabilní hemoglobinopatií?
6.2
Demonstrace: Detekce hemoglobinopatie pomocí gelové
elektroforézy
Materiál
Polyakrylamidový gel se vzorky hemoglobinu.
Postup
Z erytrocytů pacienta trpícího hemoglobinopatií a z erytrocytů zdravého člověka jsou připraveny
lyzáty. Ke každému lyzátu se přidá barvivo a lyzáty se nanesou do jamek na polyakrylamidovém
gelu (gel je ponořený v elektroforetické vaně v roztoku pufru). Provede se nativní elektroforéza
hemoglobinu.
Výsledek
Na gelu pozorujeme jednotlivé proužky obarvených proteinů. V případě erytrocytů je majoritním
proteinem hemoglobin. U zdravého člověka pozorujeme jediný silný proužek, odpovídající
jednomu typu molekul hemoglobinu. U pacienta trpícího hemoglobinopatií můžeme pozorovat dva
proužky – erytrocyty pacienta obsahují normální i patologický hemoglobin.
Komentář
Záměna aminokyseliny způsobuje změnu mobility bílkoviny na gelu.
6.3
Imunohistochemická detekce buněčně specifického proteinu
Cílem imunodetekce proteinů na tkáňových řezech je detekce specifických antigenních determinant
s využitím imunologické vazby, tj. s využitím principu vazby antigenu a protilátky. Podrobné
seznámení s termíny „antigen“ a „protilátka“ umožní až přednášky ze základů imunologie v letním
semestru. Pro potřeby tohoto cvičení stačí představa, že vazba protilátky na buněčný antigen
připomíná vazbu specifického klíče k zámku. Specifická protilátka se při inkubaci naváže na
specifický buněčný antigen. Detekční systém pak umožní zviditelnění navázané protilátky a tím
zviditelnění buněk (resp. buněčných struktur), které exprimují daný antigen (protein).
23
v20140903
Materiál
Trvalé preparáty – řezy slezinou – ve kterých byl pomocí imunohistochemického barvení
zviditelněn protein, specificky exprimovaný pouze B-lymfocyty. Je možné pozorovat obarvené Blymfocyty ve folikulech.
Komentář
Slezina má několik funkcí. Ve fetálním období embryogeneze je to krvetvorný orgán. V dospělosti
zde dochází k destrukci zanikajících červených krvinek a především – slezina patří mezi orgány
imunitního systému. Ve slezině dozrávají B-lymfocyty (které produkují protilátky). Na řezech byl
imunodetekcí zviditelněn jeden z proteinů specifických pro B-lymfocyty.
6.4
Důkaz hemoglobinu
Pomůcky
Podložní sklíčko se zaschlou kapkou krve kteréhokoli savce, konc. kyselina octová, 0,2% roztok
NaBr nebo NaCl ve vodě, elektrická topná plotýnka, mikroskopické potřeby.
Postup
Na zaschlou krev kápneme kapku roztoku soli a necháme uschnout. Potom přikápneme kyselinu
octovou, přikryjeme krycím sklíčkem a preparát položíme na topnou plotýnku. Tím kyselinu
pomalu odpařujeme. Malým zvětšením mikroskopu pak vyhledáme ve zbytku kyseliny i v suchých
částech preparátu hnědé krystalky (Teichmannovy krystaly), někdy seskupené do srostlic čili drúz.
Výsledek
Zakreslíme několik krystalů při velkém zvětšení.
Výklad
V horké kyselině se ničí bílkovinná část hemoglobinu (globin) a uvolňuje prostetická složka – hem.
Po odpaření kyseliny se vylučují krystalky soli oxidovaného hemu s ionty Br- nebo Cl- (bromhemin,
chlorhemin). Ty jsou důkazem přítomnosti hemoglobinu.
Význam
Reakce se nazývá Teichmannova zkouška a používala se v soudním lékařství pro důkaz krevních
skvrn.
24
v20140903
7. Enzymy
Teoretický úvod
Metabolismus jako souhrn chemických přeměn v organismu je umožněn působením enzymů. Tyto
biokatalyzátory uskutečňují a řídí téměř všechny chemické reakce v živých soustavách.
O enzymech pojednává podrobně učebnice biochemie. V úvodu do cvičení připomeneme jen
základní fakta nutná pro pochopení některých kapitol biologie.
Katalytická funkce enzymů
Jako všechny katalyzátory ovlivňují enzymy pouze rychlost příslušné reakce, nikoliv konečný stav,
resp. rovnováhu, k níž reakce dospěje. Ta je i u katalyzovaných reakcí určována zákonem
o působení aktivní hmoty (Guldberg-Waagův zákon). K uskutečnění chemické změny – reakce – je
vždy třeba určité aktivační energie. Pouze molekuly aktivované (za dostatečně vysoké teploty
apod.) jsou schopny reagovat navzájem nebo s jinými molekulami. Enzymy působící jako
katalyzátory podstatně snižují potřebnou aktivační energii tím, že reakční složky vážou na sebe,
orientují je a přibližují navzájem a obvykle rozkládají celý děj na několik reakcí s nízkou aktivační
energií. Tím nejen zvyšují rychlost reakcí, ale uskutečňují i reakce, které by za fyziologických
podmínek prakticky vůbec neprobíhaly.
Stavba enzymové molekuly
Všechny enzymy patří mezi bílkoviny a jsou syntetizovány proteosyntetickým aparátem buněk
podle genetické informace obsažené v DNA. Některé enzymy patří mezi bílkoviny jednoduché, jiné
mezi bílkoviny složené, jež obsahují ještě nebílkovinnou „prostetickou složku“. Část bílkovinná se
pak nazývá apoenzym, nebílkovinná koenzym a celek holoenzym. Jedině celistvý holoenzym může
vykonávat svou katalytickou funkci. Koenzym může být na bílkovině vázán pevně a trvale, nebo
jen labilně a pak ho lze oddělit např. dialýzou.
Specifičnost působení
Typickou vlastností enzymů je jejich specifita. Ta je v podstatě dvojí: substrátová a funkční.
Substrátová specifita spočívá v tom, že enzym působí pouze na jeden substrát nebo skupinu
substrátů. Enzymy s velmi úzkou substrátovou specifitou působí na jedinou sloučeninu nebo
dokonce na jediný z jejích izomerů. Většina enzymů však působí na několik blízce příbuzných látek
a některé i na velkou skupinu sloučenin téhož typu (např. na řadu různých esterů, alkoholů apod.).
Substrátová specifita je určována bílkovinnou složkou (apoenzymem). Funkční specifita znamená,
že enzym z několika možných přeměn substrátu katalyzuje pouze jediný typ reakce. Tak např.
dekarboxyláza mění aminokyseliny na aminy, ne však na oxokyseliny, jiné aminokyseliny, amidy,
estery apod. – tyto přeměny uskutečňují jiné enzymy. Funkční specifita je určována především
koenzymem (je-li přítomen), podílí se však na ní i složka bílkovinná.
Mechanismus působení
Vysvětlení katalytického účinku enzymů je třeba hledat v jejich molekulární stavbě. Každá
molekula enzymu má na svém povrchu tzv. aktivní místo (aktivní centrum). Toto místo obsahuje
skupinu nebo skupiny, schopné reagovat s molekulou substrátu. Srazí-li se molekula enzymu a
molekula substrátu ve vhodné orientaci, je substrát v aktivním místě vázán a vzniká tzv. komplex
enzym-substrát (ES). Samo aktivní místo tvoří obvykle prohloubeninu povrchu bílkovinné
molekuly a substrát do něj zapadá jako do určité „formy“. Tím je zabráněno vazbě jiných látek a
zaručena přesná orientace substrátové molekuly. Vazbou substrátu se současně mění struktura
aktivního místa i substrátu samého. Vzniká labilní konfigurace, která vyvolává další strukturální
změnu, tj. právě příslušnou katalyzovanou reakci. Jakmile je substrát chemicky změněn na produkt,
ztrácí schopnost vazby na enzym, uvolňuje se a aktivní místo se vrací do původního stavu. Celý
průběh reakce lze znázornit schématem:
25
v20140903
E + S → ES → ES' → E + S'
kde E je enzym, S substrát a S' změněný substrát (produkt reakce). U složených enzymů je
koenzym vázán právě v aktivním centru a podílí se na vlastní reakci. Některé koenzymy se při
reakci samy mění (poskytují např. substrátu vodík), uvolňují se spolu s produkty a mohou se vázat
zpět až po regeneraci na jiném místě. I v dalších otázkách je pochopitelně mechanismus mnohých
enzymových reakcí složitější, než je ve stručnosti popsáno.
Enzymová kinetika
Rychlost enzymové reakce závisí na mnoha podmínkách, jejichž vliv studuje enzymová kinetika.
Velký vliv má obvykle pH prostředí, a to i u reakcí, jichž se ionty H+ a OH- přímo neúčastní.
Na hodnotě pH závisí totiž celá struktura enzymové molekuly, včetně aktivního místa. Pro každý
enzym a substrát lze stanovit optimální pH, při němž je rychlost reakce nejvyšší. Rychlost reakce
dále závisí na teplotě. Se zvyšující se teplotou rychlost reakce narůstá, při vysoké teplotě však
začíná postupná denaturace enzymu a jeho aktivita se opět snižuje. Dále záleží i na poměru
koncentrací enzymu a substrátu. Nejvyšší rychlosti reakce je obvykle dosahováno v nadbytku
substrátu, kdy je enzym substrátem „nasycen“. Různé substráty jsou ovšem enzymem zpracovávány
nestejně rychle. Mírou afinity enzymu k danému substrátu a jeho celkové účinnosti může být např.
číslo přeměny. Udává počet molekul substrátu, které přemění v optimálních podmínkách jedna
molekula enzymu za minutu. Obvykle jde o několik tisíc, někdy však činí číslo přeměny až několik
milionů (u acetylcholinesterázy 18×106 ).
Aktivátory a inhibitory
Nutnou podmínkou pro činnost některých enzymů jsou také aktivátory, jimiž jsou obvykle ionty
kovů (Mg2+, Zn2+, Co2+ aj.). Tyto ionty ovlivňují strukturu enzymové molekuly, neváží se však
obvykle přímo do aktivního místa jako koenzymy. Opačně působí tzv. inhibitory, které mohou být
pro jednotlivé enzymy velmi specifické. Mechanismus jejich účinku je různý, některé se dočasně
nebo trvale váží do aktivního místa namísto substrátu, jiné blokují vlastní aktivní skupiny a další
mění normální prostorové uspořádání celé enzymové molekuly. Studium inhibitorů je pro poznání
stavby a funkce enzymů velmi důležité.
V živých soustavách neprobíhají enzymové reakce odděleně, ale jsou spojeny v enzymové řetězce
nebo i rozsáhlé metabolické dráhy. Produkt jednoho enzymu je substrátem dalšího. Při stálé
přeměně produktů na další látky probíhají i rovnovážné reakce jednosměrně. Reakce
spotřebovávající energii jsou vždy spjaty s reakcemi exergonickými, takže i ony probíhají
s dostatečnou rychlostí.
Rozdělení enzymů
Mezinárodní systém rozeznává 6 tříd podle jejich funkční specifity:
1. Oxidoreduktázy (uskutečňují oxidoredukční reakce, zejména přenos elektronů).
2. Transferázy (přenášejí různé funkční skupiny).
3. Hydrolázy (štěpí molekuly za vstupu vody).
4. Lyázy (štěpí nebo syntetizují vazby C-C, C-O, C-N bez účasti vody).
5. Izomerázy (přeměňují navzájem izomery téže sloučeniny).
6. Ligázy (syntetizují různé vazby za účasti makroergických sloučenin).
Pro biologické účely je vhodné i dělení podle jiných hledisek, např. na lyoenzymy rozpuštěné
v plazmě a desmoenzymy vázané na pevné struktury, vnitrobuněčné endoenzymy a ektoenzymy,
vylučované z buněk do vnějšího prostředí atd.
26
v20140903
Aktivita enzymů
Podle soustavy SI je základní jednotkou enzymové aktivity katal (kat). 1 katal odpovídá množství
enzymu, jež za daných podmínek přemění 1 mol substrátu na produkt za sekundu. Vedle toho se
používá starší mezinárodní jednotka IU (international unit). 1 IU je množství enzymu, jež přemění
1 mikromol substrátu na produkt za 1 minutu při 30°C.
Enzymové jednotky:
1 kat = 1 mol/s ⇒ 6×107 IU
1 UI = 1 μmol/min (30°C) ⇒ 16,67 nkat
Cíl cvičení
Na praktických příkladech si přiblížíme princip detekce enzymové aktivity v buňkách a tělních
tekutinách.
7.1
Stanovení pH optima aktivity kyselé fosfatázy
Chemikálie, biologický materiál, pomůcky
1 M Na2CO3, destilovaná voda
PBS: pufrovaný fyziologický roztok fosfátovým pufrem
Lyzační pufr: 50 mM NaCl, 10mM Tris/HCl, pH=7.3, 2mM MgCl2, 1mM dithiotreithol, 1% Triton
X-100
Pufr pro měření aktivity: 100 mM Tris/kyselina mravenčí, pH = 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 a 9.5
Substrát: 50 mM p-nitrofenyl fosfát
Buňky K562: nádorová buněčná linie, odvozená z myeloidní leukémie s Filadelfským
chromosomem; buňky rostou volně v médiu, jsou tedy neadherentní
Spektrofotometr Genios, centrifuga.
Postup
Příprava buněčného lyzátu
Přibližně 5×106 buněk sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min při lab.
teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml PBS pufru a znovu sedimentujeme za stejných podmínek.
Supernatant odsajeme pipetou a sediment resuspendujeme ve 200 μl lyzačního pufru a zkumavku
inkubujeme v ledové lázni 30 min. Lyzát přečistíme centrifugací (18000 ot/min, 5 min při 4°C).
Měření pH optima aktivity kyselé fosfatázy
Do 2 sad zkumavek napipetujeme po 500 μl pufru o pH 2,5-9,5. Do každé zkumavky pak přidáme
10 μl substrátu. Reakci iniciujeme přídavkem 10 μl buněčného lyzátu, který přidáme pouze do první
sady zkumavek a protřepeme. Do druhé sady zkumavek napipetujeme 10 μl destilované vody (tzv.
„blank“). Zkumavky inkubujeme 30 min. při laboratorní teplotě. Reakci ukončíme přídavkem
500 μl 1 M Na2CO3 (do obou sad zkumavek). Pozor: přidání Na2CO3 do kyselého prostředí způsobí
uvolňování plynu (CO2) – zkumavky necháme chvíli otevřené, nezavíráme je bezprostředně po
ukončení reakce. Z každé zkumavky poté napipetujeme 200 µl směsi do mikrotitrační destičky.
U každého vzorku změříme absorbanci při 405 nm. Od naměřené hodnoty vždy odečteme hodnotu
absorbance odpovídajícího slepého vzorku (blanku) – tj. slepého vzorku v pufru o stejné hodnotě
pH. Aktivitu vyjádříme v bezrozměrných jednotkách jako velikost absorbance při 405 nm (osa Y)
proti pH (osa X). O maximální naměřené hodnotě pak řekneme, že je pH optimem pro kyselou
fosfatázu.
27
v20140903
Komentář
Fosfatázy jsou enzymy, které hydrolyzují fosforečné monoestery a uvolňují kyselinu ortofosforečnou. V některých buňkách je více fosfatáz, které se dělí na alkalické a kyselé – podle
optimálního pH, při kterém jsou tyto enzymy aktivní. Alkalické fosfatázy jsou aktivovány ionty
hořčíku, slaběji ionty manganu, zinku a kobaltu. Naproti tomu kyselé fosfatázy nepotřebují ionty
hořčíku a lze je selektivně inhibovat fluoridy. Kyselé fosfatázy se nacházejí v lysozomech, kde
představují jeden z nejběžnějších hydrolytických enzymů a podílejí se na rozkladu pohlceného
materiálu v sekundárních lysozomech.
Primární lysozomy vznikají odštěpením z cisteren Golgiho komplexu a obsahují asi
40 hydrolytických enzymů – již zmíněnou kyselou fosfatázu, různé typy proteáz, glykosidázy, riboa deoxyribonukleázy a jiné. Sekundární lysozomy vznikají splynutím primárních lysozomů
s membránou obalených váčků, jež obsahují materiál určený k likvidaci. Tyto váčky se nazývají
buď autofagosomy (obsahují vlastní buněčný materiál – nefunkční organely) nebo fagosomy
(obsahují extracelulární materiál pohlcený při fagocytóze).
Kyselá fosfatáza se hojně nalézá u hemopoetických buněk. Bylo zjištěno, že aktivita kyselé
fosfatázy je vyšší u některých typů lymfocytárních leukémií (toho se využívá i k diagnostickým
účelům). Alkalická fosfatáza je membránově vázaný glykoprotein, jehož přirozený substrát není
dosud znám. Přítomnost alkalické fosfatázy lze prokázat prakticky ve všech tkáních a také v tělních
tekutinách, například v krevním séru. Medicínsky se nejvíce její aktivita testuje kromě séra také
v játrech, kostní tkáni, střevě a placentě. Vysoká aktivita alkalické fosfatázy bývá často spojená
s různými onemocněními vč. výskytu nádoru.
Otázky
1. Proč je pH optimum kyselé fosfatázy tak nízké?
2. Jaký je pravděpodobný fyziologický smysl nízkého pH optima u lysozomálních enzymů?
7.2
Průkaz slinné amylázy člověka
Pomůcky
1% roztok škrobového mazu (škrob rozpuštěný ve vroucí vodě), Lugolův roztok, destilovaná voda,
malá nálevka s papírovou vatou, kádinka, 2 dělené pipety na 5 ml, kapátko, vodní lázeň nastavená
na 37°C.
Postup
Pokus provádíme ve skupinách po 3-4 posluchačích. Pro získání roztoku slinné amylázy podrží
jeden ze skupiny v ústech malý doušek destilované vody (25-30 ml) po dobu 5 min. Výplašek pak
zfiltruje nálevkou s vatou do kádinky. Získáme tak enzymový preparát.
Další studenti napipetují po 1 ml škrobového mazu do dvou zkumavek. Do první (pokusné)
zkumavky se dále přidá 1 ml slinného výplašku (s amylázou), do druhé zkumavky (kontrolní) 1 ml
destilované vody. Obě zkumavky označíme, protřepeme a vložíme do vodní lázně o teplotě 37°C.
Po 15 min obě zkumavky vyjmeme. Porovnáme proti světlu stupeň zákalu roztoku a výsledek
poznačíme do protokolu. Do každé zkumavky pak kápneme jednu kapku Lugolova roztoku a
promícháme. Všimneme si barevné reakce v obou zkumavkách a porovnáme.
Otázky
1. Jakou látku obsahuje Lugolův roztok a jak reaguje toto činidlo se škrobem?
2. O čem svědčí změna reakce po působení slinné amylázy?
3. Jaké látky vznikají enzymovým štěpením (částečným, úplným) ze škrobu?
28
v20140903
4. Jak vysvětlíme změny ve stupni zakalení škrobového roztoku působením enzymu?
Poznámka
Úkol lze modifikovat tak, že preparát slin od jedné skupiny posluchačů zředíme 10× destilovanou
vodou a připravíme deset stejných zkumavek obsahujících po 1 ml škrobového mazu a 1 ml
ředěných slin. Vložíme do vodní lázně a pak zkumavky po dvou minutách postupně vyjímáme
a přikápneme Lugolův roztok. U kontrolní zkumavky přikápneme tento roztok okamžitě po smíšení
škrobového mazu a slin. Ve stojánku seřadíme zkumavky podle doby působení enzymu (doby
pobytu ve vodní lázni), přičemž kontrolní zkumavku zařadíme jako první. Pozorujeme postupné
mizení zákalu a jodoškrobové reakce. Obvykle lze zachytit vznik tzv. erytrodextrinů, krátkých
oligosacharidických řetězců, které se jódem nebarví fialově, ale červeně.
7.3
Průkaz peroxidázy v krvi
Pomůcky
Lidská krev; acetátový pufr o pH 4,7 (připravíme smísením stejných dílů 0,1 mol/dm3 roztoků kys.
octové a octanu sodného); destilovaná voda; 0,02% roztok indigokarmínu ve vodě; 0,1% peroxid
vodíku; zkumavky; dělené pipety na 5 ml a 1 ml.
Postup
Krev zředíme destilovanou vodou v objemovém poměru 1:1000. Ve zkumavce smícháme postupně
4 ml acetátového pufru, 3 ml ředěné krve, 1 ml roztoku indigokarmínu a 0,5 ml roztoku H2O2.
V další zkumavce použijeme namísto roztoku H2O2 destilovanou vodu (kontrola).
Výsledek
Barva roztoku se v první zkumavce změní během 30-50 s z modré na zelenou a dále žlutorůžovou
(barva zředěné krve). V kontrolní zkumavce odbarvení nenastane.
Komentář
Při oxidačních dějích v buňce vzniká v některých případech namísto vody peroxid vodíku, který je
pro svou reaktivitu i v malých množstvím toxický. Je odstraňován jednak katalázou, která jej štěpí
na vodu a kyslík, jednak peroxidázami, které pomocí H2O2 oxidují různé další sloučeniny. Krev
savců obsahuje katalázu i peroxidázy. V našem případě peroxidáza oxidovala modrý indigokarmín
na bezbarvý oxidační produkt.
Otázky
1. O čem svědčí možnost provedení reakce v krvi tisícinásobně „zředěné“?
2. Co se stane s erytrocyty, pokud krev „naředíme“ 1000× destilovanou vodou?
29
v20140903
8. Biomembrány a osmóza
Studijní příprava
Membránový princip organizace buňky. Molekulární struktura biomembrán, chemické složení,
uspořádání molekul. Membránové kompartmenty a organely. Obecný význam membránového
principu. Plazmatická membrána a její struktura. Membránové přenosy.
Teoretický úvod
Difúze a osmóza
Částice rozpuštěných látek ve zředěných roztocích se chovají podobně jako částice ideálních plynů.
Smísíme-li různě koncentrované roztoky téže látky nebo roztoky různých látek, rozptýlí se po určité
době všechny přítomné částice rovnoměrně v celém dosažitelném objemu. Nastalo vyrovnání
koncentrací difúzí. Složitější případ nastane, oddělíme-li takové roztoky polopropustnou
membránou, která propouští pouze molekuly rozpouštědla a nepropouští částice rozpuštěných látek.
V tomto případě nastane přesun rozpouštědla přes membránu do koncentrovanějšího roztoku, který
se zřeďuje tak dlouho, až se koncentrace na obou stranách membrány vyrovnají. Přesunem
rozpouštědla se současně mění objemy roztoků v obou prostorech. Popsaný děj je příkladem
osmotického děje. Osmóza je tedy difúze molekul rozpouštědla přes polopropustnou membránu (ve
směru koncentračního gradientu).
Osmotický tlak a osmolarita
Osmotické děje vypadají navenek jako „vysávání“ rozpouštědla (např. vody) ze zředěnějších
roztoků roztoky koncentrovanějšími. Sílu, kterou nasává určitý roztok čisté rozpouštědlo přes
semipermeabilní membránu v osmotické soustavě, nazýváme osmotický tlak. Měříme jej
v jednotkách tlaku, pascalech (Pa). Osmotický tlak má každý roztok sám o sobě, v takové situaci
jde však o tlak latentní (tzv. osmotická hodnota). Jako skutečná síla, schopná konat i práci, se tento
tlak projeví teprve po vytvoření osmotického systému.
Osmotický tlak roztoku je přímo úměrný počtu částic rozpouštěných látek v jednotce objemu.
U látek nedisociujících v roztoku závisí proto osmotický tlak na jejich molární koncentraci.
U disociujících sloučenin je třeba násobit jejich molární koncentraci c ještě disociačním
koeficientem i, který udává, kolik samostatných částic disociuje z jedné molekuly této sloučeniny
v roztoku. Takto vyjádřenou koncentraci (c.i) nazýváme koncentrací osmolární. Např. u NaCl,
jehož molekuly ve vodě úplně disociují na dvě částice (Na+ a Cl-), je osmolární koncentrace
dvojnásobkem molární koncentrace.
Osmotický tlak každého roztoku dále závisí na teplotě (s rostoucí teplotou se zvyšuje). Naproti
tomu vůbec nezávisí na velikosti, tvaru, hmotnosti nebo náboji částic rozpuštěných látek (tedy na
jejich kvalitě). Všechny uvedené závislosti shrnuje vzorec pro výpočet osmotického tlaku:
P=R.T.c.i
(Pa)
R ... plynová konstanta
T ... absolutní teplota (v Kelvinech)
c ... molární koncentrace rozpuštěné látky
i ... disociační koeficient (c×i tedy znamená osmolární koncentraci)
Vzorec umožňuje vypočítat osmotický tlak každého roztoku z koncentrace rozpuštěných látek
a teploty. U biologických tekutin, které jsou složitým roztokem mnoha látek, je stanovení celkové
osmolarity z výpočtů pro jednotlivé složky těžko proveditelné. Proto využíváme toho, že na
osmolaritě roztoku jsou závislé i další vlastnosti, např. změny bodu varu a bodu tání. Osmolaritu
biologických tekutin pak určíme např. kryoskopicky na základě poklesu bodu tání.
30
v20140903
Osmóza v živých buňkách
Osmotické jevy hrají velmi důležitou roli ve všech živých soustavách. V buňce se klasické
polopropustné membráně nejvíce podobá plazmatická membrána (PM). Tato membrána volně
propouští pouze molekuly rozpouštědla, tj. vodu. Látky ve vodě rozpuštěné pouhou difúzí
nepropouští (až na výjimky). Podobně se chová membrána na povrchu vakuol, membrány
mitochondrií a plastidů a do určité míry i dalších membránových organel. Systémem membrán je
tak eukaryotická buňka rozdělena na větší počet osmoticky oddělených prostorů.
Nejnápadnější a nejdůležitější jsou osmotické jevy na rozhraní buňky a vnějšího prostředí, tedy
na PM. Roztok, který obklopuje živou buňku, může být vůči ní izotonický (má stejný osmotický
tlak jako tekutý obsah buňky), hypotonický (má nižší osmotický tlak) nebo hypertonický (má vyšší
osmotický tlak). Pokud jsou buňky v izotonickém roztoku, nenastává žádný osmotický děj – buňky
neztrácejí ani nepřijímají vodu a jejich životní pochody nejsou narušovány.
Jsou-li buňky v hypotonickém roztoku (případně v čisté vodě), proniká voda osmózou ve směru
vyšší koncentrace, tedy dovnitř buňky. Mluvíme o tzv. endosmóze vody. Endosmózou se zvětšuje
objem buňky a může dojít až k prasknutí PM a vylití cytoplazmy – tzv. plazmoptýze. Plazmoptýza
nastává velmi snadno u savčích červených krvinek. Vstříknutí většího množství hypotonického
roztoku (nebo vody) do krve vyvolává jejich praskání (osmotickou hemolýzu).
Také rostlinné buňky v hypotonickém roztoku nasávají vodu a zvětšují svůj objem. Prasknutí zde
však obvykle zabraňuje pevná buněčná stěna. Vytvoří se rovnováha, v níž napínaná buněčná stěna
tlačí zpětně na rozpínající se obsah buňky. Tomuto stavu říkáme buněčné napětí neboli turgor.
Turgor je podstatnou složkou mechanické pevnosti rostlinných orgánů; při poklesu turgoru rostlina
vadne. Na rozdíl od živočišných buněk snášejí rostlinné buňky dobře styk s hypotonickými roztoky
i čistou vodou.
Pokud jsou buňky v hypertonickém roztoku, nastává exosmóza vody z buněk
do koncentrovanějšího prostředí. Živočišné buňky se přitom smršťují a obvykle mění tvar. Takové
smrštění nazýváme plazmorhiza. Nápadný je tento děj opět u červených krvinek (viz úkol 8.2.).
Rostlinné buňky v hypertonickém roztoku také ztrácejí vodu a živý obsah buňky (protoplast)
s plazmatickou membránou na povrchu se smršťuje. Beze změny však zůstává pevná buněčná
stěna, která je pro vnější roztok plně propustná. Výsledkem je odtržení plazmatické membrány
od buněčné stěny: tento děj nazýváme plazmolýza. Hypertonický roztok proniká pak do prostoru
mezi stěnu a plazmatickou membránu, smršťování protoplastu pokračuje a může vést až k jeho
roztrhání a zániku buňky.
Vznik a složky osmotického tlaku
V předchozích odstavcích jsme měli na mysli osmotický tlak živé buňky jako celku. Čím je však
dán osmotický tlak v tak složité soustavě? Zjednodušeně jej můžeme rozložit na několik složek, jak
vyjadřuje vzorec:
P = Pkr + Pko + D – PD
Pkr zde znamená osmotický tlak přítomných krystaloidů (látek tvořících pravé roztoky) a Pko
osmotický tlak všech koloidů. Koloidy nebývají zcela nasyceny vodou a zvyšují proto příjem vody
svým bobtnacím tlakem D. Osmotické jevy ovlivňuje také membránová neboli Donnan-Gibbsova
rovnováha (bude probírána ve fyziologii), která osmotický tlak buňky snižuje. Její příspěvek (PD)
nese proto záporné znaménko.
Naprostou většinu osmotického tlaku v živých soustavách vytvářejí krystaloidy. Koloidy s malým
počtem velkých molekul vyvolávají jen malý tlak. Navíc je tento tlak těžko odlišitelný
od posledních dvou složek v našem vzorci. Všechny složky osmotického tlaku závislé
na přítomnosti koloidů shrnujeme proto pod pojem onkotický tlak PO:
PO = Pko + D - PD
31
v20140903
Můžeme tedy shrnout:
P = Pkr + PO
V krvi člověka je osmotický tlak udržován na hodnotě cca 0,75 MPa; z toho naprostou většinu tvoří
tlak krystaloidů (zvlášť NaCl) a onkotický tlak je jen cca 0,003 MPa. Nejjednodušší anorganický
roztok izotonický s lidskou krví bývá nazýván roztokem fyziologickým a je to 0,9% roztok NaCl
v destilované vodě. V tomto roztoku lze savčí buňky udržet kratší dobu bez poškození a zabránit
vzniku hrubých artefaktů.
Význam osmotických jevů
Osmotické děje jsou pro život rostlin, živočichů i člověka zcela nezbytné. Tak např. vyšší rostliny
přijímají vodu kořeny na základě osmózy. Suchomilné druhy přitom vytvářejí v buňkách
kořenových vlásků osmotický tlak až 20 MPa. V těle člověka se stále vytváří osmotická rovnováha
mezi krví a buňkami a tkáněmi těla. Osmotické jevy hrají zásadní roli při tvorbě a resorpci
tkáňového moku (lymfy), příjmu vody a rozpuštěných živin, zahušťování primární moči v kanálcích
ledvin a dalších dějích, jimiž se zabývá fyziologie. Poruchy v těchto pochodech mohou vést např.
ke vzniku otoků.
Cíl cvičení
Seznámíme se prakticky s některými vlastnostmi plazmatické membrány a s osmotickými jevy
na buněčné úrovni.
8.1
Rozpad plazmatické membrány erytrocytů – chemická hemolýza
Pomůcky
Krev z krevní konzervy, fyziologický roztok, pipeta, 5% roztok Septonexu, kapátka, mikroskopické
potřeby, filtrační papírky; rukavice (nitrilové, latexové nebo vinylové; možno i nesterilní).
Postup
Krev naředíme fyziologickým roztokem (do růžového zbarvení). Napipetujeme kapku naředěné
krve na podložní sklo a přikryjeme krycím sklem. Pozorujeme postupně malým a velkým zvětšením
jednotlivé plovoucí erytrocyty. Bez změny polohy stolku mikroskopu přidáme k hraně krycího skla
kapku roztoku Septonexu a průnik roztoku pod sklo urychlíme opatrným odsáváním filtračním
papírkem u protější hrany krycího skla. Nyní pozorujeme preparát velkým zvětšením postupně
od středu k hraně, u níž je kapka Septonexu. Nalezneme hranici, na které probíhá rozpad erytrocytů.
Vybereme si jeden dosud neporušený erytrocyt a pozorujeme jej až do jeho rozpadu („rozplynutí“).
Pozorování opakujeme a výsledek popíšeme.
Výklad
Septonex je látka povahy kvarterní amoniové soli; výrazně snižuje povrchové napětí kapalin
(povrchově aktivní látka neboli tenzid). V jeho přítomnosti ztrácí bimolekulární film fosfolipidů
v plazmatické membráně stabilitu a rozpadá se na kulovité micely. Erytrocyty jsou k působení
podobných látek zvláště citlivé, rozpadají se a jejich vnitřní obsah včetně hemoglobinu se vylévá
do prostředí. Tento děj se nazývá chemická hemolýza. Při správném zaclonění vidíme na místě
erytrocytu po určitou dobu ještě jeho bezbarvý „stín“ ze zbytků buněčných struktur, zejména
cytoskeletu. Septonex se díky výše popsaným účinkům na živé buňky používá jako dezinfekční
činidlo a k ošetření drobných poranění.
Poznámka
Podobný rozpad erytrocytů lze pozorovat v hypotonickém roztoku. V tomto případě je však
příčinou rozpadu buněk nasávání vody do erytrocytů (po koncentračním gradientu); plazmatická
32
v20140903
membrána mechanicky praská při zvětšení objemu buňky (plazmoptýza, viz úvod). Jedná se
o osmotickou hemolýzu.
8.2
Změna tvaru krvinek v hypertonickém prostředí
Pomůcky
Krev z krevní konzervy, 1,5% roztok NaCl, 0,9% roztok NaCl (fyziologický roztok), pipety na
1 ml, zkumavky; rukavice (nitrilové, latexové nebo vinylové; možno i nesterilní).
Postup
Do dvou zkumavek eppendorf napipetujeme po 100 µl krve; do jedné zkumavky přidáme 1 ml
fyziologického roztoku, do druhé přidáme 1 ml 1,5% roztoku NaCl. Po promíchání zhotovíme
z obou buněčných suspenzí nativní preparát a pozorujeme při silném zvětšení (objektiv 40×).
Výsledek
Zatímco krvinky ve fyziologickém roztoku zachovávají svůj typický tvar, krvinky ve vyšší
koncentraci NaCl se zakulacují, smršťují a nabývají zvláštního „ježatého“ tvaru. Zakreslíme několik
erytrocytů typického a změněného tvaru.
Výklad
Ve fyziologickém roztoku, který je pro krvinky izotonický, mají buňky stejný tvar jako v krvi.
V hypertonickém prostředí však exosmózou rychle ztrácejí vodu a jejich objem se zmenšuje. Přitom
se svrašťuje membrána na povrchu krvinky a vytváří se typické osténkovité výběžky. Srovnejte
tento děj s chováním rostlinné buňky v hypertonickém prostředí (úkol 8.3). Jak reagují krvinky
v hypotonickém prostředí?
Poznámka
Erytrocyty snadno mění svůj tvar i v krvi, která byla zahuštěna pouhým odpařováním – např.
v nesprávně zhotoveném krevním nátěru, kapce krve na podložním skle apod.
8.3
Průběh plazmolýzy a deplazmolýzy
Pomůcky
Mech měřík (Mnium sp.), 1 M roztok sacharózy, mikroskopické potřeby.
Postup
Připravíme nativní preparát lístku mechu ve vodě. Pozorujeme jej při malém zvětšení. Při tomto
zvětšení prosajeme preparátem roztok sacharózy a pozorujeme pak při zvětšení velkém.
Po zakreslení plazmolyzované buňky prosajeme preparátem destilovanou vodu a pozorujeme
deplazmolýzu: cytoplazma se vrátí do své původní polohy a plazmatická membrána opět přilne
k buněčné stěně.
Výsledek
Vlivem hypertonického prostředí, do něhož pletivo uvádíme prosáváním roztoku sacharózy, nastává
před našima očima plazmolýza buněk. Při silném zvětšení zakreslíme jednu buňku
neplazmolyzovanou a jednu plazmolyzovanou.
Výklad
Plazmolýza je zmenšení objemu protoplastu exosmózou vody z buňky (zejména z vakuol)
v hypertonickém prostředí. Morfologicky se projevuje odchlípením cytoplazmy od buněčné stěny.
33
v20140903
8.4
Vznik nadmolekulární struktury autoorganizací
Pomůcky
Lecitin, voda (případně roztok KOH), kapátko, jehla, mikroskopické potřeby.
Postup
Příprava lecitinu (studenti neprovádějí): vaječný žloutek smísíme po kapkách za stálého míchání
na el. magnetické míchačce s 20 ml absolutního etanolu. Protřepeme. Přidáme 50 ml éteru.
Promícháme. Filtrujeme do odpařovací misky: rozpuštěné lecitiny se oddělí od vysrážených
bílkovin. Směs na vodní lázni odpaříme. Zůstane nažloutlá, olejovitá emulze. Misku přeneseme na
led a k emulzi přidáme 20 ml vychlazeného acetonu a promícháme. Necháme usadit a žlutou
tekutinu odlijeme. Vícekrát opakujeme, až aceton zůstane bezbarvý. Zbylý materiál je surový
extrakt lecitinu, má voskovitou konzistenci. Uchováváme jej v chladničce.
Na hrotu jehly přeneseme malé množství (asi 1/2 mm3) lecitinu na podložní sklo a trochu jej po skle
rozmázneme. Přikryjeme krycím sklem, které na materiál jen slabě přitlačíme. Při malém zvětšení
vyhledáme okraj lecitinového materiálu. Pozorujeme jej objektivem 20× zvětšujícím. Materiál je
amorfní. Jeho okraj je světlolomný a jeví se jako tmavší. Požádáme sousedního studenta, aby nám
přikápnul na podložní sklo (k okraji krycího skla) kapku vody nebo roztoku KOH. Přitom
pozorujeme okraj materiálu.
Výsledek
Z amorfního lecitinu vyrůstají při styku s vodou trubičky, které se různě ohýbají a proplétají.
Nazývají se myelinové útvary. Nakreslíme je a vysvětlíme jejich vznik.
Výklad
Lecitin je fosfolipid. Jeho molekuly obsahují na jednom konci (nepolárním) hydrofobní skupiny
(koncové –CH3 skupiny mastných kyselin) a na druhém konci (polárním) hydrofilní skupiny
(glycerol, kys. fosforečná a cholin). Molekuly lecitinu jsou tedy amfifilní. Vykazují povrchovou
aktivitu ve styku s polární tekutinou – vodou: orientují se na hranici fází. Snižují povrchové napětí
vody.
Při styku s vodou se polární konce molekul lecitinu orientují směrem do vodného prostředí, zatímco
nepolární konce molekul jsou z vodného prostředí vytlačovány; molekuly se sestavují
do pravidelných struktur. Dochází k asociaci molekul lecitinu – navzájem asociují mezi sebou vždy
jen nepolární konce molekul a stejně tak konce polární (ty se orientují směrem do vodného
prostředí). Následkem toho vzniká paralelní uspořádání lecitinových molekul do poměrně stabilní
molekulární dvojvrstvy (bimolekulárního filmu) o tloušťce asi 5 nm. K tomuto bimolekulárnímu
filmu se paralelně přiřazují velkou rychlostí další dvojvrstvy. Od sebe jsou odděleny mezivrstvou
vodních molekul. Z velkého počtu takových dvojvrstev vzniká posléze nadmolekulární struktura
tvaru trubičky, kterou vidíme v mikroskopu.
Autoorganizace fosfolipidových molekul probíhá, dokud všechny volné hydrofilní konce molekul
nejsou „obsazeny“ vodou: proto trubičky přijímají vodu, rostou a přitom se různě prohýbají. Hnací
silou tohoto samosestavovacího procesu je tendence vodních molekul směřovat do svého stavu
maxima entropie, která "nutí" fosfolipidové molekuly uspořádat se tak, aby jejich uhlovodíkové
konce byly co nejméně vystaveny molekulám vody.
Význam
Vznik výše popsaných útvarů je modelem autoorganizačního procesu. Tento mechanismus
(autoorganizace fosfolipidových molekul) také zajišťuje orientaci molekul fosfolipidů v buněčných
membránách. Bimolekulární vrstva lipidů typu lecitinů je základem membránových struktur všech
buněk. Podílí se na této autoorganizaci genetická informace?
34
v20140903
8.5
Traubeho měchýřek
Pomůcky
Zkumavka, stojánek, pinzeta, vodný roztok síranu měďnatého (2 %), krystalický ferokyanid
draselný (žlutá krevní sůl).
Postup
Zkumavku naplníme asi do poloviny roztokem síranu měďnatého a pinzetou do něj vhodíme
několik krystalků ferokyanidu. Zkumavku postavíme do stojánku a pozorujeme.
Výsledek
Na povrchu krystalku vzniká rudohnědá blanka ve tvaru měchýřku, který zvětšuje svůj objem –
roste. Zakreslíme tvar měchýřku po 2,5 a 10 min.
Výklad
Krystal ferokyanidu draselného se rozpouští a reakcí s ionty mědi tvoří semipermeabilní membránu
ferokyanidu měďnatého, která má tvar měchýřku:
2 CuSO4 + K4Fe(CN)6 → Cu2Fe(CN)6 + 2 K2SO4
Koncentrovaný roztok uvnitř měchýřku nasává osmoticky volné molekuly vody z roztoku síranu
měďnatého (endosmóza), tím se zvětšuje objem měchýřku, až posléze praskne. Otvorem se vylije
z měchýřku roztok ferokyanidu draselného, který při styku s roztokem síranu měďnatého okamžitě
reaguje podle výše uvedené rovnice, vytvoří se nová membrána (kterou se otvor uzavře) a
endosmóza vody se obnoví. Růst celého útvaru se jeví jako naskakování drobných puchýřků.
Význam
Traubeho měchýřek je anorganickým modelem osmózy. Měchýřky vznikají, rostou, mění tvar
a pohybují se z fyzikálně chemických příčin: chemickou reakcí (substitucí) vzniklé molekuly
ferokyanidu měďnatého se v použité směsi organizují automaticky do plošných vrstev a formují
membránu měchýřku. Ta propouští jenom vodu. Tím vzniká osmotická soustava: uvnitř měchýřku
je hypertonický roztok ferokyanidu draselného, který endosmózou vody zvětšuje objem a v jeho
okolí je hypotonický roztok síranu měďnatého.
35
v20140903
9. Buněčný cyklus, mitóza
Studijní příprava
Dělení buněk, průběh buněčného cyklu. Fáze buněčného cyklu a jeho regulace. Regulace
buněčného dělení v mnohobuněčném organismu.
Teoretický úvod
Zatímco prokaryotická buňka se dělí velmi rychle a jednoduše (obsahuje jediný „chromozom“),
buněčné dělení u eukaryotické buňky je mnohem složitější – její jaderný genom je tvořen mnoha
chromozomy. Eukaryotické buňky také obsahují mnoho membránových organel a cytoskeletálních
filament. Během buněčného cyklu, což je období buňky od jejího vzniku do jejího rozdělení, musí
tedy buňka duplikovat svůj jaderný a cytoplazmatický materiál a rovnoměrně jej rozdělit
do dceřiných buněk. Tímto způsobem se dělí somatické buňky – jejich buněčný cyklus je zakončen
mitózou a vznikají při něm dceřiné buňky se shodnou genetickou výbavou, jakou měla buňka
mateřská. Při zrání pohlavních buněk probíhá zvláštní buněčný cyklus, zakončený meiózou,
při němž se dceřiné buňky liší genetickou výbavou od buňky mateřské.
Buněčný cyklus somatické eukaryotické buňky se skládá z metabolicky aktivní, dlouhé interfáze
a ze závěrečné M-fáze – mitózy, která zahrnuje karyokinezi a cytokinezi.
Interfáze je doba mezi dvěma buněčnými děleními, kterou dělíme na G1 fázi, S fázi a G2 fázi.
G1 fáze obsahuje hlavní kontrolní bod buněčného cyklu a má proto ze všech fází nejvíce
proměnlivou délku v závislosti na vnějších podmínkách. V této fázi dochází k intenzivní syntéze
RNA a proteinů, buňka roste, duplikuje cytoplazmatické organely. Syntézou DNA polymerázy,
některých enzymů a zásoby nukleotidů se připravuje na následující replikaci jaderné DNA,
na syntetickou fázi.
S fáze (syntetická fáze) je obdobím replikace chromozomální DNA. Nejdříve se replikují jejich
euchromatinové úseky chromozomů, později heterochromatinové. Současně s replikací DNA
probíhá syntéza histonů (histony jsou nezbytné pro tvorbu nových chromatinových vláken).
Na konci S fáze je každý chromozom tvořen dvěma chromatidami spojenými centromerou a jádro
obsahuje dvojnásobné množství DNA, než před zahájením S fáze. (Replikace mimojaderné DNA
probíhá během celé interfáze.)
G2fáze je relativně krátké období, v němž pokračuje růst buňky, syntéza RNA a proteinů, tvorba
organel a dalších buněčných struktur. Tato fáze obsahuje kontrolní body pro zahájení karyokineze
a cytokineze.
M-fáze, mitóza je zahájena kondenzací chromozomů. Je to plynulý sled událostí, který podle
morfologie a umístění chromozomů dělíme na 5 stadií:
Profáze je zahájena rozestupem dceřiných centriolů k pólům buňky a tvorbou mitotického vřeténka.
Kondenzace chromozomů pokračuje, přechodně se pozastavuje jejich genetická aktivita. Jadérko se
postupně zmenšuje.
Prometafáze začíná náhlým rozpadem jaderného obalu a zánikem jadérka. Chromozomy se
připojují na mitotické vřeténko, je dokončována jejich kondenzace.
Metafáze vede k postupnému uspořádání chromozomů v ekvatoriální rovině buňky – je to období
jejich dynamické stability. Každý chromozom je složen ze dvou chromatid.
Anafáze začíná oddělením dceřiných chromatid každého chromozomu, ze kterých se tak stávají
dceřiné chromozomy. Každý z nich je tažen k opačnému pólu dělicího vřeténka.
Během telofáze se obě sady dceřiných chromozomů dostávají k pólům buňky, vytvářejí se jaderné
membrány dceřiných jader. Jádra rostou, v místech nukleolárních organizátorů se tvoří jadérka.
Chromozomy dekondenzují do svého aktivního interfázového stavu. Je dokončována cytokineze –
36
v20140903
u živočišných buněk pomocí kontraktilního prstence, u rostlinných buněk tvorbou nové buněčné
stěny.
Dvě vzniklé dceřiné buňky jsou opět ve stadiu počínající interfáze, tedy G1 fáze.
Cíl
Naučit se měřit obsah DNA pomocí průtokové cytometrie, rozlišovat fáze eukaryotického
buněčného cyklu a fáze mitózy a pozorování dělení buněk pučením.
9.1
Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie
Princip průtokové cytometrie
Průtoková cytometrie je technika pro rychlé měření optických vlastností jednotlivých částic
nebo buněk, které procházejí snímacím místem. Jednou z nejpodstatnějších vlastností průtokové
cytometrie (cytometrické analýzy) je skutečnost, že se provádí měření každé jednotlivé buňky
nebo částice a nejde tedy o průměrné hodnoty měřené v buněčné suspenzi nebo v buněčném lyzátu.
Průtokový cytometr je vybaven laserem (nejčastěji argonovým), který umožňuje analýzu mnoha
buněčných parametrů na základě 1) rozptylu laserového paprsku, 2) fluorescence. Rozptyl paprsku
i intenzita fluorescence jsou zaznamenávány jednotlivými detektory a softwarově vyhodnocovány.
ad 1) Rozptyl laserového paprsku je závislý na velikosti a granularitě (denzitě) procházejících
buněk (nebo částic). Například lymfocyty jsou malé a denzní buňky, naopak granulocyty jsou
buňky větší s vyšší denzitou (Obr. 1):
Obr. 1. Bodový a vrstevnicový graf zobrazující velikost a granularitu různých leukocytů
Bodový graf (vlevo): každá tečka odpovídá 1 buňce – na ose x můžeme odečíst relativní velikost
buňky, na ose y potom její granularitu. Vrstevnicový graf (vpravo): jiné zobrazení údajů z grafu
vlevo (jednotlivé vrstevnice spojují oblasti s výskytem konkrétní hustoty buněk). osa X – velikost
částic (buněk); osa Y – granularita
ad 2) Kromě výše uvedené základní analýzy lze buňky obarvit fluorescenčním barvivem a následně
stanovit intenzitu fluorescence. Je možné přímo barvit specificky určité organely (např.
mitochondrie) nebo biomolekuly (např. DNA). Nepřímo lze obarvit i zvolené proteiny v buňce
(např. povrchové antigeny, atd.): na zvolený protein necháme navázat fluorescenčně označenou
protilátku (specificky se vážící na tento protein). Každá molekula této protilátky je konjugována
s molekulou fluorescenčního barviva. Po nabarvení buněk a následném odmytí nenavázané
37
v20140903
protilátky zůstanou molekuly fluorescenčně označené protilátky navázány pouze na molekulách
vybraného proteinu. Takto lze např. u leukocytů určit přítomnost/nepřítomnost tzv. diferenciačních
znaků (Clusters of Differentiation – CD) a tím určovat specifické buněčné subpopulace – například
CD4+ T-lymfocyty (pozitivně reagují s protilátkou proti znaku CD4 na jejich povrchu). Dále lze
použít barviva, která se stávají fluorescenčními v důsledku chemické reakce uvnitř buňky a tak
sledovat některé parametry buněčného metabolismu.
Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie
Aplikací metod průtokové cytometrie je celá řada. Jednou z velmi hojně používaných aplikací je
analýza obsahu jaderné DNA (analýza buněčného cyklu). Tato metoda využívá fluorescenční
barvivo, jež se „váže“ specificky a stechiometricky na DNA a jehož fluorescence je zvýšená po
„navázání“ na DNA. Měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách poskytuje statistický pohled na
buněčný cyklus (Obr. 2):
Osa X – intenzita fluorescence (⇒ obsah jaderné DNA); osa Y – počet buněk
Obr. 2. Analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií
Chemikálie, biologický materiál
N6-dimethylaminopurin (nespecifický inhibitor protein kináz)
PBS (Phosphate buffered saline; izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfátovým pufrem)
Fixační směs: 70% etanol/30% PBS (v/v), pH 7,3
Pufr pro barvení jader: PBS obsahující propidium jodid (5 μg/ml) a ribonukleázu (100 μg/ml)
Buňky K562: nádorová buněčná linie odvozená z myeloidní
chromozomem (buňky jsou volně rostoucí v médiu)
leukémie s Filadelfským
Postup
Indukce změn v buněčném cyklu: K buněčné suspenzi přidáme látku, jež blokuje určitou fázi
buněčného cyklu (500μM N6-dimethylaminopurin ) a inkubujeme za standardních podmínek. Jako
kontrolu použijeme buňky kultivované ve standardním médiu (bez N6-dimethylaminopurinu).
Fixace buněk: Přibližně 2×106 buněk inkubovaných 48 h v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu
sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min. při lab. teplotě), sediment
resuspendujeme v 1 ml ledové fixační směsi. Buňky necháme ve fixační směsi při -18°C přes noc.
Barvení buněk: Fixované buňky sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (2000 ot/min, 5 min. při
lab. teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml pufru pro barvení. Buňky inkubujeme v pufru pro
barvení minimálně 30 min. při 37°C.
38
v20140903
Průtoková cytometrie: U obarvených buněk analyzujeme obsah jaderné DNA (ploiditu) pomocí
průtokového cytometru. Relativní četnost (zastoupení) buněk v jednotlivých fázích buněčného
cyklu (G0/G1, S a G2/M) stanovíme pomocí softwaru. Porovnáme, jak se liší relativní zastoupení
v jednotlivých fázích buněčného cyklu u buněk ovlivněných N6-dimethylaminopurinem a buněk
kontrolních. Výsledky analýz viz následující obr.:
Obr. 3: Buňky K562 kultivované za standardních podmínek.
Obr. 4: Buňky K562 kultivované v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu 48 h.
Otázky
1. Proč je nutné buňky při barvení jaderné DNA pro průtokovou cytometrii inkubovat při
37°C?
2. Kterou fázi buněčného cyklu N6-dimethylaminopurin inhibuje?
39
v20140903
9.2
Odhadování obsahu jaderné DNA pomocí světelného mikroskopu
Chemikálie, biologický materiál
PBS; buňky K562 (viz výše); acetorcein (1 % roztok orceinu ve 45 % kyselině octové)
Postup:
Indukce změn v buněčném cyklu. Postupujeme stejně jako v předcházející úloze.
Barvení buněk: Buňky sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min při laboratorní
teplotě). Sediment resuspendujeme ve 100 μl média, přidáme 300 μl acetorceinu a po dobu 10 min.
zahřejeme na 60°C.
Pozorování buněčných jader ve světelném mikroskopu. Obarvené buňky naneseme na podložní
sklíčko, přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme při největším možném zvětšení. Všímáme si
změny velikosti buněk, zejména se však zaměříme na výskyt dvoujaderných buněk. Spočítáme
relativní četnost výskytu dvoujaderných buněk u buněk kultivovaných za standardních podmínek a
buněk kultivovaných v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu.
9.3
Mitóza rostlinné buňky
Pomůcky
Trvalý preparát roztlaků kořínků bobu koňského (Vicia faba) barvených Feulgenovou reakcí.
Postup
Preparát pozorujeme nejdříve malým zvětšením a vyhledáváme jednotlivé fáze mitózy.
Výsledek pozorování
Buňky s nalezenými fázemi mitózy pozorujeme objektivem 40× zvětšujícím a zakreslíme.
Všímáme si tvaru, velikosti a uložení jednotlivých chromozomů, pokusíme se určit jejich počet.
Výklad
Princip průkazu DNA Feulgenovou reakcí: Po hydrolýze (maceraci) kyselinou chlorovodíkovou se
z řetězců DNA odštěpují purinové báze a v místě jejich odštěpení se na podjednotkách deoxyribózy
uvolňují aldehydické skupiny. Schiffovo reagens – leukofuchsin (tj. fuchsin odbarvený siřičitanem)
pak reaguje specificky s těmito aldehydickými skupinami za vzniku kontrastního červenofialového
zbarvení.
Příprava preparátu
(studenti neprovádějí): odříznuté primární kořínky naklíčeného bobu koňského (1,5-2 cm dlouhé)
fixujeme v alkohol-octové fixáži po dobu 2 hod. Macerujeme v 5M HCl v pokojové teplotě
15 minut. Barvíme 2 hod v Schiffově bazi. Vypíráme v tekoucí vodě 10-20 min. Na podložní sklo
natřené glycerolbílkem přeneseme vždy jen špičku kořínku (meristematická zóna o délce 1-2 mm)
a přikryjeme celofánovým čtverečkem o velikosti krycího sklíčka zvlhčeným ve vodě. Objekt pak
poklepem gumou a rozválením zkumavkou roztlačíme do plochy. Ve formaldehydových parách
roztlačené buňky za 45 min přilnou k podložnímu sklu. Po stáhnutí celofánu umístíme preparát
na 10-20 min do vody a pak na 3 min do 96% etanolu. Po převedení přes odvodňovací řadu
zaléváme preparáty do solakrylu.
Složení roztoků:
Alkohol-octová fixáž: 3 díly absolutního alkoholu a 1 díl ledové kyseliny octové.
40
v20140903
Schiffova baze: 2 g bazického fuchsinu rozpustíme ve 170 ml vody, přidáme 30 ml 1M HCl a 3,8 g
K2S2O5 a mícháme 2 hod. Přes noc umístíme do tmy. Pak přidáme 1g aktivního uhlí. Po 1 minutě
přefiltrujeme přes papír zvlhčený v 1M HCl. Výsledná barva je čirá, nažloutlá.
Glycerolbílek: směs 25 ml vaječného bílku a 25 ml glycerolu (fixována tymolem).
Odvodňovací řada: 100% etanol+xylen 3:1; 1:1 a 1:3; xylen – po 5 minutách).
9.4
Dělení buněk pučením
Pomůcky
24 hod. stará kultura kvasinek (droždí) v tekutém Sabouraudově glukózovém médiu.
Mikroskopické potřeby, imerzní objektiv, papírky na čočky, benzín nebo etanol, krycí skla 0.
Postup
Ze suspenze kvasinek připravíme nativní preparát. Použijeme tenká krycí skla (nejlépe 0).
Po orientačním prohlédnutí preparátu malým zvětšením prohlížíme preparát imerzním objektivem.
Po skončeném pozorování otřeme imerzní objektiv papírkem na čočky. Pro dokonalé očištění
můžeme papírek slabě zvlhčit benzínem nebo etanolem.
Výsledek
Do protokolu nakreslíme několik kvasinkových buněk v různé fázi pučení. Jednu z nich prokreslíme
podrobně, tj. s vnitřní strukturou.
Výklad
Kvasinky patří mezi jednobuněčné houby (Endomycetes), jejichž cytokineze probíhá pučením.
Pučení je zvláštní způsob buněčného dělení. Jádro kvasinkové buňky se dělí mitoticky. Zaživa není
patrné, jeho polohu však často prozrazuje koncentrické seskupení organel u jeho povrchu. Některé
rody kvasinek jsou patogenní – vyvolávají u člověka onemocnění sliznic, pokožky nebo napadají
vnitřní orgány. Nejčastěji izolovanou patogenní kvasinkou je Candida albicans.
Kontrolní otázky
1. Která z fází interfáze má nejvíce proměnlivou délku a proč?
2. Jmenujte „kontrolní uzly“ buněčného cyklu. Ve kterých fázích jsou a co ovlivňují?
3. Rostou buňky během M fáze?
4. Z kolika chromatid se skládají chromozomy v G1 a v G2 fázi? Ve které fázi mitózy se
z chromatid stávají dceřiné chromozomy?
5. Uveďte různé typy cytokineze, které znáte.
41
v20140903
10. Meióza a gametogeneze
Studijní příprava
Rozmnožování a sexuální proces. Diferenciace pohlaví. Rekombinace genetické informace při
meióze. Meiotická segregace chromozomů. Průběh meiózy. Tvorba gamet – spermatogeneze
a oogeneze. Oplození.
Teoretický úvod
Diploidní buňka u pohlavně se množícího organismu obsahuje dvě homologní sady chromozomů.
Při pohlavním rozmnožování vznikají haploidní pohlavní buňky – gamety – které po oplození
dávají vznik diploidní zygotě, z níž postupně vznikají všechny buňky nového jedince.
Meióza je specializované buněčné dělení, v jehož důsledku vznikají haploidní gamety z diploidních
prekurzorových buněk. Gameta má jen jeden chromozom každého typu, buď paternálního nebo
maternálního původu. Rozchod paternálních a maternálních chromozomů do gamet během meiózy
je náhodný, proto jsou v gametách obsaženy v různých náhodných kombinacích. Kromě toho jsou
chromozomy v gametách rekombinovány, protože při synapsi homologních chromozomů
na začátku meiózy dochází s vysokou pravděpodobností ke crossing-overu. Meióza je tedy hlavním
zdrojem genetické variability jedinců, vznikajících pohlavním rozmnožováním.
Meióza probíhá v zárodečném epitelu pohlavních orgánů: v semenotvorných kanálcích varlat
a v korové vrstvě vaječníků. Buněčný cyklus takovéto zárodečné buňky (gametocyt prvního řádu)
také začíná interfází s G1, S a G2 fází a dále pokračuje meiózou, zahrnující dvě rychle po sobě
následující buněčná dělení, tzv. první a druhé meiotické dělení. Po jediné replikaci chromozomů
tedy následuje dvojí dělení buňky. Proto jsou buňky vzniklé meiózou haploidní.
První meiotické dělení označujeme jako heterotypické (pro některé základní odlišnosti od mitózy)
a redukční (vznikají při něm z jedné buňky diploidní dvě buňky haploidní – tj. s redukovaným
počtem chromozomů). Druhé meiotické dělení, které se shoduje s mitózou, nazýváme
homeotypické, ekvační.
Dlouhou a složitou první meiotickou profázi rozdělujeme podle morfologie chromozomů na pět
stadií – leptoten, zygoten, pachyten, diploten a diakinezi.
V leptotenu dochází ke zvětšování jader a je zahájena kondenzace chromozomů. Chromozomy jsou
značně dlouhé a jemné, obtížně rozlišitelné.
V zygotenu začíná synapse chromozomů – těsný kontakt homologních chromozomů. Každý pár
homologních chromozomů vytváří bivalent, přichycený k jaderné membráně.
V pachytenu je synapse téměř úplná, chromatidy se od sebe začínají vzdalovat, vznikají
čtyřvláknové útvary – tetrády. Kondenzace chromozomů pokračuje – začínáme pozorovat
chiazmata, místa proběhlého crossing-overu – výměny částí nesesterských chromatid, vedoucí
k rekombinaci genů.
V diplotenu končí synapse chromozomů, centromery chromozomů se od sebe začínají vzdalovat
a chiazmata se posunují ke koncům chromozomů. Krátké, silné chromozomy se odpojují od jaderné
memebrány.
V diakinezi vrcholí terminalizace chiazmat, zaniká jaderná membrána, mizí jadérko a vytváří se
dělicí vřeténko.
V první meiotické metafázi se chromozomy soustřeďují v ekvatoriální rovině buňky, homologní
chromozomy jsou ještě spojeny chiazmaty, ale jejich centromery již směřují k opačným pólům
buňky.
V první meiotické anafázi dochází k úplnému oddělení homologních chromozomů v tetrádě (jejich
centromery se nedělí) a z každého páru je tažen zcela náhodně k jednomu pólu buňky chromozom
42
v20140903
otcovský a ke druhému mateřský, každý stále tvořený dvěma sesterskými chromatidami. Je to
okamžik redukce počtu chromozomů na polovinu a náhodné meiotické segregace chromozomů.
Krátká první meiotická telofáze zakončuje první meiotické dělení, zaniká při ní dělicí vřeténko,
okolo částečně dekondenzovaných chromozomů u pólů se vytvoří jaderné membrány a uvnitř
dceřiných jader vznikají jadérka. Cytokinezí vznikají dvě haploidní dceřiné buňky s polovičním
počtem chromozomů. Obsahují však stejné množství DNA jako diploidní buňky, protože
chromozomy jsou dvouchromatidové.
Mezi prvním a druhým meiotickým dělením je krátká interkineze nebo buňky přecházejí přímo
do profáze druhého meiotického dělení, které je shodné s mitózou. Začíná krátkou profází
s kondenzací chromozomů, v níž zaniká jaderná membrána a vzniká dělicí vřeténko. Druhá
meiotická metafáze a anafáze probíhají rychle za sebou. Teprve v této druhé anafázi se rozdělují
centromery chromozomů, k pólům se rozcházejí jednotlivé chromatidy – budoucí dceřiné
chromozomy. V krátké telofázi se vytvoří jaderné membrány a buňky se podruhé rozdělí.
Z jednoho diploidního gametocytu tímto dvojím dělením vznikají čtyři haploidní buňky, z nichž
čtvrtina (při oogenezi), nebo všechny (při spermatogenezi) se stávají zralými funkčními gametami.
Cíl cvičení
1. rozlišení jednotlivých fází meiózy a spermatogeneze
2. ověření účinku cytostatika na tyto procesy
Velmi dobrý objekt pro pozorování meiózy jsou trvalé roztlakové preparáty získané z varlat
sarančete vrzavého, s velkými meiotickými chromozomy. Účinek cytostatik budeme pozorovat
na histologických řezech lidských varlat.
10.1 Meióza a spermatogeneze u sarančete
Pomůcky
Trvalé preparáty buněk varlat sarančete (saranče vrzavé – Psophus stridulus L.), barvené Giemsou;
mikroskop; soubor fotografií meiózy druhu Chothippus parallelus (2n = 17, X0).
Postup
Při vyhledávání jednotlivých stadií spermatogeneze a fází meiózy se studenti průběžně orientují
také podle sady fotografií s popisem, kterou mají k dispozici. Vhodná stadia vyhledávají malým
zvětšením, detaily prohlížejí objektivem 40× zvětšujícím. Nalezená stadia nakreslí.
Výsledek
Výsledkem jsou obrázky fází meiózy s popisem, nakreslené podle preparátu.
Výklad
Karyotyp sarančete vrzavého: samec 23 X0, samice 24 XX.
Rozlišení jednotlivých stadií spermatogeneze a meiózy:
1. Mitóza spermatogonií – profáze, metafáze (párové chromozomy blíže u sebe, možno zjistit počet
chromozomů, karyotyp 23 X0, foto 1a), anafáze, telofáze → spermatocyt I. řádu (primární
spermatocyt)
2. Meióza I – redukční dělení, heterotypické dělení
Profáze I: leptoten – minimální spiralizace, sotva znatelná vlákna chromozomů (foto 1b).
Zygoten – synapse homologních chromozomů → bivalenty; X chromozom výrazněji zbarvený než
heterochromatin autozomů. Je patrná spiralizace chromozomů (foto 1c, d).
43
v20140903
Pachyten – pokračující spiralizace chromozomů, proto jsou bivalenty kratší a silnější, je patrné
rozlišení chromozomů na dvě chromatidy (vznik tetrád); X chromozom je silněji spiralizován (foto
1e).
Diploten – vzájemné oddalování homologních chromozomů, jsou patrná chiasmata, je možné zjistit
vtah mezi délkou chromozomů a počtem chiasmat, a také průměrný počet chiasmat v jedné buňce,
případně rozdělit chromozomy na tři kategorie podle délek a zjistit u nich počty chiasmat (foto 1f,
5).
Diakineze – oddalování centromerických oblastí homologních chromozomů v bivalentech od sebe,
terminalizace chiasmat, maximální spiralizace bivalentů umístěných u jaderné membrány; je možno
zjistit počet bivalentů (11+X). Pozor – chromozom X nevytváří bivalent. Je možno se pokusit
o určení počtu chromozomů. (foto 2a).
Metafáze I – lokalizace chiasmat v ekvatoriální rovině, centromery směřují k pólům (foto 2b).
Anafáze I – charakteristický obraz, kdy se rozcházejí homologní chromozomy složené ze dvou
chromatid, které jsou dobře patrny. Je možné zjistit počet (n) a zastoupení jednotlivých typů
chromozomů (pozor, k jednomu pólu jde navíc X chromozom (foto 2c, d).
Telofáze I – telofázní shluky chromozomů, vznik spermatocytů II. řádu (sekundární spermatocyty)
(foto 3a).
3. Meióza II – ekvační dělení, homeotypické dělení
Profáze II a prometafáze II – zřetelná dvojitá struktura chromozomů, chromozom X je silně
spiralizován (foto 3b1, b2).
Metafáze II – patrný haploidní počet dvouchromatidových chromozomů, sestavení centromer
do ekvatoriální roviny (foto 3c1, c2).
Anafáze II – rozchod dceřiných chromozomů k pólům, je možno ověřit haploidní počet
chromozomů, které jsou jednochromatidové (foto 4a,b).
Telofáze II a konec meiózy se vznikem dvou spermatid.
4. Spermatida – dva typy, buď s chomozomem X nebo bez chromozomu X.
5. Spermatozoid – spermiohistogeneze, různá stadia vývoje spermií.
Poznámka
Příprava preparátů (studenti neprovádějí)
Samci sarančat jsou hned po chycení 2 hod fixováni v acetalkoholové fixáži (1 díl ledové kyseliny
octové a 3 díly 96% etanolu) a vloženi do 70% etanolu. Z takto předfixovaných sarančat
vypreparujeme varlata, která preparační jehlou částečně roztrháme a vložíme je na 30 minut do
čerstvé acetalkoholové fixáže. Vzorky promýváme 5 minut vodou a 3 min hydrolyzujeme (60°C
v 1 M HCl). Po hydrolýze vložíme část varlete na čisté podložní sklíčko do kapky vody a
provedeme roztlak. Při roztlaku postupujeme tak, že přes vzorek položíme ve vodě namočený
proužek celofánu.
Vezmeme zkumavku a pomocí zkumavky mírným tlakem valivým pohybem vzorek roztlačíme
(pouze jednou). Vzorek s celofánem necháme zaschnout. Po zaschnutí celofán sám odpadne.
Sklíčko s roztlačenými buňkami barvíme Giemsou 10-20 min (roztok Giemsy ředíme destilovanou
vodou 1:9 obj. a zfiltrujeme). Po barvení vzorek opláchneme vodou, přikápneme glycerin,
přiklopíme krycí sklíčko a pozorujeme. Fixáž i Giemsu připravujeme čerstvě.
44
v20140903
10.2 Spermatogeneze u člověka
Pomůcky
Trvalé preparáty histologických řezů semennými kanálky varlat člověka, barvené hematoxylineosinem nebo Feulgenovou reakcí; mikroskop
Postup
Preparáty prohlédneme malým zvětšením, při velkém zvětšení se pokusíme najít a zakreslit
jednotlivá stadia spermatogeneze. Nové generace semenných buněk postupují od periferie
(membrana propria) k lumen kanálku. Poblíž membrana propria nacházíme spermatogonie,
směrem k lumen potom primární a sekundární spermatocyty; spermatidy (drobnější buňky se sytě
zbarveným jádrem) a spermatozoidy se nacházejí uprostřed kanálku.
Výsledek
Zakreslíme schematický průřez kanálkem a popíšeme jednotlivé buňky.
10.3 Vliv cytostatika na spermatogenezi
Pomůcky
Trvalý preparát histologického řezu semennými kanálky varlat člověka, který byl dlouhodobě léčen
cytostatiky (řez barvený Feulgenovou reakcí); mikroskop
Postup
Preparát prohlížíme postupně malým a velkým zvětšením. Nález srovnáme s nálezem v předchozím
úkolu. Výsledek srovnání zapíšeme. Nekreslíme.
Poznámka
Léčba cytostatiky zastavuje buněčnou proliferaci. Inhibuje rozmnožování nádorových buněk,
ale současně zastavuje i meiózu (gamety se nediferencují). Po léčbě cytostatiky dochází u některých
pacientů k nevratné zástavě gametogeneze (zůstávají poté neplodní). U jiných pacientů se naopak
může spermatogeneze obnovit po skončení léčby (v závislosti na typu použitého cytostatika).
Pacientům je možno nabídnout autokryokonzervaci spermií před zahájením chemoterapeutické
léčby.
Kontrolní otázky:
1. Ve které fázi meiotického dělení dochází k rekombinaci chromozomů, kdy dochází
k redukci jejich počtu a kdy k jejich segregaci?
2. Co je to bivalent? Z kolika chromatinových vláken se skládá? Co je to synaptonemální
komplex?
3. Kolik bivalentů vzhledem k počtu chromozomů vytváří buňka v zygotenu?
4. Co jsou to chiasmata? Kdy dochází k jejich terminalizaci?
5. Uveďte dva hlavní zdroje genetické variability gamet v meióze.
6. Uveďte stadia spermatogeneze člověka. Které buňky jsou diploidní a které haploidní?
7. Proč tato stadia nenacházíme v semenných kanálcích člověka, který byl léčen cytostatiky?
45
v20140903
11. Buněčná diferenciace a apoptóza
Teoretický úvod
Celý mnohobuněčný organismus se vyvíjí z jediné buňky – zygoty (oplozeného vajíčka). Somatické
buňky v jednom organismu tak nesou stejnou genetickou informaci. Přesto se buňky různých tkání
liší svojí strukturou i funkcí – jsou diferencované. Jako diferenciace se označuje proces, při kterém
ke specializaci buněk dochází. Je důležité si uvědomit, že buňka nese identickou genetickou
informaci ve všech stadiích buněčné diferenciace. Odlišné specializace buněk je dosaženo tím,
že v různých typech buněk jsou exprimovány různé geny – jedná se o tzv. diferenciální
(specifickou) genovou expresi (tj. expresi různých genových skupin).
Různé typy buněk tak vytváří různé proteinové produkty a v průběhu procesu diferenciace získávají
buňky konkrétní, specializované vlastnosti. Termínem konečná (terminální) diferenciace se
označuje pozdní fáze diferenciačního procesu, konec vývojové dráhy. Terminálně diferencované
buňky jsou vysoce specializované, schopné plnit konkrétní funkce v organizmu.
V průběhu ontogeneze můžeme u člověka pozorovat buněčnou diferenciaci na těchto úrovních:

rýhování vajíčka a raná embryogeneze (vznik trofoblastu a embryoblastu; vznik
zárodečných listů)

vývoj orgánů a diferenciace buněk tkání (embryonální vývoj)

po narození: hematopoéza, obnova buněk (epitely), spermatogeneze
Aktivace kaspázových proteáz, indukce apoptózy
V průběhu prenatálního vývoje dochází k výrazným změnám embrya a plodu; některé tkáně nebo
buňky během tohoto vývoje také zanikají (blána spojující prsty; neurony, které nenavázaly funkční
synapse, atd.). Dále v průběhu života opotřebené buňky některých tkání zanikají a jsou nahrazovány
novými. Existují 2 základní typy buněčné smrti, které se liší v základních charakteristikách:
apoptóza a nekróza. Apoptóza je fyziologická buněčná smrt, která je řízena samotnou umírající
buňkou. Apoptóza se vyskytuje jako nedílná součást embryogeneze, ontogenetického vývoje
a diferenciace buněk u živočichů. Podílí se na udržování homeostáze ve tkáních, hraje
nezastupitelnou roli při vývoji imunitního systému. Apoptotické buňky nezpůsobují zánět v okolní
tkáni a jsou okolními buňkami pohlcovány.
Apoptóza se vyznačuje charakteristickou kondenzací jádra i celé buňky. Ke kondenzaci a viditelné
fragmentaci jádra dochází v důsledku aktivace endonukleáz, které nevratně štěpí jadernou DNA
na fragmenty o definované délce. Tento biochemický znak se používá jako jedno z kritérií
na odlišení apoptózy od nekrózy, neboť při nekróze je jaderná DNA relativně málo degradována.
Klíčovou roli v procesu apoptózy u živočichů hrají kaspázy (cysteinové proteázy), jež jsou
v procesu apoptózy aktivovány. Kaspázy mají vyhraněnou substrátovou specifitu – štěpí sekvenci
proteinu za zbytkem kyseliny asparagové. Jejich fyziologickými substráty jsou strukturní proteiny
jádra i cytoplazmy, regulační proteiny aj.
Předpokládá se, že štěpení těchto proteinů pak vede k charakteristické morfologii apoptotických
buněk. Kaspázy jsou syntetizovány jako neaktivní proenzymy a v této formě jsou přítomny
v buňkách. Jsou aktivovány proteolytickým štěpením na velkou a malou podjednotku (aktivní
enzym se pak skládá ze dvou větších a dvou menších podjednotek). Aktivace kaspáz je do značné
míry prostudována u savčích buněk, rozeznáváme tři mechanizmy: s přímou účastí mitochondrií,
prostřednictvím extracelulárních receptorů a granzymem B (granzym B je serinová proteáza
vylučovaná cytotoxickými T-lymfocyty).
Jako protiklad apoptózy se obvykle uvádí nekróza, což je termín používaný pro nefyziologickou
a „pasivní“ buněčnou smrt. Charakteristickým morfologickým rysem nekrózy je bobtnání
46
v20140903
mitochondrií i celých buněk, jež končí rozpadem všech buněčných struktur a organel. Nekróza
postihuje skupiny buněk a v okolní tkáni způsobuje zánět.
11.1 Rýhování zygoty a vývoj zárodku
Pomůcky
Suspenze vyvíjejících se vajíček škrkavky prasečí (Ascaris suum) ve 4% roztoku formaldehydu;
mikroskopické potřeby
Postup
Připravíme preparát z nepříliš husté suspenze vajíček Ascaris suum. Prohlížíme nejprve při použití
10× zvětšujícího objektivu, vyhledáváme různá stadia vývoje zárodku ve vajíčku a všímáme si
rýhování. Při větším zvětšení zakreslíme a popíšeme stadium nerýhované zygoty a stadia po prvním
a druhém rýhovacím dělení, dále blastulu, stadium gastruly, případně i vyvinutou larvu. Stadium
nerýhované zygoty kreslíme se všemi vaječnými obaly, ostatní stadia zakreslujeme bez obalů.
Jednotlivá vývojová stadia porovnáme s fotografiemi vývojových stadií, které jsou vystaveny jako
demonstrace.
Výklad
Rýhování vajíček Ascaris suum je totální, ekvální – jsou to vajíčka holoblastická s malým
množstvím žloutku (vajíčka obsahující mnoho žloutku jsou meroblastická, dělí se parciálně).
Vajíčka škrkavek jsou determinační, mozaiková – jedna ze dvou prvních blastomer se vyvíjí
v reprodukční systém a druhá ve všechny ostatní části těla. (U indeterminačních, regulačních zygot
jsou blastomery zárodku až do pozdních fází rýhování pluripotentní).
Vajíčka škrkavek jsme získali z děloh dospělých samic. Škrkavka prasečí parazituje u prasat.
Její životní cyklus je stejný jako u škrkavky dětské (Ascaris lumbricoides), která parazituje
u člověka. Dospělé škrkavky žijí v tenkém střevě svého hostitele, kde samice kladou vajíčka, která
se stolicí dostávají do vnějšího prostředí, kde se rýhují. Po spolknutí rozrýhovaného vajíčka
v invazivním stadiu (tzn. schopném vyvolat onemocnění) je vajíčko v žaludku zbaveno obalů
a larvy pronikají stěnou tenkého střeva do krevních kapilár, do jater a přes srdce do plic. Zde larvy
rostou a aktivně se pohybují, což postiženého nutí ke kašli. Jsou-li larvy vykašlány a znovu
polknuty, dostávají se přes žaludek do tenkého střeva, kde dospívají.
Poznámka
V dělohách samic se vajíčka nerýhují, zde se tedy nacházejí ve stadiu zygoty. K vývoji dochází
až ve vnějším prostředí, při 80-100 % relativní vzdušné vlhkosti, asi 24°C a za přítomnosti kyslíku.
Prostředím pro vývoj je i 4% formaldehyd, ve kterém vajíčka zůstávají živá. Vajíčka obsahující
pohyblivou larvu po prvním svlékání jsou invazivní a jsou-li polknuta, mohou vyvolat onemocnění
i u člověka (až po plicní stadium). Vajíčka v nižších vývojových fázích nejsou patogenní.
Po cvičení je nutné umýt si ruce.
11.2 Měření aktivity kaspázy-3
Chemikálie, biologický materiál
PBS (Phosphate buffered saline; izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfátovým pufrem);
Lyzační pufr: 50 mM HEPES, pH 7,2; 5 mM dithiotreithol (DTT); 0,5 % Triton X-100;
Směs inhibitorů proteáz;
Pufr pro měření aktivity: 20 mM HEPES, pH 7,2; 5 mM dithiotreithol; 2 mM EGTA;
Substrát: 1mM acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-methyl kumarin (Ac-DEVD-AMC)
47
v20140903
Buňky K562: nádorová buněčná linie odvozená z myeloidní leukémie s Filadelfským
chromosomem. Buňky jsou volně rostoucí v médiu.
Postup
Indukce apoptózy: K buněčné suspenzi přidáme cytotoxické agens (0,5 μM Glivec) a inkubujeme
přes noc.
Příprava cytoplazmatického lyzátu: Přibližně 5×106 buněk inkubovaných přes noc v přítomnosti
Glivecu sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min. při lab. teplotě), sediment
resuspendujeme v 1 ml PBS pufru a znovu sedimentujeme centrifugací za stejných podmínek.
Supernatant odsajeme pipetou a sedimentu resuspendujeme ve 100 μl lyzačního pufru a zkumavku
inkubujeme na ledu 15 minut za občasného protřepávání. Lyzát přečistíme sedimentací (18 000
ot/min, 5 min při 4°C). Jako kontrolu použijeme buňky kultivované ve standardním médiu, jež
zpracujeme stejným způsobem (viz výše).
Měření aktivity kaspázy-3: Do tří zkumavek napipetujeme 200 μl pufru pro měření aktivity
kaspázy-3. Do každé pak přidáme 10 μl substrátu. Reakci iniciujeme přídavkem 50 μl buněčného
lyzátu. Do první zkumavky přidáme lyzát z buněk kultivovaných za normálních podmínek
(kontrola), do druhé lyzát z buněk inkubovaných v přítomnosti Glivecu a do třetí pak místo lyzátu
destilovanou vodu (blank). Zkumavky inkubujeme 45-60 min při laboratorní teplotě. Následně
napipetujeme 200 µl z každé zkumavky do mikrotitrační destičky. U každého vzorku změříme
fluorescenci: excitační vlnová délka 360 nm, emisní vlnová délka 465 nm. Aktivitu kaspázy
vyjádříme v bezrozměrných jednotkách jako intenzitu fluorescence (osa Y). Od hodnot fluorescence
obou vzorků buněk odečteme hodnotu blanku. Vypočteme kolikrát se zvýšila aktivita kaspázy-3
u buněk kultivovaných v přítomnosti Glivecu proti kontrole.
11.3 Pozorování morfologických změn u apoptotických buněk
Chemikálie, biologický materiál:
buňky K562 (viz výše), acetoorcein
Postup:
Indukce apoptózy: K buněčné suspenzi přidáme cytotoxické agens (0,5 μM/ml Glivec)
a inkubujeme přes noc.
Barvení buněk: K buněčné suspenzi (50 μl) neovlivněných i ovlivněných buněk přikápneme
acetoorcein a necháme inkubovat 5 min při laboratorní teplotě. Obarvené buňky naneseme
na podložní sklíčko, přikryjeme krycím sklíčkem, přebytek tekutiny odsajeme a pozorujeme při
největším možném zvětšení. Všímáme si změny velikosti a tvaru buněk, zejména se však zaměříme
na morfologické změny v jádře buněk kultivovaných v přítomnosti Glivecu. Pozorování zakreslíme.
Kontrolní otázky:
1. Proč vzniká v okolí nekrotických buněk zánět, zatímco v případě apoptotických buněk ne?
2. Vyjmenujte nejdůležitější funkce mitochondrií.
3. Jaký je rozdíl mezi zygotami determinačními (mozaikovými) a indeterminačními
(regulačními)?
48
v20140903
12. Biologie krve. Krevní elementy
Teoretický úvod
Krvetvorba (hematopoéza), proces tvorby a obnovy krevních buněk, je příkladem diferenciace,
která probíhá v průběhu celého života jedince. V průběhu hematopoézy diferencuje hematopoetická
kmenová buňka do všech krevních řad. Hematopoéza se vyznačuje neustálou obnovou, kdy různé
skupiny krevních buněk jsou obměňovány různou rychlostí. Např. červené krvinky mají životnost
120 dnů; některé T-lymfocyty až několik let. S diferenciací krevních buněk jsme se poprvé setkali
ve cvičení o buněčných kulturách, kdy jsme pozorovali kolonie krevních buněk rostoucí
na polotekutém (metylcelulózovém) médiu.
Hematopoetická kmenová buňka je nediferencovaná krevní buňka, jejíž diferenciací vznikají
charakteristické krevní řady (někdy označované také jako krevní linie). Tzv. progenitorové
kmenové buňky jsou již do určité míry diferencované, patří už k určité krevní řadě, ale mají
schopnost ještě dále diferencovat. Kmenové buňky a progenitory se v dospělosti nacházejí hlavně
v kostní dřeni.
V periferní krvi dominují již terminálně (koncově) diferencované krevní elementy: granulocyty
(několik podtypů), monocyty, trombocyty (krevní destičky), erytrocyty (červené krvinky), B a T
lymfocyty a některé další vzácnější krevní buňky. Specifickou formou diferenciace se vyznačuje
proces tvorby krevních destiček (tzv. megakaryopoéza). Zrání megakaryocytů se vyznačuje tzv.
endomitózou, tedy množením jaderného materiálu bez dělení buňky (vznikají polyploidní buňky).
Následně dochází k syntéze řady nových proteinů (většinou glykoproteinové povahy), které
vytvářejí v cytoplazmě krevní destičky. Ty se následně uvolňují přímým rozpadem megakaryocytů.
Poruchy diferenciace u lidských chorob
Kancerogeneze je proces hromadění genetických a buněčných změn vedoucích k rozvoji
zhoubných nádorů. Označuje se také jako proces maligní transformace (viz výklad v kapitole
věnované kultivaci savčích buněk a buněčným liniím). Kancerogeneze je závislá na souhře těchto
genetických změn, ke kterým musí postupně dojít v jediné buňce. Součástí procesu maligní
transformace bývá i porucha diferenciace, která se většinou projevuje jako zástava (blok)
49
v20140903
terminální diferenciace. Typickým příkladem choroby, která se vyznačuje neschopností určitého
buněčného typu (tkáně) terminálně diferencovat, jsou akutní leukémie. Podle typu
hematopoetického progenitoru, ve kterém dojde k bloku diferenciace, rozlišujeme akutní leukémie
myeloidní nebo lymfoidní. Jedním z možných léčebných postupů je opětné navození terminální
diferenciace diferenciačními látkami, které aktivují expresi diferenciačních genů. Některé z těchto
látek se používají v léčbě akutních leukémií, jiné (jako např. adenin) se teprve testují
experimentálně.
12.1 Odečet krevního diferenciálu
Jak jste se již seznámili v praktiku věnovaném buněčnému cyklu, průtoková cytometrie je technika
pro rychlé měření optických vlastností jednotlivých částic nebo buněk, které procházejí snímacím
místem. Tato skutečnost se využívá v hematologii pro automatické určení krevního diferenciálu.
Rozptyl světla odpovídá velikosti a granularitě (denzitě) procházejících buněk nebo částic. Přístroj
zaznamenává počet buněk ve vzorku krve a zároveň identifikuje jednotlivé krevní elementy;
např. lymfocyty jsou malé a denzní buňky, naopak granulocyty jsou buňky větší s vyšší denzitou.
Kromě toho je tento přístroj schopný změřit i obsah hemoglobinu v erytrocytech.
V praktiku budou demonstrovány krevní diferenciály zdravých jedinců a pacientů s různými
poruchami krvetvorby.
12.2 Krevní nátěry
Materiál
Nátěry periferní krve několika zdravých i nemocných jedinců, barvené tzv. barvením GiemsaRomanowski.
Postup
V krevních nátěrech periferní krve se pokusíte identifikovat základní krevní elementy. Použijte
zvětšení 400×. Nakreslete hlavní typy krevních buněk.
12.3 Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu
Dělící se a diferencující buňky v polotuhém médiu mají omezený pohyb, vytvářejí proto kolonie
(kolonie = potomstvo jedné dělící se buňky, klon). U krevních buněk můžeme pozorovat
hemoglobinizované kolonie červených krvinek a kolonie různých typů bílých krvinek.
Materiál
Metylcelulózové kultivační médium, hematopoetické (=krvetvorné) růstové faktory, prekurzory
lidských krevních buněk izolované z periferní krve. Plastové misky s kulturami lidských krevních
buněk
Postup
Prekurzory lidských krevních buněk byly smíchány s metylcelulózovým médiem a do kultury byly
přidány hematopoetické růstové faktory, které umožnily růst a diferenciaci krevních prekurzorů
do jednotlivých krevních buněčných typů. Kolonie krevních buněk rostly na miskách v polotuhém
kultivačním médiu v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2 atmosféře po dobu 10 až 14 dnů.
Při zvětšení 100× (10× zvětšujícím objektivem) budeme pozorovat různé typy kolonií krevních
buněk.
50
v20140903
12.4 Indukce diferenciace nádorových buněk linie K562
Materiál:
buňky buněčné linie K562; adenin, pufr PBS (izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfáty; pH 7,4),
barvící roztok benzidinu (2 mg benzidinu jsme rozpustili v 1 ml 0,5 M kyseliny octové a přidali
30 µl H2O2). Benzidin je činidlo, které tvoří modrou sraženinu po oxidaci hemoglobinu hemovou
skupinou v přítomnosti peroxidu vodíku.
Postup
1. Indukce diferenciace: K buněčné suspenzi (buňky K562 v tekutém kultivačním médiu) jsme
přidali adenin (výsledná koncentrace adeninu v médiu: 0,5 mM) a inkubovali 3-5 dnů
při standardních podmínkách. Jako kontrolu jsme použili buňky bez přídavku adeninu.
2. Barvení buněk: Přibližně 2×106 buněk bude centrifugováno (1500 ot/min, 5 min) a buňky
budou resuspendovány v 1 ml PBS a opět centrifugovány. Po odsátí PBS bude buněčný
pelet resuspendován a k 50 µl přečistěné buněčné suspenze přidáme 10 µl barvícího roztoku
benzidinu. Směs promícháme a inkubujeme 5 min při laboratorní teplotě.
3. Počítání benzidin-pozitivních buněk. V preparátu budeme počítat procento modře
obarvených buněk a srovnáme s kontrolou. Modré buňky jsou erytroidní buňky exprimující
hemoglobin.
Upozornění
Benzidin je toxický a má karcinogenní účinky.
Kontrolní otázky
1. Jaký je poměr červených a bílých krvinek v periferní krvi a proč?
2. Jakou jedinečnou vlastností z hlediska buněčného dělení a replikace se vyznačují
megakaryocyty?
3. Jaký by byl rozdíl mezi krevním nátěrem periferní krve a krevním nátěrem kostní dřeně
u dospělého člověka?
4. Jaký typ krevních buněk převládá v nátěru u pacienta s akutní leukemií?
5. Ze kterého krevního progenitoru je odvozena buněčná linie K562, jestliže buňky K562
mohou být diferencovány do fenotypu červené krevní řady?
51
v20140903
13. Onkogeny a tumor-supresorové geny (prezentace studentů)
Doporučená témata pro referáty
 protoonkogeny a tumor-supresorové geny

etiologie nádorů, genetická podstata zhoubného bujení

léčba nádorových onemocnění

mutagenní faktory vnějšího prostředí a vznik nádorů

poruchy diferenciace a/nebo apoptózy ve vztahu k onemocněním

imunitní systém a nádorová onemocnění

leukémie
o např. chronická myeloidní leukémie, Bcr/Abl, inhibitory kináz, ...
o typy leukémií, jejich progrese a možnosti léčby
Další doporučená témata
 šest nejčastějších nádorových onemocnění představuje téměř polovinu všech nově
diagnostikovaných nádorů ve světě:
o karcinom plic
o karcinom prsu (např. i geny BRCA1, BRCA 2)
o karcinom žaludku
o kolorektální karcinom
o karcinom jater
o karcinom děložního čípku
Vybrané odkazy
http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/prirucky/brca1-brca2.pdf
http://www.hpv.cervix.cz/charakteristika-viru.html
http://www.gynet.cz/?page=9&msgid=52
http://www.hpb.cz/index.php?pId=05-2-04
http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/aflatox.php
dále:
materiály na internetu – pouze z důvěryhodných webů (např. weby institucí – nemocnic,
onkologických center, ústavů, ...)
časopisy v knihovně LF UP, ...
Seznam použitých zdrojů
Na konci prezentace bude uveden seznam všech použitých zdrojů.
52
v20140903
© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc
Praktická cvičení z biologie
2012
Skriptum pro zimní semestr 1. ročníku
Určeno pro studenty oborů Všeobecné lékařství, Zubní lékařství
53
v20140903
54
v20140903