Analýza komplexní odpovědi buněk na poškození DNA v kombinaci

Analýza komplexní odpovědi buněk na poškození
DNA v kombinaci s fenotypizací
Karel Souček
Šárka Šimečková
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i.
Královopolská 135
612 65 Brno
e-mail: [email protected]
tel.: 541 517 166
DNA damage
DNA Damage and Repair
BioFiles 2007, 2.4, 20.
Targeting the DDR
Examples of DDR inhibitors in clinical use or in
development
Stéphane Richard
Cíl

Vyvinout
detekci
metodu
pro
současnou
– poškození DNA
– syntézy DNA
– Buněčného cyklu
– Apoptózy
– Životnosti
v kombinaci s buněčnou imunofenotypizací
Detekované parametry
Parametry
Markery
Flourochrom
Povrchové
znaky
CD133
PerCPeFluor710
CD44
APC/Cy7
Životnost buněk LIVE/DEAD kit
Yellow
Syntéza DNA
Pacific Blue
Click-it EdU
Buněčný cyklus FxCycle
FarRed
Poškození DNA pH2AX
PE
apoptóza
FITC
M30
CD133/Prominin-1



Transmembránový glykoprotein popsaný jako typický znak
nádorových kmenových buněk (NKB)
stále kontroverzní z hlediska definice NKB
funkce není detailně známa
Yu X, et al. (2011). CD133, Stem Cells, and Cancer Stem Cells:
Myth or Reality? Curr Colorectal Cancer Rep 7: 253-259.
CD44



receptor pro kyselinu hyaluronovou
funkce v regulaci mezibuněčné interakce, adheze a migrace
exprese u řady buněčných typů včetně NKB prostaty a prsu
Ponta H, Sherman L, Herrlich PA (2003). CD44: From adhesion
molecules to signalling regulators. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 33-45.
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stains

fluorescenční značky reagující s aminy
– Živé buňky – pouze na povrchu
– Mrtvé buňky s permeabilní membránou až
50x > fluorescence
– Kompatibilní s formaldehydovou fixací
– Kompenzace - ArC™ Amine Reactive
Compensation Bead Kit
EdU Click-It
- Metoda pro analýzu syntézy DNA
FxCycle Far Red
značka pro detekci nukleových kyselin u
fixovaných buněk
 pro detekci DNA nutno použít RNasu
 značka se po inkubaci neoplachuje

gH2A.X (p-Ser139)

Abundantní znak korelující s
výskytem dvouřetězcových
zlomů DNA
Lukas J, Bartek J (2009). DNA repair: New
tales of an old tail. Nature 458: 581-583.
Detekce apoptózy
M30 CytoDEATH antibody


protilátka specificky rozpoznává fragment CK18 po
štěpení kaspázami 3, 6, 7, 9
CK18, součást mikrofilament epiteliálních buněk
Materiály, design experimentu

Buněčné linie
– HCT116
– (cE2)

Použité látky
– MLN-4924
• Inhibitor dráhy neddylace
• ↑p27Kip1, Cdt1, …
– TRAIL, MG132 (pozitivní kontroly)

Design experimentu
(Soucy et al. 2009)
Shrnutí

Podařilo se zavedení protokolu na
víceparametrovou analýzu
+
 Možnost komplexní analýzy cytokinetiky
nádorových buněk ve smyslu detekce
syntézy DNA, buněčného cyklu,
poškození DNA, apoptózy v kombinaci
s povrchovými znaky
Limitace

M30 ~ znak apoptózy pouze u lidských epiteliálních
buněk
– Náhrada např. anti-cleaved PARP (Asp214) Antibody
(mouse or human specific)
– TUNEL (?)

hCD133 ab cross reaguje s intracelulárním epitopem
CK18
– Nelze detekovat u mrtvých buněk
vysoká svítivost FxCycle Far Red znesnadňuje
kompenzaci s APC-Cy7
 Vysoký CV u histogramů buněčného cyklu po fixaci
PFA
 vysoké pozadí u kontrol u M30a gH2A.X
 omezený výběr konjugovaných Ab
