Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány

Univerzita Karlova v Praze
1. lékařská fakulta
Psychiatrická klinika
Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány
HABILITAČNÍ PRÁCE
Praha 2005
RNDr. Zdeněk Fišar, CSc.
Není dosud jasné, co je primární příčinou vzniku většiny duševních poruch a jaké jsou
molekulární mechanismy vedoucí k terapeutickým účinkům používaných psychofarmak.
Pokrok v této oblasti je spojen s hlubším poznáním normálních funkcí mozku. Při formulaci a
ověřování hypotéz o molekulárních mechanismech provázejících vznik nebo léčbu poruch
nálady vycházíme hlavně z pozorování mechanismů účinků látek s antidepresivními účinky.
Místem primárního účinku většiny antidepresiv je plazmatická membrána. Vzhledem
k amfifilním vlastnostem těchto léčiv dochází nejen k vazbě na specifická proteinová vazebná
místa, ale i k významným interakcím s lipidovou částí buněčných membrán. Protože
terapeutické účinky antidepresiv se projevují až po delší době jejich podávání, je nutné poznat
i jimi vyvolané adaptivní buněčné změny. Jedná se o mezioborový výzkum využívající
především biochemické, genetické, molekulárně biologické, biofyzikální a farmakologické
modely a metody.
Předložená práce shrnuje výsledky studia interakcí antidepresiv s modelovými a buněčnými
membránami, které jsem publikoval v letech 1996-2005. Protože řada výsledků má své
kořeny i v době dřívější, rád bych zde poděkoval nejen spoluautorům prezentovaných prací,
ale i ostatním spolupracovníkům, kteří se podíleli na výzkumu mechanismů účinků
antidepresiv. Za podporu, kterou věnovali a věnují výzkumné činnosti naší laboratoře, děkuji
prof. MUDr. Jiřímu Rabochovi, DrSc., přednostovi Psychiatrické kliniky, a prof. MUDr.
Petru Zvolskému, DrSc., emeritnímu přednostovi Psychiatrické kliniky.
Tuto práci věnuji své ženě Andree s díky za stálou podporu, inspiraci a pochopení.
V Praze, 26. září 2005
2
Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány
OBSAH
1.
ÚVOD DO PROBLEMATIKY...........................................................................................................4
1.1.
SYNAPTICKÝ PŘENOS NERVOVÉHO SIGNÁLU ..........................................................................................6
1.1.1. Neurony a chemické synapse ...........................................................................................................6
1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán ...............................................................................................7
1.1.3. Dynamika buněčných membrán .....................................................................................................10
1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery ...............................................................................12
1.1.5. Membránové přenašeče pro neurotransmitery ..............................................................................14
1.1.6. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi ......................................................15
1.2.
HYPOTÉZY PORUCH NÁLADY (AFEKTIVNÍCH PORUCH)..........................................................................17
1.2.1. Východiska hypotéz........................................................................................................................17
1.2.2. Serotoninové hypotézy....................................................................................................................18
1.2.3. Biofyzikální (membránové) hypotézy .............................................................................................19
1.3.
ANTIDEPRESIVA ....................................................................................................................................22
1.4.
MEMBRÁNOVÝ PŘENAŠEČ PRO SEROTONIN PŘI DEPRESI A JEJÍ LÉČBĚ ...................................................25
1.5.
INTERAKCE ANTIDEPRESIV S LIPIDOVÝMI MEMBRÁNAMI ......................................................................28
1.5.1. Modelové membrány (liposomy) ....................................................................................................28
1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána...............................................................................29
1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně .............................................................................................31
1.6.
LITERATURA .........................................................................................................................................34
2.
SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ ................................................................42
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
VAZBA IMIPRAMINU K FOSFOLIPIDOVÝM DVOJVRSTVÁM MĚŘENÁ METODOU VAZBY RADIOLIGANDU .42
INTERAKCE TRICYKLICKÝCH ANTIDEPRESIV S FOSFOLIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI ...............................47
ROZDĚLENÍ IMIPRAMINU MEZI KREVNÍ BUŇKY, PLAZMU A MOZEK .......................................................50
VLIV ANTIDEPRESIV S RŮZNÝMI FARMAKOLOGICKÝMI ÚČINKY NA UPTAKE SEROTONINU DO
TROMBOCYTŮ .......................................................................................................................................52
2.5.
VLIV DLOUHODOBÉHO PODÁVÁNÍ ANTIDEPRESIV NA LIPIDOVÉ SLOŽENÍ MOZKOVÝCH MEMBRÁN .......55
2.6.
UPTAKE SEROTONINU DO TROMBOCYTŮ U DEPRESIVNÍCH PACIENTŮ BĚHEM LÉČBY ............................58
2.7.
TRANSPORT TRIJODTHYRONINU DO ERYTROCYTŮ JAKO MEMBRÁNOVÝ PARAMETR DEPRESE...............60
2.8.
FARMAKOLOGICKY INDUKOVANÉ SNÍŽENÍ CHOLESTEROLU VYVOLÁVÁ ČASOVĚ OMEZENÉ ZMĚNY
V SEROTONERGNÍ TRANSMISI ................................................................................................................63
2.9.
CELKOVÁ DISKUSE ...............................................................................................................................66
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...........................................................................................................................75
3.
SEZNAM PUBLIKACÍ TVOŘÍCÍCH PODKLAD HABILITAČNÍ PRÁCE.............................77
4.
CITAČNÍ OHLASY ..........................................................................................................................81
5.
PŘÍLOHY...........................................................................................................................................90
3
1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY
Poznatky o molekulární podstatě poruch nálady (afektivních poruch) jsou získávány
především na základě studia mechanismů účinků antidepresiv. Předpokládá se, že poruchy
nálady jsou způsobeny narušením neurotransmise v mozku, především poruchami v přenosu
signálu přes chemické synapse, a antidepresiva uskutečňují své terapeutické účinky
specifickým ovlivněním funkce membránových a nitrobuněčných složek zapojených do
tohoto přenosu.
Synaptický přenos nervového signálu umožňují specifické membránové proteiny
(receptory, iontové kanály, přenašeče, enzymy) a přímé i adaptivní účinky antidepresiv na
jejich funkce jsou studovány jak in vitro na izolovaných membránách a buňkách, tak in vivo
na zvířecích modelech nebo ex vivo na lidských krevních buňkách. Významnou úlohu mají
v přenosu signálu i membránové lipidy a steroly, o nichž je známo, že netvoří pouze
strukturní základ buněčných membrán, ale jsou substráty pro některé druhé posly a volné
mastné kyseliny a ovlivňují aktivitu řady proteinů přes změnu jejich pohyblivosti v membráně
nebo přes specifické interakce lipid-protein.
Vzhledem k chemickým vlastnostem antidepresiv dochází nejen k jejich vazbě na
specifická proteinová vazebná místa, ale i k jejich akumulaci v lipidové části buněčných
membrán. Dosud nejsou známy všechny důsledky těchto interakcí pro účinnost nebo pro
vedlejší účinky farmakoterapie. Interakce antidepresivum-membránové molekuly jsou
studovány na modelových fosfolipidových dvojvrstvách, na rekonstituovaných systémech
(proteoliposomech), na izolovaných membránách i na celých buňkách.
Nepřímo lze interakce léčivo-buněčná membrána charakterizovat pomocí sekundárních
reakcí, nebo přes ovlivnění procesů vyvolaných jinými biologicky aktivními látkami. Metody
používané pro toto studium využívají často látky značené radionuklidy, jadernou magnetickou
rezonanci, diferenciální skanovací kalorimetrii, elektronovou paramagnetickou rezonanci,
neutronovou difrakci a v neposlední řadě fluorescenční spektroskopii. V našich
experimentech jsme používali hlavně tritiem značená antidepresiva, neurotransmitery nebo
fosfolipidy a fluorescenční sondy. Tento přístup nám umožnil studovat interakce membránaléčivo s minimálními vedlejšími efekty informačních molekul (sond, značek) na vlastnosti
membrán.
Naše práce je příspěvkem k poznání úlohy membránových lipidů a funkce membránového
přenašeče pro serotonin při depresivní poruše a její léčbě. Vycházeli jsme ze skutečnosti, že
4
značná část makromolekul podílejících se na přenosu signálu je vázána v buněčných
membránách a vyžaduje pro svou správnou funkci interakce s určitými membránovými lipidy.
V úvodní části jsou stručně shrnuty hlavní poznatky o synaptickém přenosu nervového
signálu a o synaptických membránách. Následují základní informace o biochemických a
biofyzikálních hypotézách afektivních poruch a o mechanismech působení antidepresiv.
Podrobněji jsou uvedeny dosud známé poznatky o úloze membránového přenašeče pro
serotonin při depresi a její léčbě a možnosti studia interakcí antidepresiv s membránovými
lipidy. V druhé části následuje stručné shrnutí k pracím, které jsem publikoval na téma
interakcí antidepresiv s modelovými i buněčnými membránami a jejichž kopie jsou v příloze.
Komentáře a shrnutí k jednotlivým publikacím jsou řazeny dle složitosti zkoumaných objektů,
od modelových membrán k laboratorním zvířatům a lidským subjektům; zakončeny jsou
celkovou diskusí. Následuje seznam publikovaných prací tvořících podklad této habilitační
práce, citační ohlasy a přílohy.
5
1.1. Synaptický přenos nervového signálu
1.1.1. Neurony a chemické synapse
Neurony obsahují podobné buněčné složky jako jiné buňky, tj. plazmatickou membránu,
jádro, jadérko, jadernou membránu, neuroplazmu a organely. Důležitou složku neuronů tvoří
cytoskelet - heterogenní síť vláknitých struktur, kterou tvoří navzájem interagující a
propojené sítě z mikrotubulů, neurofilament a mikrofilament. Jedná se o vysoce dynamický
systém napojený na další buněčné struktury, především na membránu. Vzhledem k velké
spotřebě energie nutné pro udržování transmembránových iontových gradientů jsou neurony
zvláště bohaté na mitochondrie. Polyribosomy lokalizované na drsném endoplazmatickém
retikulu poblíž jádra tvoří Nisslovu substanci, která produkuje specifické neuronové proteiny.
Kromě běžných buněčných složek mají neurony morfologicky a funkčně odlišné oblasti, které
se specializují na přenos signálu: axon, dendrity a synapse. Struktura a funkce neuronů je
známa z buněčné biologie (Fišar a Jirák 2001, Levitan and Kaczmarek 2002).
Synapse jsou specializované oblasti buněčného kontaktu umožňující přenos informace z
jednoho neuronu na druhý nebo mezi neurony a receptorovými nebo efektorovými buňkami.
Jsou tvořeny presynaptickou částí (obsahující mimo jiné synaptické váčky s
neurotransmitery) spolu s přilehlou postsynaptickou (obvykle dendritickou) membránou.
Presynaptická a postsynaptická část jsou odděleny synaptickou štěrbinou (20-30 nm).
V průměru vytváří každý neuron asi 1000 synaptických zakončení, ale počet synapsí na
jednom postsynaptickém neuronu může dosahovat i několika desítek tisíc; pokrývají potom
značnou část membrán dendritů i buněčného těla. Může docházet jak k velké konvergenci
signálů na jeden neuron od stovek až tisíců presynaptických buněk, tak k divergenci signálu
z jednoho presynaptického neuronu na desítky nebo stovky postsynaptických buněk. Účinky
přenosu signálu na postsynaptickou část mohou být excitační nebo inhibiční; teprve jejich
součet v daném čase určuje, zda vznikne akční potenciál nebo nitrobuněčná odezva.
Neuroaktivní látky (mediátory, transmitery, působky) podílející se na přenosu nervového
signálu lze dělit na neurotransmitery, neuromodulátory a neurohormony. Neurotransmitery
jsou látky uvolňované z neuronu do synaptické štěrbiny a ovlivňující aktivitu
(excitovatelnost) pouze jedné nebo několika prostorově blízkých buněk. Zajišťují tak
mezibuněčný přenos nervového signálu. Z chemického hlediska se jedná především o
monoaminy, aminokyseliny a peptidy. Neurohormony jsou hormony syntetizované a
uvolňované nervovým systémem a poté přenášené krví ke vzdáleným cílovým buňkám,
jejichž aktivitu ovlivňují. Klasickými neurohormony jsou oxytocin a vasopressin. Rozdělení
6
na neurotransmitery a neurohormony lze považovat za zastaralé, neboť je známo, že řada
neuropeptidů působí nejen dálkově jako neurohormony, ale i lokálně jako neurotransmitery.
Podobně některé klasické neurotransmitery se mohou uvolňovat do krevního oběhu a působit
jako hormony. Zvláštní skupinu látek podílejících se na mezibuněčném přenosu signálu tvoří
růstové faktory, které stimulují proliferaci buněk a podporují jejich přežití.
Neurotransmisí se rozumí aktivní, časově omezený a nevratný proces, jehož výsledkem je
přenos nervového signálu mezi neurony. Po příchodu depolarizační vlny na presynaptické
zakončení je elektrický signál převeden (transdukován) na chemický (uvolnění
neurotransmiteru), a ten může být v postsynaptické části převeden buď zpět na elektrický
signál, nebo na nitrobuněčnou změnu. Sekrece neurotransmiteru z presynaptické části
následuje po vstupu kalcia přes napěťově řízené Ca2+-kanály. Množství uvolněného mediátoru
přitom závisí na koncentraci nitrobuněčného kalcia. Všechny procesy související s přenosem
signálu přes chemickou synapsi nejsou dosud známy.
1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán
Mnoho základních buněčných procesů, včetně zpracování informací, nitrobuněčného a
mezibuněčného přenosu signálu, se odehrává v plazmatických membránách nebo jiných
membránových strukturách. V této kapitole jsou uvedeny pouze základní informace o složení,
stavbě a vlastnostech membrán s ohledem na jejich funkci při šíření nervového signálu a na
úlohu lipidové dvojvrstvy.
Buněčné membrány jsou tvořeny především lipidy, steroly, proteiny, glykolipidy a
glykoproteiny. Mají jednotný organizační princip, tj. uspořádání většiny membránových
lipidů do dvojné vrstvy (o tloušťce kolem 6 nm) s více či méně zanořenými proteiny. Značná
část buněčných proteinů se vyskytuje pouze v membránách, kde zajišťují řadu specifických
procesů spojených s transportními a rozpoznávacími funkcemi membrán (pumpy, nosiče,
iontové kanály, receptory, enzymy apod.). Umožňují udržování iontových a metabolických
gradientů nezbytných pro většinu buněčných funkcí včetně přenosu nervového signálu.
Lipidová část membrán je směsí fosfolipidů, glykolipidů, sfingomyelinu, kardiolipinu a
cholesterolu, přičemž zastoupení těchto složek je v různých membránách velmi odlišné.
Hlavními lipidovými složkami buněčných membrán jsou glycerofosfolipidy, jejichž
základem je sn-glycerol-3-fosfát esterifikovaný na uhlících C(1) (sn-1) a C(2) (sn-2) mastnými
kyselinami a na fosforylové skupině další skupinou. Nejběžněji se vyskytující
glycerofosfolipidy jsou fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin,
7
fosfatidylinositol, fosfatidylglycerol, difosfatidylglycerol (kardiolipin) a kyselina fosfatidová.
Podstatnou složkou některých biomembrán jsou sfingolipidy odvozené ze sfingosinu, resp. z
jeho N-acyl-derivátů, ceramidů. Nejčastější sfingolipidy jsou sfingomyeliny
(sfingofosfolipidy), cerebrosidy (jednoduché sfingoglykolipidy, které nemají fosfátovou
skupinu a obvykle ani náboj; v mozkových buňkách se hojně vyskytují galaktocerebrosidy) a
gangliosidy (sfingoglykolipidy, které obsahují alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; tvoří asi
6% mozkových lipidů a jsou lokalizovány v povrchové vrstvě membrány, kde mají
receptorovou funkci).
Významnou složkou živočišných membrán je cholesterol, který se vyskytuje hlavně
v plazmatických membránách, méně v membránách organel. Cholesterol je hlavní
membránový aktivní sterol, který může významně ovlivňovat buněčný růst a aktivitu
membránových proteinů (receptorů, přenašečů, iontových kanálů apod.) jak přímými
interakcemi, tak i nepřímo, přes změny struktury a fyzikálních vlastností lipidových dvojných
vrstev. V mozku je neesterifikovaný cholesterol přítomen ve vysokých koncentracích
v plazmatických membránách neuronů a glií. Protože cholesterol neprostupuje
hematoencefalickou bariérou, je syntetizován v mozku. Jeho obrat má důležitou úlohu při
opravě a přetváření neuronů.
Dle známého a stále upřesňovaného modelu tekuté mozaiky (Singer and Nicolson 1972)
mají buněčné membrány tyto základní vlastnosti:
•
strukturní základ membrány je tvořen lipidovou dvojvrstvou, v níž jsou zakotveny
integrální a periferní proteiny;
•
existuje heterogenita lipidového složení v rovině horizontální i vertikální; cholesterol je
lokalizován mezi řetězci mastných kyselin;
•
za fyziologických podmínek je lipidová dvojvrstva v „tekutém“ stavu;
•
translační a rotační pohyblivost membránových molekul umožňuje specifické procesy
v membráně, např. transmembránový přenos signálu.
Tento model byl doplněn o existenci nedvojvrstevných struktur v membránách a o výskyt
mikrodomén („raftů“) s odlišným zastoupením cholesterolu a určitých fosfolipidů (Mouritsen
et al. 1995, Barenholz 2002). Integrální proteiny jsou v lipidové dvojvrstvě „rozpuštěny“
prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí a vodíkových vazeb. Specifické
interakce lipid-protein jsou umožněny nejen vazebnými vlastnostmi proteinů, ale i polárními
hlavičkami lipidů, zbytky nenasycených mastných kyselin v molekulách lipidů a asymetrií
lipidové dvojvrstvy (na vnější straně jsou lokalizovány především fosfatidylcholin,
8
sfingomyelin, galaktocelebrosid; na vnitřní straně hlavně fosfatidyletanolamin,
fosfatidylserin, fosfatidylinositol).
Membránové lipidy netvoří jen strukturní základ membrány, ale jsou také substráty
fosfolipas, modulátory funkce řady membránových proteinů a podílejí se na biosyntéze jiných
biologicky aktivních molekul, např. druhých poslů, volných mastných kyselin nebo
endogenních kanabinoidů. Transportní mechanismy zahrnující receptory, iontové kanály,
enzymy, přenašeče a pumpy jsou často regulovány membránovými lipidy a cholesterolem,
samotnými i uspořádanými do lipidové dvojvrstvy (Shinitzky 1984, Srivastava et al. 1987,
Scanlon et al. 2001, Cornelius 2001, Lee 2003). Celkově lze říci, že úloha membránových
lipidů a mastných kyselin v buněčných funkcích není zdaleka poznána. Rovněž existence a
úloha hustotních fluktuací nebo oblastí s nenáhodným lipidovým složením (mikrodomén) je
teprve studována (Barenholz 2002, Fielding and Fielding 2003).
Polární hlavičky membránových lipidů jsou obvykle tvořeny záporně nabitou fosfátovou
skupinou s navázanými kladnými, zápornými, zwiterionickými nebo nenabitými skupinami.
Specifické ovlivnění funkcí membránových proteinů těmito polárními hlavičkami lze
vysvětlit na základě elektrostatických interakcí, jejichž specificita je dána prostorovým
rozložením náboje jak na povrchu proteinu, tak v polárních hlavičkách interagujících lipidů.
Obtížnější je vysvětlení vysoké variability v délce a nasycenosti acylových řetězců, protože
pro udržení struktury, uspořádanosti a určité fluidity lipidové dvojvrstvy není tato různorodost
nezbytná. Pravděpodobným vysvětlením je možnost přizpůsobení se tvaru acylových řetězců
hydrofobnímu povrchu membránových proteinů („hydrophobic matching“), což umožňuje
specificky ovlivňovat vlastnosti proteinů (Dumas et al. 1999). Proteiny vázající fosfolipidy
jsou důležitou složkou přenosu buněčných signálů, přenosu molekul a metabolismu (Hurley et
al. 2000).
Saturované a mononenasycené mastné kyseliny mohou být syntetizovány v těle de novo,
avšak esenciální polynenasycené mastné kyseliny jsou syntetizovány z potravních prekursorů,
linolové kyseliny (18:2) pro n-6 skupinu a α-linolenové kyseliny (18:3) pro n-3 skupinu
mastných kyselin. V neuronech se vyskytují především arachidonová kyselina (20:4, n-6) a
dokosahexaenová kyselina (22:6, n-3) vázané v pozici sn-2 glycerolového základu
fosfolipidů. Arachidonát je uvolňován hydrolýzou fosfolipasou A2 nebo kombinovaným
působením fosfolipasy C a diglycerid lipasy. Většina arachidonátu je inkorporována ve
fosfatidylcholinu, fosfatidylinositolu a fosfatidyletanolaminu. V mozku tvoří arachidonát až
10% z celkových mastných kyselin.
9
Úloha cholesterolu, fosfolipidů a esenciálních nenasycených mastných kyselin je již
dlouho diskutována v některých biochemických hypotézách afektivních poruch, které
vycházejí z předpokladu, že pro správný vývoj a funkci mozkových struktur je nezbytný
normální neuronální lipidový metabolismus (viz kap. 1.2). Mechanismy působení n-3 a n-6
nenasycených mastných kyselin při normální nebo patologické funkci neuronální aktivity
nejsou dostatečně známy, ale je zřejmé, že dokosahexaenová kyselina je hlavní n-3 masná
kyselina v mozku a že eikosapentaenová kyselina má významnou úlohu jako protizánětlivý
prekursor (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Kyselina arachidonová je u lidí
prekursorem prostaglandinů, prostacyklinů, tromboxanů a leukotrienů (Jiang et al. 1998).
Obecně mohou být nenasycené mastné kyseliny spojeny s mnoha aspekty fukce
neuronů,včetně neurotransmise, fluidity membrán, regulace receptorů, přenašečů a iontových
kanálů a genové exprese.
1.1.3. Dynamika buněčných membrán
Malé membránové molekuly jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé v rovině
dvojné vrstvy (podélná, laterální difúze). Se snížením teploty dochází k uspořádávání
membránových molekul a ke snížení jejich laterální i rotační pohyblivosti. Přechod lipidové
dvojné vrstvy z fluidního do zatuhlého stavu je přirovnáván k přechodu ze stavu tekutého
krystalu do stavu tuhého gelu. Teplota, při níž dochází k přechodu membrány, nebo její části,
ze stavu gelového do stavu fluidního se nazývá teplota fázového přechodu. Na tekutost,
resp. fluiditu lipidové dvojné vrstvy má kromě teploty vliv také přítomnost cholesterolu
(snižuje tekutost membrán), stupeň nenasycenosti zbytků mastných kyselin, přítomnost
glykolipidů a dále řada fyzikálních a chemických činitelů. Příčná difúze (flip-flop,
překlápění), tj. přesmyk lipidové molekuly z vnější části dvojné vrstvy do vnitřní nebo
naopak, je velmi pomalá (poločas několik dnů); v buňkách může být toto překlápění
katalyzováno flipasami. Rovněž nepolární zbytky mastných kyselin v lipidech jsou za
fyziologických podmínek vysoce pohyblivé. Celkový tvar molekul membránových lipidů, je
určen hlavně konformací jejich uhlovodíkových řetězců. Změny prostorového uspořádání jsou
přitom umožněny relativně volnými rotacemi kolem jednoduchých vazeb C−C. Dvojné vazby
nenasycených mastných kyselin mají cis (Z) konfiguraci, což způsobuje rigidní ohyb o 30°
v uhlovodíkovém řetězci. Větší zastoupení dvojných vazeb potom vede k velmi složitým
tvarům molekul. Vyšší obsah zbytků nenasycených mastných kyselin nebo nižší obsah
cholesterolu zvyšují pohyblivost molekul v membráně.
10
K pozorovatelným změnám v distribuci molekul v rovině membrány dochází během
milisekund, k rotační reorientaci malých molekul nebo částí makromolekul dochází během
nanosekund. Heterogenita membrán způsobuje, že laterální pohyblivost molekul v rovině
membrány je menší, než by odpovídalo jejich rotační pohyblivosti. Experimentálně je však
často sledován jen jeden typ difúzního pohybu molekul v membráně. Nejčastěji se pro tato
měření používají spektroskopické metody (elektronová spinová rezonance, jaderná
magnetická rezonance, fluorescence, Ramanův rozptyl). Tyto metody jsou založeny na měření
určitého signálu (rezonanční absorpce energie vysokofrekvenčního magnetického pole,
fluorescenční nebo rozptýlené záření apod.) molekul, skupin či atomů lokalizovaných v
membráně. Tyto zpravodajské skupiny jsou buď membráně vlastní, nebo jsou do ní vneseny
(spinové sondy, radionuklidem značené molekuly, fluorescenční sondy a značky, rezonanční
značky pro Ramanův rozptyl atd.); jedná se o molekuly citlivé na vlastnosti mikrookolí, které
samy výrazně neovlivňují sledovaný systém, ale umožňují detekovat změny jeho vlastností.
V prvním přiblížení se lze dívat na vnitřek lipidové dvojvrstvy biologické membrány jako
na homogenní neasociovanou izotropní nestlačitelnou kapalinu, jejíž vlastnosti jsou
charakterizovány jedinou konstantou. V analogii s mechanikou kontinua je tato konstanta
označována jako viskozita nebo fluidita, resp. tekutost. V případě lipidových dvojvrstev
bylo zavedeno označení mikroviskozita. Protože viskozitu vnitřního prostředí dvojvrstvy
nelze měřit přímo, je experimentálně určován parametr, který je s ní v přímé souvislosti. Je
jím obvykle difúzní konstanta, korelační čas nebo relaxační čas. V druhém přiblížení
bereme biologické membrány jako částečně anizotropní – tj. pohyb v membráně je omezený a
rozlišujeme pohyb v rovině lipidové dvojvrstvy a kolmo k ní.
Stanovení změn fluidity membrán na základě měření anizotropie ustálené fluorescence
vhodné sondy je pro svou jednoduchost velmi rozšířeno. Vzhledem k anizotropii buněčných
membrán, ztrácí ale pojem fluidity či mikroviskozity membrán původní fyzikální význam a
v těchto měřeních se jedná pouze o kvalitativní postižení změn uspořádání mikrookolí sondy
a její pohyblivosti v membráně. Pomocí časově rozlišené fluorescence bylo potvrzeno, že
anizotropie fluorescence určená stacionární metodou v sobě obsahuje jak informaci o
pohyblivosti membránových molekul, tak informaci o jejich průměrném uspořádání.
Podrobnější informace o možnostech fluorescenční spektroskopie při studiu dynamiky
buněčných membrán publikoval autor na internetu
(http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/Default.htm).
11
1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery
Receptor je makromolekula specializovaná na přenos informace. Lze jej definovat jako
specifické vazebné místo s funkčními vztahy. Funkčními vztahy se při synaptickém přenosu
nervového signálu rozumí procesy vyvolané vazbou neurotransmiteru nebo jeho agonisty,
které vedou ke změně propustnosti synaptické membrány pro určité ionty nebo k jiným
specifickým změnám vlastností cílových buněk, jako je regulace obecného metabolického
stavu, syntézy, ukládání a uvolňování neurotransmiterů, senzibility receptorů, organizace a
struktury cytoskeletu, genové exprese apod. Receptory jsou dynamické systémy, které se
mohou přizpůsobovat vnějším podmínkám a vyrovnávat tak např. změny v dostupnosti
neurotransmiterů; může být regulován jak počet receptorů, tak jejich vlastnosti.
Neurotransmiterové receptory buď obsahují interní iontový kanál, nebo se jedná o
receptorový komplex zahrnující kromě specifického vazebného místa i transdukční prvek
(obvykle G protein) a efektorový systém (iontové kanály, adenylátcyklasy, fosfolipasy C),
který zajišťuje buněčnou odezvu.
Pro určitý neurotransmiter existuje obvykle více podtypů receptorů, které mohou nebo
nemusí mít stejný nebo podobný transdukční prvek a efektorový systém. Na synapsích se
mohou vyskytovat postsynaptické i presynaptické receptory, což umožňuje zpětnovazebné a
křížové ovlivňování přenosu signálu. Více informací o vlastnostech, klasifikaci a funkci
receptorů umožňujících synaptický přenos signálu lze nalézt např. v monografii Fišar a Jirák
(2001).
Interakce neurotransmiteru se specifickým receptorem nastává na jednom nebo více
aktivních (specifických) rozpoznávacích místech a vede k aktivaci receptorového systému.
Různá léčiva soutěží s neurotransmiterem o obsazení těchto rozpoznávacích míst
(kompetitivní látky). Působení některých psychofarmak může být úplně nebo částečně
identické jako u fyziologického ligandu; hovoříme o úplných nebo částečných (parciálních)
agonistech. Podobně u inhibitorů mluvíme o úplných nebo parciálních antagonistech.
Inverzní agonisté vedou k opačnému efektu než plní agonisté. Nehledě ke kompetici,
vytvářejí některé látky ireverzibilní vazby se skupinami v rozpoznávacích místech - jsou
označovány jako blokátory. Látky, které se vážou k vazebným místům na receptorovém
komplexu, tak že nedochází ke kompetici s neurotransmiterem, jsou označovány jako
nekompetitivní. Konformační změny vyvolané vazbou nekompetitivních látek však mohou
ovlivnit jak vazbu neurotransmiteru k receptoru, tak přenos signálu o jeho vazbě.
12
Biochemické hypotézy afektivních poruch (Fišar 1998) se nejčastěji zabývají
narušením přenosu signálů v mozku vyvolaném aktivací receptorů a napojeném na G proteiny
a systémy druhých poslů (cyklické nukleotidy, metabolity fosfatidylinositolu a kyseliny
arachidonové, kalcium, oxid dusnatý). Dvě základní přenosové cesty nejčastěji uvažované
v patofyziologii afektivních poruch a jejich léčbě jsou adenylátcyklasová a fosfoinositidová.
Adenylátcyklasový systém je aktivován nebo inhibován těmito typy a podtypy receptorů
(Fišar a Jirák 2001): adrenergními α2 a β, serotoninovými 5-HT1,4,6,7, dopaminovými D1 až
D5, GABAB, metabotropními glutamátovými mglu2,3,4,6,7,8, histaminovými H2,3,
muskarinovými acetylcholinovými M2,4, opioidními a dalšími peptidovými. Receptorem
aktivovaná hydrolýza fosfoinositidů se uskutečňuje přes receptory serotoninové 5-HT2,
adrenergní α1, dopaminové D2, metabotropní glutámátové mglu1,5, histaminové H1,
muskarinové acetylcholinové M1,3,5 a řadu peptidových. Část přenosové cesty, která se
uskutečňuje v plazmatické membráně, může být přímo ovlivněna membránovými lipidy.
V receptorových studiích (Bennett and Yamamura 1985) je vazba ligandu k
membránovým vazebným místům charakterizována zdánlivou disociační konstantou, Kd, a
vazebnou kapacitou, Bmax. Disociační konstanta je základní veličina pro charakterizaci vztahu
struktura-funkce při interakcích neurotransmiteru nebo léčiva se specifickým receptorem. Lze
ji použít i pro charakterizaci interakcí léčivo-lipidová dvojvrstva, kdy je však poněkud odlišný
způsob interpretace. Vyšší afinita intramembránového vazebného místa může být způsobena
jak vhodnější strukturou ligandu vzhledem k požadavkům vazebného místa, tak vyšší
koncentrací nebo vhodnější konformací a orientací ligandů lokalizovaných v lipidové
dvojvrstvě (Schwyzer 1991, Mason et al. 1991). Pro výpočet parametrů saturovatelné
specifické vazby k intramembránovým místům je tedy vhodnější použít koncentraci léčiva v
dvojvrstvě místo koncentrace volného ligandu. Spočtená efektivní disociační konstanta potom
odpovídá zdánlivé disociační konstantě korigované na akumulaci ligandu (Heirwegh et al.
1992). Vynásobením zdánlivé disociační konstanty hodnotou rozdělovacího koeficientu je
ovšem provedena jen velmi hrubá korekce, neboť distribuce léčiva v membráně je
nerovnoměrná - v určitých oblastech lipidové dvojvrstvy mohou vznikat mnohem vyšší
koncentrace ligandu, než odpovídá průměrné hodnotě. Na druhou stranu nemusí být vazebná
místa zanořena v dvojvrstvě stejně hluboko jako je lokalizována většina léčiva (Mason et al.
1991). Nesmíme však zapomenout, že uvedené korekce platí jen pro vazbu k
intramembránovým místům, neboť pro vazebná místa na povrchu membrány (přístupná přímo
z vodného prostředí) může mít akumulace léčiva v lipidové dvojvrstvě opačný efekt a projevit
13
se jako úbytek dostupného volného ligandu; disociační konstanta takových míst je nepřímo
vztažena k rozdělovacímu koeficientu léčiva v membránách (Boer et al. 1989).
1.1.5. Membránové přenašeče pro neurotransmitery
Pro funkci chemické synapse mají významnou úlohu membránové přenašeče
(transportní proteiny, transportéry, „carriers“), které zajišťují vychytávání neurotransmiterů ze
synaptické štěrbiny a jejich přenos do presynaptického zakončení (transportní proteiny závislé
na Na+ a Cl-) nebo do gliových buněk (transportní proteiny závislé na Na+);další typ
přenašečů (závislých na pH) umožňuje ukládání neurotransmiterů do zásobních váčků.
Transportní proteiny závislé na Na+ a Cl- slouží k přenosu serotoninu (5-hydroxytryptamin, 5HT), noradrenalinu, dopaminu, γ-aminomáselné kyseliny (GABA), prolinu, glycinu, taurinu,
betainu a kreatinu; přenašeče závislé na Na+ transportují glutamát a aspartát.
Předpokládá se, že zpětné vychytávání (reuptake) neurotransmiterů pomocí přenašečů má
3 základní důsledky:
1. koncentrace neurotransmiteru ve štěrbině je snižována rychleji, než při pouhé difúzi; to
umožňuje lepší časové rozlišení následných dějů;
2. účinky neurotransmiteru jsou omezeny na menší plochu, což dovoluje funkci anatomicky
blízkých chemicky identických ale funkčně odlišných synapsí;
3. neurotransmiter může být po přenosu do presynaptického zakončení znovu použit.
Předmětem studia při duševních poruchách jsou především transportní proteiny pro
noradrenalin (NET), dopamin (DAT) a serotonin (SERT, 5-HTT) které se oproti ostatním
přenašečům vyznačují vysokoafinní vazbou kokainu (inhibice reuptake dopaminu),
amfetaminů, metylendioxymetamfetaminu (extáze) a metamfetaminu (indukce obráceného
transportu serotoninovým a dopaminovým přenašečem), fencyklidinu (mimo jiné inhibuje
uptake 5-HT). NET, SERT nebo oba tyto přenašeče jsou inhibovány řadou různých
antidepresiv (viz kap. 1.3). Inhibice zpětného vychytávání neurotransmiteru vede ke zvýšení
jeho mimobuněčné koncentrace, takže receptory mohou být aktivovány déle a na větší
vzdálenost od synapse.
Citlivost membránových přenašečů na ionty a napětí může určovat rychlost
transmembránového přenosu (uptake) neurotransmiterů. V případě SERT se Na+, Cl- a
protonovaný 5-HT+ vážou k přenašeči a tvoří komplex, který poté podléhá konformační
změně, při níž dochází k přenosu přes membránu a uvolnění neurotransmiteru a iontů do
cytoplazmy. Poté se nitrobuněčné K+ váže k SERT a podporuje jeho reorientaci tak, aby byl
14
připraven na další transportní cyklus. Nitrobuněčné K+ tedy urychluje vtok 5-HT. Vazba
antagonistů k SERT je rovněž závislá na mimobuněčném Na+, např. pro vazbu imipraminu
vyžaduje SERT přítomnost 2 iontů Na+ na 1 molekulu imipraminu. Preferovaný stav SERT
v živých buňkách je homo-oligomerní forma ze 4 molekul.
1.1.6. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi
Klasické schéma přenosu signálu přes chemickou synapsi zahrnuje tyto kroky:
1. metabolismus, syntéza a ukládání neurotransmiteru v presynaptickém zakončení;
2. exocytóza neurotransmiteru (v odezvě na vtok Ca2+ po depolarizaci presynaptické
membrány);
3. difúze neurotransmiteru v synaptické štěrbině, jeho interakce s receptorem;
4. aktivace receptoru vedoucí k otevření iontového kanálu, nebo k aktivaci G proteinu,
vnitřní guanylátcyklasy nebo vnitřní tyrozinkinasy;
5. metabolismus nebo zpětné vychytávání neurotransmiteru.
Přenos signálu je přirovnáván k 3-dimenzionální síti, v níž se podráždění v jednom bodě
přenese do všech dalších a v níž existuje řada kladných i záporných zpětných vazeb.
Receptory s tyrozinkinasovou aktivitou se na synaptickém přenosu nepodílejí přímo; jejich
agonisty jsou růstové faktory, cytokiny a některé hormony.
Nové metody a zdokonalující se přístroje umožňují získávání nových poznatků o převodu
(transdukci) signálu z úrovně elektrické (depolarizace membrány) na chemickou
(neurotransmitery) a zpět na elektrickou (membránový potenciál) nebo nitrobuněčnou
(fosforylace proteinů a související procesy). Tyto nové poznatky lze využít při hledání
molekulárních mechanismů vzniku duševních poruch a účinků psychofarmak. Pozornost je
věnována nejen buněčným proteinům (neutransmiterovým receptorům a přenašečům,
iontovým kanálům, enzymům, transkripčním faktorům), ale i úloze membránových lipidů a
cholesterolu.
Je známo, že značná část molekul podílejících se na přenosu signálu je lokalizována
v buněčných membránách. Jedná se nejen o receptory, iontové kanály a transportní proteiny,
ale i o G proteiny, adenylátcyklasy, fosfolipasy a další enzymy. Na funkci těchto
membránových proteinů mají značný vliv vlastnosti lipidové dvojvrstvy tvořené především
fosfolipidy, glykolipidy a steroly. Integrální proteiny jsou v membránách obaleny vrstvou tzv.
„anulárních“ lipidů, na jejichž vazbě k proteinu se podílejí jednak hydrofobní a van der
15
Waalsovy síly uvnitř membrány, jednak Coulombovy interakce a interakce ion-indukovaný
dipól mezi nabitými a polárními skupinami v povrchové části membrány.
Obecně je vliv lipidů na membránové proteiny dán jednak specifickými interakcemi lipidprotein podmiňujícími aktivitu řady enzymů, jednak nespecifickým ovlivněním dostupnosti
vazebných míst (ovlivněním vertikálního pohybu proteinů) nebo vzájemných interakcí
jednotlivých podjednotek vícesložkových systémů (změnami pohyblivosti těchto složek
v rovině membrány). Byla popsána úloha fyzikálního stavu membrány (charakterizovaná
fluiditou) ve funkci řady membránových receptorů, enzymů a iontových kanálů. Maximální
receptorová odezva závisí nejen na hustotě vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro
agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným
interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu.
Dostupnost i pohyblivost membránových integrálních proteinů závisí jak na fluiditě lipidové
dvojné vrstvy, tak na existenci nehomogenit v jejím složení (mikrodomény) a stavbě
(nedvojvrstevné struktury). Vliv cholesterolu, lipidového složení a dynamických vlastností
(mikroviskozity) membrán byl popsán jak pro vlastnosti neurotransmiterových receptorů
(acetylcholinových, serotoninových, α1- a β-adrenergních, peptidových, GABA a dalších), tak
pro aktivitu řady membránových enzymů a přenašečů (různých ATPas, proteinkinas C,
fosfolipas C, membránového přenašeče pro serotonin) (Lee 2003, Scanlon 2001, Pfrieger
2003) podílejících se na přenosu nervového signálu. V aktivaci různých enzymových a
receptorových systémů hrají významnou roli především kyselé fosfolipidy (Tsakiris a
Deliconstantinos 1984, Rando 1988, Bernik et al. 1991, Sandermann a Duncan 1991,
Gelbmann and Müller 1992, Cohen a Müller 1992). Rovněž metylace fosfolipidů
v synaptických membránách nebo podávání fosfolipidů in vivo může zřejmě ovlivnit adaptaci
receptorů na chronické podávání antidepresiv (Sulser et al. 1983, Racagni and Brunello
1984).
Membránové fosfolipidy se podílejí na přenosu nervového signálu nejen jako strukturní
základ membrány, ale i jako substráty fosfolipas C, D, A2, tj. jako zdroje některých druhých
poslů - diacylglycerolu (DAG), inositoltrisfosfátu (IP3, I(1,4,5)P3) a volných mastných
kyselin, především kyseliny arachidonové. Předpokládá se např., že poruchy v interakcích
lipid-protein způsobené nadměrnou aktivitou fosfolipasy A2 mohou vést ke vzniku
afektivních poruch.
16
1.2. Hypotézy poruch nálady (afektivních poruch)
Afektivní poruchy se projevují patickou náladou. Projevují se v epizodách trvajících od
několika dnů do několika měsíců. Při bipolárním typu onemocnění dochází ke střídání
depresivních a manických epizod, unipolární typ zahrnuje pouze epizody depresivní, nebo
pouze manické. Nástup onemocnění je obvykle mezi 20. a 35. rokem. Těžká podoba postihuje
asi 1% populace a je obvykle dobře léčitelná. Pro klasifikaci poruch nálady je používána 10.
revize Mezinárodní klasifikace nemocí (MKN-10, http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/fricd.htm, http://www.pcp.lf3.cuni.cz/pcpout/is/CD/mkn_klin/obsah.htm).
Na léčbu antidepresivy odpovídá 65-70% pacientů. Zlepšení nastává po asi 10-20 dnech
farmakoterapie a je úplné po asi 8 týdnech. Elektrokonvulzivní terapie je účinná v dalších 1015%. Tedy asi 20% depresivních pacientů je rezistentních ke všem známým formám terapie.
Neléčená deprese vede ve 25-30% k pokusu o sebevraždu.
Molekulární mechanismy a procesy vedoucí ke vniku poruch nálady, ani mechanismy
odpovědné za terapeutické účinky antidepresiv nejsou dosud dostatečně poznány.
1.2.1. Východiska hypotéz
Psychiatrie se snaží popsat a vysvětlit mechanismy vzniku a léčby afektivních poruch pomocí
vlastních i mezioborových metod a postupů, tj. na základě poznatků získaných jak klinickým
hodnocením nemocných, tak měřením fyziologických, biochemických a biofyzikálních změn.
Zdroje poznatků vedoucích k formulaci hypotéz afektivních poruch se nacházejí především
v oblasti biologické (genetické faktory, účinky stresu, chronobiologické aspekty),
imunoneuroendokrinní (změny aktivity osy hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin, HPA,
nebo osy hypotalamus-hypofýza-štítná žláza, HPT, uvolňování cytokinů apod.),
neurochemické a biofyzikální (funkce membránových receptorů, iontových kanálů,
přenašečů, G proteinů, lipidů, systémů druhých poslů, membránových i nitrobuněčných
enzymů).
Afektivní poruchy mají ve své patogeneze významnou genetickou složku, zvláště
bipolární onemocnění, i když odpovídající geny nebyly dosud nalezeny. Z biochemického a
elektrofyziologického hlediska existuje řada důkazů, že se na vzniku afektivních poruch
podílejí poruchy v přenosu nervového signálu, především v oblasti chemických synapsí.
Svědčí pro to jednak změny koncentrací neurotransmiterů a jejich metabolitů v mozku,
mozkomíšním moku a plazmě u některých depresivních pacientů, jednak dosud známé účinky
17
antidepresiv. Pozornost je věnována především poruchám ve funkci noradrenergních a
serotonergních systémů v mozku, ale v různých hypotézách jsou uvažovány i další
neurotransmiterové systémy, především cholinergní, GABAergní, dopaminergní a
peptidergní. Na postreceptorové úrovni se předpokládají změny ve funkci G proteinů,
druhých poslů, proteinkinas a fosfatas a transkripčních faktorů. Z hlediska biofyzikálního jsou
studovány především interakce antidepresiv s membránami a změny vlastností buněčných
membrán při onemocnění a jeho léčbě.
Ze zřejmých etických důvodů je studium přenosu signálu a receptorových a
postreceptorových procesů na úrovni synapsí zatím omezeno na použití nepřímých postupů a
na experimenty s použitím zvířecích a buněčných modelů (synaptosomy, izolované
synaptické membrány, leukocyty, trombocyty, erytrocyty, buněčné kultury, liposomy). Cenné
poznatky o fungování mozku in vivo přinášejí zobrazovací a funkční zobrazovací metody
(pozitronová emisní tomografie, jednofotononvá emisní tomografie, funkční magnetická
rezonance, dynamická počítačová tomografie); jejich prostorová rozlišovací schopnost však
neumožňuje sledování procesů na jednotlivých synapsích.
Většina hypotéz afektivních poruch se soustřeďuje na změny v dostupnosti
neurotransmiterů, ve vlastnostech receptorů a přenašečů pro neurotransmitery a ve
vlastnostech molekul podílejících se na přenosu signálu na postreceptorové úrovni (Manji
1992, Lachman a Papolos 1995). Jako určující se jeví narušení funkce serotonergních a
noradrenergních systémů v mozku. Vznik a vývoj biochemických hypotéz afektivních poruch
jsem podrobně popsal v monografii (Fišar 1998).
1.2.2. Serotoninové hypotézy
Serotonin je jedním z nejvýznamnějších neurotransmiterů a podílí se na regulaci spánku,
agrese, chuti k jídlu, kardiovaskulární a dýchací aktivitě, motorického výstupu, úzkosti,
nálady, neuroendokrinní sekrece a analgezie. Serotonergní neurony mají buněčná těla
lokalizována především ve skupině jader obklopujících raphe nuclei ve středním mozku, ale
inervují všechny oblasti mozku. Serotonin je po uvolnění do synaptické štěrbiny rychle
inaktivován především vysokoafinním transportním systémem (viz kap. 1.1.5), který zajišťuje
jeho zpětné vychytávání (reuptake) do presynaptické části.
Serotoninové hypotézy afektivních poruch vycházejí z předpokladu, že změny
v dostupnosti serotoninu, stavu jeho receptorů nebo funkci jeho transportního proteinu
doprovázejí různé poruchy nálady a že jedním z projevů dlouhodobé antidepresivní terapie je
18
zvýšení serotonergní aktivity (Meltzer and Lowy 1987, Siever et al. 1991, Caldecott-Hazard
et al. 1991, Charney et al. 1992, Stahl 1992, 1994, Maes and Meltzer 1995). Tyto hypotézy
byly formulovány na základě pozorování řady změn a abnormalit u depresivních pacientů,
jako je: 1. nedostatečná serotonergní presynaptická aktivita (vztažená např. ke snížené
dostupnosti L-tryptofanu, nebo k funkci systému pro uptake neurotransmiteru); 2. zvýšený
počet 5-HT2 receptorů a desenzitizace nebo snížený počet 5-HT1A receptorů;
3. glukokortikoidní hyperaktivita; 4. antidepresivní účinky látek ovlivňujících serotonergní
systém.
Nejprve byly formulovány neurotransmiterové hypotézy předpokládající spojení
depresivní poruchy s relativním snížením hladin serotoninu a noradrenalinu v mozku. Např.
podle tzv. permisivní hypotézy je nedostatečná centrální serotonergní neurotransmise nutnou,
ale nikoli postačující podmínkou pro vznik afektivní poruchy; blízkou příčinou pro vznik
afektivního stavu je za této situace změna v centrální katecholaminové transmisi. Toto
propojení serotonergního a noradrenergního systému je obsaženo i v novějších receptorových
hypotézách afektivních poruch. Např. podle obecné katecholaminové hypotézy je
supersenzitivita určitých katecholaminových receptorů při nízkých hladinách serotoninu
biochemickým základem deprese. V poslední době je věnována pozornost molekulární a
buněčné hypotéze deprese, podle níž náchylnost k depresi může vzniknout v důsledku
poškození neuronů, např. po chronickém stresu, dlouhodobém zvýšení hladin
glukokortikoidů, hypoglykémii, ischémii, účinkem neurotoxinů nebo některých virových
infekcí apod. Terapeutické účinky různých antidepresiv se podle této hypotézy uskutečňují
přes zvýšení funkce serotonergního a noradrenergního systému vedoucí ke zvýšení plasticity
neuronů a následné obnově jejich buněčných funkcí (Duman et al. 1997).
1.2.3. Biofyzikální (membránové) hypotézy
Z hlediska biofyzikálního jsou zajímavé hypotézy afektivních poruch předpokládající
významnou úlohu membránových a plazmatických lipidů ve vzniku onemocnění. Při depresi
byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostazi (Maes et al. 1997, Chiu et al. 2003).
Podle membránových hypotéz afektivních poruch abnormality v zastoupení a vlastnostech
fosfolipidů a cholesterolu, které jsou základem struktury buněčných membrán, mohou
indukovat změny v interakcích lipid-protein a v důsledku toho změny v různých
neurotransmiterových systémech, o nichž se předpokládá, že jsou vztaženy k patofyziologii
deprese (např. v serotonergním a noradrenergním systému). Náchylnost pro depresi potom
19
může vzniknout v důsledku změn vlastností lipidové části buněčných membrán v určitých
oblastech mozku.
Některé tyto hypotézy předpokládají, že narušení interakcí lipid-protein v buněčných
membránách při depresi může být způsobeno změnami mikroviskozity membrán v důsledku
snížené esterifikace sérového cholesterolu při depresi (Maes et al. 1994), nebo nadměrnou
aktivitou fosfolipas A2, C, D, které jsou hlavními regulátory lipidového složení membrán.
Zvýšený obsah volných mastných kyselin v plasmě (Mueller et al. 1970) a snížené
koncentrace membránového fosfatidylcholinu v trombocytech a erytrocytech depresivních
pacientů (Sengupta et al. 1981) zřejmě souvisejí především se zvýšenou aktivitou fosfolipasy
A2 (Hibbeln et al. 1989, Horrobin 2001). Rovněž změněná fluidita membrán a snížená aktivita
ATPas (Rybakowski and Lehmann 1994) v erytrocytech naznačují, že při afektivních
poruchách dochází ke změnám ve složení a vlastnostech buněčných membrán.
Biofyzikální vlastnosti synaptických membrán (strukturu, uspořádání, mikroviskozitu)
určují do značné míry esenciální nenasycené mastné kyseliny, cholesterol a glykolipidy.
Poměrně malé změny ve struktuře membrán způsobené cholesterolem a zastoupením n-3, n-6
a dalších nenasycených mastných kyselin potom mohou modulovat nejen metabolismus
biogenních aminů (Mandell 1984), jejich vazbu (Heron et al. 1980) nebo zpětné vychytávání
(Block and Edwards 1987), ale i transdukci signálu, např. vlivem na aktivitu adenylátcyklas a
jiných membránových enzymů. V tzv. biofyzikální hypotéze afektivních poruch se uvažuje
především o úloze dokosahexaenové kyseliny (22:6, n-3) a arachidonové kyseliny (20:4, n-6)
ve funkci neuronálních membrán (Salem and Niebylski 1995, Hibbeln and Salem 1995, Peet
et al. 1998, Horrobin 2001, Frasure-Smith et al. 2004). Terapeutická účinnost podávání n-3
polynenasycených mastných kyselin, především eikosapentaenové kyseliny, byla pozorována
při léčbě schizofrenie, deprese i jiných duševních poruch (Peet and Stokes 2005, Young and
Conquer 2005). Mechanismy působení polynenasycených mastných kyselin při depresi nejsou
dostatečně známy, ale lze předpokládat jejich vliv na serotonergní aktivitu v mozku (De
Vriese et al. 2004).
Byla formulována také hypotéza o vztahu mezi sérovými lipidy, depresí a aterosklerosou
(Penttinen 1995). Podle hypotézy o optimální fluiditě membrán (Shinitzky 1984) závisí
maximální receptorová odezva nejen na hustotě receptorových vazebných míst, ale i na jejich
přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na difúzně kontrolované rychlosti, s níž
může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami
podílejícími se na přenosu signálu. Jak dostupnost, tak pohyblivost membránových proteinů
přitom závisí na mikroviskozitě lipidové dvojvrstvy. Hypotéza o měnitelné afinitě receptorů
20
(Bevan et al. 1989) vychází z pozorování, že k výrazným změnám v afinitě receptorů vedou
rozdíly nejen v chemické struktuře receptoru, ale i v lokálním membránovém mikrookolí a
v různých nitrobuněčných procesech. Změny v lipidovém složení plazmatických membrán
tedy mohou ovlivňovat přenos signálu a podílet se na terapeutických účincích antidepresiv
(Sengupta et al. 1981, Vinokur and Gubachev 1994).
V řadě studií bylo popsáno zvýšené riziko deprese a sebevražedného chování u osob se
sníženou koncentrací sérového (a zřejmě i membránového) cholesterolu (Kunugi et al. 1997,
Vevera et al. 2003). Protože serotonergní systém má významnou úlohu v patofyziologii
afektivních poruch a SERT je modulován jak fluiditou, tak přímými interakcemi
s cholesterolem, byla formulována hypotéza (Engelberg 1992, Terao et al. 2000), podle níž po
snížení koncentrace cholesterolu dochází ke snížení funkce serotonergního systému
v důsledku změněné mikroviskozity a propustnosti plazmatických membrán.
21
1.3. Antidepresiva
Antidepresiva se používají především k léčbě deprese; jejich dlouhodobé podávání (týdny,
měsíce) upravuje patologicky zhoršenou náladu. Ačkoli jsou používána v léčbě afektivních
poruch již téměř 50 let, přesný mechanismus jejich terapeutického působení není znám.
Antidepresiva jsou chemicky různorodou skupinou psychofarmak s různými primárními
biochemickými účinky. Významnou skupinu antidepresiv tvoří látky primárně inhibující
zpětné vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny (reuptake inhibitor, RUI), zvláště
serotoninu, noradrenalinu nebo dopaminu (monoaminové neurotransmitery). Kromě
klasických tricyklických antidepresiv (TCA), která reuptake serotoninu a noradrenalinu
inhibují neselektivně, patří do této skupiny selektivní inhibitory reuptake serotoninu (SSRI),
selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu (NRI), duální inhibitory zpětného vychytávání
serotoninu i noradrenalinu (SNRI) nebo noradrenalinu i dopaminu (NDRI). Druhou skupinou
antidepresiv zvyšujících účinky monoaminových neurotransmiterů jsou inhibitory
monoaminoxidasy (MAO), enzymu lokalizovaného na vnější membráně mitochondrií a
katalyzujícícho deaminaci těchto neurotransmiterů v cytoplazmě. Inhibice zpětného
vychytávání nebo inhibice enzymu MAO však není jediným mechanismem, jímž antideprsiva
zvyšují funkci serotonergního a noradrenergního systému v mozku; některá jsou antagonisty
α2-adrenergních, serotoninových 5-HT2 a 5-HT3 a jiných receptorů, např. noradrenergní a
specifická serotonergní antidepresiva (NaSSA). Některá antidepresiva blokují jak
serotoninové 5-HT2A receptory, tak reuptake serotoninu; jsou klasifikována jako duální
serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake (SARI). Pro předcházení vzniku dalších
manických a depresivních fází se používají rovněž stabilizátory nálady (např. lithium,
valproát, karbamazepin), jejichž mechanismus účinku rovněž není dosud zřejmý (Vinař 1998,
Švestka a kol. 1995, Stahl 2000).
Primární biochemické účinky antidepresiv nejsou dostačující pro vysvětlení jejich
terapeutických účinků, ke kterým dochází až po dlouhodobé léčbě (2-4 týdny). Klíčovou
úlohu v léčebných účincích antidepresiv mají adaptivní změny v neurotransmisi, jejichž
přesné určení ztěžuje jednak vzájemná provázanost nitrobuněčných procesů, jednak
skutečnost, že odezva na stejné antidepresivum je rozdílná u osob se stejnými depresivními
symptomy a obecně je farmakoterapie úspěšná pouze ve 2/3 případů. Dosud neexistuje
biochemický, biofyzikální, endokrinní nebo genetický test schopný předpovědět náchylnost
k afektivní poruše nebo správnou terapeutickou odpověď na podávání určitého antidepresiva.
22
Všeobecně se předpokládá, že klinické účinky antidepresiv jsou způsobeny jejich
schopností indukovat adaptivní změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech
(hlavně noradrenergních a serotonergních). Zpočátku byly studovány především jejich účinky
na změnu dostupnosti monoaminových neurotransmiterů v synapsích, později vliv na změny
hustoty a senzibility receptorů a přenašečů a na vlastnosti molekul podílejících se na
postreceptorové transdukci signálu (G proteinů, efektorových enzymů, systémů druhých
poslů, proteinkinas a transkripčních faktorů) (Manji 1992, Lachman and Papolos 1995, Fišar
1998, Fišar a Jirák 2001). Nejčastěji pozorované změny vyvolané dlouhodobým podáváním
antidepresiv jsou regulace snížením počtu (down-regulace) β1-adrenergních receptorů nebo
snížení odezvy na agonisty (desenzibilizace) 5-HT1A receptorů. Byly však pozorovány změny
i v jiných receptorových systémech. V poslední době je věnována pozornost především
molekulárním a buněčným teoriím deprese, podle nichž jsou terapeutické účinky antidepresiv
uskutečňovány přes aktivaci nitrobuněčných mechanismů zahrnujících zvýšení genové
exprese určitých neurotrofinů a jejich receptorů (Duman et al. 1997, Schloss and Henn 2004);
konkrétně, transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP (CREB) je
možným nitrobuněčným cílem dlouhodobé léčby antidepresivy a gen pro mozkový-odvozený
neurotrofní faktor (BDNF) je možným cílovým genem CREB.
Takže ačkoli jsou primární biochemické účinky antidepresiv poměrně specifické a dobře
známé, je nalezení buněčných funkcí ovlivněných dlouhodobým podáváním antidepresiv a
odpovědných za jejich terapeutické účinky obtížné a je dosud předmětem výzkumu.
Nejdůkladněji prostudovanou skupinou antidepresiv jsou TCA, která jsou používána již
téměř 50 let a jejichž terapeutické účinky jsou dávány do souvislosti s inhibicí reuptake
serotoninu a noradrenalinu, u některých i s blokádou 5-HT2A receptorů. Dnes nejčastěji
podávanými antidepresivy jsou SSRI, které sice nejsou obecně účinější než TCA, ale mají
menší nežádoucí vedlejší účinky.
Pro terapeutickou účinnost současných antidepresiv je nezbytný jejich snadný průchod
hematoencefalickou bariérou (Gulyaeva et al. 2003) a schopnost indukovat změny přenosu
nervového signálu v mozku. Předpokládá se, že antidepresiva mohou ovlivňovat funkci řady
membránových proteinů a to nejen přímou specifickou vazbou, ale i nepřímým ovlivněním
interakcí protein-protein a lipid-protein v důsledku akumulace antidepresiv v lipidové části
buněčných membrán a tím indukovaných změn ve složení nebo struktuře lipidové dvojvrstvy
(Toplak et al. 1990). Fyzikálně-chemické vlastnosti antidepresiv totiž umožňují jejich vazbu v
lipidových dvojvrstvách. Koncentrace v lipidových částech biologických membrán potom
mohou mnohonásobně převyšovat koncentrace v tělesných tekutinách. Je proto možné, že
23
některé účinky antidepresiv se realizují přes interakce s membránovými fosfolipidy (Bauer et
al. 1990; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1994, Seydel and Wiese 2002).
V rovnovážném stavu se antidepresiva nacházejí jak v mimobuněčném prostoru, tak
v buněčných membránách a v cytoplazmě. V plazmě se antidepresiva nacházejí jednak volná,
jednak vázaná na albumin, alfa 1-kyselý glykoprotein a lipoproteiny (Riant et al. 1988).
Rovnovážná rozdělení některých antidepresiv mezi krevní buňky a plazmu byla studována
v podmínkách in vitro (Burch et al. 1981, Amitai et al. 1993) i in vivo (Sikora et al. 1990,
Krulík et al. 1991, Fišar et al. 1996). Po dlouhodobém podávání antidepresiv dochází k
ustavení jejich koncentrace v krvi a nerovnoměrné distribuci v mozku (Miyake et al. 1990).
Existují velké rozdíly mezi plazmatickými hladinami antidepresiv u různých osob v důsledku
rozdílů v metabolismu léků, variabilitě distribuce mezi plazmu a tkáně, způsobu podání léku,
vlivu věku, kouření a jiných psychofarmak (Nagy and Johansson 1985, Perel et al. 1978); k
výraznému kolísání dochází u jednotlivců i v průběhu dne. Kromě podaných antidepresiv jsou
obvykle aktivní i jejich metabolity (Sanchez and Hyttel 1999). Různé studie vedly k závěru,
že maximálních terapeutických účinností některých antidepresiv u určitých skupin pacientů
může být dosaženo v určitém rozsahu ustálených plazmatických hladin, avšak vzájemný vztah
mezi plazmatickými koncentracemi a klinickou účinností není jednoduchý (Perel et al. 1978,
Risch et al. 1979, Perry et al. 1994, Jerling et al. 1995). Terapeutické rozsahy plazmatických
koncentrací antidepresiv leží v oblasti desítek až stovek ng/ml.
Lze uzavřít, že působení antidepresiv není omezeno jen na části receptorů, transportních
proteinů a enzymů nacházejících se na povrchu buněčných membrán, ale že mohou být
ovlivněny i procesy probíhající v hydrofobním vnitřku membrán a rovněž nic nebrání
případným interakcím antidepresiv s nitrobuněčnými složkami efektorových systémů a
systémů druhých a třetích poslů, včetně procesů v jádře. Existují hypotézy afektivních poruch
(viz kap. 1.2.3) předpokládající, že jak onemocnění samo, tak terapeutické účinky
antidepresiv jsou spojeny se změnami v metabolismu membránových lipidů a se změnami ve
fyzikálním stavu lipidové dvojvrstvy.
24
1.4. Membránový přenašeč pro serotonin při depresi a její léčbě
Mezi hlavní faktory určující aktivitu serotonergního systému v mozku patří biosyntéza
serotoninu z tryptofanu, jeho katabolismus, ukládání do synaptických váčků, uvolňování do
synaptické štěrbiny a zpětné vychytávání (reuptake). Membránovému přenašeči pro serotonin
(SERT) je v serotoninových hypotézách afektivních poruch věnována značná pozornost,
neboť inhibice jeho funkce je primárním biochemickým účinkem řady antidepresiv, včetně
dnes nejčastěji podávaných selektivních inhibitorů reuptake serotoninu (SSRI). Přibližně 80%
vazebných míst pro 5-HT na SERT je obsazeno při podávání SSRI (Meyer et al. 2001).
Podávání inhibitorů uptake 5-HT vede k rychlému tří až pětinásobnému zvýšení
mimobuněčných koncentrací 5-HT v mozku (Fuller 1994), avšak, jak již bylo uvedeno výše,
ke klinickému zlepšení dochází až po několika týdnech. Zvýšené mimobuněčné koncentrace
5-HT tedy teprve indukují žádoucí adaptivní změny. Předpokládá se, že terapeutické účinky
antidepresiv jsou podmíněny výsledným zvýšením serotonergní neurotransmise v mozku
(Blier and de Montigny 1994).
Aktivitu neurotransmiterových systémů v mozku lze měřit nepřímo pomocí různých
neuroendokrinních testů, kdy v odezvě na farmakologickou stimulaci či inhibici lze měřit
změny hladin hormonů regulovaných příslušným neuromediátorem. Příkladem je
fenfluraminový test, který je zkoušen u duševních poruch pro sledování aktivity
serotoninergního systému v mozku. d-Fenfluramin inhibuje transport 5-HT do synaptických
váčků a působí jako substrát pro SERT, čímž jednak inhibuje zpětné vychytávání 5-HT do
presynaptické části, jednak usnadňuje jeho obrácený transport ven. Podání fenfluraminu
zvyšuje hladiny uvolněného 5-HT v mozku, což vede ke zvýšenému vyplavování prolaktinu
z adenohypofýzy.
Byla publikována řada důkazů ukazujících, že serotonergní systém v trombocytech zrcadlí
presynaptický serotonergní systém. Transport 5-HT, jeho ukládání a uvolňování, stejně jako
vazebné charakteristiky 5-HT2 receptorů, jsou velmi podobné v trombocytech i
presynaptických neuronech. Navíc bylo potvrzeno, že SERT a 5-HT2A receptor
v plazmatických membránách lidských trombocytů a neuronů jsou identické (Lesch et al.
1993, Cook et al. 1994). Toto zjištění poskytlo další podporu pro použití trombocytů jako
vhodného modelu pro sledování funkce mozkového serotonergního systému. Zájem o
studium uptake 5-HT do trombocytů u depresivních pacientů byl v poslední době obnoven
poté, co bylo popsáno spojení mezi polymorfismem SERT promotoru a osobnostními rysy a
jeho úloha v průběhu afektivních poruch.
25
Funkční vlastnosti SERT jsou charakterizovány rychlostí a účinností přenosu serotoninu
do buňky. Ukázalo se, že pro charakterizaci kinetiky uptake serotoninu do buněk lze použít
rovnici analogickou rovnici Michaelise a Mentenové s parametry Vmax (maximální rychlost
transportu serotoninu do buněk, která odráží existenci saturovatelného množství SERT v
membránách) a KM (zdánlivá Michaelisova konstanta odpovídající koncentraci
mimobuněčného 5-HT, při níž je rychlost transportu rovna polovině Vmax). Za předpokladu, že
rychlostní konstanta disociace komplexu serotonin-přenašeč je větší než rychlostní konstanta
odpovídající přenosu serotoninu přes membránu, jeho uvolnění do nitrobuněčného prostoru a
návratu SERT do původního stavu, odpovídá konstanta KM přibližně disociační konstantě
komplexu serotonin-přenašeč a charakterizuje tedy afinitu SERT. Poměr Vmax/KM lze
považovat za kritérium účinnosti transportního systému (zdánlivou účinnost uptake 5-HT) při
nízkých (fyziologických) koncentracích mimobuněčného 5-HT (Franke et al. 2000).
Pro zjištění mechanismů účinků antidepresiv a předpověď klinické odezvy na jejich
podávání při depresi byly sledovány různé periferní parametry serotonergní transmise, jako
koncentrace metabolitů 5-HT v mozkomíšním moku, denzita a aktivita SERT nebo
koncentrace 5-HT v trombocytech a v plazmě. Bohužel, informace o změnách různých
serotonergních parametrů v trombocytech depresivních osob před a po léčbě antidepresivy
jsou často rozporné. Může to být do značné míry způsobeno vlivem předchozí farmakoterapie
na měřené veličiny. Např. vazebná místa pro uptake 5-HT charakterizovaná vazbou
[3H]imipraminu k SERT v trombocytech depresivních pacientů byla zjištěna snížená,
nezměněná i zvýšená (Koyama and Yamashita 1992, Mellerup and Langer et al. 1990, Owens
and Nemeroff 1994). Vzhledem v vysoké nespecifické vazbě imipraminu byly nověji použity
selektivnější ligandy [3H]paroxetin, [3H]citalopram a [3H]nitroguipazin, s nimiž byly získány
konsistentnější výsledky o hustotě a afinitě těchto vazebných míst a byla zjištěna i
mimoneuronální exprese SERT (D'haenen et al. 1988, Lawrence et al. 1994, Bakish et al.
1997, Hrdina et al. 1997). Většina studií zabývajících se vazbou inhibitorů k SERT se týká
vysokoafinního vazebného místa, avšak bylo charakterizováno i nízkoafinní alosterické
vazebné místo, jehož funkce není dostatečně známa (Plenge and Wiborg 2005).
Často jsou měřeny parametry kinetiky transportu 5-HT do trombocytů, o nichž se
předpokládá, že odrážejí změny funkce serotonergního systému v mozku (Lesch et al. 1993,
Bianchi et al. 2002, Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Meltzer and Lowy 1987,
Caldecott-Hazard et al. 1991). Snížení maximální rychlosti transportu serotoninu do
trombocytů bylo dokonce navrženo jako možný biochemický marker deprese, avšak ukázalo
se, že tento marker není dostatečně specifický (Caldecott-Hazard et al. 1991, Lawrence et al.
26
1994). U depresivních pacientů před léčbou byla popsána jak snížená (Tuomisto et al. 1979,
Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard 1987, Franke et al. 2000, Stain-Malmgren et al. 2001),
tak zvýšená (Hrdina et al. 1997) maximální rychlost Vmax transportu 5-HT do trombocytů. Po
podávání antidepresiv se Vmax buď nezměnilo (Meltzer et al. 1981, Hrdina et al. 1997) nebo
snížilo (Stain-Malmgren et al. 2001, Axelson et al. 2005). Konsistentnější výsledky byly
získány s parametrem KM, který je u depresivních pacientů před léčbou nezměněn (Tuomisto
et al. 1979, Meltzer et al. 1981), ale po dlouhodobém podávání různých antidepresiv dochází
k jeho významnému zvýšení (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard
1987, Hrdina et al. 1997, Stain-Malmgren et al. 2001). Na základě těchto výsledků se
předpokládá, že aktivita SERT v trombocytech může být použita pro sledování účinků
antidepresiv (především SSRI) na serotonergní systém v mozku a jako znak účinnosti SSRI
při léčbě deprese (Bakish et al. 1997, Axelson et al. 2005).
SERT je regulován řadou procesů, např. protenkinasou C (PKC). Rovněž aktivace
terminálních serotoninových autoreceptorů zvyšuje kinetiku uptake 5-HT přes vliv na SERT.
Víme málo o tom, jak se 5-HT váže k SERT a jak je přenášen přes membránu, nebo o tom jak
se vážou antagonisté. Rovněž studium úlohy fosforylace SERT nebo jiné posttranslační
modifikace vedoucí ke změnám jeho funkce jsou v začátcích. Je zřejmé, že významnou úlohu
mohou mít i složení a vlastnosti lipidové dvojvrstvy (Bhat and Block 1992) a specifické
interakce SERT s membránovými lipidy v mikrodoménách (Magnani et al. 2004).
Významným modulátorem funkce SERT je především membránový cholesterol, jehož nižší
koncentrace vedly v experimentech in vitro ke snížení aktivity SERT (Scanlon et al. 2001).
Propojení změn vlastností buněčných membrán způsobených různým obsahem cholesterolu s
aktivitou serotonergního systému by mohlo být mechanismem podílejícím se na zvýšení
rizika vzniku deprese spojené se suicidálním chováním při nízkých hladinách sérového
cholesterolu (Penttinen 1995, Kunugi et al. 1997).
27
1.5. Interakce antidepresiv s lipidovými membránami
Většina antidepresiv jsou amfifilní molekuly (tj. molekuly sestávající z polární a nepolární
části) nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj (patří do skupiny CAD, „cationic
amphiphilic drug“). Mohou se vázat jak ke specifickým proteinovým vazebným místům, tak
k lipidové části membrán (Lieber et al. 1984, Sikora et al. 1990, Fišar et al. 1996). Není
známo, zda akumulace antidepresiv v lipidové části buněčných membrán má výrazný vliv na
jejich terapeutické účinky, ale interakce protein-lipid-antidepresivum mohou ovlivňovat
funkci řady membránových systémů podílejících se na přenosu nervového signálu (Bevan et
al. 1989). Pro úlohu membránových lipidů v účincích antidepresiv svědčí také změny ve
složení membránových lipidů pozorované po dlouhodobém podávání antidepresiv (Moor et
al. 1988, Toplak et al. 1990, Pettegrew et al. 2001). Některá antidepresiva mohou indukovat
generalizovanou fosfolipidózu, tj. akumulaci různých fosfolipidů uvnitř buňky (Xia et al.
2000) a s tím související vedlejší nebo toxické účinky.
Souhrnně lze říci, že membránové lipidy mohou ovlivňovat účinky antidepresiv jednak
změnou dostupnosti antidepresiv pro více či méně specifická vazebná místa v membráně,
jednak působením na neurotransmiterové receptory a přenašeče. Přímý vliv lipidů na účinky
antidepresiv spočívá jak v řádovém zvýšení jejich koncentrace v bezprostřední blízkosti
buněčného povrchu v důsledku elektrostatických vlastností membránových lipidů
(výsledného záporného náboje), tak v ovlivnění vazby (akumulace) amfifilních antidepresiv
v lipidové části membrán. Nepřímý vliv membránových lipidů na působení antidepresiv je
dán skutečností, že aktivita řady membránových proteinů, které jsou zapojeny do přenosu
nervového signálu a jsou ovlivněny antidepresivy, silně závisí na interakci s určitými
fosfolipidy nebo cholesterolem. Je předmětem dalšího výzkumu jak může farmakologické
nebo nutriční ovlivnění vlastností membránových lipidů zlepšit příznaky afektivních poruch
nebo účinnost jejich farmakoterapie.
1.5.1. Modelové membrány (liposomy)
Pro in vitro studium interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán jsou používány
izolované buňky, buněčné membrány a modelové membrány. Zvláště liposomy jsou široce
používaným modelem lipidové části buněčných membrán a umožňují měřit nejen rozdělovací
koeficienty, ale i vazebné parametry různých léčiv v lipidových dvojvrstvách s definovaným
složením. Liposomy jsou váčky (vezikuly) uzavírající vodný roztok membránou tvořenou
28
především fosfolipidy. Tvoří se spontánně, když jsou fosfolipidy dispergovány ve vodném
prostředí. V závislosti na způsobu přípravy (New 1990) mohou vzniknout liposomy
1. mnohovrstevné (multilamellar vesicles, MLV, vezikuly o velikosti 10-1 až 100 µm, přičemž
každý váček je tvořen mnoha koncentrickými vrstvičkami lipidových dvojvrstev), 2. malé
jednovrstevné (small unilamellar vesicles, SUV, vezikuly o velikosti cca 25 nm) nebo 3. velké
jednovrstevné (large unilamellar vesicles, LUV, vezikuly o velikosti 100 µm). Jako zvláštní
skupina se někdy uvádějí jednovrstevné liposomy střední velikosti (intermediate-sized
unilamellar vesicles, IUV, vezikuly o velikosti kolem 100 nm). Bylo ověřeno, že liposomy
jsou vhodným modelem pro studium vlastností lipidové části buněčných membrán, včetně
studia interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán (Reith et al. 1984).
1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána
Na vazbě antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám se podílejí stejné nekovalentní interakce, jako
je tomu u vazeb neurotransmiter-receptor nebo substrát-enzym; jedná se o: 1. interakce mezi
elektroneutrálními molekulami nebo jejich částmi, označované jako van der Waalsovy síly,
2. elektrostatické (iontové, Coulombovy) interakce mezi ionty s určitým výsledným nábojem,
3. vodíková vazba a 4. hydrofobní interakce, které spočívají v přiblížení hydrofobních skupin
tak, aby se minimalizovala velikost rozhraní mezi vodou a nepolárními skupinami.
Coulombovy interakce mezi dipóly a zvláště mezi nabitými skupinami jsou dlouhodosahové,
zatímco van der Waalsovy interakce se vzdáleností rychle klesají.
Vazba antidepresiv do lipidové dvojvrstvy je chápána jako omezení „dimenzionality“
(Mosior and McLaughlin 1992, Beschiaschvili and Seelig 1992), neboť se nejedná o vazbu
stabilní, jako je tomu např. u receptorových specifických vazeb. Termodynamická analýza
vazebné rovnováhy pro různé amfifilní ligandy vedla k závěru, že hnací silou pro vazbu
těchto léčiv do lipidové dvojvrstvy je hlavně změna entalpie, tzn. van der Waalsovy interakce
(Bäuerle a Seelig 1991). Významnou úlohu v interakcích lipid-antidepresivum mají i
elektrostatické (coulombické) interakce, neboť jak membránové molekuly, tak antidepresiva
nesou za fyziologických podmínek často náboj nebo alespoň obsahují polarizovatelné
skupiny. Rozdíly v rozdělovacích koeficientech antidepresiv pro lipidové membrány, jejichž
povrch je celkově elekroneutrální (např. fosfatidylcholinové, fosfatidyletanolaminové), nebo
nese celkový záporný náboj (např. fosfatidylserinové, fosfatidylinositolové) ukazují, že
záporně nabité fosfolipidy mohou zvyšovat lokální koncentraci antidepresiv i jiných kladně
29
nabitých molekul u povrchu buněčných membrán (Fišar et al. 2004) a ovlivnit tak jejich
specifickou vazbu na membránové receptory, přenašeče, iontové kanály nebo enzymy.
Studium interakcí amfifilních léčiv s liposomy spočívá především v měření rozdělovacích
koeficientů, charakterizujících rovnováhu mezi molekulami léčiv ve vodném roztoku a
molekul adsorbovaných na povrch membrány nebo inkorporovaných do hydrofobního vnitřku
lipidové dvojvrstvy. Tato adsorpce a inkorporace se obvykle chápe jako nespecifický proces.
Novější přístup spočívá v respektování heterogenity fosfolipidové membrány
charakterizované polaritou membrány, nábojem a orientací polárních skupin (tzv.
fosfolipidových hlaviček), délkou a nenasyceností acylových řetězců (zbytků mastných
kyselin) a konformací jejich dvojných vazeb, asymetrií membrány, existencí mikrodomén a
nedvojvrstevných struktur a fluktuacemi hustoty. V důsledku této heterogenity jsou molekuly
léčiv distribuovány v lipidových membránách nerovnoměrně (Herbette et al. 1986, Müller et
al. 1986,). Existuje také možnost vzniku specifických interakcí některých ligandů s acylovými
řetězci fosfolipidů (Bäuerle a Seelig 1991, Jørgensen et al. 1991). Celkově mohou vést
interakce lék-dvojvrstva ke změnám (Seydel and Wiese 2002) 1. konformace molekul léku, 2.
konformace membránových molekul (orientace polárních hlaviček fosfolipidů, trans-gauche
konformace acylových řetězců), 3. plochy a tloušťky membrány, 4. membránového
potenciálu, 5. dynamických vlastností lipidové dvojvrstvy (uspořádanost a rotační a translační
pohyblivost membránových molekul). Při vysokých koncentracích amfifilních molekul může
dojít k destabilizaci lipidových dvojvrstev (Zimmer 1984, Balgavý and Devínsky 1996,
Zachowski and Durand 1988, Heerklotz and Seelig 2000, Schreier et al. 2000, Sanganahalli et
al. 2000).
Označení výsledku interakce lék-lipidová membrána jako „vazba“ bylo předmětem
diskusí vzhledem k běžnému významu tohoto označení v klasických interakcích enzymsubstrát nebo ve studiích ligand-receptor. Pro odlišení byly používány přívlastky
„pseudospecifická“, „nesaturovatelná“ a byl navržen termín „nespecifická akumulace“. Pokud
chápeme lipidovou dvojvrstvu jako isotropní prostředí, potom je postačují kvantitativní
charakteristikou vazby léku rozdělovací koeficient. Vezmeme-li v úvahu heterogenitu
lipidové membrány, je nutno použít veličiny analogické receptorovým studiím (Bennett a
Yamamura 1985), jako je vazebná kapacita (Bmax) a disociační konstanta (Kd), které umožňují
kvantifikovat vazbu léku do různých oblastí lipidové dvojvrstvy. Teoreticky by mělo být
možné určit ze saturačních křivek vazebné parametry i dvou či více různých vazebných míst.
Parametry charakterizující vazbu CAD k membránám vycházejí z měření koncentračních
závislostí množství volného a vázaného ligandu. Byla pozorována nezávislost rozdělovacích
30
koeficientů na nízkých koncentracích CAD (Mason et al. 1989) a jejich závislost na teplotě,
pH a lipidovém složení membrán (Luxnat and Galla 1986, Zachowski and Durand 1988,
Austin et al. 1995). Saturovatelnost adsorpčních izoterem pozorovaná při vyšších
koncentracích amfifilních léčiv je vysvětlována změnami elektrostatického potenciálu na
povrchu membrán v důsledku inkorporace nabitých molekul ligandu do lipidové dvojvrstvy.
Elektrostatika nabitých lipidových dvojvrstev byla intenzivně studována a diskutována
v mnoha pracích (McLaughlin a Harary 1976, Eisenberg et al. 1979, McLaughlin 1989,
Beschiaschvili and Seelig 1990, Cevc 1990, 1993, Stankowski 1991, Seelig et al. 1993,
Langner and Kubica 1999, Averbakh and Lobyshev 2000). Pro analýzu výsledků interakcí
nabitých molekul s modelovými membránami se pokládá za postačující Sternova teorie
používající pro určení vztahu hustoty povrchového náboje a povrchového potenciálu
Gouyovu-Chapmanovu teorii elektrických dvojvrstev (Beschiaschvili and Seelig 1992).
Gouyova-Chapmanova teorie umožňuje při studiu elektrostatiky nabitých lipidových
dvojvrstev určit:
•
elektrostatický potenciál v blízkosti povrchu membrány a jeho prostorový průběh;
•
elektroforetickou pohyblivost nabitých lipidových váčků;
•
koncentrace malých iontů u povrchu membrány;
•
adsorpci léčiv, hormonů, peptidů a proteinů na povrch membrány;
•
rozlišení hydrofobního a elektrostatického příspěvku k celkové vazbě ligandu k
lipidové dvojvrstvě.
Vazba mezi kladně nabitými antidepresivy a negativně nabitými membránami je zvýšena
oproti vazbě k celkově elektricky neutrálním membránám. Pomocí Gouy-Chapmanovy teorie
lze provést korekci na elektrostatické efekty a popsat interakci antidepresiv s membránami
pomocí vazebných parametrů nebo povrchových rozdělovacích koeficientů (Fišar et al. 2004).
1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně
Pro lokalizaci amfifilních molekul v membráně je důležitá polarita a náboj membrán. Statická
dielektrická konstanta se na povrchu membrány mění z hodnoty 78 (voda) k hodnotě kolem 2
(vnitřek membrány) a celkový náboj biologických membrán je obvykle záporný. Mnoho
procesů probíhajících na rozhraní membrána-voda ovlivňuje hydratace membrán (Cevc
1990). Nositeli záporného náboje u membránových fosfolipidů jsou hlavně fosfátové a
karboxylové skupiny, kladný náboj mohou mít aminoskupiny a cholinové hlavičky. Náboj je
31
přitom lokalizován pro fosfátovou a karboxylovou skupinu u atomů kyslíku, pro
aminoskupinu u atomů vodíku a pro cholinovou hlavičku u atomů dusíku a vodíku.
V důsledku heterogenity membrán jsou v nich antidepresiva rozdělena nerovnoměrně.
Zjednodušený model pro vazbu amfifilních molekul k lipidové membráně rozlišuje 4 oblasti
(Bauer et al. 1990, Tieleman et al. 1997, Fišar 2005):
1. oblast rozrušené vody - je tvořena molekulami vody, které reagují na přítomnost
polárních skupin lipidů;
2. interfáze – je tvořena hlavně atomy polárních hlaviček lipidů;
3. měkký polymer – oblast tvořená částečně uspořádanými uhlovodíkovými řetězci a
nízkým volným objemem;
4. dekan – oblast ve střední části lipidové dvojvrstvy charakterizovaná hustotou
podobnou dekanu a velkým volným objemem.
První dvě oblasti jsou společně chápány jako rozhraní membrána-vodný roztok. Vlastnosti
tohoto rozhraní jsou určující pro vazbu amfifilních molekul do membrány. Polární hlavičky
fosfolipidů mohou být rozděleny do dvou oblastí: 1. na záporně nabitou fosfátovou skupinu a
2. na kladnou, zápornou, zwiterionickou nebo nenabitou oblast (Langner and Kubica 1999).
Pro bližší charakterizaci a lokalizaci amfifilních molekul v membráně byl studován vliv
vnějšího prostředí (iontů, pH, teploty) a lipidového složení membrán (Zachowski a Durand
1988, Fišar a Krulík 1995, Fišar 2005). Jak rozdělení léčiv, tak vliv na některé vlastnosti
membrán závisí silně na vlastnostech membránových lipidů, zvláště na přítomnosti záporně
nabitých fosfolipidů a cholesterolu (Luxnat a Galla 1986). I dosti podobné molekuly mohou
přitom interagovat s membránou značně rozdílně. Vliv na složení a vlastnosti lipidové části
buněčných membrán byl sledován hlavně pro léčiva ze skupiny fenothiazinů, butyrofenony a
tricyklická antidepresiva. Protože fenothiaziny i TCA si jsou strukturně podobné, ale
stereochemicky jsou značně odlišné a mají i odlišné terapeutické účinky, byla srovnávána
jejich lokalizace v buněčných membránách a vliv na fázové přechody lipidové dvojné vrstvy.
Ukázalo se, že fenothiaziny mají vyšší rozdělovací koeficienty než TCA, tj. mají vyšší
hydrofobicitu a tedy silnější tendenci být inkorporovány dovnitř membrán. Pravděpodobná
lokalizace molekul fenothiazinů v membráně je v hydrofobním vnitřku membrány s orientací
nepolární části podél uhlovodíkových řetězců. TCA jsou vázána více periferně, v
povrchových vrstvách lipidové dvojné vrstvy s nepolární částí orientovanou v rovině
membrány.
Po vazbě do lipidové dvojvrstvy antidepresiva snadno ztrácejí kladný náboj, stávají se
nepolárními a akumulují se v hydrofobním vnitřku membrány nebo procházejí na vnitřní
32
stranu membrány, získávají kladný náboj a buď interagují s membránovými proteiny a
kyselými fosfolipidy, nebo se uvolňují do nitrobuněčného prostředí a mohou ovlivňovat
procesy v cytosolu, organelách nebo buněčném jádře. Heterogenitu vazby antidepresiv
v membránách lze charakterizovat pomocí vazebných parametrů a podílu různých
nekovalentních interakcí na vazbě (viz kap. 1.5.2).
33
1.6. Literatura
Amitai Y., Kennedy E.J., DeSandre P., Frischer H.: Distribution of amitriptyline and nortriptyline in blood: role
of alpha-1-glycoprotein. Ther. Drug Monit. 1993; 15: 267-273.
Austin R.P., Davis A.M., Manners C.N.: Partitioning of ionizing molecules between aqueous buffers and
phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 1995, 84: 1180-1183.
Averbakh A., Lobyshev V.I.: Adsorption of polyvalent cations to bilayer membranes from negatively charged
lipid: estimating the lipid accessibility in the case of complete binding. J. Biochem. Biophys. Methods 2000;
45: 23-44.
Axelson D.A., Perel J.M., Birmaher B., Rudolph G., Nuss S., Yurasits L., Bridge J., Brent D.A.: Platelet
serotonin reuptake inhibition and response to SSRIs in depressed adolescents. Am. J. Psychiatry 2005; 162:
802-804.
Bakish D., Cavazzoni P., Chudzik J., Ravindran A., Hrdina P.D.: Effects of selective serotonin reuptake
inhibitors on platelet serotonin parameters in major depressive disorder. Biol. Psychiatry 1997; 41: 184-190.
Balgavý P., Devínsky F.: Cut-off effect in biological activities of surfactants. Adv. Colloid Interface Sci. 1996;
66, 23-63.
Barenholz Y.: Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane evolution to “rafts”. Prog. Lipid
Res. 2002; 41: 1-5.
Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J.: Differential scanning calorimetry study of
the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J.
Pharm. Sci. 1990; 79, 897-901.
Bäuerle H.-D., Seelig J.: Interaction of charged and uncharged calcium channel antagonists with phospholipid
membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy, and membrane location. Biochemistry 1991; 30, 72037211.
Bennett J.P.Jr., Yamamura H.I.: Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In:
Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura H.I., Enna S.J. and Kuhar M.J., Eds.), 2nd edition, New
York: Raven Press, 1985, pp. 61-89.
Bernik, D.L., Rivas, E.A., Arnaiz, G.R.D.: Fusion between rat-brain synaptosomes and phosphatidylserine
liposomes. Neurochem. Int. 1991; 19: 611-618.
Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms and ζ-potential of a cyclic
somatostatin analogue. Biochemistry 1990; 29, 10995-11000.
Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Nonclassical hydrophobic effect and membraneinduced pK shifts. Biochemistry 1992; 31, 10044-10053.
Bevan, J.A., Bevan, R.D., Shreeve, S.M.: Variable receptor affinity hypothesis. FASEB J. 1989; 3:1696-1704.
Bhat, G.B., Block, E.R.: Serotonin transport in reconstituted endothelial cell plasma membrane proteoliposomes:
effect of hypoxia. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992; 6: 633-638.
Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato E, Crespi F.: Forced swimming test and fluoxetine treatment: in
vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels,
whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp. Brain Res. 2002; 143: 191-197.
Blier P., de Montigny C.: Current advantages and trends in the treatment of depression. TiPS 1994; 15, 220-226.
34
Block, E., Edwards, D.: Effects of plasma membrane fluidity on serotonin transport by endothelial cells. Am. J.
Physiol. 1987; 253: C672-C678.
Boer R., Grassegger A., Schudt C., Glossmann H.: (+)-Niguldipine binds with very high affinity to Ca2+
channels and to a subtype of alpha 1-adrenoceptors. Eur. J. Pharmacol. 1989; 172: 131-145.
Burch J.E., Roberts S.G., Raddats M.A.: Binding of amitriptyline and nortriptyline in plasma determined from
their equilibrium distributions between red cells and plasma, and between red cells and buffer solution.
Psychopharmacology 1981; 75: 262-272.
Caldecott-Hazard S., Morgan D.G., DeLeon-Jones F., Overstreet D.H., Janowsky D.: Clinical and biochemical
aspects of depressive disorders: II. transmitter/receptor theories. Synapse 1991; 9: 251-301.
Cevc G.: Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1990; 1031, 311-382.
Cevc G.: Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 1993; 64, 163-186.
Charney D.S., Delgado P.L.: Current concepts of the role of serotonin function in depression and anxiety. In:
Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications (Langer S.Z.,
Brunello N., Racagni G., Mendlewicz J., Eds.), Int. Acad. Biomed. Drug Res., vol. 1., Basel: Karger, 1992,
pp. 89-104
Chiu C.-C., Huang S.-Y., Su K.-P., Lu M.-L., Huang M.-C., Chen C.-C., Shen W.W.: Polyunsaturated fatty acid
deficit in patients with bipolar mania. Eur. Neuropsychopharmacol. 2003; 13: 99-103.
Cohen S.A., Müller W.E.: Age-related alterations of NMDA-receptor properties in the mouse forebrain – partial
restoration by chronic phosphatidylserine treatment. Brain Res. 1992; 584: 174-180.
Cook E.H. Jr., Fletcher K.E., Wainwright M., Marks N., Yan S.-Y., Leventhal B.L.: Primary structure of the
human platelet serotonin 5-HT2A receptor: identify with frontal cortex serotonin 5-HT2A receptor. J.
Neurochem. 1994; 63: 465-469.
Cornelius F.: Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steadystate kinetics. Biochemistry 2001; 40, 8842-8851.
De Vriese S.R., Christophe A.B., Maes M.: In humans, the seasonal variation in poly-unsaturated fatty acids is
related to the seasonal variation in violent suicide and serotonergic markers of violent suicide.
Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 2004; 71: 13-18.
D'haenen H., De Waele M., Leysen J.E.: Platelet [3H]paroxetine binding in depressed patients. Psychiatry Res.
1988; 26: 11-17.
Duman R.S., Heninger G.R., Nestler E.J.: A molecular and cellular theory of depression. Arch. Gen. Psychiatry
1997; 54: 597-606.
Dumas F., Lebrun M.C., Tocanne J.-F.: Is the protein/lipid hydrophobic matching principle relevant to
membrane organization and functions? FEBS Lett. 1999; 458, 271-277.
Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent cations to bilayer
membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18, 5213-5223.
Engelberg H.: Low serum cholesterol and suicide. Lancet. 1992; 339: 727-729.
Fielding C.J., Fielding P.E.: Relationship between cholesterol trafficking and signaling in rafts and caveolae.
Biochim. Biophys. Acta 2003; 1610: 219-228.
Fišar Z., Krulík R.: Buněčné membrány a jejich interakce s antidepresivy. Biol. listy 1995; 60: 81-96.
35
Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J.: Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain
tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996; 15: 51-64.
Fišar Z.: Biochemické hypotézy afektivních poruch. Praha, Galén, 1998, 103 s.
Fišar Z., Jirák R.: Vybrané kapitoly z biologické psychiatrie. Praha, Grada, 2001, 316 s.
Fišar Z.: Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol.
Biophys. 2005; 24: 161-180.
Franke L., Schewe H.-J., Müller B., Campman V., Kitzrow W., Uebelhack R., Berghöfer A., MüllerOerlinghausen B.: Serotonergic platelet variables in unmedicated patients suffering from major depression
and healthy subjects. Relationship between 5HT content and 5HT uptake. Life Sci. 2000; 67: 301-315.
Frasure-Smith N., Lesperance F., Julien P.: Major depression is associated with lower omega-3 fatty acid levels
in patients with recent acute coronary syndromes. Biol. Psychiatry 2004; 55: 891-896.
Fuller R.W.: Uptake inhibitors increase extracellular serotonin concentration measured by brain microdialysis.
Life Sci. 1994; 55: 163-167.
Gelbmann C.M., Müller W.E.: Chronic treatment with phosphatidylserine restores muscarinic cholinergic
receptor deficit in the aged mouse brain. Neurobiol. Aging 1992; 13: 45-50.
Gulyaeva N., Zaslavsky A., Lechner P., Chlenov M., McConnell O., Chait A., Kipnis V., Zaslavsky B.: Relative
hydrophobicity and lipophilicity of drugs measured by aqueous two-phase partitioning, octanol-buffer
partitioning and HPLC. A simple model for predicting blood-brain distribution. Eur. J. Med. Chem. 2003;
38: 391-396.
Healy D., Leonard B.E.: Monoamine transport in depression: kinetics and dynamics. J. Affect. Disord. 1987; 12:
91-103.
Heerklotz H., Seelig J.: Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization.
Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 69-85.
Heirwegh K.P., De Smedt H., Vermeir M.: Analysis of membrane-bound acceptors. A correction function for
non-specific accumulation of poorly water-soluble hydrophobic or amphipathic ligands based on the ligand
partition concept. Biochem Pharmacol. 1992; 43: 701-704.
Herbette L.G., Chester D.W., Rhodes D.G.: Structural analysis of drug molecules in biological membranes.
Biophys. J. 1986; 49: 91-94.
Heron D., Shinitzky M., Hershkowitz M., Samuel D.: Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin
to mouse brain membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980; 77: 7463-7467.
Hibbeln J.R., Palmer J.W., Davis J.M.: Are disturbances in lipid-protein interactions by phospholipase-A2 a
predisposing factor in affective illness? Biol. Psychiatry 1989; 25: 945-961.
Hibbeln J.R., Salem N.Jr.: Dietary polyunsaturated fatty acids and depression: when cholesterol does not satisfy.
Am. J. Clin. Nutr. 1995; 62: 1-9.
Horrobin D.F.: Phospholipid metabolism and depression: the possible roles of phospholipase A2 and coenzyme
A-independent transacylase. Hum. Psychopharmacol. 2001; 16: 45-52.
Hrdina P.D., Bakish D., Ravindran A., Chudzik J., Cavazzoni P., Lapierre Y.D.: Platelet serotonergic indices in
major depression: up-regulation of 5-HT2A receptors unchanged by antidepressant treatment. Psychiatry Res.
1997; 66: 73-85.
36
Hurley J.H., Tsujishita Y., Pearson M.A.: Floundering about at cell membranes: a structural view of
phospholipid signaling. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000; 10: 737-743.
Jerling M.: Dosing of antidepressants-the unknown art. J. Clin. Psychopharmacol. 1995; 15: 435-439.
Jørgensen K., Ipsen J.H., Mouritsen O.G., Bennett D., Zuckermann M.J.: The effects of density fluctuations on
the partitioning of foreign molecules into lipid bilayers: application to anaesthetics and insecticides.
Biochim. Biophys. Acta 1991; 1067: 241-253.
Koyama T., Yamashita I.: Biological markers of depression: WHO multi-center studies and future perspective.
Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 1992; 16: 791-796.
Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J.: Radioimmunoassay of dibenzazepines and
dibenzcycloheptanodienes in body fluids and tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991; 29: 827-832.
Kunugi H., Takei N., Aoki H., Nauko S.: Low serum cholesterol in suicide attempters. Biol. Psychiatry 1997;
41: 196-200.
Lachman H.M., Papolos D.F.: A molecular model for bipolar affective disorder. Med. Hypoth. 1995; 45: 255264.
Langner M., Kubica K.: The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids 1999; 101: 3-35.
Lawrence K.M., Katona C.L.E., Abou-Saleh M.T., Robertson M.M., Nairac B.L., Edwards D.R., Lock T., Burns
R.A., Harrison D.A., Horton R.W.: Platelet 5-HT uptake sites, labelled with [3H]paroxetine, in controls and
depressed patients before and after treatment with fluoxetine or lofepramine. Psychopharmacology (Berl).
1994; 115: 261-264.
Lee A.G.: Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta
2003; 1612, 1-40.
Lesch K.-P., Wolozin B.L., Murphy D.L., Riederer P.J.: Primary structure of the human platelet serotonin uptake
site – identity with the brain-serotonin transporter. J. Neurochem. 1993; 60: 2319-2322.
Levitan I.B., Kaczmarek L.K.: The Neuron. Cell and Molecular |Biology. 3rd Edition, Oxford: Univ. Press, 2002
Lieber M.R., Lange Y., Weinstein R.S., Steck T.L.: Interaction of chlorpromazine with the human erythrocyte
membrane. J. Biol. Chem. 1984; 259: 9225-9234.
Luxnat M., Galla H.-J.: Partition of chlorpromazine into lipid bilayer membranes: the effect of membrane
structure and composition. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 274-282.
Maes M., Delanghe J., Meltzer H.Y., Scharpé S., D'Hondt P., Cosyns P.: Lower degree of esterification of serum
cholesterol in depression: relevance for depression and suicide research. Acta Psychiatr. Scand. 1994; 90:
252-258.
Maes M., Meltzer H.Y.: The serotonin hypothesis of major depression. In: Psychopharmacology: The Fourth
Generation of Progress (Bloom F.E., Kupfer D.J., Eds.), New York: Raven Press, 1995; pp. 933-944.
Maes M., Smith R., Christophe A, Vandoolaeghe E., Van Gastel A., Neels H., Demedts P., Wauters A., Meltzer
H.Y.: Lower serum high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in major depression and in depressed men
with serious suicidal attempts: relationship with immune-inflammatory markers. Acta Psychiatr. Scand.
1997; 95: 212-221.
Magnani F., Tate C.G., Wynne S., Williams C., Haase J.: Partitioning of the serotonin transporter into lipid
microdomains modulates transport of serotonin. J. Biol. Chem. 2004; 279: 38770-38778.
37
Mandell A.J.: Non-equilibrium behavior of some brain enzyme and receptor systems. Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 1984; 24: 237-274.
Manji H.K.: G proteins: implications for psychiatry. Am. J. Psychiatry 1992; 149: 746-760.
Mason R.P., Campbell S.F., Wang S.-D., Herbette L.G.: Comparison of location and binding for the positively
charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in
cardiac membranes. Mol. Pharmacol. 1989; 36, 634-640.
Mason R.P., Rhodes D.G., Herbette L.G.: Reevaluating equilibrium and kinetic binding parameters for lipophilic
drugs based on a structural model for drug interaction with biological membranes. J. Med. Chem. 1991; 34:
869-777.
McLaughlin S.: The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1989; 18: 113136.
Mellerup E., Langer S.Z., et al.: Validity of imipramine platelet binding sites as a biological marker of
endogenous depression. A World Health Organization Collaborative Study. Pharmacopsychiatry 1990; 23:
113-117.
Meltzer H.Y., Arora R.C., Baber R., Tricou B.J.: Serotonin uptake in blood platelets of psychiatric patients.
Arch. Gen. Psychiatry 1981; 38: 1322-1326.
Meltzer H.Y., Lowy M.T.: The serotonin hypothesis of depression. In: Psychopharmacology: The Third
Generation of Progress (Meltzer H.Y., Ed.), New York: Raven Press, 1987; 513-526.
Meyer J.H., Wilson A.A., Ginovart N., Goulding V., Hussey D., Hood K., Houle S.: Occupancy of serotonin
transporters by paroxetine and citalopram during treatment of depression: a [11C]DASB PET imaging study.
Am. J. Psychiatry 2001; 158: 1843-1849.
Miyake K., Fukuchi H., Kitaura T., Kimura M., Sarai K., Nakahara T.: Pharmacokinetics of amitriptyline and its
demethylated metabolite in serum and specific brain regions of rats after acute and chronic administration of
amitriptyline. J. Pharmaceutical Sci. 1990; 79: 288-291.
Moor M., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Organspecific, qualitative changes in the phospholipid composition
of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 1988; 37:
2035-2039.
Mosior M., McLaughlin S.: Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when
basic peptides bind to acidic lipids in membranes. Biochim. Biophys. Acta 1992; 1105: 185-187.
Mouritsen O.G., Jørgensen K.: Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid bilayers and its influence on
macroscopic membrane properties. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 15-20.
Mueller P.S., Davis J.M., Bunney W.E.Jr., Weil-Malherbe H., Cardon P.V.: Plasma free fatty acids
concentration in depressive illness. Arch. Gen. Psychiatry 1970; 22: 216-221.
Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J.: Lateral diffusion of small solutes and partition of amphipaths in defect
structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 283-289.
Nagy A., Johansson R.: Plasma levels of imipramine and desipramine in man after different routes of
administration. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1985; 290: 145-160.
New R.R.C.: Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach (New R.R.C., Ed.), Oxford: Oxford
Univ. Press, 1990, pp. 33-104.
38
Owens M.J., Nemeroff C.B.: Role of serotonin in the pathophysiology of depression: focus on the serotonin
transporter. Clin. Chem. 1994; 40: 288-295.
Peet M., Murphy B., Shay J., Horrobin D.: Depletion of omega-3 fatty acid levels in red blood cell membranes
of depressive patients. Biol. Psychiatry 1998; 43: 315-319.
Peet M., Stokes C.: Omega-3 fatty acids in the treatment of psychiatric disorders. Drugs 2005; 65: 1051-1059.
Penttinen J.: Hypothesis: low serum cholesterol, suicide, and interleukin-2. Am. J. Epidemiol. 1995; 141: 716718.
Perel J.M., Stiller R.L., Glassman A.H.: Studies on plasma level/effect relationships in imipramine therapy.
Commun Psychopharmacol 1978; 2: 429-439.
Perry P.J., Zeilmann C., Arndt S.: Tricyclic antidepressant concentrations in plasma: an estimate of their
sensitivity and specificity as a predictor of response. J. Clin. Psychopharmacol. 1994; 14: 230-240.
Pettegrew J.W., Panchalingam K., McClure R.J., Gershon S., Muenz L.R., Levine J.: Effects of chronic lithium
administration on rat brain phosphatidylinositol cycle constituents, membrane phospholipids and amino
acids. Bipolar Disord. 2001; 3: 189-201.
Pfrieger F.W.: Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim Biophys Acta 2003; 1610: 271280.
Plenge P., Wiborg O.: High- and low-affinity binding of S-citalopram to the human serotonin transporter
mutated at 20 putatively important amino acid positions. Neurosci. Lett. 2005; 383: 203-208.
Racagni G., Brunello N.: Transynaptic mechanisms in the action of antidepressant drugs. Trends Pharmacol. Sci.
1984; 5 (12): 527-531.
Rando R.R.: Regulation of protein kinase-C activity by lipids. FASEB J. 1988; 2: 2348-2355.
Reith M.E.A., Sershen H., Lajtha A.: Binding of imipramine and cocaine to a model lipid membrane:
comparison with binding to brain membranes. Neurochem. Res. 1984; 9: 965-977.
Riant P., Urien S., Albengres E., Renouard A., Tillement J.P.: Effects of the binding of imipramine to
erythrocytes and plasma proteins on its transport through the rat blood-brain barrier. J. Neurochem. 1988;
51: 421-425.
Risch S.C., Leighton Y.H., Janowsky D.S.: Plasma levels of tricyclic antidepressants and clinical efficacy:
review of the literature - part I. J. Clin. Psychiatry 1979; 40: 9-21.
Rybakowski J.K., Lehmann W.: Decreased activity of erythrocyte membrane ATPases in depression and
schizophrenia. Neuropsychobiol. 1994; 30: 11-14.
Salem N.Jr., Niebylski C.D.: The nervous system has an absolute molecular species requirement for proper
function. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 131-134.
Sanchez C., Hyttel J.: Comparison of the effects of antidepressants and their metabolites on reuptake of biogenic
amines and on receptor binding. Cell. Mol. Neurobiol. 1999; 19: 467-489.
Sandermann H., Duncan T.M.: Lipid-dependent membrane enzymes – kinetic modeling of the activation of
protein-kinase-C by phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 1991; 1069: 235-240.
Sanganahalli B.G., Joshi P.G., Joshi N.B.: Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane
dynamics-a fluorescence spectroscopic study. Life Sci. 2000; 68: 81-90.
Scanlon S.M., Williams D.C., Schloss P.: Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity.
Biochemistry 2001; 40: 10507-10513.
39
Schloss P., Henn F.A.: New insights into the mechanisms of antidepressant therapy. Pharmacol. Ther. 2004; 102:
47-60.
Schreier S., Malheiros S.V.P., de Paula E.: Surface active drugs: self-association and interaction with membranes
and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 210-234.
Schwyzer R.: New principle in QSAR: membrane requirements. J. Recept. Res. 1991; 11: 45-57.
Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C.: Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding
and functional properties of somatostatin analogues of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 1993; 32:
9714-9721.
Sengupta N., Datta S.C., Sengupta D.: Platelet and erythrocyte membrane lipid and phospholipid patterns in
different types of mental patients. Biochem. Med. 1981; 25: 267-275.
Seydel J.K., Coats E.A., Cordes H.P., Wiese M.: Drug membrane interaction and the importance for drug
transport, distribution, accumulation, efficacy and resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 1994; 327: 601-610.
Seydel J.K., Wiese M.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. Weinheim: WileyVCH, 2002.
Shinitzky M.: Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Kates M., Manson L.A., Eds.),
New York: Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 585-601.
Siever L.J., Kahn R.S., Lawlor B.A., Trestman R.L., Lawrence T.L., Coccaro E.F.: II. Critical issues in defining
the role of serotonin in psychiatric disorders. Pharmacol. Rev. 1991; 43: 509-525.
Sikora J., Krulík R., Beitlová D., Příhoda P.: Plasma levels of antidepressants after their withdrawal. Endocrinol.
Exp. 1990; 24: 221-227.
Singer S.J., Nicolson G.L.: The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175: 720731.
Srivastava L.K., Kazmi S.M., Blume A.J., Mishra R.K.: Reconstitution of affinity-purified dopamine D2
receptor binding activities by specific lipids. Biochim. Biophys. Acta 1987; 900: 175-182.
Stahl S.M.: Serotonin receptors and the mechanism of action of antidepressant drugs: postmortem, platelet, and
neuroendocrine studies in depressed patients. In: Serotonin IA Receptors in Depression and Anxiety (Stahl
S.M., Gastpar M., Keppel Hesselink J.M., Traber J., Eds.), New York: Raven Press, 1992, pp. 119-134
Stahl S.M.: 5HT1A receptors and pharmacotherapy. Is serotonin receptor down-regulation linked to the
mechanism of action of antidepressant drugs? Psychopharmacol. Bull. 1994; 30: 39-43.
Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications. Second
Edition, Cambridge Univ. Press, Cambridge
Stain-Malmgren R., Khoury A.E., Ǻberg-Wistedt A., Tham A.: Serotonergic function in major depression and
effect of sertraline and paroxetine treatment. Int. Clin. Psychopharmacol. 2001; 16: 93-101.
Stankowski S.: Surface charging by large multivalent molecules. Extending the standard Gouy-Chapman
treatment. Biophys. J. 1991; 60: 341-351.
Sulser F., Janowsky A.J., Okada F., Manier D.H., Mobley P.L.: Regulation of recognition and action function of
the norepinephrine (NE) receptor-coupled adenylate cyclase system in brain: implications for the therapy of
depression. Neuropharmacol. 1983; 22: 425-431.
Švestka a kol.: Psychofarmaka v klinické praxi. Praha: Grada , 1995.
40
Terao T., Nakamura J., Yoshimura R., Ohmori O., Takahashi N., Kojima H., Soeda S., Shinkai T., Nakano H.,
Okuno T.: Relationship between serum cholesterol levels and meta-chlorophenylpiperazine-induced cortisol
responses in healthy men and women. Psychiatry Res. 2000; 96: 167-173.
Tieleman D.P., Marrink S.J., Berendsen H.J.C.: A computer perspective of membranes: molecular dynamics
studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys. Acta 1997; 1331: 235-270.
Toplak H., Zuehlke R., Loidl S., Hermetter A., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Single and multiple
desipramine exposures of cultured cells. Changes in cellular anisotropy and in lipid composition of whole
cells and of plasma membranes. Biochem. Pharmacol. 1990; 39: 1437-1443.
Tsakiris S., Deliconstantinos G.: Influence of phosphatidylserine on (Na+/K+)-stimulated ATPase and
acetylcholinesterase activities of dog brain synaptosomal plasma-membranes. Biochem. J. 1984; 220: 301307.
Tuomisto J., Tukiainen E., Ahlfors U. G.: Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from
patients with endogenous depression. Psychopharmacology 1979; 65: 141-147.
Vevera J., Žukov I., Morcinek T., Papežová H.: Cholesterol concentrations in violent and non-violent women
suicide attempters. Eur. Psychiatry 2003; 18: 23-27.
Vinař O.: Psychofarmaka. Minimum pro praxi. Praha: Triton, 1998.
Vinokur V.A., Gubachev Iu.M.: The effect of antidepressants on lipid metabolism and the clinical course in
IHD. Ter. Arkh. 1994; 66: 76-80.
Xia Z., Ying G., Hansson A.L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J.W., Nässberger L.:
Antidepressant-induced lipidosis with special reference to tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 2000; 60:
501-512.
Young G., Conquer J.: Omega-3 fatty acids and neuropsychiatric disorders. Reprod. Nutr. Dev. 2005; 45: 1-28.
Zachowski A., Durand P.: Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths with artificial and biological
membranes. Biochim. Biophys. Acta 1988; 937: 411-416.
Zimmer G.: Fluidity of cell membranes in the presence of some drugs and inhibitors. In: Membrane Fluidity
(Kates M.and Manson L.A., Eds.), Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 169-203.
41
2. SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ
2.1. Vazba imipraminu k fosfolipidovým dvojvrstvám měřená metodou
vazby radioligandu
Příloha 1:
FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of
imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol.
Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99.
Úvod
Tricyklická antidepresiva (TCA) jsou nejdůkladněji prozkoumanou skupinou antidepresiv,
neboť se používají k léčbě afektivních poruch již téměř 50 let. Chemicky se jedná o amfifilní
molekuly ze skupiny dibenzazepinů nebo dibenzcykloheptanodienů, které za fyziologických
podmínek nesou kladný náboj (pKw = 9,4). Jejich primárním biochemickým účinkem
vedoucím k terapeutickým účinkům je inhibice funkce membránových přenašečů pro
serotonin a noradrenalin v neuronálních membránách.
Při ztrátě kladného náboje se molekula TCA stává nepolární a může se akumulovat
v hydrofobním vnitřku dvojvrstvy nebo projít na druhou stranu membrány, získat náboj a být
lokalizována na vnitřním povrchu nebo se uvolnit do vodné fáze. Nakolik se akumulace TCA
v lipidové části buněčných membrán podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích
není známo. Pro popis adsorpce nebo inkorporace amfifilních léčiv do lipidových dvojvrstev
lze použít Gouyovu-Chapmanovu teorii, která umožňuje provést korekci vazebných izoterem
na elektrostatické efekty u povrchu membrán. Mohou tak být určeny správné vazebné
parametry léčiv k lipidovým dvojvrstvám a rozlišen příspěvek hydrofobních a
elektrostatických interakcí k celkové vazbě. Dosud nebyla dostatečně poznána heterogenita
vazby a vazebné parametry TCA k lipidovým dvojvrstvám.
V našich dřívějších experimentech (Fišar et al. 1991) jsme zjistili, že na vazbu TCA
k modelovým membránám má větší vliv lipidové složení dvojvrstvy, než rozdíly mezi
jednotlivými TCA, přičemž významnou úlohu mají fosfolipidy nesoucí záporný výsledný
náboj. Proto jsme naše experimenty provedli s mnohovrstevnými liposomy připravenými
z fosfatidylcholinu (PC), který je celkově elektricky neutrální, nebo fosfatidylserinu (PS),
který nese celkový záporný náboj. Zaměřili jsme se na možnost rozlišení mezi slabší
42
povrchovou adsorpcí TCA k liposomům a inkorporací léku dovnitř dvojvrstvy. Z antidepresiv
byl testován především imipramin (IMI), ale také desipramin (DMI), didesmetylimipramin
(DDMI) a amitriptylin (AMI).
Cíle
Cílem této práce byla charakterizace vazby TCA k lipidovým membránám. Studie byla
rodělena do tří etap:
1. Určit propustnost fosfolipidových dvojvrstev pro IMI: úkolem bylo zjistit, zda
mnohovrstevné liposomy jsou vhodným modelem pro studium interakcí IMI s lipidovou
dvojvrstvou, tj. prokázat, že IMI prochází lipidovými dvojvrstvami dostatečně rychle, aby
změřené vazebné parametry odpovídaly vazbě ke vnějším i vnitřním dvojvrstvám.
2. Změřit a analyzovat celkovou vazbu IMI k liposomům: úkolem bylo analyzovat vazebné
izotermy vazby IMI k liposomům připravených z celkově elektroneutrálních nebo záporně
nabitých fosfolipidů pomocí Gouyovy-Chapmanovy teorie a Sternových rovnic.
3. Charakterizovat vysokoafinní vazbu TCA k liposomům: úkolem bylo vypracovat techniku
umožňující rozlišit slabou povrchovou adsorpci od silnější vazby IMI do vniřních oblastí
lipidových dvojvrstev a určit vazebné parametry silné vazby TCA lipidovým membránám
a možnosti jejího vytěsňování.
Metody
Byla měřena rovnovážná vazba TCA k lipidovým membránám. Jako modelové membrány
byly použity liposomy typu MLV (viz kap. 1.5.1) připravené z PC nebo PS. Pro měření vazby
TCA k MLV jsme použili jsme metodu vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy,
přičemž pro oddělení volného a vázaného radionuklidu byla použita centrifugační nebo
filtrační technika. Vazba antidepresiv byla popsána rozdělovacími koeficienty nebo parametry
Langmuirových nebo Sternových adsopčních izoterem.
Výsledky
Propustnost lipidových dvojvrstev pro IMI
Úlohu jsme řešili porovnáním tří typů vzorků odlišujících se tím, ve které fázi přípravy MLV
byl přidán tritiem značený IMI, a změřením kinetiky asociace a disociace IMI z liposomů.
Zjistili jsme, že inkubace MLV s IMI při 20°C po dobu 30 min. je postačující pro ustavení
rovnovážného stavu a rovnoměrného rozdělení IMI v mnohovrstevných liposomech.
43
Měření a analýza celkové vazby IMI k liposomům
Vazebné izotermy IMI k dvojvrstvám připraveným z PC a z PS byly změřeny s použitím
centrifugační techniky pro oddělení nenavázaného antidepresiva. Při jejich analýze pomocí
Sternových rovnic byl vzat v úvahu vliv IMI a monovalentních kationtů v roztoku na
povrchový potenciál lipidových dvojvrstev a hustota povrchového náboje lipidových
membrán byla korigována na průměrný elektrický náboj IMI a na zvětšení plochy membrány
v důsledku inkorporace IMI do dvojvrstvy. Pro různé koncentrace IMI tak byly spočteny
parametry jako elektrostatický povrchový potenciál, koncentrace IMI ve vodné fázi
v bezprostřední blízkosti povrchu membrán, hydrofobní rozdělovací koeficient nebo zdánlivý
celkový rozdělovací koeficient. Zatímco poslední dva uvedené parametry se od sebe pro
membrány připravené z celkově elektroneutrálního PC příliš nelišily, záporný náboj PSmembrán způsobil mnohem menší hodnoty hydrofobního rozdělovacího koeficientu a vyšší
hodnoty zdánlivého celkového rozdělovacího koeficientu. Koncentrační závislosti
sledovaných parametrů byly silně nelinární. Experimentálně určené molární množství IMI
vázaného na mol lipidu bylo pro PC menší a pro PS výrazně větší než předpovídá GouyovaChapmanova teorie. Tyto odchylky experimentálních dat od teorie ukazují na významnou
úlohu jak elektrostatických odpudivých sil způsobených molekulami IMI vázanými v PCmembránách, tak elektrostatických přitažlivých sil mezi IMI a zápornými náboji v PSmembránách.
Vysokoafinní vazba TCA k liposomům
Vypracování vhodné techniky pro měření vysokoafinní vazby TCA k MLV obnášela např.
porovnání účinnosti filtrace a centrifugace pro oddělení MLV od vodného média, stanovení
vazby tritiovaného TCA na používané filtry, určení závislosti vazby TCA k MLV na
koncentraci fosfolipidů a další. Vazebné saturační izotermy TCA k dvojvrstvám připraveným
z PC, PS nebo hrubého extraktu lipidů z mozku byly měřeny s použitím techniky rychlé
filtrace pro oddělení nenavázaného TCA. Vazebné parametry spočtené s použitím GouyovyChapmanovy teorie a zdánlivé vazebné parametry spočtené bez jejího použití se pro PCmembrány významně nelišily, zatímco pro PS-membrány byly velmi rozdílné. Množství
navázaného IMI na mol fosfolipidu bylo významně vyšší pro PS-membrány. Tyto výsledky
ukazují na významnou úlohu PS v interakcích IMI s membránami. Parametry vazby různých
TCA (IMI, DMI, DDMI, AMI) se významně nelišily, což ukazuje na určující úlohu
lipidového složení membrán při jejich interakcích s TCA. Analýza vytěsňovacích křivek
44
ukázala, že vazba IMI k PS-membránám je mnohem hůře vytěsnitelná, než vazba k PCmembránám.
Závěry
•
Pro měření interakcí antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami lze použít modifikovanou
metodu vazby radioligandu, původně vyvinutou pro receptorové studie. Citlivost metody a
možnosti analýzy výsledků jsou srovnatelné např. s izotermickou titrační kalorimetrií.
•
Vyšší hydrofobní rozdělovací koeficienty pro IMI v PC-membránách ve srovnání s PSmembránami lze interpretovat jako důsledek lepší dostupnosti hydrofobního vnitřku PCdvojvrstev pro IMI.
•
Porovnání hodnot změřených a hodnot korigovaných na základě Gouyovy-Chapmanovy
teorie ukázalo, že při nízkých koncentracích IMI (pod 1 µmol/l) je vliv navázaného IMI
na povrchový náboj PC-membrán zanedbatelný; určující síly pro vazbu jsou zřejmě síly
van der Waalsovy. Oproti tomu pro vazbu IMI k PS-membránám jsou elektrostatické
interakce určující i při velmi nízkých koncentracích IMI.
•
Nelinearita rozdělovacích koeficientů překvapivě pozorovaná i při nízkých koncentracích
IMI znamená, že parametry Sternových adsopčních izoterem (tj. maximální množství
léčiva vázaného na mol fosfolipidu a rovnovážná asociační konstanta) popisují vazbu
TCA k lipidovým membránám mnohe lépe, než jednoduché rozdělovací koeficienty.
•
Významně vyšší vazebná kapacita a nižší asociační konstanta pro vazbu IMI k PSmembránám ve srovnání s vazbou k PC-membránám znamená, že fosfolipidové složení
může výrazně ovlivňovat rozdělení antidepresiv mezi membránu a vodnou fázi, a že při
analýze vazby antidepresiv k záporně nabitým membránám je vhodnější použít jejich
koncentraci v bezprostřední blízkosti membrány, než objemovou koncentraci ve vodném
roztoku. Model založený na nespecifické akumulaci IMI v blízkosti povrchu membrán
následovaný hydrofobní adsorpcí je mnohem realističtější, než model běžně používaný
v receptorových studií, který předpokládá stejnou koncentraci ligandu ve větší i menší
vzdálenosti od buněčného povrchu.
•
Vazebné konstanty antidepresiv k lipidové části buněčných membrán jsou mnohem
menší, než je tomu pro receptorová vazebná místa, avšak za předpokladu, že každá
receptorová molekula je obklopena řádově 106 lipidovými molekulami, je součin počtu
lipidových molekul a jejich vazebné kapacity a vazebné konstanty blízký receptorové
vazebné konstantě. Významná část IMI je vázána k lipidové části studovaných buněčných
45
membrán a není dostupná pro vazbu k receptorovým vazebným místům přístupným
v vodné fáze. Na druhou stranu přítomnost negativně nabitých skupin v blízkosti
receptorového vazebného místa může úbytek dostupného IMI i více než kompenzovat.
•
Pro zjištění možné interference mezi vazbou IMI do lipidové dvojvrstvy a ke specifickým
vazebným místům v biologických membránách jsme detailně proměřili silnou
(vysokoafinní) část z celkové vazby IMI k membránám z PC nebo PS. Zjistili jsme, že pro
toto měření je vhodné použít filtrační techniku oddělení volného a vázaného IMI. Čisté
PC-membrány vykazují saturovatelnou vytěsnitelnou (specifickou) vysokoafinní vazbu,
která je však z fyzikálního hlediska jen zdánlivá. Nicméně naše zjištění znamená, že
v receptorových vazebných studiích, kdy je studována vazba IMI nebo podobného
amfifilního ligandu, může docházet k obtížně rozlišitelné interferenci mezi vazbou ke
specifickému proteinovému vazebnému místu a touto zdánlivou vysokafinní vazbou do
lipidové dvojvrstvy. Specifikace vazebných sil podílejících se na zdánlivé vysokoafinní
vazbě TCA k lipidovým dvojvrstvám je předmětem naší následující publikace (viz
Příloha 2).
46
2.2. Interakce tricyklických antidepresiv s fosfolipidovými dvojvrstvami
Příloha 2:
FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer
membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180.
Úvod
V dřívější práci (viz Příloha 1) jsme ukázali, že vazba tricyklických antidepresiv (TCA)
k modelovým membránám má kromě nízkoafinní složky charakterizující hlavně slabou
povrchovou adsorpci nabitých molekul TCA i zdánlivou vysokoafinní složku, která dosud
nebyla popsána a charakterizována. Rovněž jsme ukázali, že vazba TCA k liposomům silně
závisí na elektrickém náboji, který je na jejich povrchu a který je dán nábojem fosfolipidů
tvořících dvojvrstvy.
Fosfatidylcholin (PC) a fosfatidyletanolamin (PE) jsou v širokém rozsahu pH celkově
elektricky neutrální, neboť záporný náboj fosfátové skupiny (pKPO4- ≤ 1) je kompenzován
kladným nábojem cholinové hlavičky (pKNH3+ = 11,25); při vysokých pH však nesou PC a PE
záporný náboj. Fosfatidylserin (PS) může nést kromě záporného náboje fosfátu (pKPO4- ≤ 1) a
kladného náboje aminoskupiny (pKNH3+ = 11,5) i záporný náboj na karboxylové skupině
(pKCOO- = 5,5). PS tedy nese za normálních podmínek záporný náboj, který se zvyšuje při
vyšších hodnotách pH, zatímco při nízkých pH je PS elektricky neutrální. Fosfatidylinositol
(PI) je negativně nabitý v širokém rozsahu pH (pKPO4- = 2,7). Podíl coulombických interakcí
na celkové vazbě TCA k liposomům připraveným z různých fosfolipidů lze určit na základě
měření pH závislostí těchto vazeb.
Mezi nejčastějí používaná a studovaná TCA patří imipramin (IMI), desipramin (DMI),
amitriptylin (AMI) a nortriptylin (NOR). Při pH 7,4 nese kolem 99% molekul TCA ve vodě
kladný náboj (pKw = 9,4). Hodnoty pK se však mohou lišit u ionizovatelných molekul léčiv
lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě od molekul léčiv ve vodném roztoku. Snadno lze
odvodit vztah mezi posunem pK léčiva v membráně a ve vodě na jedné straně a poměrem
rozdělovacích koeficientů nabité a nenabité formy tohoto léčiva na straně druhé. Posun pK lze
určit z pH-závislosi vazby léčiva k lipidové dvojvrstvě.
Cíle
Cílem této práce byla charakterizace zdánlivé vysokoafinní vazby TCA k lipidovým
dvojvrstvám. Především jsme chtěli analýzou pH-závislostí vazby určit podíl Coulombových
47
a jiných nekovalentních interakcí v této vazbě, a rozlišit vliv vlastností antidepresiv a
vlastností fosfolipidů na vazbu.
Metody
Byly změřeny pH-závislosti zdánlivé vysokoafinní vazby čtyř různých tricyklických
antidepresiv (IMI, DMI, AMI, NOR) k mnohovrstevným liposomům (MLV) připraveným z
různých fosfolipidů (PC, PE, PS, PI). Pro měření vazby TCA k MLV byla použita metoda
vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy, přičemž pro oddělení volného a
vázaného radionuklidu byla použita filtrační technika. Záchyt MLV na filtrech při různých
hodnotách pH byl měřen pomocí tritiem značených fosfolipidů.
Výsledky
Nejprve byla upřesněna metoda měření stanovením pH-závislostí účinnosti záchytu MLV
(obsahujících tritiem značené fosfolipidy) na filtrech. Při vyhodnocení vlastních vazebných
experimentů potom byl proveden přepočet na 100% účinnost záchytu.
Metodou fluorescenčních sond jsme ověřili, že v rozsahu pH 4 až 11 nedochází
k významným změnám v anizotropie fluorescence membránových sond, tj. nedochází
k podstatným změnám ani ve struktuře a uspořádání lipidových dvojvrstev, ani v pohyblivosti
membránových molekul.
Metodou vazby radioligandu byly změřeny pH-závislosti (v rozsahu 2 až 12) vazby
tritiovaného IMI, DMI, AMI nebo NOR k liposomům připraveným jak z čistého PC, PE, PS
nebo PI, tak ze směsí PC+PE, PC+PS nebo PC+PI. Křivky byly vyhodnoceny na základě
známých hodnot pK zásaditých a kyselých skupin na molekulách fosfolipidů a antidepresiv.
Zjistili jsme, že:
1. Pro rozlišení vazby nabitých a nenabitých molekul bylo nutné použít velmi nízké
(nanomolární) koncentrace TCA.
2. Celková vazba byla závislá jak na pH, tak na lipidovém složení membrán, zatímco
nespecifická vazba byla nízká a prakticky konstantní v celém rozsahu pH.
3. Průběhy pH-závislostí vazby k PC-, PE- nebo PI-membránám odpovídaly změně
průměrného kladného náboje na molekulách TCA, avšak křivka pro PC byla posunuta
směrem k nižším pH. Průběhy závislostí vazby TCA k PS-membránám byly komplexnější
a odrážely jak změnu kladného náboje na TCA, tak negativního náboje na PS molekulách.
4. Analýzou pH-závislostí vazby k PC-membránám bylo zjištěno, že poměr rozdělovacích
koeficientů nenabité a nabité formy antidepresiva je pro IMI a AMI asi 50, zatímco pro
48
DMI a NOR pouze 13. Pro dvojvrstvy připravené ze směsi PC+PE byl rozdělovací
koeficient nenabité formy IMI nebo AMI dokonce 500 krát větší než formy nabité, pro
DMI nebo NOR jen 250krát větší.
5. pH-závislosti vazby TCA k membránám připraveným z PS nebo PS+PC ukázaly, že při
fyziologickém pH je příspěvek nabitých a nenabitých molekul TCA k vazbě přibližně
stejný.
6. Vazba TCA k membránám z PI+PC je realizována inkorporací nabitých i nenabitých
molekul TCA.
Závěry
•
Ukázali jsme, že pro získání základních údajů o intermolekulových silách podílejících se
na zdánlivé vyskoafinní vazbě TCA a lipidovým dvojvrstvám lze použít nejen
spektroskopicé a kalorimetrické metody, ale i metodu vazby radiologandu.
•
Velikost zdánlivé vysokoafinintní vazby TCA k lipidovým dvojvrstvám závisí silně na
fosfolipidovém složení membrán a na pH, ale je velmi podobná pro různá TCA.
•
Průběhy pH-závislostí vazby TCA k membránám z elektroneutrálních fosfolipidů (PC,
PE) lze interpretovat jako důsledek usnadněné inkorporace nenabitých molekul TCA do
hydrofobního vnitřku dvojvrstev tvořených PC, PE nebo PC+PE.
•
Vyšší poměr rozdělovacích koeficientů nenabité a nabité formy pro vazbu IMI a AMI ve
srovnání s DMI a NOR ukazuje, že v membránách připravených z PC nebo PC+PE
ovlivňuje silně zdánlivou vysokoafinní vazbu nejen náboj, ale i metylace bočního
acylového řetězce TCA .
•
Z měření vazby TCA k membránám obsahujícím PS vyplývá, že na zdánlivé vysokoafinní
vazbě se za fyziologických podmínek silně podílí také Coulombovy interakce. Porovnání
vazby TCA k membránám obsahujícím PS s membránami obsahujícími PI ukázalo, že
existuje určitá specificita vazby TCA k PS, která není určena celkovým záporným
nábojem jeho polární hlavičky. Jedná se zřejmě o důsledek rozdílného prostorového
rozdělení náboje na povrchu membrán tvořených PS a PI.
•
Podíl jednotlivých nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA
k lipidovým membránám silně závisí na fosfolipidovém složení membrán, tzn. že
určujícím faktorem je rozložení náboje v oblasti polárních hlaviček fosfolipidů. Existuje
však i závislost vazby na typu TCA, především na metylaci či demetylaci jejich acylového
řetězce.
49
2.3. Rozdělení imipraminu mezi krevní buňky, plazmu a mozek
Příloha 3:
FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan.
Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol.
Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64.
Úvod
Tricyklická antidepresiva, jako je imipramin (IMI) a desipramin (DMI), patří do skupiny
amfifilních léčiv nesoucích kladný náboj. Dobře prostupují hematoencefalickou bariérou a
akumulují se v lipidové části buněčných membrán. Byla zjištěna rozmezí plazmatických
koncentrací potřebná pro terapeutickou účinnost antidepresiv, ale plazmatické koncentrace
IMI a jeho metabolitů vykazují i při stejném dávkování značné interindividuální rozdíly.
Nebyl dosud stanoven dostatečně přesný vztah mezi běžně měřenými koncentracemi v plazmě
a skutečnými koncentracemi v mozku.
Po dlouhodobém podávání antidepresiv dochází k ustavení jejich koncentrace jak v krvi,
tak v mozku. Antidepresiva se mohou vyskytovat volné i vázané v mimobuněčném i
nitrobuněčném prostoru a v membránách. V krvi se amfifilní léčiva akumulují především
v erytrocytárních membránách. Akumulace antidepresiv v mozkových membránách a její
vztah ke koncentracím plazmatickým nebyly dosud určeny.
Cíle
Cílem této práce bylo stanovení vztahu mezi koncentracemi antidepresiv v krvi a mozku
s uvážením jejich rozdělení mezi membrány, plazmu a cytosol.
Metody
Laboratorním potkanům byl podáván dlouhodobě IMI v různých dávkách a poté byl měřeny
koncentrace IMI a jeho aktivního metabolitu DMI v plazmě, erytrocytech, erytrocytárním
cytosolu, erytrocytárních membránách (ghostech), homogenátu z mozku, mozkových
membránách a mozkovém cytosolu. Pro měření koncentrací antidepresiv byla použita
radioimunoassay (RIA) s tritiovaným IMI jako radioligandem. Koncentrace antidepresiv byly
vyjádřeny buď v ng na 1 ml vzorku (plazmy, erytrocytů, erytrocytárního cytosolu, mozkové
tkáně nebo mozkového cytosolu), nebo v ng na 1 ml fosfolipidových membrán (pro
50
erytrocytární nebo mozkové membrány) za předpokladu, že hustota membrán je přibližně 1
g/cm3.
Výsledky
Použité dávky IMI vedly po 7 dnech podávání k plazmatickým hladinám v rozsahu 3 až 338
ng/ml. Byla potvrzena akumulace IMI i DMI v buněčných membránách. Jejich koncentrace v
erytrocytárních ghostech činila téměř 80% z koncentrace v neporušených erytrocytech.
Pro kvantitativní ohodnocení vzájemné souvislosti koncentrací IMI+DMI v různých
vzorcích byly spočteny korelační koeficienty pro všechny dvojice koncentrací měřených v
různých částech krve a mozkové tkáně. Byly zjištěny statisticky významné závislosti mezi
všemi těmito dvojicemi koncentrací. Byly spočteny koeficienty pro vzájemný přepočet
koncentrací IMI+DMI v plazmě, erytrocytech, erytrocytárním cytosolu, erytrocytárních
ghostech, homogenátu z mozku, mozkových membránách a mozkovém cytosolu.
Ukázalo se, že dochází k výrazné akumulaci IMI+DMI v mozkové tkáni, zvláště v
membránách. Koncentrace v homogenátu z mozkové tkáně byla zjištěna téměř 15 krát vyšší
než v neporušených erytrocytech, koncentrace v mozkových membránách asi 11 krát vyšší
než v erytrocytárních membránách atd.
Z analýzy dat vyplynulo, že existuje primární závislost mezi koncentracemi v mozkovém
homogenátu, v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách. Pomocí vícenásobné regresní
analýzy jsme nalezli vztah pro výpočet koncentrace antidepresiva v mozkové tkáni
z koncentrací v plazmě a erytrocytárních membránách
Závěry
•
Koncentrace antidepresiv v membránách, především mozkových, jsou mnohem vyšší než
koncentrace v plazmě. Jakou úlohu má tato akumulace antidepresiv v membránách
v jejich terapeutických účincích není dosud známo.
•
Existuje významná závislost mezi koncentracemi antidepresiva v mozku (resp. mozkovém
homogenátu), v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách. Pro dobrý odhad
koncentrace imipraminu v mozkové tkáni lze proto použít koncentrace změřené v krvi.
•
Koncentrace antidepresiv v mozku jsou určeny jak koncentracemi v plazmě, tak
koncentracemi v membránách krevních buněk, a mohou být v principu ovlivněny
změnami složení nebo vlastností lipidové části buněčných membrán. Lze tak vysvětlit
skutečnost, že v některých případech plazmatické koncentrace antidepresiv nekorelují
dobře s jejich terapeutickými účinky.
51
2.4. Vliv antidepresiv s různými farmakologickými účinky na uptake
serotoninu do trombocytů
Příloha 4:
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically
selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys.
2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128.
Úvod
Primární biochemické účinky různých antidepresiv jsou velmi různorodé (viz kap. 1.3). Přesto
po dlouhodobém podávání pozitivně ovlivňují klinicky stejné depresivní příznaky. Existují
důkazy, že antidepresiva s farmakologicky selektivními primárními účinky ovlivňují
neurotransmisi zprostředkovanou jak cílovým neurotransmiterem, tak i jinými
neurotransmitery. Mechanismy propojení mezi různými systémy aktivovanými antidepresivy
však nejsou dostatečně známy.
Existuje shoda v tom, že za terapeutické účinky antidepresiv jsou odpovědné adaptivní
buněčné změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech. V hypotézách
afektivních poruch je pozornost věnována především serotonergní aktivitě v mozku. Tato
aktivita je uskutečňována a modulována především serotoninovými receptory a přenašeči a
syntézou a metabolismem sertotoninu. Důležitou úlohu v serotoninových hypotézách
afektivních poruch má membránový přenašeč pro serotonin (SERT), který má určující úlohu
v regulaci koncentrace serotoninu uvolněného do synaptické stěrbiny (viz kap. 1.4) a který je
inhibován řadou antidepresiv. Vzhledem k závislosti aktivity SERT na interakcích
s membránovými lipidy a cholesterolem lze uvažovat o spojení serotoninových a
membránových hypotéz afektivních poruch (viz kap. 1.2.2 a 1.2.3).
Není dosud známo, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s odlišnými primárními
biochemickými účinky vede ke společným adaptivním změnám např. v aktivitě SERT. Na
základě předpokladu, že parametry kinetiky uptake serotoninu do trombocytů lze používat pro
sledování změn v serotonergní aktivity v mozku (viz kap. 1.4), jsme v této práci sledovali vliv
různých antidepresiv na serotonergní systém laboratorních potkanů.
52
Cíle
Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání antidepresiv
s různými primárnímuí farmakologickými účinky na zprostředkovaný transport serotoninu do
trombocytů. Porovnáním vlivu akutního a dlouhodobého podávání antidepresiv jsme chtěli
zjistit, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou může
mít společný vliv na aktivitu SERT. Studie byla provedena ve dvou etapách:
1. Proměření akutních účinků antidepresiv na uptake serotoninu do trombocytů in vitro.
2. Stanovení vlivu dlouhodobého podávání antidepresiv in vivo na uptake serotoninu do
trombocytů.
Metody
Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva s různými primárními biochemickými
účinky: desipramin (účinný neselektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), maprotilin
(selektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), citalopram (selektivní inhibitor reuptake
serotoninu), moklobemid (reverzibilní inhibitor monoaminoxidasy) a lithium (stabilizátor
nálady s různými účinky na přenos nervového signálu) po dobu 4 týdnů. Trombocyty byly
izolovány z periferní krve a aktivita SERT (charakterizovaná parametry KM, Vmax a Vmax/KM;
viz kap. 1.4) byla měřena pomocí tritiem značeného serotoninu.
Výsledky
1. Krátkodobá in vitro inkubace trombocytů s antidepresivy vedla k inhibici uptake
serotoninu do trombocytů pro citalopram > desipramin > maprotilin, zatímco pro
moklobemid a lithium nebyla pozorována významná změna uptake.
2. Dlouhodobé podávání antidepresiv způsobilo adaptivní změny v transmembránovém
přenosu serotoninu. Statisticky významné snížení KM oproti hodnotám kontrolní skupiny
bylo zjištěno po podávání maprotilinu, citalopramu, moklobemidu a lithia; podávání
desipraminu tento parametr neovlivnilo. Změny parametru Vmax nebyly statisticky
významné. Poměr Vmax/KM, reprezentující účinnost vychytávání serotoninu
z mimobuněčného prostoru, byl zvýšen po podávání všech antidepresiv, především po
citalopramu a maprotolinu.
Závěry
•
Pozorované snížení zdánlivé Michaelisovy konstanty KM po podávání většiny antidepresiv
lze interpretovat jako zvýšení afinity SERT pro substrát (serotonin). Zda může být tato
53
změna afinity způsobena membránovými lipidy a cholesterolem bylo studováno v naší
další práci (viz Příloha 5).
•
Nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu (jako je
citalopram), ale i antidepresiva s naprosto odlišnými primárními biochemickýmu účinky
způsobují po dlouhodobém podávání adaptivní změny v přenosu serotoninu, které se
projevují zvýšenou účinností vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru.
•
Naše výsledky podporují hypotézu afektivních poruch založenou na předpokladu, že
důležitým faktorem ve vzniku náchylnosti pro depresi je nedostatečná serotonergní
aktivita a že jedním ze společných projevů dlouhodobého podávání různých antidepresiv
je zvýšení této aktivity v mozku, které je umožněno mimo jiné i adaptivními změnami
v membránovém přenosu serotoninu.
54
2.5. Vliv dlouhodobého podávání antidepresiv na lipidové složení
mozkových membrán
Příloha 5:
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora.
Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain
plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236.
Úvod
Je známo, že antidepresiva jsou amfifilní molekuly, které jednak více či méně specificky
interagují s neurotransmiterovými receptory, přenašeči nebo katabolizujícími enzymy, jednak
se akumulují v lipidové části membrán, především v membránách mozkových buněk. Např.
celkové koncentrace imipraminu a jeho aktivního metabolitu desipraminu byly zjištěny
v mozkové tkáni téměř 15krát vyšší než v neporušených erytrocytech z periferní krve, a
koncentrace v plazmatických membránách izolovaných z mozku téměř 500krát vyšší než
v mozkovém cytosolu, více něž 300krát vyšší než v plazmě z periferní krve a 11krát vyšší než
v erytrocytárních membránách (viz Příloha 3). Zda má akumulace antidepresiv v lipidové
části membrán mozkových buněk úlohu v jejich terapeutických účincích není dostatečně
známo, ale v jejím důsledku dochází ke změnám v pohyblivosti, uspořádání a vzájemných
interakcích membránových molekul, což může ovlivnit transmembránový přenos signálu.
Byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostázi při depresi, ale spojitost mezi
dlouhodobým podávání terapeutických dávek antidepresiv a změnami lipidového složení
mozkových plazmatických membrán dosud nebyla prokázána.
V předchozí studii (viz Příloha 4) jsme zjistili, že dlouhodobé podávání antidepresiv
s různou farmakologickou selektivitou vede k adaptivním změnám v přenosu serotoninu do
trombocytů. Za pozorované zvýšení účinnosti vychytávání serotoninu z mimobuněčného
prostoru bylo odpovědné zvýšení afinity membránového přenašeče pro serotonin (SERT).
Podle hypotézy o měnitelné afinitě receptorů (viz kap. 1.2.3) mohou afinitu receptorů ovlivnit
jak změny proteinové struktury, tak změny lokálního membránového mikrookolí nebo přímé
interakce lipid-protein.
Všechna antidepresiva ovlivňují monoaminergní neurotransmisi, což zřejmě vede ke
změnám genové exprese v určitých neuronech. Předpokládáme, že důsledkem těchto procesů
může být nejen změna denzity receptorů, přenašečů, enzymů apod., ale i regulace lipidového
složení mozkových membrán. Studovali jsme proto vliv dlouhodobého podávání vybraných
55
antidepresiv s různými primárními mechanismy působení na fluiditu a lipidové složení
plazmatických membrán izolovaných z mozku laboratorních potkanů.
Cíle
Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání různých antidepresiv
na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán v mozku. Naše výsledky by měly
přispět k potvrzení hypotézy o úloze membránových lipidů ve vzniku a léčbě afektivních
poruch.
Metody
Byly měřeny změny v lipidovém složení a mikroviskozitě plazmatických membrán z mozku
po dlouhodobém podávání antidepresiv. Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva
s různými primárními biochemickými účinky (desipramin, maprotilin, citalopram,
moklobemid a lithium) po dobu 4 týdnů. Z mozku těchto potkanů byly izolovány plazmatické
membrány a poté byly jednak změřena jejich mikroviskozita metodou fluorescenčních sond
(byly použity sondy 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien, DPH, a 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl1,3,5-hexatrien, TMA-DPH), jednak byla izolována a analyzována lipidová část membrán.
Celkové lipidy byly určeny vážením, cholesterol byl stanoven plynovou chromatografií a
celkové fosfolipidy jako součet koncentrací fosfatidylcholinu, fosfatidyletanolaminu,
fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu a sfingomyelinu, přičemž jednotlivé fosfolipidy byly
stanoveny dvourozměrnou tenkovrstevnou chromatografií a následným měřením fosforu.
Výsledky
•
Ve srovnání s kontrolami jsme pozorovali významné snížení v zastoupení
fosfatidyletanolaminu v plazmatických membránách v mozku potkanů po podávání
maprotilinu, citalopramu a moklobemidu.
•
Obsah membránového cholesterolu byl snížen po desipraminu a zvýšen po citalopramu
nebo lithiu.
•
Došlo ke snížení v zastoupení neutrálních fosfolipidů po všech testovaných
antidepresivech kromě desipraminu.
•
Snížení fosfatidylserinu bylo pozorováno po podávání maprotilinu nebo desipraminu a
relativní zastoupení fosfatidylinositolu bylo sníženo po lithiu.
56
•
Významná negativní korelace byla zjištěna mezi obsahem cholesterolu a
elektroneutrálních fosfolipidů.
•
Mikroviskozita membrán byla jen málo snížena po desipraminu a zvýšena po citalopramu.
Závěry
•
Ukázali jsme, že dlouhodobá léčba antidepresivy ovlivňuje lipidové složení
plazmatických membrán v mozku. Struktura a dynamické vlastnosti těchto membrán ale
nebyly významně změněny oproti kontrolám.
•
Byla podpořena hypotéza, že změny v mozkové neurotransmisi vyvolané antidepresivy
mohou být alespoň částečně spojeny i s adaptivními změnami ve složení lipidové části
buněčných membrán, které se mohou transformovat do procesů přímo ovlivňujících
transmembránový přenos nervového signálu.
•
Porovnání výsledků této práce s výsledky zjištěnými v předchozí práci (viz Příloha 4)
naznačuje, že zvýšená aktivita transmembránového přenosu serotoninu po dlouhodobém
podávání antidepresiv může být způsobena spíše změnami interakcí cholesterol-SERT
nebo fosfolipid-SERT, než změnami mikroviskozity membrán.
57
2.6. Uptake serotoninu do trombocytů u depresivních pacientů během
léčby
Příloha 6:
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ,
Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in
depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173.
Úvod
Podle serotoninové hypotézy deprese (viz kap. 1.2.2) jsou v patogeneze deprese zahrnuty
abnormality v serotonergní neurotransmisi a terapeutické účinky antidepresiv jsou spojeny
s adaptivními změnami v monoaminergních systémech. Určující úlohu v udržování
serotonergní funkce má membránový přenašeč pro serotonin (SERT, viz kap. 1.4), který je
také hlavním cílem většiny antidepresiv, včetně selektivních inhibitorů zpětného vychytávání
(reuptake) serotoninu (SSRI). Předpokládá se, že serotonergní systém v trombocytech zrcadlí
změny v aktivitě centrálního serotonergního systému. Trombocyty jsou proto vhodný model
pro studium funkce serotonergního systému v mozku při depresivní poruše a její léčbě
antidepresivy. V řadě prací byly zjištěny změny transportu serotoninu do trombocytů při
depresi, avšak výsledky nejsou jednoznačné. Aktivita SERT je charakterizována parametry
kinetiky přenosu serotoninu, tj. maximální rychlostí transportu (Vmax), která kvantifikuje
kapacitu přenosového systému, a zdánlivou Michaelisovou konstantou (KM), která je vztažena
k afinitě přenašeče (viz kap. 1.4).
V této práci jsme publikovali naše předběžné výsledky o změnách uptake serotoninu
měřených ex vivo v trombocytech depresivních pacientů před léčbou a během podávání
citalopramu (antidepresivum ze skupiny SSRI). Pro rozlišení vlivu depresivního onemocnění
od vlivu citalopramu byly do studie zařazeny pouze depresivní osoby, které dosud žádné
antidepresivum nepožívaly. Další skupinu tvořily osoby s afektivní poruchou dlouhodobě
léčenou lithiem (stabilizátor nálady, který primárně neovlivňuje uptake serotoninu).
Cíle
Cílem studie bylo přispět k poznání vlivu samotného depresivního onemocnění a vlivu
antidepresivní léčby na přenašečem zprostředkovaný přenos serotoninu do trombocytů.
58
Metody
U kontrol, osob dlouhodobě léčených lithiem a u depresivních osob před léčbou a po 5-42
dnech podávání citalopamu byla provedena měření kinetiky přenosu (uptake) serotoninu do
trombocytů z periferní krve (Vmax, KM). Uptake serotoninu byl měřen pomocí tritiem
značeného serotoninu.
Výsledky
•
Pozorovali jsme významně vyšší hodnoty KM u depresivních osob před začátkem léčby;
po 1-6 týdnech podávání citalopramu zůstal tento parametr zvýšený.
•
Parametr Vmax se před léčbou citalopramem nelišil od kontrol a podávání citalopramu
vedlo k jeho snížení.
•
Parametry kinetiky uptake serotoninu u skupiny osob požívajících dlouhodobě lithium
nebyly významně odlišné od kontrol.
Závěry
•
Vyšší KM při nezměněné Vmax znamená sníženou účinnost vychytávání mimobuněčného
serotoninu (charakterizovanou poměrem Vmax/KM) u neléčených depresivních osob.
•
Dlouhodobé podávání citalopramu zlepšilo klinické příznaky deprese sledovaných osob a
současně ovlivnilo parametry uptake serotoninu do trombocytů. Účinnost vychytávání
serotoninu, ale zůstala i po týdnech léčby výrazně snížena.
•
Naše výsledky naznačují, že při depresi je narušena funkce SERT, za kterou je odpovědná
hlavně snížená afinita SERT pro serotonin. Předpokládáme, že jsou za to odpovědné
změněné interakce SERT s lipidovým mikrookolím v membráně.
•
Výsledky a závěry uvedené v této práci lze považovat za předběžné, s tím že budou
upřesněny měřením dat u větší skupiny dosud neléčených depresivních osob.
59
2.7. Transport trijodthyroninu do erytrocytů jako membránový
parametr deprese
Příloha 7:
KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ, Zdeněk and
VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of
depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print].
Úvod
Etiologie afektivních poruch není doposud plně objasněná. Jedním z možných faktorů, které
ovlivňují vznik afektivních poruch by mohla změněná funkce osy hypotalamus-hypofýzaštítná žláza (HPT). U pacientů s afektivními poruchami byly opakovaně potvrzeny různými
studiemi odchylky funkce této osy.
Erytrocyty, ač nejsou cílovými buňkami pro hormony štítné žlázy, mohou hrát roli v jejich
transportu. Thyroxin (T4) vstupuje do červených krvinek volnou difuzí, L-trijodthyronin (LT3) prostupuje přes erytrocytární membránu usnadněnou difuzí pomocí stereospecifického
saturovatelného přenašečového systému nezávislého na Na+. Červené krvinky zřejmě fungují
jako zásobárna tohoto hormonu. Předpokládáme, že změněná schopnost vychytávání L-T3
erytrocyty by mohla být také znakem, který odráží narušenou funkci HPT osy a tím
vulnerabilitu ke vzniku deprese.
Funkci transportního membránového systému pro L-T3 lze hodnotit pomocí parametrů
jako je maximální rychlost transportu (Vmax), zdánlivá Michaelosova konstanta (KM) a jejich
poměr Vmax/KM, jejichž význam je podobný jako je tomu pro serotoninový přenašeč (viz kap.
1.4). Aktivita membránových přenašečů může být obecně ovlivněna vlastnostmi lipidové části
membrán, především složením a uspořádáním molekul v lipidové dvojvrstvě. Parametrem
charakterizujícím rotační pohyblivost a průměrné uspořádání membránových molekul je
mikroviskozita (viz kap. 1.1.3), jejíž změny lze kvalitativně sledovat měřením anizotropie
fluorescence vhodných fluorescenčních sond. Byla popsána závislost vazebných parametrů LT3 na membránových fosfolipidech.
V naší studii jsme testovali hypotézu o úloze, kterou má ve vývoji a léčbě afektivních
porucha osy HPT, transport L-T3 do erytrocytů a vlastnosti lipidové dvojvrstvy
(mikroviskozita, cholesterol). Předpokládáme, že změněná schopnost vychytávání L-T3
erytrocyty by mohla souviset se změnami vlastností buněčných membrán a tím být markerem,
který odráží vulnerabilitu ke vzniku deprese.
60
Cíle
V této studii jsme chtěli ověřit tyto předpoklady:
1. Membránový přenos L-T3 je odlišný u pacientů s depresí a u zdravých kontrol a odráží
změny na systémové úrovni.
2. Funkce membránového přenašečového systému je ovlivněna změnou vlastností lipidové
dvojvrstvy.
3. Užíváním antidepresiv dochází u pacientů s depresí k normalizaci parametrů.
Metody
U kontrol, osob trpících hypercholesterolemií (viz Příloha 8) a u depresivních osob před
léčbou a po 1 měsíci podávání citalopamu (antidepresivum primárně účinkující jako
selektivní inhibitor reuptake serotoninu) byla provedena měření kinetiky přenosu (uptake) LT3 do neporušených erytrocytů (Vmax, KM) a mikroviskozity erytrocytárních membrán
(ghostů). U depresivních osob bylo provedeno i klinické hodnocení deprese pomocí
standardních stupnic (HAMD, BECK). Uptake L-T3 do neporušených erytrocytů byl měřen
pomocí jódem 125 značeného L-T3 s použitím námi modifikované metody. Mikroviskozita
membrán byla charakterizovaná anizotropií fluorescence sondy DPH.
Výsledky
•
Klinické hodnocení deprese ukázalo u všech pacientů významné zlepšení po 1 měsíci
podávání citalopramu. Parametry charakterizující uptake L-T3 do erytrocytů (Vmax a KM) i
mikroviskozita erytrocytárních membrán byly u depresivních osob významně zvýšeny jak
před, tak i po podávání citalopramu. Nebyla zjištěna statisticky významná změna
měřených parametrů po jednoměsíční léčbě ve srovnání s hodnotami před jejím začátkem.
•
U osob se zvýšenou koncentrací cholesterolu (detaily viz Příloha 8) byla ve srovnání s
kontrolami zjištěna významně vyšší mikroviskozita erytrocytárních membrán, vyšší Vmax i
KM a nižší poměr Vmax/KM.
Závěry
•
Depresivní porucha je provázena zvýšenou mikroviskozitou erytrocytárních membrán.
•
Funkce přenašeče pro L-T3 v erytrocytárních membránách je při depresi změněna.
Kinetické parametry uptake L-T3 do erytrocytů jsou při depresi zvýšeny, celková účinnost
61
vychytávání L-T3 z mimobuněčného prostoru však změněna není, neboť vyšší kapacita
přenosu je kompenzováno nižší afinitou přenašeče.
•
Po 1 měsíci léčby ukázalo klinické hodnocení významné zmírnění depresivních příznaků,
ale nedošlo k normalizaci parametrů měřených v erytrocytech. Kinetika uptake L-T3 do
erytrocytů by mohla být použita jako jeden ze znaků narušené funkce osy HPT při
depresi.
•
Změna funkce přenašeče pro L-T3 souvisí pravděpodobně se změnami vlastností lipidové
dvojvrstvy, v níž je přenašeč inkorporován. Úloha cholesterolu a dynamických vlastností
membrán v aktivitě membránového přenašeče pro L-T3 byla podpořena výsledky
získanými u osob se zvýšenými koncentracemi plazmatického a membránového
cholesterolu.
•
Naše výsledky propojují hypotézu o narušené funkci osy HPT při depresi s membránovou
hypotézou, podle níž může náchylnost k depresi vzniknout jako důsledek změn ve složení
a biofyzikálních vlastnostech buněčných membrán.
62
2.8. Farmakologicky indukované snížení cholesterolu vyvolává časově
omezené změny v serotonergní transmisi
Příloha 8:
VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk;
STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering
therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005,
vol. 133, no. 2-3, p. 197-203.
Úvod
V posledních 15 letech byla publikována řada prací zabývajících se vztahem mezi snížením
hladin cholesterolu, depresí a sebevražedným chováním. Výsledky jsou však často rozporné a
vztah cholesterolu k neurotransmiterovým systémům narušeným při depresi nebyl dostatečně
objasněn. Předpokládá se, že snížením hladin cholesterolu je změněna mikroviskozita a
propustnost buněčných membrán, což vede ke snížení serotonergní neurotransmise v mozku a
vzniku depresivních příznaků.
Klíčovou úlohu v udržování normální serotonergní funkce má membránový přenašeč pro
serotonin (SERT), který kontroluje koncentraci mimobuněčného serotoninu a jehož aktivita je
modulována mimo jiné i mikroviskozitou membrán a přímými interakcemi s cholesterolem.
Funkci SERT lze hodnotit pomocí parametrů kinetiky přenosu serotoninu přes membránu
(maximální rychlost transportu Vmax, zdánlivá Michaelosova konstanta KM). Vhodným
modelem pro sledování funkce SERT v mozku jsou trombocyty z periferní krve (viz kap.
1.4).
Syntézu cholesterolu v mozku lze snížit farmakologicky, např. podáváním simvastatinu.
Simvastatin prostupuje dobře hematoencefalickou bariérou a inhibuje reduktasu
hydroxymetylglutaryl-koenzymu A, čímž snižuje koncentraci cholesterolu v plazmatických
membránách v mozku. V naší studii jsme u osob trpících hypercholesterolemií sledovali vliv
terapie simvastatinem jak na změny jejich chování, tak na změny koncentrací cholesterolu
v plazmě i buněčných membránách, mikroviskozity membrán a uptake serotoninu do
trombocytů.
Cíle
Cílem této práce bylo objasnit vliv terapie vedoucí ke snížení cholesterolu jak na parametry
charakterizující změny chování (deprese, impulsivita, empatie, dobrodružnost), tak na
63
biochemické a biofyzikální parametry ovlivňující serotonergní neurotransmisi (lipidové
složení a mikroviskozita membrán, kinetika transmembránového přenosu serotoninu).
Metody
U osob trpících hypercholesterolemií před léčbou, po 1 měsíci, po 2 měsících a po více než 1
roce podávání simvastatinu bylo provedeno klinické hodnocení impulsivity, empatie,
dobrodružnosti a depresivních symptomů. Současně byl stanoven celkový sérový cholesterol,
HDL cholesterol, LDL cholesterol a triacylglyceroly. Kinetika přenosu (uptake) serotoninu do
trombocytů (Vmax, KM) byla určena pomocí tritiem značeného serotoninu, mikroviskozita
erytrocytárních membrán (ghostů) metodou fluorescenčních sond. Z erytrocytárních memrán
byly izolovány lipidy a membránový cholesterol byl analyzován tenkovrstevnou
chromatografií s plameno-ionizační detekcí; celkové fosfolipidy byly stanoveny měřením
fosforu.
Výsledky
•
Impulsivita, empatie, dobrodružnost a depresivní symptomy nebyly změněny v průběhu
celé léčby.
•
Mikroviskozita erytrocytárních membrán nebyla výrazněji změněna v průběhu celé léčby.
•
Po 2 měsících podávání simvastatinu bylo zjištěno významné snížení celkového
cholesterolu a LDL cholesterolu, ale jen menší snížení membránového cholesterolu.
•
Parametry kinetiky uptake serotoninu do trombocytů KM i Vmax byly zvýšeny po 1 a 2
měsících podávání simvastatinu. Aktivita SERT (hodnocená jako poměr Vmax/KM) byla
významně zvýšena po 1 měsíci léčby, ale již méně po 2 měsících terapie.
•
Po 13-16 měsících terapie zůstaly celkový cholesterol a LDL cholesterol významně
sníženy, ale jak membránový cholesterol, tak aktivita SERT se vrátily na hodnoty před
započetím léčby.
Závěry
•
Během terapie snižující cholesterol jsme nepozorovali změny chování, což může být dáno
skutečností, že se jednalo o osoby s hypercholesterolemií, kdy došlo ke snížení sérového
cholesterolu na normální hodnoty, nikoli na hodnoty podnormální. Samotné relativní
snížení cholesterolu tedy nevyvolávalo nežádoucí změny chování.
64
•
Pozorovali jsme snížení afinity SERT po snížení cholesterolu. Parametr Vmax byl
cholesterolem modulován mnohem významněji než parametr KM a byl odpovědný za
celkové zvýšení účinnosti vychytávání mimobuněčného serotoninu.
•
Dlouhodobá terapie simvastatinem má na serotonergní transmisi jiný vliv než terapie
krátkodobá (1-2 měsíce); aktivita SERT je zřejmě citlivější na změnu koncentrace
cholesterolu než na jeho stabilní hladinu.
•
Významná změna v aktivitě SERT byla pozorována pouze po prvním měsíci terapie
simvastatinem. Lze předpokládat, že případná zvýšená náchylnost k depresi, násilí nebo
sebevraždě je spojena s tímto obdobím.
65
2.9. Celková diskuse
Soubor předložených prací se týká studia mechanismů účinků antidepresiv, především jejich
vlivu na lipidovou část membrán a funkci membránového přenašeče pro serotonin.
Experimenty byly provedeny s modelovými membránami, s krevními buňkami a mozkovou
tkání pokusných zvířat a s buňkami lidské periferní krve. Cílem našich experimentů bylo
popsat interakce antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami, určit vztah mezi koncentracemi
antidepresiv v mozku a v periferní krvi a přispět k poznatkům o vlivu dlouhodobého podávání
různých antidepresiv na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán a na transport
serotoninu do buněk. Dosažené výsledky přispěly k poznání vztahu membránových změn a
kinetiky transmembránového přenosu serotoninu a trijodthyroninu při depresi a její léčbě a
byly použity pro upřesnění a propojení serotoninových a membránových hypotéz afektivních
poruch.
Existuje značná akumulace antidepresiv v lipidových membránách. Úlohu membránových
lipidů v mechanismech účinku antidepresiv jsme se snažili objasnit jak pokusy s modelovými
membránami, tak studiemi s izolovanými buněčnými membránami či živými buňkami.
V experimentech s modelovými membránami (liposomy) jsme zjistili, že vazbu antidepresiv
k neutrálním nebo záporně nabitým lipidovým membránám lze velmi dobře studovat
s použitím metody vazby radioligandu (Fišar et al. 1991, Fišar et al. 2004b). Přitažlivými
elektrostatickými silami mezi kladně nabitými molekulami imipraminu a záporně nabitými
povrchy membrán připravenými z fosfatidylserinu (PS) lze vysvětlit významně vyšší vazbu
k PS-membránám ve srovnání s vazbou k membránám z fosfatidylcholinu (PC).
Elektrostatické vlastnosti buněčných membrán mají tedy klíčovou úlohu v ustavení
rovnovážné koncentrace antidepresiva v bezprostřední blízkosti buněčného povrchu, přičemž
tato koncentrace může být řádově vyšší, než je koncentrace volného antidepresiva ve vodné
fázi. V důsledku zvýšené koncentrace antidepresiv u povrchu membrány a v důsledku jejich
chemických vlastností dochází k akumulaci antidepresiv v lipidové části buněčných membrán
a k možnosti obsazení proteinových vazebných míst s relativně nízkou afinitou (která by
podle koncentrace volného antidepresiva být obsazena neměla). Po korekci na elektrostatické
efekty pomocí Gouyovy-Chapmanovy teorie byly vazebné izotermy popsány jak
povrchovými rozdělovacími koeficienty, tak vazebnými parametry, jako je rovnovážná
asociační konstanta a vazebná kapacita. Analýza saturačních vazebných izoterem ukázala, že
vazba antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám je silně heterogenní a lze rozlišit nízkoafinní a
66
zdánlivá vysokoafinní vazebná místa. Kapacita jak celkové, tak zdánlivé vysokoafinní vazby
je významně vyšší u PS-membrán ve srovnání s PC-membránami.
Proměřením a analýzou pH-závislostí jsme charakterizovali podíl elektrostatických a
jiných nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě různých tricyklických
antidepresiv (TCA) k lipidovým dvojvrstvám (Fišar 2005). Zjistili jsme, že rozhodující vliv
na zapojení jednotlivých nekovalentních interakcí v této vazbě má nejen fosfolipidové složení
membrán, ale i metylace bočního acylového řetězce v molekulách TCA. Za zdánlivou
vysokoafinní vazbu TCA k membránám připraveným z PC nebo fosfatidyletanolaminu (PE)
jsou odpovědny především van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce (realizují
inkorporaci nenabitých molekul TCA do hydrofobního vnitřku dvojvrstvy). Důležitou úlohu
ve vazbě TCA k PS-membránám mají i coulombické interakce a interakce ion-indukovaný
dipól, neboť jsme pozorovali významnou vazbu jak nabitých, tak nenabitých molekul TCA
k těmto membránám. Důležité je zjištění, že elektrostatické interakce mezi TCA a záporně
nabitými povrchy lipidových membrán závisí nejen celkovém náboji fosfolipidů, ale i na jeho
prostorovém rozložení, např. existuje určitá specificita vazby TCA k PS-dvojvrstvám.
Není dosud objasněno do jaké míry se akumulace antidepresiv v blízkosti buněčných
povrchů a v samotných membránách podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích.
Může však docházet ke změnám rotační a laterální difúze, uspořádání a vzájemných interakcí
membránových molekul, což ovlivňuje transmembránový přenos signálu. Naše výsledky
podpořily hypotézu o úloze membránových lipidů v mechanismech účinků antidepresiv,
zvláště úlohu fosfatidylserinu, který silně ovlivňuje vazbu antidepresiv k lipidové části
membrány a o němž je známo, že specificky působí na funkci řady membránových proteinů
zapojených do přenosu nervového signálu přes chemickou synapsi.
V experimentech s laboratorními potkany jsme studovali jednak rozdělení antidepresiv mezi
membrány a vodnou fázi v krvi i v mozku v podmínkách in vivo, jednak vliv dlouhodobého
podávání různých antidepresiv na složení a mikroviskozitu plazmatických membrán v mozku
a na kinetiku vychytávání serotoninu do trombocytů v periferní krvi.
Potvrdili jsme, že po dlouhodobém podávání imipraminu je v krvi i v mozku toto
antidepresivum vázáno v buněčných membránách v koncentracích mnohonásobně
převyšujících plazmatické nebo cytoplazmatické koncentrace. Koncentrace v membránách z
mozku navíc mnohonásobně převyšují koncentrace v membránách z krevních elementů.
Určili jsme vztah, podle něhož lze pro dobrý odhad koncentrace imipraminu v mozkové tkáni
použít koncentrace změřené v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách (Fišar et al.
67
1996b). Tyto výsledky mohou přispět k objasnění skutečnosti, že plazmatické koncentrace
antidepresiv nekorelují často dobře s jejich terapeutickými účinky. Protože koncentrace v
mozkové tkáni nejsou určeny jen koncentrací v plazmě, ale i koncentrací v buněčných
membránách krevních elementů, lze předpokládat, že při změně rozdělení antidepresiva mezi
plazmu a membrány (např. v důsledku změn fosfolipidového složení erytrocytárních
membrán), mohou být koncentrace v mozku značně odlišné i při nezměněných plazmatických
koncentracích.
Studovali jsme také rozdělení různých antidepresiv ex vivo v lidské krvi mezi erytrocyty a
plazmu (Fišar a spol. 2004a). Rovnovážné rozdělení antidepresiv mezi erytrocyty a plazmu
silně závisí na teplotě, ale nezávisí na koncentraci antidepresiv v oblasti jejich terapeutických
koncentrací. Vysoké hodnoty poměru koncentrací erytrocyty/plazma byly zjištěny pro
demetylované metabolity tricyklických antidepresiv a pro citalopram. Poměr koncentrací
antidepresiv v erytrocytech a v plazmě je parametr citlivý jak na typ antidepresiva, tak na
vazebné vlastnosti plazmatických proteinů a buněčných membrán. Za rozdílnou vazbu
antidepresiv k erytrocytům jsou odpovědné různé části jejich molekul (aromatické kruhy i
aminopropylové řetězce). Předpokládáme, že účinky antidepresiv jsou poměrem koncentrací
v erytrocytech a v plazmě vystiženy lépe než plazmatickými koncentracemi a tento parametr
může být použit jak pro studium změn při onemocnění a jeho léčbě, tak pro studium
interindividuálních rozdílů na podávání téhož antidepresiva.
Ve výše uvedených experimentech jsme potvrdili, že rozdělení léčiv v krvi i mozku se
výrazně liší pro různá antidepresiva a na vazbě k buněčným membránám se podílí nepolární i
nabité části molekul léčiv. Výsledky podporují hypotézu, že schopnost přestupu antidepresiv
z plazmy do membrán a zpět může ovlivňovat jejich terapeutické účinky a že poměr
koncentrací antidepresiv v erytrocytech a v plazmě by mohl být jedním ze snadno měřitelných
parametrů použitelných při predikci účinnosti léčby daným antidepresivem nebo při
charakterizaci podtypu onemocnění. Na rozdílných poměrech koncentrací antidepresiv
v plazmě a v erytrocytech se mohou podílet jak změny složení erytrocytárních membrán, tak
změny v plazmatických proteinech. Předpokládáme, že detailní studium změn ve
fosfolipidovém a cholesterolovém složení erytrocytárních membrán a ve vazebných
parametrech plazmatických proteinů pro antidepresiva u osob neodpovídajících na
farmakoterapii by mohlo pomoci ve snaze určit příčiny rozdílné odpovědi jednotlivých osob
na podávání téhož antidepresiva.
68
Cílem našich dalších experimentů byla snaha upřesnit adaptivní mechanismy související
s dlouhodobým podáváním antidepresiv. Zaměřili jsme se na změny lipidového složení
plazmatických membrán, na změny jejich dynamických vlastností a na ovlivnění přenosu
(uptake) serotoninu zprostředkovaného membránovým přenašečem (SERT).
Nejprve jsme testovali hypotézu, že dlouhodobé podávání antidepresiv s různými
primárními biochemickými účinky má vliv na kinetiku přenosu serotoninu do trombocytů.
Výsledky ukázaly, že nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake
serotoninu (citalopram), ale i ta, která jsou inhibitory reuptake noradrenalinu (desipramin,
maprotilin), inhibitory monoaminoxidasy (moklobemid) nebo stabilizátory nálady (lithium)
způsobují po dlouhodobém podávání změny v serotonergním systému trombocytů
laboratorních potkanů (Fišar et al. 2005a). Za předpokladu, že trombocyty jsou dobrým
modelem pro serotonergní aktivitu v mozku, by pozorované zvýšení účinnosti vychytávání
mimobuněčného serotoninu mohlo být společným adaptivním účinkem dlouhodobého
podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou. Naše výsledky podporují
serotoninovou hypotézu afektivních poruch, která vychází z předpokladu, že nedostatečná
serotonergní aktivita je významný vulnerabilní faktor ve vzniku deprese a jedním z projevů
dlouhodobého podávání antidepresiv je zvýšení serotonergní aktivity. Na tomto zvýšení se
zřejmě podílí změna zpětného vychytávání (reuptake) serotoninu, která může být dána jak
více či méně specifickou inhibicí SERT, tak změnou jeho afinity pro serotonin. Zvýšení
afinity SERT vede při nezměněné maximální rychlosti transportu k úplnějšímu vychytávání
serotoninu z mimobuněčného prostoru a k možnosti jeho opakovaného využití v
neurotransmisi.
Pozorovaná změna kinetiky přenosu serotoninu po podávání antidepresiv laboratorním
potkanům byla způsobena především změnou zdánlivé Michaelisovy konstanty KM
odpovídající zvýšení afinity SERT pro serotonin. O tomto parametru je známo, že je ovlivněn
i přímou interakcí s membránovým cholesterolem. Proto jsme v další práci testovali hypotézu,
že změna lipidového složení plazmatických membrán v mozku může být jednou z adaptivních
buněčných změn indukovaných dlouhodobým podáváním různých antidepresiv. Zjistili jsme,
že podávání výše uvedených antidepresiv skutečně ovlivňuje lipidové složení buněčných
membrán v mozku (Fišar et al. 2005b). Pozorované snížení relativního zastoupení fosfolipidů
v mozkových plazmatických membránách bylo přitom dáno zvýšením obsahu cholesterolu
(především po podávání citalopramu). Je obtížné interpretovat vztah mezi změnami v
lipidovém složení mozkových plazmatických membrán a terapeutickými účinky antidepresiv,
protože membránové lipidy ovlivňují řadu buněčných procesů s velmi odlišnými
69
fyziologickými účinky. Nicméně, na základě našich výsledků se lze domnívat, že terapeutické
účinky lithia a antidepresiv, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu nebo
noradrenalinu, mohou souviset se zvýšením relativního zastoupení cholesterolu v buněčných
membránách a s tím souvisejícími změnami funkce membránových proteinů, např.
transportních proteinů pro serotonin nebo noradrenalin. Zvýšení membránového cholesterolu
přitom může být specifické pro mozek, neboť v plazmatických membránách izolovaných
z jater, srdce a ledvin nebyly pozorovány významné změny poměru cholesterolu k celkovým
fosfolipidům (Fišar et al. 1999c). Výraznější ovlivnění membrán mozkových buněk může být
dáno skutečností, že koncentrace antidepresiv v mozku jsou mnohem vyšší než v periferii
(Fišar et al. 1996b).
Mikroviskozita plazmatických membrán z mozku laboratorních potkanů charakterizovaná
anizotropií fluorescence membránových sond se po dlouhodobém podávání antidepresiv
významně nezměnila; zvýšení relativního zastoupení cholesterolu se tedy neprojevilo
v očekávaném snížení fluidity membrán. Z našich výsledků nelze jednoznačně usoudit na
příčinu tohoto výsledku, neboť jsme neměřili časově rozlišenou fluorescenci. Po
dlouhodobém podávání antidepresiv tedy nedochází k podstatným změnám v dynamických
vlastnostech plazmatických membrán a fluidita membrán pravděpodobně nemá přímou úlohu
v mechanismech jejich terapeutických účinků.
Dlouhodobé podávání antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do
trombocytů a relativní zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů, ale jen minimálně
ovlivňuje stavbu a dynamické vlastnosti plazmatických membrán v mozku. Chceme-li tedy v
dalších studiích analyzovat u depresivně nemocných změny v parametrech uptake serotoninu,
je nezbytné získat potřebné vzorky před započetím farmakoterapie, kdy lze případné změny
považovat za znaky onemocnění a nikoli za důsledek působení léčiv. Oproti tomu případné
změny fluidity buněčných membrán by bylo možné považovat za charakteristiky depresivního
onemocnění i v případě, že by byly měřeny až v průběhu podávání antidepresiv.
Naše výsledky ukazují, že změna serotonergní aktivity po dlouhodobém podávání různých
antidepresiv laboratorním potkanům může být dána zvýšením afinity SERT, způsobeném
spíše změnami interakcí cholesterol-transportní protein nebo fosfolipid-transportní protein,
než změnami mikroviskozity membrán. Podpořili jsme hypotézu, že dlouhodobé podávání
antidepresiv může způsobit změny v lipidovém složení buněčných membrán, které se mohou
transformovat do procesů přímo ovlivňujících serotonergní neurotransmisi v mozku.
70
V experimentech s laboratorními potkany jsme zjistili, že dlouhodobé podávání různých
antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do trombocytů a relativní
zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů. Výsledky získané na modelových
zvířatech ale mohou být obtížně přenositelné na depresivní osoby. Studovali jsme proto i
účinky dlouhodobého podávání citalopramu (antidepresiva ze skupiny selektivních inhibitorů
reuptake serotoninu) na aktivitu serotonergního systému měřenou kinetikou přenosu
serotoninu do trombocytů z periferní krve. Pro odlišení vlivu citalopramu od vlivu samotné
depresivní poruchy byla měření provedena u depresivních osob, které nebyly dosud nikdy
antidepresivy léčeny. Ukázalo se, že jak depresivní porucha tak antidepresivum výrazně
ovlivňují parametry uptake serotoninu do trombocytů. Celkově byla účinnost vychytávání
mimobuněčného serotoninu u depresivních osob snížena nejen před léčbou, ale i po několika
týdnech farmakoterapie, kdy bylo pozorováno jasné klinické zlepšení depresivních příznaků
(Fišar et al. 1998). Naše výsledky ukazují, že snížení reuptake serotoninu při depresi je
způsobeno spíše sníženou afinitou transportního proteinu pro serotonin, než sníženou
maximální rychlostí vtoku, jak se dosud předpokládalo. Za předpokladu, že serotonergní
aktivita trombocytů odráží serotonergní aktivitu v mozku, znamená nižší afinita SERT při
nezměněné maximální rychlosti transportu, že při nízkých mimobuněčných koncentracích
serotoninu se výrazně sníží jeho reuptake do presynaptických zakončení.
Tyto předběžné výsledky (získané pro 16 depresivních osob) byly potvrzeny a upřesněny
po rozšíření souboru pacientů na 30 (dosud nepublikované výsledky). Potvrdili jsme, že
přenos serotoninu do trombocytů je u depresivních osob ovlivněn citalopramem mnohem více
než samotným depresivním onemocněním. Nalezli jsme také významnou korelaci mezi
účinností uptake serotoninu a klinickým hodnocením depresivních příznaků, což znamená, že
uptake serotoninu do trombocytů lze použít jako znak účinné farmakoterapie depresivní
poruchy. Zdánlivá Michaelisova konstanta KM zahrnující informaci o afinitě SERT pro
serotonin byla zvýšena nejen před léčbou, ale významně i po dlouhodobém podávání
citalopramu a byla odpovědná za nižší účinnost vychytávání serotoninu ve srovnání se
zdravými kontrolami.
Dalším membránovým přenašečem, jehož funkce by mohla být změněna při depresivní
poruše a její léčbě je přenašeč pro L-trijodthyronin (L-T3). Získaná data ukazují, že kinetické
parametry uptake L-T3 do erytrocytů jsou zvýšeny u depresivních pacientů před počátkem
léčby ve srovnání se skupinou zdravých kontrol a v průběhu farmakoterapie se výrazně
nemění (Kališová-Stárková et al. 2005). Všichni pacienti přitom byli euthyroidní a odpovídali
71
dobře na léčbu citalopramem. Získaná data umožňují diskutovat úlohu uptake L-T3 do
erytrocytů při vzniku a léčbě depresivní poruchy a to jak z hlediska změn kinetických
parametrů uptake, tak z hlediska změn dynamických vlastností lipidové dvojvrstvy, v níž je
transportní protein pro L-T3 zanořen.
Kinetiku uptake L-T3 do erytrocytů lze chápat jako proces změněný při depresi, který ale
přímo nekoreluje s depresivní symptomatologií. Pravděpodobně se jedná o změnu aktivity
membránového přenašeče pro L-T3 způsobenou změněnými vlastnostmi lipidové dvojvrstvy,
v níž je zanořen. Pro tento závěr svědčí výsledky měření anizotropie fluorescence sondy DPH
v plazmatických membránách z erytrocytů ukazující, že depresivní porucha je provázená
sníženou fluiditou těchto membrán. Dynamika buněčných membrán je veličina ovlivňující
řadu membránových enzymů, receptorů, iontových kanálů a přenašečů, a jedním z projevů její
změny může být zvýšení parametrů kinetiky uptake L-T3. Pro tuto skutečnost svědčí i naše
výsledky z jiné studie (doposud nepublikované), kdy jsme měřili uptake L-T3 do erytrocytů u
osob s hypercholesterolemií. Zvýšené hladiny cholesterolu významně korelovaly se zvýšenou
anizotropií fluorescence DPH v membránách a kinetické parametry uptake L-T3 do erytrocytů
byly rovněž významně zvýšeny. Není dosud zřejmé, zda jsou vlastnosti přenašeče pro L-T3
ovlivněny spíše specifickými interakcemi lipid-protein, nebo celkovým dynamickým stavem
lipidové dvojvrstvy.
Naše výsledky podporují hypotézu, že i u klinicky euthyrodiních osob s depresí můžeme
nalézt subklinické markery odrážející narušení funkce hypotalamo-hypofýzo-thyroidální osy a
potvrzují hypotézu, že změněná funkce této osy vede ke změně parametrů uptake L-T3 do
erytrocytů. Současně jsme tuto hypotézu propojili s membránovou hypotézou afektivních
poruch, podle níž může náchylnost k depresi vzniknout v důsledku změn biofyzikálních
vlastností buněčných membrán v určitých oblastech mozku.
Úlohu cholesterolu ve funkci SERT jsme sledovali u osob trpících hypercholesterolemií před
a v průběhu dlouhodobé léčby simvastatinem. Zjistili jsme, že cholesterol skutečně ovlivňuje
aktivitu SERT, neboť v prvních dvou měsících jeho snižování došlo ke zvýšení kinetických
parametrů KM i Vmax. Celková účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu se po snížení
sérového cholesterolu nejprve zvýšila (po 1 až 2 měsících léčby), ale po delší době
farmakoterapie (více než rok) se parametry kinetiky přenosu serotoninu do trombocytů vrátily
na původní hodnoty před léčbou (Vevera et al. 2005). Snížení koncentrací cholesterolu
z vysokých hodnot na normální tedy způsobilo pouze dočasné změny v serotonergní funkci.
Tyto výsledky ukazují na existenci buněčných mechanismů vyrovnávajících odchylky
72
serotonergní funkce vlivem změny koncentrace cholesterolu. Pro klinickou praxi to znamená
možnost zvýšené náchylnosti osob užívajících léky pro snížení cholesterolu k poruchám
nálady především v prvních měsících farmakoterapie.
Anizotropie fluorescence sondy DPH charakterizující omezenost pohyblivosti malých
membránových molekul v lipidové dvojvrstvě byla významně zvýšena u depresivních
pacientů před léčbou proti kontrolám. Po několikatýdenní terapii citalopramem, kdy došlo
k významnému zlepšení klinického stavu, již nebylo zvýšení mikroviskozity statisticky
významné (Kališová-Stárková et al. 2005). Interpretace tohoto výsledku je ztížena
skutečností, že nebylo použito měření časově rozlišené fluorescence a že obsah cholesterolu,
nenasycenost zbytků mastných kyselin a zastoupení jednotlivých druhů fosfolipidů a
glykolipidů mohou mít opačný vliv na anizotropii fluorescence DPH a vzájemně se
kompenzovat. Pro podrobnou analýzu změn dynamických vlastností buněčných membrán
v důsledku podávání antidepresiv bude nutno provést měření jak lipidového složení membrán
tak změn v obsahu nenasycených mastných kyselin. Nicméně naše výsledky zatím ukazují, že
na změny dynamických vlastností lipidových dvojvrstev má větší vliv depresivní porucha než
antidepresiva.
Naše výsledky také demonstrují obtížnou přenositelnost údajů získaných na zvířecích
modelech na člověka s depresivní poruchou, neboť ve srovnání s kontrolní skupinou byla
účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu po podávání citalopramu u potkanů
zvýšená, zatímco u depresivních osob snížená. Rozhodující úlohu v tomto rozporu má zřejmě
vliv depresivní poruchy.
Jak u zvířecího modelu, tak u lidí byly za změny v kinetice vychytávání serotoninu po
dlouhodobém podávání citalopramu zodpovědné především změny KM, tj. změny afinity
SERT. Vzhledem k vysoké lipofilitě citalopramu předpokládáme, že významnou úlohu
v těchto změnách mají interakce lipid-protein. Navíc je známo, že membránový cholesterol
moduluje funkční vlastnosti SERT přes specifické interakce potřebné pro stabilizaci
přenašeče v jeho optimálně aktivní formě. Úlohu cholesterolu v aktivitě SERT u člověka in
vivo jsme potvrdili v naší studii, v níž jsme nalezli významně vyšší účinnost uptake
serotoninu do trombocytů a vyšší afinitu SERT (nižší KM) u osob s hypercholesterolemií
(Vevera et al. 2005) ve srovnání se skupinou zdravých kontrol nebo depresivních osob z naší
dřívější studie (Fišar et al. 1998). Nepozorovali jsme významně změny lipidového složení
erytrocytárních membrán u neléčených depresivních pacientů před farmakoterapií, ale po
dlouhodobém podávání citalopramu došlo k mírnému zvýšení relativního zastoupení
73
cholesterolu, fosfatidylcholinu a fosfatidylserinu v těchto membránách (Fišar et al. 1999c).
Zdá se, že vyšší cholesterol může indukovat snížení KM a naopak. Tyto úvahy jsou značně
spekulativní, neboť nejsou dostupné údaje o změnách membránového cholesterolu nebo
fosfolipidového složení v lidském mozku v průběhu léčby antidepresivy.
Zvýšení KM při depresi před započetím léčby lze chápat jako jeden z adaptivních
mechanismů, jímž se organismus pokouší vyrovnat s narušením serotonergní neurotransmise.
Funkce SERT je při depresi již narušena a účinky citalopramu zřejmě nespočívají v rychlém
návratu SERT do normálního stavu, ale naopak v ještě větším vychýlení jeho funkce
z rovnováhy. Kvalitativně stejný účinek citalopramu jsme pozorovali i pro uptake L-T3 do
erytrocytů u depresivních osob (Kališová-Stárková et al. 2005). Lze proto uvažovat o
možnosti, že existuje nějaký společný účinek citalopramu na aktivitu různých membránových
přenašečů zprostředkovaný změnami vlastností lipidové části plazmatických membrán.
Na základě našich výsledků lze navrhnout přeformulování jednoho z východisek o úloze
serotoninu v patofyziologii depresivní poruchy: snížení reuptake serotoninu v depresivní fázi
je způsobeno spíše snížením afinity transportního proteinu pro serotonin (zvýšením KM), než
snížením maximální rychlosti vtoku (Vmax), jak se dosud předpokládalo. Není zcela jasné, zda
je zvýšení KM primární či sekundární vzhledem ke snížené dostupnosti 5-HT, nebo zda se
jedná o nezávislý doprovodný znak deprese. Nižší afinita SERT znamená na jednu stranu
sníženou účinnost reuptake a tedy sníženou možnost opětovného využití 5-HT pro přenos
signálu, na druhou stranu zůstává uvolněný 5-HT delší dobu v mimobuněčném prostoru,
může difundovat na větší vzdálenost a aktivovat po delší dobu procesy závislé na 5-HT.
Sjednocenou serotoninovou-membránovou hypotézu afektivních poruch lze formulovat
takto: Snížená dostupnost serotoninu v určitých oblastech mozku se může podílet na vzniku
depresivní poruchy. Snížená afinita transportního proteinu pro serotonin v membránách patří
spíše mezi adaptivní změny doprovázející narušenou serotonergní funkci při depresi, než mezi
vyvolávající příčiny onemocnění. Změny afinity transportního proteinu mohou být způsobeny
změnami interakcí cholesterol-protein nebo fosfolipid-protein v membránách. Společné
účinky různých antidepresiv na této úrovni přenosu signálu by mohly spočívat ve zvýšení
mimobuněčných koncentrací 5-HT daných inhibicí SERT nebo snížením afinity SERT pro 5HT. Zatímco specifickou inhibici SERT uskutečňují inhibitory reuptake serotoninu, snížení
afinity SERT je možné přes ovlivnění lipidového složení membrán a interakcí lipid-SERT,
tedy přes změny vlastností lipidové dvojvrstvy, které je možné vyvolat i jinými antidepresivy.
74
Seznam použitých zkratek
5-HT - 5-hydroxytryptamin, serotonin
AMI - amitriptylin
ATP - adenosin-5´-trifosfát, adenosintrifosfát
BDNF - mozkový-odvozený neurotrofní faktor („brain-derived neurotrophic factor“)
BECK – Beckův sebeposuzovací dotazník deprese
Bmax - vazebná kapacita
CAD - amfifilní molekuly nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj („cationic
amphiphilic drug“).
cAMP - cyklický adenosinmonofosfát
CREB - transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP („cAMP response
element-binding protein“)
DAG - sn-1,2-diacylglycerol (obvykle 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol), diacylglycerol
DAT - transportní protein pro dopamin
DDMI - didesmetylimipramin
DMI - desipramin
DPH - 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien
G protein - protein vázající guaninové nukleotidy
GABA - 4-aminomáselná kyselina (též γ-aminomáselná kyselina)
HAMD – Hamiltonova škála deprese
HDL – lipoproteiny s vysokou hustotou
HPA - hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin
HPT - hypotalamus-hypofýza-štítná žláza
IMI - imipramin
IP3, I(1,4,5)P3 - inositol-1,4,5-trisfosfát, inositoltrisfosfát
IUV - jednovrstevné liposomy střední velikosti („intermediate-sized unilamellar vesicles“)
Kd - zdánlivá disociační konstanta
KM - zdánlivá Michaelisova konstanta
LDL – lipoproteiny s nízkou hustotou
L-T3 - L-trijodthyronin
LUV - velké jednovrstevné liposomy („large unilamellar vesicles“)
MAO - monoaminoxidasa
MKN - mezinárodní klasifikace nemocí
75
MLV – mnohovrstevné liposomy („multilamellar vesicles“)
NaSSA - noradrenergní a specifická serotonergní antidepresiva
NDRI - inhibitory zpětného vychytávání noradrenalinu i dopaminu
NET - transportní protein pro noradrenalin
NOR - nortriptylin
NRI - selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu
PC - fosfatidylcholin
PE - fosfatidyletanolamin
PI - fosfatidylinositol
PKC - proteinkinasa typu C
PS – fosfatidylserin
RIA - radioimunoassay
RUI - inhibitory zpětného vychytávání (reuptake) neurotransmiterů
SARI - duální serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake
SERT (též 5-HTT) - specifický serotoninový transportní protein
SNRI – duální inhibitory reuptake serotoninu i noradrenalinu
SSRI - selektivní inhibitor reuptake serotoninu
SUV – malé jednovrstevné liposomy („small unilamellar vesicles“)
TCA - tricyklická antidepresiva
T4 - thyroxin
TMA-DPH - 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl-1,3,5-hexatrien,
Vmax - maximální rychlost transportu serotoninu do buněk
76
3. SEZNAM PUBLIKACÍ TVOŘÍCÍCH PODKLAD
HABILITAČNÍ PRÁCE
BUREŠ, Přemysl; KRULÍK, Radoslav; FIŠAR, Zdeněk et al. Vliv kokainu na vazbu
tricyklických antidepresiv v SPM mozku. Čs. psychiatrie. 1993, vol. 89, no. 5, p. 272-275.
FIALOVÁ, Lenka; MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIŠAR, Zdeněk et al. Metoda ELISA pro
stanovení antifosfatidylserinových protilátek. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 1996, vol.
45, no. 2, p. 52-55.
FIALOVÁ, Lenka; MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIŠAR, Zdeněk et al. Antifosfatidylinositolové
protilátky a jejich stanovení vlastní ELISA metodou. Sborník lékařský. 1996, vol. 97, no.
4, p. 463-467.
FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav and BEITLOVÁ, Dana. Liposomes – model membranes
to study the binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabolism and Drug Interactions.
1991, vol. 9, no. 3-4, p. 269-281.
FIŠAR, Zdeněk a KRULÍK, Radoslav. Buněčné membrány a jejich interakce s antidepresivy.
Biol. listy. 1995, vol. 60, no. 2, p. 81-96.
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; FUKSOVÁ, Květoslava et al. Effect of long-term
treatment by antidepressants on serotonin uptake in platelets and on membrane fluidity.
Chemické listy. 1996a, vol. 90, no. 9, p. 636-637.
FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava et al. Imipramine distribution
among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996b, vol. 15, p.
51-64.
FIŠAR, Zdeněk a SIKORA, Jan. Neurochemické hypotézy afektivních poruch. In Sikora, Jan;
Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel et al. (eds.). Biologické podklady psychických poruch.
Praha: Galén, 1997, p. 68-72.
FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; ANDERS, Martin et al. Effect of long-term
antidepressant treatment on membrane phospholipids. Homeostasis. 1997, vol. 38, no. 2,
p. 68-69.
FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; HANUŠ, Zdeněk et al. Vliv dlouhodobého podávání
antidepresiv na membránový cholesterol. In Sikora, Jan; Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel
et al. (eds.). Biologické podklady psychických poruch. Praha: Galén, 1997, p. 73-75.
FIŠAR, Zdeněk. Biochemické hypotézy afektivních poruch. 1. vyd. Praha: Galén, 1998, 103 s.
ISBN 80-85824-80-9.
77
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin et al. Platelet serotonin uptake in depressed
patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173.
FIŠAR, Zdeněk. Biochemické hypotézy afektivních poruch [online]. c1999. Dostupný
z WWW: <http://psych.lf1.cuni.cz/bhap/default.htm>.
FIŠAR, Zdeněk a JIRÁK, Roman. Úvod do biologické psychiatrie [online]. c1999. Dostupný
z WWW: <http://psych.lf1.cuni.cz/bp/default.htm>.
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; KOVÁŘŮ, Hana et al. Membranes and platelet serotonin
uptake in depression. Homeostasis. 1999a, vol. 39, no. 3-4, p. 130-131.
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo and SIKORA, Jan. Uptake serotoninu do trombocytů při dosud
neléčené depresi. In Sikora, Jan and Fišar, Zdeněk (eds.). Neurobiologie duševních
poruch. Praha: Galén, 1999b, p. 45-48.
FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; HANUŠ, Zdeněk et al. Má deprese a podávání
antidepresív vliv na lipidové složení erytrocytárních membrán? In Sikora, Jan and Fišar,
Zdeněk (eds.). Neurobiologie duševních poruch. Praha: Galén, 1999c, p. 49-51.
FIŠAR, Zdeněk. Interaction of tricyclic antidepressants with liposomes. Eur.
Neuropsychopharm. 2000, vol. 10, no. Suppl. 3, p. S270.
FIŠAR, Zdeněk and PACLT, Ivo. Clinical course of depression and platelet serotonin uptake.
European Psychiatry. 2000, vol. 15, no. Suppl. 2, p. 380s.
FIŠAR, Zdeněk a PACLT, Ivo: Korelace klinického průběhu deprese a uptake serotoninu. In
Raboch, Jiří; Zrzavecká, Irena a Uhrová, Tereza (eds.). Psychiatrie pro XXI. století. Praha:
Galén, 2000, p. 152.
FIŠAR, Zdeněk. Serotonin v mozku. Trendy ve farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin
vol. 50). 2001, vol. 1, no. 1, p. 3-5.
FIŠAR, Zdeněk. Význam serotoninu v léčbě duševních poruch. Trendy ve farmakoterapii
(příloha Zdravotnických novin vol. 50). 2001, no. 1, p. 6-7.
FIŠAR, Zdeněk a JIRÁK, Roman. Vybrané kapitoly z biologické psychiatrie. 1. vyd. Praha:
Grada, 2001, 316 s. ISBN 80-247-0061-1.
FIŠAR, Zdeněk. Psychiatrie. 1. vyd. Praha: Galén, Karolinum, 2001. 622 s. ISBN 80-7262140-8, 80-246-0390-X. Neurochemie, s. 33-55.
FIŠAR, Zdeněk. Neurochemie návykových látek. Trendy ve farmakoterapii (příloha
Zdravotnických novin vol. 51, no. 9). 2002, no. 1, p. 4-7.
FIŠAR, Zdeněk. Přehled biochemických účinků vybraných návykových látek. Trendy ve
farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin vol. 51, no. 9). 2002, no. 1, p. 8-10.
78
FIŠAR, Zdeněk. Introduction to Biological Psychiatry [online]. c2002. Dostupný z WWW:
<http://psych.lf1.cuni.cz/bpen/default.htm>.
FIŠAR, Zdeněk. Psychiatrie na Internetu [online]. c2003. Dostupný z WWW:
<http://www.lf1.cuni.cz/zfisar/psychiatrie/>.
FIŠAR, Zdeněk. Fluorescenční spektroskopie v neurovědách [online]. c2003. Dostupný
z WWW: <http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/Default.htm>.
FIŠAR, Zdeněk, ANDERS, Martin, TVRZICKÁ, Eva et al. Membrane lipids and serotonin
uptake after long-term administration of antidepressants. Eur. Neuropsychopharm. 2003,
vol. 13, no. Suppl. 4, p. S217-S218.
FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava a VELENOVSKÁ, Marie. Úloha membránových
lipidů v účincích antidepresiv. Psychiatrie. 2003, vol. 7, no. Suppl. 2, p. 31-32.
FIŠAR, Zdeněk. Antidepresiva a membránové lipidy. Klin. Farmakol. Farm. 2004, vol. 18,
no. 4, p. 198-202.
FIŠAR, Zdeněk. Psychiatry [online]. c2004. Dostupný z WWW:
<http://www.lf1.cuni.cz/zfisar/psychiatry/>.
FIŠAR, Zdeněk, FUKSOVÁ, Květoslava, SIKORA, Jan et al. Rozdělení antidepresiv v krvi
mezi plazmu a erytrocyty. In Raboch, Jiří; Zrzavecká, Irena; Doubek, Pavel et al. (eds.).
Česká psychiatrie a svět, 1. vydání. Praha: Galén, 2004a, p. 44-45.
FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of
imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol.
Biophys. 2004b, vol. 23, no. 1, p. 77-99.
FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer
membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180.
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically
selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys.
2005a, vol. 24, no. 1, p. 113-128.
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva et al. Effect of long-term
administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes.
Gen. Physiol. Biophys. 2005b, vol. 24, no. 2, p. 221-236.
FIŠAR, Zdeněk. Fytokanabinoidy. Chemické listy. ca. 2006. přijato do tisku.
FIŠAR, Zdeněk. Endokanabinoidy. Chemické listy. ca 2006. přijato do tisku.
KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo et al. Red blood cell
triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Physiol. Res. 2005, [Epub
ahead of print].
79
KRULÍK, Radoslav a FIŠAR, Zdeněk. Adrenergní a serotonergní receptory při depresi a
během její terapie. Čs. psychiatrie. 1992, vol. 88, no. 5, p. 229-236.
KRULÍK, Radoslav a FIŠAR, Zdeněk. Přehled poznatků o vazbě tricyklických antidepresív.
Čs. psychiatrie. 1993, vol. 89, no. 2, p. 71-78.
KRULÍK, Radoslav; BUREŠ, Přemysl; FIŠAR, Zdeněk et al. Blokátory Ca2+-kanálů a vazba
tricyklických antidepresiv. Čs. psychiatrie. 1995, vol. 91, no. 3, p. 143-151.
MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIALOVÁ, Lenka; FIŠAR, Zdeněk et al. ELISA method for
determination of anticardiolipine and antiphosphatidylcholine antibodies. Chemické listy.
1996, vol. 90, no. 9, p. 737.
SIKORA, Jan; FIŠAR, Zdeněk and SIKOROVÁ, Michaela. Serotoninergní mechanismy u
afektivních poruch. In Sikora, Jan; Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel et al. (eds.).
Biologické podklady psychických poruch. Praha: Galén, 1997, p. 228-231.
SIKORA, Jan; FIŠAR, Zdeněk a NOVOTNÁ, Michaela. Molekulární změny při opakovaném
podávání návykových látek. In Sikora, Jan a Fišar, Zdeněk (eds.). Neurobiologie
duševních poruch. Praha: Galén, 1999, p. 245-249.
STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk a PACLT, Ivo. Změny kinetických parametrů
vychytávání trijodhyroninu erytrocyty u pacientů s depresivním onemocněním.
Psychiatrie. 2001, vol. 5, no. Suppl. 2, p. 125-126.
STÁRKOVÁ, Lucie; PACLT, Ivo a FIŠAR, Zdeněk. Vychytávání thyroidních hormonů
erytrocyty ve vztahu k depresivním onemocněním. Čes. a slov. Psychiat. 2001, vol. 97,
no. 8, p. 430-433.
STÁRKOVÁ, Lucie, FIŠAR, Zdeněk, PACLT, Ivo et al.. Red blood cell triiodothyronine
uptake as membrane parameter of depression. Eur. Neuropsychopharm. 2003, vol. 13, no.
Suppl. 4, p. S259-S260.
VELENOVSKÁ, Marie; FIŠAR, Zdeněk; HRUBÝ, Tomáš et al. Vliv kanabinoidů na
vlastnosti buněčné bembrány. Psychiatrie. 2003, vol. 7, no. Suppl. 2, p. 137-138.
VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš et al. Cholesterol-lowering therapy
evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133,
no. 2-3, p. 197-203.
80
4. CITAČNÍ OHLASY
Citační ohlasy dle SCI (k 31.8.2005)
1. Citovaný článek
Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z:
Ontogenetic analysis of some surface markers on pig lymphocytes using Fluorescenceactivated cell sorter
FOLIA MICROBIOLOGICA 30: 277-290, 1985
Citující článek
1. Wang FI, Williams TJ, Elawar FY, Pang VF, Hahn EC
Characterization of porcine peripheral-blood leukocytes by light-scattering flowcytometry
CAN J VET RES 51: (4) 421-427 OCT 1987
2. Trebichavsky I, Mandel L, Vetvicka V
Immunological markers and fine-structure of alveolar cells in germ-free pigs
FOLIA BIOL-PRAGUE 33: (4) 246-& 1987
3. Trebichavsky I, Patrikova I, Mandel L, Kovaru F, Zahradnickova M.
Ontogeny of lymphocytes-T in the pig
FOLIA MICROBIOL 33: (4) 329-331 1988
2. Citovaný článek
Fišar Z, Krulík R, Fuksová K, Sikora J
Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue
GENERAL PHYSIOLOGY AND BIOPHYSICS 15: (1) 51-64 FEB 1996
Citující článek
1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB
Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a
fluorescence spectroscopic study
LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000
2. de Gandarias JM, Irazusta J, Varona A, Gil J, Fernandez D, Casis L
Effect of imipramine on enkephalin-degrading peptidases
EUR NEUROPSYCHOPHARM 9: (6) 493-499 DEC 1999
81
3. Citovaný článek
Fišar Z, Tvrzická E, Anders M, Kovářů H, Sikora J, Staňková B, Vujić Z
Effect of long-term antidepressant treatment on membrane phospholipids
HOMEOSTASIS IN HEALTH AND DISEASE 38: (2) 68-69 JUL 1997
Citující článek
1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB
Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a
fluorescence spectroscopic study
LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000
4. Citovaný článek
Fišar Z, Hýsek J, Binek B
Quantification of airborne microorganisms and investigation of their interactions with nonliving particles
INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMETEOROLOGY 34: (3) 189-193 1990
Citující článek
1. Stark KDC
The role of infectious aerosols in disease transmission pigs
VET J 158: (3) 164-181 NOV 1999
2. Kasama T, Murakami T
The effect of microorganisms on Fe precipitation rates at neutral pH
CHEM GEOL 180: (1-4) 117-128 OCT 1 2001
3. Spurny KR
On the chemical-detection of bioaerosols
J AEROSOL SCI 25: (8) 1533-1547 DEC 1994
4. Hilliger HG
Emissions of dust and microorganisms from animal houses
DEUT TIERARZTL WOCH 98: (7) 257-261 JUL 1991
5. Citovaný článek
Kovářů H, Kozáková H, Fišar Z, Mareš V
In vitro early allogeneic reaction of murine brain cortex cells
PHYSIOLOGICAL RESEARCH 46: (2) 127-135 1997
82
Citující článek
1. Kovaru H, Kovaru F, Haskova V
Cell surface enzymes of brain cortex cells or lymphocytes during early allogeneic
reaction
PHYSIOL RES 46: (2) 137-144 1997
2. Kozakova H, Kovaru H, Mares V, Kovaru F, Siman P.
Peptide cytokines in CNS and the immune system
PHYSIOL RES 46: (2) 145-153 1997
6. Citovaný článek
Vyhnálek V, Fišar Z, Fišarová A, Komárková J
In vivo fluorescence of chlorophyll a: Estimation of phytoplankton biomass and activity in
Římov reservoir (Czech Republic)
WATER SCIENCE AND TECHNOLOGY 28: (6) 29-33 1993
Citující článek
1. Honeywill C, Paterson DN, Hagerthey SE
Determination of microphytobenthic biomass using pulse-amplitude modulated
minimum fluorescence
EUR J PHYCOL 37: (4) 485-492 NOV 2002
2. Acevedo MF, Waller WT
Modelling and control of a simple trophic aquatic system
ECOL MODEL 131: (2-3) 269-284 JUL 1 2000
3. Komarkova J
Fish stock as a variable modifying trophic pattern of phytoplankton
HYDROBIOLOGIA 370: 139-152 1998
4. Becker G, Holfeld H, Hasselrot AT, Fiebig DM, Menzler DA
Use of a microscope photometer to analyze in vivo fluorescence intensity of epilithic
microalgae grown on artificial substrata
APPL ENVIRON MICROB 63: (4) 1318-1325 APR 1997
5. MacCarthy P, Klusman RW, Cowling SW, Rice JA
Water analysis
ANAL CHEM 67: (12) R525-R582 JUN 15 1995
6. Podola B, Melkonian M
Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse
83
microalgae
JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY 17 (3): 261-271 MAY 2005
7. Citovaný článek
Hýsek J, Fišar Z, Žižka Z, Kofroňová O, Binek B
Airborne microorganism monitoring: A comparison of several methods, including a new
direct counting technique
ZENTRALBLATT FUR MIKROBIOLOGIE 146: (6) 435-443 1991
Citující článek
1. Stark KDC
The role of infectious aerosols in disease transmission pigs
VET J 158: (3) 164-181 NOV 1999
2. Dawson MW, Scott JG, Cox LM
The medical and epidemiologic effects on workers of the levels of airborne
Thermoactinomyces spp spores present in Australian raw sugar mills
AM IND HYG ASSOC J 57: (11) 1002-1012 NOV 1996
8. Citovaný článek
Fišar Z, Krulík R, Beitlová D
Liposomes - model membranes to study the binding of tricyclic antidepressants
DRUG METABOLISM AND DRUG INTERACTIONS 9: (3-4) 269-281 1991
Citující článek
1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB
Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a
fluorescence spectroscopic study
LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000
2. Beigi F, Lundahl P
Immobilized biomembrane chromatography of highly lipophilic drugs
J CHROMATOGR A 852: (1) 313-317 AUG 6 1999
3. Rogoz Z, Dlaboga D, Dziedzicka-Wasylewska M
Effect of combined treatment with imipramine and amantadine on the central
dopamine D-2 and D-3 receptors in rats
J PHYSIOL PHARMACOL 54 (2): 257-270 JUN 2003
4. Macri BM, Stoian G, Marin A, Flonta ML
84
Hypericin potentates the effect of tricyclic antidepressants on artificial lipid bilayers
CHEMISTRY AND PHYSICS OF LIPIDS 130 (1): 54-54 JUN 2004
9. Citovaný článek
Stožický V, Kovářů F, Trebichavský I, Stožická I, Fišar Z, Kovářů H, Šiman P
Imunitní poškození fetoplacentární jednotky
3RD C CZECH IMM 43 1982
Citující článek
1. Trebichavsky I, Kovaru F, Stozicky V, Siman P
Localization of the antigen and antibodies in the placenta of immunized sheep
AM J REPROD IMMUNOL 5: (4) 161-163 1984
10. Citovaný článek
Kovářů H., Fišerová A., Lisá V., Kovářů F., Fišar Z., Malbohan I.M.:
Antidepressant effect of GTP-binding proteins in C-6 glioma cells and natural killer
lymphocytes.
BIOL. PSYCHIATRY 42, 47S, 1997
Citující článek
1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J.
Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and
immune system
ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998
11. Citovaný článek
Kovářů H, Fišerová A, Španová A, Lisá V, Fišar Z, Velek J:
Antidepressants as neuroimmunomodulators at postreceptor level.
J. NEUROIMMUNOLOGY 90, 1, 41, 1998
Citující článek
1. Kovaru H, Fiserova A, Kovaru F, Pospisil M, Lisa V
Modulation of heterotrimeric GTP-binding proteins in immune system and brain
CZECH J ANIM SCI 46: (2) 62-67 FEB 2001
12. Citovaný článek
Kovářů H, Kovářů F, Plášek J, Fišar Z, Mandel L:
85
Lectin-induced surface changes in lymphocytes of gnotobiotic pigs.
In: Lectins - Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry (T.C.Bog-Hansen, ed.), W. de
Gruyter and Co., Berlin-New York, Vol. II, 315-323, 1982
Citující článek
1. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M
Physiological and immunological profiles after intrauterine immunization
ACTA VET BRNO 71 (4): 487-493 DEC 2002
13. Citovaný článek
Kovářů H, Kozáková H, Hašková V, Kovářů F, Fišar Z, Mareš V, Lisá V:
Cell surface events in allogeneic reactions between brain cells and/or lymphocytes.
PHYSIOL. RES. 45, 2, 3P, 1996
Citující článek
1. Fiserova A, Kovaru H, Hajduova Z, Mares V, Starec M, Kren V, Flieger M, Pospisil
M
Neuroimmunomodulation of natural killer (NK) cells by ergot alkaloid derivatives
PHYSIOL RES 46: (2) 119-125 1997
2. Kovaru H, Kovaru F, Haskova V
Cell surface enzymes of brain cortex cells or lymphocytes during early allogeneic
reaction
PHYSIOL RES 46: (2) 137-144 1997
14. Citovaný článek
Kovářů H, Kovářů F, Fišar Z, Svoboda P, Malbohan I, Žižkovský V
Development of Galpha subunits in pig immune system
P 14 INT IPVS C BOL 380 1996
Citující článek
1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J
Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and
immune system
ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998
15. Citovaný článek
Kovářů H, Lisá V, Fišar Z, Kovářů F, Černá V, Žižkovský V, Dobrovský K
86
Antidepressant effect on expression of G-alpha subunits in C-6 glioma cells
ROYAL MICR SOC P 30: 123 1995
Citující článek
1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J
Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and
immune system
ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998
16. Citovaný článek
Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z
Development of T lymphocyte subpopulation in pig fetuses
12TH P C INT PIG VET II: 396 1992
Citující článek
1. Tlaskalova-Hogenova H, Mandel L, Trebichavsky I, Kovaru F, Barot R, Sterzl J
Development of immune-responses in early pig ontogeny
VET IMMUNOL IMMUNOP 43: (1-3) 135-142 OCT 1994
17. Citovaný článek
Hýsek J, Fišar Z, Binek B
Long-run monitoring of bacteria, yeasts and other micromycetes in the air of an industrial
conurbation
GRANA 29: 450-453 1991
Citující článek
1. Lighthart B
The ecology of bacteria in the alfresco atmosphere
FEMS MICROBIOL ECOL 23: (4) 263-274 AUG 1997
2. Antropova AB, Mokeeva VL, Bilanenko EN, Chekunova LN, Petrova-Nikitina AD,
Zheltikova TM
Seasonal variation in micromycetes of Moscow dwellings
MIKOLOGIYA I FITOPATOLOGIYA 38 (5): 32-41 2004
18. Citovaný článek
Krulík R, Bureš P, Fišar Z, Fuksová K, Sikora J, Beitlová D
Blokátory Ca2+-kanálů a vazba tricyklických antidepresiv
87
CESK PSYCHIAT 91: (3) 143-151 1995
Citující článek
1. Fisunov A, Lozovaya N, Tsintsadze T, Chatterjee S, Noldner M, Krishtal O
Hyperforin modulates gating of P-type Ca2+ current in cerebellar Purkinje neurons
PFLUG ARCH EUR J PHY 440: (3) 427-434 JUL 2000
19. Citovaný článek
Fialová L, Mikulíková L, Fišar Z, Beitlová D, Malbohan I
Antifosfatidylinositolové protilátky a jejich stanovení vlastní ELISA metodou
SB LÉK 97: (4) 463-467 1996
Citující článek
1. McIntyre JA, Wagenknecht DR, Faulk WP
Antiphospholipid antibodies: discovery, definitions, detection and disease
PROG LIPID RES 42 (3): 176-237 MAY 2003
20. Citovaný článek
Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z
Immunophenotyping markers on T lymphocyte subpopulations in fetal pig development
HISTOCHEM J 26: (11) 876-877 1994
Citující článek
1. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M
Fetal and postnatal development of T-lymphocyte subpopulations
ACTA VET BRNO 71 (4): 495-+ DEC 2002
21. Citovaný článek
Kovářů H, Kovářů F, Kozáková H, Fišar Z, Knotek Z, Vojtíšek P
Lymphocyte cell surface events and regulation of cell maturation and proliferation
P 12TH INT IPVS C HAAG II: 416 1992
Citující článek
1. Matalova E, Spanova A, Kovaru F
Apoptotic DNA alterations in pig leukocytes after phagocytosis of bacteria are linked
to maturation of the immune system
PHYSIOL RES 52 (2): 235-242 2003
2. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M
88
Physiological and immunological profiles after intrauterine immunization
ACTA VET BRNO 71 (4): 487-493 DEC 2002
Citační ohlasy v českých časopisech
22. Citovaný článek
Fišar Z
Biochemické hypotézy afektivních poruch
Praha Galén 1998
Citující článek
1. Höschl C.
Současné trandy v psychiatrii (Current Trends in Psychiatry)
Psychiatrie (Suppl. 2) 4-5 1999
11. Citovaný článek
Kovářů H, Fišarová A, Španová A, Lisá V, Fišar Z, Velek J
Antidepressants as neuroimmunomodulators at postreceptor level
J. NEUROIMMUNOLOGY 90: 41 1998
Citující článek
1. Kovářů H, Fišerová A, Kovářů F.
Neuroimmunomodulatory aspects of postreceptor signalling
Psychiatrie 5: (Suppl. 2) 61-62 2001
15. Citovaný článek
Kovářů H, Lisá V, Fišar Z, Kovářů F, Černá V, Žižkovský V, Dobrovský K
Antidepressant effect on expression of G-alpha subunits in C-6 glioma cells
PROC ROYAL MICR. SOC. 30: (Pt 2) 123 1995
Citující článek
1. Kovářů H, Fišerová A, Kovářů F.
Neuroimmunomodulatory aspects of postreceptor signalling
Psychiatrie 5: (Suppl. 2) 61-62 2001
89
5. PŘÍLOHY
Příloha 1: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of
imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys.
2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99.
Příloha 2: FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid
bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180.
Příloha 3: FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan.
Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol.
Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64.
Příloha 4: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of
pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol.
Biophys. 2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128.
Příloha 5: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora.
Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma
membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236.
Příloha 6: FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ,
Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in
depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173.
Příloha 7: KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ,
Zdeněk and VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of
depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print].
Příloha 8: VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk;
STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering therapy
evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133, no.
2-3, p. 197-203.
90
Příloha 1:
FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of
imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol.
Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99.
Gen. Physiol. Biophys. (2004), 23, 77—99
77
Binding of Imipramine to Phospholipid Bilayers Using
Radioligand Binding Assay
Z. Fišar1 , K. Fuksová2 and M. Velenovská1
1
2
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University,
Prague, Czech Republic
Institute of Nuclear Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University,
Prague, Czech Republic
Abstract. Binding of the tricyclic antidepressant imipramine (IMI) to neutral
and negatively charged lipid membranes was investigated using a radioligand binding assay combined with centrifugation or filtration. Lipid bilayers were composed of brain phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). IMI binding
isotherms were measured up to IMI concentration of 0.5 mmol/l. Due to electrostatic attraction, binding between the positively charged IMI and the negatively
charged surfaces of PS membranes was augmented compared to binding to neutral
PC membranes. After correction for electrostatic effects by means of the Gouy–
Chapman theory, the binding isotherms were described both by surface partition
coefficients and by binding parameters (association constants and binding capacities). It was confirmed that binding of IMI to model membranes is strongly affected
by negatively charged phospholipids and that the binding is heterogeneous; in fact,
weak surface adsorption and incorporation of the drug into the hydrophobic core
of lipid bilayer can be seen and characterized. These results support the hypothesis
suggesting that the lipid part of biological membranes plays a role in the mechanism
of antidepressant action.
Key words: Antidepressants — Binding — Liposomes — Phosphatidylcholine —
Phosphatidylserine
Abbreviations: IMI, imipramine; DMI, desipramine; AMI, amitriptyline; CMI,
clomipramine; DDMI, didesmethylimipramine; PC, phosphatidylcholine; PS, phosphatidylserine; CAD, cationic amphiphilic drug; TCA, tricyclic antidepressant;
MLV, multilamellar vesicle; SUV, small unilamellar vesicle; LUV, large unilamellar
vesicle; GC, Gouy–Chapman; Bmax , maximum amount of drug bound to phospholipid (binding capacity); K, equilibrium association constant; Bmax,app , apparent
binding capacity; Kapp, apparent association constant; Kd , equilibrium dissociation
Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine,
Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic
E-mail: [email protected]
78
Fišar et al.
constant; IC50 , half-maximum displacement (cold ligand concentrations displacing
50 % of bound radioligand); kp , intrinsic (hydrophobic) partition coefficient; kp,app ,
apparent overall partition coefficient; Ceq , equilibrium IMI concentration in the
bulk aqueous phase; BIMI , amount of IMI in milimoles bound per mole of phospholipid; σ, surface electric charge density; λ, Debye length; ψ0 , electrostatic surface
potential; C0 , concentration of IMI in the aqueous phase at the membrane; PEI,
polyethyleneimine.
Introduction
Antidepressants are amphiphilic molecules which are able to accumulate in lipid
bilayer and alter its composition or physical characteristics. There is insufficient
knowledge as regards the extent in which the action of antidepressants on lipid bilayers contributes to their therapeutic or adverse effects. Tricyclic antidepressants
(TCAs) have been used in treatment of depression for almost 50 years and have
been tested in many clinical and theoretical studies. Inhibition of serotonin and noradrenalin transporters in neuronal membranes is their primary biochemical effect
leading to the therapeutic effect. Still it is unclear whether the TCA recognition
takes place directly from the aqueous phase via binding to surface-exposed binding
sites, or whether it is mediated by the lipid part of target membranes. The latter
possibility was proposed on the basis of the amphiphilic properties of TCAs.
Liposomes are the best model of the lipid part of biological membranes and
they enable determination of partition coefficients or binding parameters (Reith et
al. 1984; Fišar et al. 1991; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1992, 1994). Liposomes
are simply vesicles in which aqueous solution is enclosed by a membrane composed
of lipid molecules. Depending on the method of preparation, multilamellar vesicles
(MLVs), small unilamellar vesicles (SUVs) or large unilamellar vesicles (LUVs) may
be produced (New 1990). LUVs are the best model of cell membranes; however, it
was demonstrated that MLVs are also a good model (Choi and Rogers 1991).
As a consequence of membrane heterogeneity, drugs are distributed non-uniformly in the lipid bilayer (Herbette et al. 1986; Müller et al. 1986) and multiple binding sites of cationic amphipaths with membranes have been described
(Boulanger et al. 1980; Kelusky et al. 1986; Zachowski and Durand 1988). Although
the lipid bilayer is a dynamic fluid structure, there are stable separate domains in
which specific interactions can occur. Specific interactions of some ligands with
phospholipid acyl chains may also occur (Bäuerle and Seelig 1991; Jørgensen et al.
1991).
At physiological conditions, TCAs in aqueous solution carry a positive charge
(pK = 9.4). It seems that these drugs primarily act on the polar phase of lipid bilayers (Zimmer and Schulze 1981). The charged phosphate and carboxylic groups
on phospholipid molecules are the main membrane binding sites for cations. Protonated amines can partition to a surprising extent into phospholipid bilayers; however, it has been found that this is not a consequence of simple ion pairing (Austin
et al. 1995). Having their charge lost, nonpolar TCA molecules may be accumulated
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
79
in the hydrophobic core of lipid bilayers or can pass through membranes. Therefore, at equilibrium, TCA molecules are localized on the outer and inner membrane
surfaces, in the hydrophobic core of lipid bilayers and in the aqueous phase. Indeed,
TCAs are known to penetrate easily into the central nervous system (Seelig et al.
1994). In our initial experiments, we verified the assumption that permeability of
lipid bilayers for TCAs enables a rapid and uniform distribution of the drugs in
MLVs.
The tendency to refer to the result of drug-lipid bilayer interaction as “binding” has been subject to discussion because of the general meaning of this term
in the classic enzyme-substrate or ligand-receptor interaction studies (Heirwegh
et al. 1992). Binding into a bilayer is considered a restriction of dimensionality
(Mosior and McLaughlin 1992; Beschiaschvili and Seelig 1992). It should be taken
into consideration that lipid-TCA interactions can be purely electrostatic, purely
hydrophobic, or a combination of both. In the case of a negatively charged membrane, not only the cationic drug, but also all other cations will accumulate at the
lipid-water interface.
Partition coefficients have been found to be concentration-independent at low
drug concentrations (Mason et al. 1989); yet they depend on temperature, pH
and membrane lipid composition (Luxnat and Galla 1986; Zachowski and Durand
1988; Austin et al. 1995). A number of studies have shown that the surface partition
coefficient, determined as the ratio of surface concentration of the drug to its actual
bulk concentration in the immediate vicinity of the membrane, is independent on
the bulk concentrations even at higher ligand concentrations (Bäuerle and Seelig
1991; Heirwegh et al. 1992).
The saturation of adsorption isotherms observed at higher concentrations of
amphiphilic drugs has been explained by changes in electrostatic potential on the
membrane surface due to incorporation of charged ligand molecules into the lipid
bilayer. The effective ion concentration near the membrane surface differs from
that in the bulk due to redistribution of the ions in the electrostatic, hydration,
and steric-repulsion fields of the membrane. The electrostatics of charged lipid bilayers has been extensively discussed in a number of reviews (McLaughlin 1989;
Cevc 1990, 1993; Langner and Kubica 1999). For long-range interactions, the electrostatic potential in the vicinity of the membrane surface can be approximated
by the Gouy–Chapman (GC) theory. The electrophoretic mobility, profile of electrostatic potential and concentrations of small ions at the membrane surface are
all described by the GC theory with sufficient accuracy. The GC theory has also
been adopted to describe adsorption (incorporation) of drugs and relatively large
molecules (hormones, peptides, proteins) onto the lipid bilayer surface (Stankowski
1991; Mosior and McLaughlin 1992; Seelig et al. 1996). After a correction for electrostatic effects by means of the GC theory, the binding isotherm (Langmuir or
Stern) can be analyzed (Beschiaschvili and Seelig 1990). The binding parameters
allow identification of one, two or more binding sites. The GC theory allows separation of the total binding to lipid bilayer into the hydrophobic and electrostatic
contributions (Seelig et al. 1993).
80
Fišar et al.
Binding of TCAs to model membranes is apparently more affected by the bilayer lipid composition than by differences between individual TCAs (Cater et al.
1974; Fišar et al. 1991). This effect is mostly due to negatively charged phospholipids. Therefore, we used liposomes prepared both from the electroneutral phosphatidylcholine (PC) and from the negatively charged phosphatidylserine (PS).
Imipramine (IMI) was used as a ligand representing the TCAs; in some experiments, however, we used other TCAs (desipramine, DMI; didesmethylimipramine,
DDMI; clomipramine, CMI; amitriptyline, AMI).
The technique employed in our study was a radioligand binding assay analogous to that used in receptor studies (Bennett and Yamamura 1985). The advantage
of this method is its ability to work with very low drug concentrations and to study
high-affinity binding sites.
The total plasma levels of TCAs and their active metabolites during the therapy of depression are usually below 1 µmol/l (Razavi and Mendlewicz 1982), and
up to 95 % thereof may be bound to plasma proteins. Consequently, the free TCA
concentrations fall inside the nanomolar range (<50 nmol/l). So far, binding of IMI
to lipid bilayers at nanomolar IMI concentrations has not been characterized.
The aim of our experiments was to give a description of different binding sites
of IMI in lipid bilayers. Total binding of IMI to PC and PS liposomes was analyzed
using the GC theory and the strong (“high-affinity”) part of the total binding was
characterized.
Materials and Methods
Chemicals and solutions
All samples were prepared in a buffer solution (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl,
30 mmol/l Tris HCl, pH 7.4). Phospholipids in the chloroform/methanol solvent
mixture (2 : 1, vol/vol; 5–20 mg/ml) were prepared in our laboratories. Crude extract of lipids from white matter of bovine brain was prepared (Folch et al. 1957;
Koul and Prasad 1996), and PC and PS were isolated by column chromatography using alumina and DEAE-Sephadex. The resulting purity, determined by twodimensional thin-layer chromatography, was over 95 %. The phospholipids were
stored in a freezer under nitrogen atmosphere. The following stock solutions of
tritium-labelled TCA ([3 H]TCA) in methanol were used: 13.0 µmol/l [3 H]IMI (specific activity 2.85 TBq/mmol, concentration 37 MBq/ml), 4.08 µmol/l [3 H]DMI (2.0
TBq/mmol, 8.16 MBq/ml), 3.00 µmol/l [3 H]AMI (4.07 TBq/mmol, 12.2 MBq/ml),
17.6 µmol/l [3 H]DDMI (2.1 TBq/mmol, 37 MBq/ml); radiochemical purity >96 %;
labelled in our laboratories (Krulík et al. 1991); 50 or 100 nmol/l of [3 H]TCA
solution with specific activity about 100 kBq/ml in buffer was used in a binding experiment. Tritium-labelled phospholipids, [3 H]PC and [3 H]PS (concentration
18.5 MBq/ml, radiochemical purity >96 %), were prepared by catalytic tritiation
of double bonds in hydrocarbon chains of phospholipids (with a relatively great
content of oleic acid) with gaseous tritium.
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
81
Preparation of liposomes
A modification of the Bangham method (Bangham et al. 1965; New 1990) was
used to prepare PC and PS vesicles. Phospholipid concentrations were checked
using phosphorus concentration determination (Bartlett 1959; Wagner et al. 1962).
Liposomes were always prepared shortly before measurement. Brief summary of
the method: An aliquot part of phospholipid solution containing less than 20 mg
of phospholipid was introduced into a 20 ml vial and the liquid was completely
evaporated from the solution by nitrogen stream at temperature about 40 ◦C. The
vial was then placed in vacuum for at least one hour to remove residual solvent.
After releasing the vacuum, 2 ml of buffer was added; the vial was filled with
nitrogen, closed and incubated at 50 ◦C for 5 min. The sample was agitated until
all lipid was removed from the walls of the vial and a homogeneous milky-white
suspension arose. The vial was shortly sonicated (for 5 to 15 s) in an XL 2020
Sonicator (Misonix, Inc.) to release all lipids from the walls and to break down
large clusters. Following incubation of the sample at 50 ◦C for 30 min, the suspension
was left at room temperature for further 2 h and diluted by buffer solution to the
required phospholipid concentration.
Radioligand binding assay
Binding equilibrium was studied by the radioligand binding assay (Bennett and
Yamamura 1985). Tritium-labelled IMI was used as marker. Non-labelled (cold)
IMI was used in the form of hydrochloride. Typically, liposome suspension was
mixed with buffer and [3 H]IMI, and the sample was incubated at 20 ◦C, pH 7.4,
for 30 min. The usual final phospholipid concentrations were 50–270 µmol/l for
PS vesicles, 270–540 µmol/l for PC-MLVs, with the resultant concentration being
about 5 nmol/l of [3 H]IMI. To separate bound and free ligand, centrifugation or
rapid filtration were employed and total binding was measured. The specific binding of TCA to liposomes was calculated as the difference between the total and
nonspecific binding, with nonspecific binding determined in the presence of excess
cold ligand (50 µmol/l). Samples were measured in a scintillation cocktail using an
LS 6000IC liquid scintillation counter (Beckman Instruments, Inc.).
Centrifugation
When working with biological or model membranes, the most common procedure
to determine binding parameters or partition coefficients is centrifugation and determination of the solute remaining in the aqueous phase. The total volume of
samples was typically 0.8 ml; 0.2 ml of the sample was removed after incubation to
measure the total drug concentration and 0.6 ml was centrifuged either at 30,000×g
at 20 ◦C for 15 min, or at 100,000 × g at 20 ◦C for 60 min; subsequently, 0.2 ml of
supernatant was removed for free (bulk) ligand concentration determination.
The separation of liposomes from aqueous phase is not complete when using centrifugation. The amount of lipid vesicles remaining in the supernatant
was determined using tritium-labelled phospholipids as markers. In more detail,
82
Fišar et al.
a trace amount (2 µl) of [3 H]PC or [3 H]PS was added to PC or PS in the chloroform/methanol solvent mixture and lipid vesicles were prepared by the standard
procedure. The percentage of liposomes in the pellet was determined. The amount
of liposomes remaining in the supernatant strongly depends on duration of the
centrifugation and rpm. We found that the percentage of phospholipid in pellet
was 69 ± 8 % (n = 7) for PC-MLVs and 54 ± 9 % (n = 7) for PS vesicles, when
samples were centrifuged at 30,000 × g at 20 ◦C for 15 min. When samples were
centrifuged at 100,000 × g at 20 ◦C for 60 min, only 9.6 % of PC-MLVs and 5.5 % of
PS-MLVs remained in the supernatant. In any case, a correction must be involved
when the molar ratio of bound IMI to the molar amount of phospholipid (BIMI )
was calculated.
Filtration
Rapid filtration provides a very fast and efficient separation bound and free ligand.
The filters used should maximally entrap particles, minimally bind the free radioligand and have a high permeability for the rinsing solution. We used Whatman glass
microfiber filters (GF/F type) impregnated previously in 0.1 % polyethyleneimine
(PEI) (Sigma) to reduce nonspecific binding of radioligands to GF/F filters. Samples were filtered and filters were washed rapidly three times with 3 ml of ice-cold
buffer and, after adding the scintillation cocktail, they were assayed on a scintillation counter. We established that the washing procedure used is sufficient to
remove the most part of unbound [3 H]IMI, since repeated washing did not decrease
the activity trapped on the filter. The measured activities of filters were corrected
for the proportion of liposomes that pass through a GF/F filter.
Permeability of the GF/F filters for liposomes was tested using tritium-labelled
phospholipids as markers. We found that 80±11 % (n = 23) of PC-MLVs or 82±5 %
of PS vesicles (n = 23) was retained on GF/F filters impregnated in 0.1 % PEI.
The amount of MLVs trapped on filters did not depend on repeated washing of the
filters.
The total duration of filtration and washing was about 10 s; it can be calculated that the filtration rate used allows correct determination of high-affinity
binding processes with Kd of order 10−8 mol/l or less (Bennett and Yamamura
1985). The rapid, easy and efficient separation of free ligand is an advantage of
the filtration technique, but the technique cannot be used for low-affinity binding
processes (Kd > 10−8 mol/l).
The percentage of radioligand bound to filters increases progressively at concentrations below 4 nmol/l of [3 H]IMI, regardless of whether cold IMI is present or
not. Within the range of 5–30 nmol/l [3 H]IMI, the percentage of [3 H]IMI bound to
filters was virtually constant (0.67 ± 0.18 %, n = 20, 20 ◦C, pH 7.4). A higher percentage of [3 H]IMI binding to GF/F filters at very low radioligand concentrations
(<4 nmol/l) could potentially distort the saturation curves and identification of
high-affinity binding sites by Kd in the sub-nanomolar region. This explains why
both total binding and displaceable binding, calculated as the difference of filter
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
83
activities with a sample incubated without and with excess cold IMI (50 µmol/l),
were determined.
Data analysis
Binding model
Three regions are distinguished in the simplified model describing binding of an
amphiphilic drug to a membrane (Seelig et al. 1993): (i) the bulk solution, (ii)
the interface (aqueous layer immediately above the plane of binding), and (iii)
the membrane. Both the protonated and unprotonated forms of the drug may be
present in these regions. The fraction of the protonated IMI, F , depends on pH
(Seelig et al. 1993) as follows:
F = (1 + 10pH-pK )−1
(1)
where pK is the negative logarithm of the dissociation constant for the N-terminal
amino group of IMI. It is well known that pK values in lipid membrane differ from
those in the bulk solution (Cevc 1990; Miyazaki et al. 1992). The thermodynamic
factors giving rise to shifts in pK also cause a difference in partitioning between
the protonated and unprotonated forms of the amphiphile.
Analysis of binding isotherms
Analysis of binding isotherms of IMI follows the approach described for adsorption
of monovalent cations (Eisenberg et al. 1979) or for binding of local anaesthetics
(Lee 1978; Miyazaki et al. 1992), small peptides (Beschiaschvili and Seelig 1990;
Seelig et al. 1993, 1996, 2000; Ziegler et al. 2003) and amphiphilic drugs (Bäuerle
and Seelig 1991; Thomas and Seelig 1993) to lipid bilayers.
Membrane surface with an electric charge density σ gives rise to an electrostatic
surface potential ψ0 . The relation between the two parameters is provided by the
GC approximation, which was obtained from the Poisson equation provided that
all structural membrane charges are confined to an infinitely narrow plane and
that the ion distribution is governed solely by coulombic forces (McLaughlin and
Harary 1976; Cevc 1990). The GC model predicts the electrostatic potential at the
membrane surface to be
ψ0 = (2kT /Ze)arcsinh (Zeσλ/2εε0 kT )
(2)
for symmetrical electrolytes with counter-ions and co-ions of similar valency, Z.
ε is the dielectric constant of water, ε0 is the permittivity of free space, k is the
Boltzmann constant, λ is the Debye screening length, σ is the surface charge density,
T is the temperature, and e is the elementary charge. The Debye length (in meters)
relates ψ0 to concentrations of ions in the bulk aqueous phase, and can be calculated
from the following equation (Cevc 1990):
λ = [εε0 kT /(103 NA e2
X
(Zi2 ci ))]1/2
(3)
84
Fišar et al.
where NA is the Avogadro number and the summation goes over all ionic species of
valencies Zi and concentrations ci (in mol/l). The surface charge density is defined
as
σ = e/Ac
(4)
where Ac is the area per charge (in nm2 ).
The effect of the surface potential is to change the ion concentration at the
membrane-water interface (Seelig et al. 2000). If coulombic interaction is the only
one included in the mean force potential, one obtains the ion concentration profile
in GC approximation. The relation between the membrane active concentration
of monovalent cations in the aqueous phase at the membrane, C0 , and the bulk
equilibrium concentration, Ceq , is given by the Boltzmann equation
C0 = Ceq exp(−zeψ0 /(kT ))
(5)
where z is the effective charge of adsorbed species.
The binding process is characterized by the transition of the drug from the
layer of concentration C0 into the membrane phase. Partitioning of cationic drugs
into electrically neutral PC membrane gives rise to a positive surface potential
of the lipid layer and the concentration of the cationic drug at the membrane
surface decreases (Ceq > C0 ). The negatively charged PS bilayers exhibit a negative
surface potential that leads to accumulation of cationic drugs in the vicinity of the
membrane surface (Ceq < C0 ). Binding of amphiphilic drugs is thermodynamically
driven by enthalpy and entropy changes and can be described by the Langmuir
binding isotherm. Due to the ion concentration profile in the vicinity of the charged
membrane surface, the degree of association is determined by the interfacial rather
than by the bulk ion concentrations and the classical Stern adsorption isotherm
is obtained (McLaughlin and Harary 1976; Cevc 1990). A description common in
ligand-receptor studies (Bennett and Yamamura 1985) was used in our study
B = Bmax C0 /(C0 + 1/K)
(6)
where C0 is the concentration of ligand in the aqueous phase at the membrane,
B is the amount of drug in moles bound to mole of phospholipid at free drug
concentration equal to C0 , Bmax is the maximum amount of drug bound per mole
of phospholipid (mol/mol), and K is the equilibrium association constant (1/K =
Kd is the dissociation constant) of the solute. The ratio B/Bmax is the degree
of association. The reciprocal value of Bmax can be interpreted as the number of
lipid molecules creating a specific binding site for IMI; however, it is a physically
unrealistic picture of drug binding (Beschiaschvili and Seelig 1990; Ziegler et al.
2003). Some authors set the maximum number of binding sites equal to the number
of lipid molecules (Lee 1978), i.e. Bmax = 1.
The apparent binding constant, Kapp , and the apparent binding capacity,
Bmax,app can be determined using the bulk IMI concentration (rather than C0 )
in Eq. (6)
B = Bmax,app Ceq /(Ceq + 1/Kapp)
(7)
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
85
Binding of solutes to membranes can be analyzed in terms of either the binding or
partitioning formalism. The partition coefficient formalism coincides with the linear
part of the binding isotherm and some authors use the partition coefficients for a
simplified description of ligand binding to membrane surface (Mason et al. 1989;
Beschiaschvili and Seelig 1990; Seelig et al. 2000). The surface partition equilibrium
can be formulated as
(8)
B = kp C0
where kp is the hydrophobic partition coefficient. If the GC approximation is not
considered, then
(9)
B = kp,app Ceq
where kp,app is the apparent overall partition coefficient.
Parameters of the binding isotherms (Eqs. (6) and (7)) were determined by
nonlinear regression analysis (AccuFit Saturation Two-Site software, Beckman).
Displacement curves were analyzed using the four-parametric logistic model (ImmunoFit EIA/RIA software, Beckman) to establish the values of cold ligand concentrations displacing 50 % of bound radioligand (IC50 ).
Data is expressed as arithmetic mean ± standard deviation (S.D.). Mann–
Whitney U-test (a nonparametric alternative to the t-test for independent samples)
was used to determine the statistical significance of differences between means.
Results
Permeability of phospholipid bilayers
The purpose of the first experiment was to find whether multilamellar liposomes
can be used as a model for determination of quantitative parameters of IMI binding
to the lipid part of biological membranes. Problems in the determination of drug
partition between liposomes and aqueous phase could arise due to the fact that only
a small part of lipid bilayers in MLVs is exposed to the surrounding environment,
because inner lamellae are confined by outer lipid bilayer(s).
The same technique was employed to prepare both PC and PS vesicles. However, because of the differences between the two phospholipid species (polar head
size and charge), PC and PS liposomes are not the same. Unsonicated PC bilayers
are characteristic by multilamellar packing. The fundamental structure of charged
lipids dispersed in water is the unilamellar vesicle; and potential smaller particles
entrapped in larger vesicles are also unilamellar (Hauser 1984). PS bilayers alone
are very similar to those formed by other phospholipids, with only the headgroup
segments being significantly different (Browning and Seelig 1980). It is therefore
due to ask whether the lipid bilayers in PC or PS vesicles are sufficiently permeable
for IMI. The problem was solved by comparison of fractions of bound IMI in three
different samples differing by the time of addition of [3 H]IMI to the sample (Fig. 1).
Binding was measured using both filtration and centrifugation to separate bound
and free [3 H]IMI, and the percentage of bound ligand was calculated. The samples
86
Fišar et al.
Figure 1. Binding of [3 H]IMI to PC-MLVs and PS vesicles using filtration or centrifugation to separate bound and free radioligand. [3 H]IMI was added to phospholipids in
different steps of liposome preparation: (A) to chloroform/methanol solvent mixture prior
to preparation of MLVs; (B) to the dried phospholipid film along with buffer; and (C)
to the ready-to-use MLVs. Final concentrations were 1.33 mmol/l of PC, 0.27 mmol/l of
PS and 7.8 nmol/l of [3 H]IMI. Activities of samples were determined following a 30 min
incubation period at 20 ◦C. Values are means ± S.D. (n = 5).
were measured in doublets. We found that the fraction of IMI bound to both PC
and PS vesicles does not depend on the moment of [ 3 H]IMI addition. The mean
fraction of IMI bound to PC-MLVs equals 10.4 ± 2.2 % (n = 5) when using the filtration separation, and 50.1 ± 3.6 % when using centrifugation. The fraction of IMI
bound to PS vesicles is significantly higher compared to PC-MLVs and amounts
to 45 ± 11 % when using filtration and 63 ± 12 % when using centrifugation. These
values are valid at our experimental conditions, i.e. 1.33 mmol/l PC or 0.27 mmol/l
PS, 7.8 nmol/l [3 H]IMI, 20 ◦C and pH 7.4.
We proved that a 30 min incubation at 20 ◦C is sufficient to restore equilibrium,
i.e., a uniform distribution of IMI within liposomes and binding of IMI to both
outer and inner lipid bilayers (Fig. 1). The implication is that repeated freezethaw cycles are not necessary in our experiments. A good agreement of the degree
of binding of an amphiphilic drug to PC vesicles subjected and not subjected to
several freeze-thaw cycles has been obtained previously (Bäuerle and Seelig 1991).
As a result, the higher IMI binding to PS liposomes compared to PC-MLVs cannot
be explained by a different availability of inner lipid bilayers. Sample filtration
followed by rapid washing leads to removal of weakly bound molecules. Therefore,
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
87
Figure 2. The time course of [3 H]IMI association with liposomes prepared from (A) PC
and (B) PS, and the dissociation following the addition of 50 µmol/l cold IMI at minute
60, determined at 20 ◦C, pH 7.4, at 4 nmol/l of [3 H]IMI and phospholipid concentration
of 0.66 mmol/l (PC) or 0.066 mmol/l (PS). Bound and free radioligand were separated
by filtration and binding of [3 H]IMI to the filter (equal to 1.1 % of total [3 H]IMI) was
subtracted from the total activity of the filter. Mean values of three (PC) or eight (PS)
repetitions of the experiment are shown.
the filtration technique was found not to be useful for measurement of total binding
of drugs to liposomes.
The period required to achieve dynamic equilibrium between IMI in the aqueous phase and IMI bound to liposomes was determined in the next experiment
as follows: The time course of [3 H]IMI association with liposomes and of dissociation following addition of excess cold IMI is shown on Fig. 2. We found that the
half-time of association of IMI with MLVs was 124 s (n = 6) for PC-MLVs and
108 s (n = 9) for PS vesicles. The equilibrium was fully restored during 30 min
both for PC and PS-MLVs. The dissociation was started by addition of 50 µmol/l
cold IMI. The half-time of dissociation of IMI from the MLVs was approximately
17 s for PC-MLVs and 6 s for PS-MLVs. The same results were found when using
unlabelled CMI as displacement agent instead of IMI.
Total binding of IMI to liposomes
The isotherms of IMI binding/adsorption to neutral PC bilayers and to negatively
charged PS bilayers were measured in the total IMI concentration range of 0.001
to 270 µmol/l (binding to PC) or 0.001 to 400 µmol/l (binding to PS) using centrifugation. The binding parameters were calculated by combination of Eqs. (2),
(5), and (6) (Stern equation). The effect of both IMI and monovalent cations on
the surface potential ψ0 was considered (Fig. 3).
88
Fišar et al.
Figure 3. Binding of IMI to bilayer membranes composed of PC (A) or PS (B). The molar
amount of IMI bound per mole of total lipid, denoted BIMI (mmol/mol), is plotted versus
the equilibrium concentration of IMI, denoted C (µmol/l), free in solution (empty symbols
@). The same data are plotted against the interfacial IMI concentration (filled symbols
A) calculated using Eq. (5), i.e., taking into account electrostatic effects by means of the
Gouy–Chapman (GC) theory. The dashed line is the theoretical binding curve calculated
from Eq. (7) (Bmax,app = 31 mmol/mol, Kapp = 6077 l/mol for PC and Bmax,app = 384
mmol/mol, Kapp = 8190 l/mol for PS). The solid line is the theoretical binding curve
calculated from Eq. (6) with binding parameters (Bmax = 35 mmol/mol, K = 5596 l/mol
for PC and Bmax = 608 mmol/mol, K = 93 l/mol for PS) taking into account electrostatic
effects by means of the GC theory and also Na+ (KNa+ = 0.6 M−1 ) and K+ (KK+ = 0.15
M−1 ) binding to PS in buffer (0.12 mol/l NaCl, 0.01 mol/l KCl, 0.03 mol/l Tris, pH 7.4,
20 ◦C).
Normally, inorganic monovalent cations do not bind to uncharged phospholipids such as PC (Eisenberg et al. 1979). The potential at the surface of a PCvesicle in solution (containing 0.12 mol/l NaCl, 0.01 mol/l KCl and 0.03 mol/l
Tris-HCl) should be 0 mV. The charged PS headgroups are assumed to be binding sites for Na+ or K+ . Sodium and potassium binding to PS headgroups follows
a Langmuir adsorption isotherm (at Bmax = 1); consequently, the mole fraction
of these ions bound to PS, BNaK , can be calculated as (Beschiaschvili and Seelig
1990):
BNaK = (KNa CNa + KK CK )/(1 + KNa CNa + KK CK )
(10)
where CNa and CK are concentrations of Na+ and K+ . The representative ionbinding constants (intrinsic association constants) for PS membranes were KNa =
0.6 l/mol for Na+ and KK = 0.15 l/mol for K+ (Eisenberg et al. 1979; Cevc 1990).
We determined BNaK = 0.0685 mol/mol in our experiment.
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
89
The surface charge density (Eq. (4)) of PC and PS vesicles in a buffer containing Na+ , K+ and IMI can be written as (Beschiaschvili and Seelig 1990; Stankowski
1991):
σ = (e/AL )[−BPS (1 − BNaK ) + zIMI BIMI ]/(1 + BIMI AIMI /AL )
(11)
where AL is the surface area of lipid, AIMI is the surface area of IMI, BPS is moles
of PS per mole of total lipid (BPS = 0 for PC liposomes), BIMI is the surface
concentration of IMI defined as moles of IMI bound per mole of lipid, zIMI is the
effective charge of bound IMI.
In the present study, we measured total binding of IMI to lipid membranes
using centrifugation for separation of bound and free ligand at 20 ◦C and pH 7.4;
i.e., we did not resolved binding of the charged and uncharged forms of IMI. Therefore, the proportion of charged IMI molecules bound to membranes was calculated
according to previously published data. Since the pK of the IMI amino group is
9.4, it follows from Eq. (1) that about 99.0 % of IMI in bulk solution bear positive
charge. The interfacial pK shifts of different tertiary amine drugs vary somewhat,
but have a mean value of ∆pK = −0.95 (Miyazaki et al. 1992). Assuming that
the interfacial pK shift of IMI is similar to that in tertiary amine local anaesthetic
analogues, 91.8 % of IMI bound to the membrane carry a positive charge, i.e. the
effective charge, zIMI , of the N-terminal amino group is about +0,92.
In model membranes, IMI is preferably localized with its charged side-chain
near phospholipid polar head groups; the nonpolar tricycle ring system of IMI is
incorporated into the acyl chain (hydrophobic) region of the lipid bilayer (Bauer
et al. 1990; Freisleben and Zimmer 1991). Therefore, a correction for membrane
expansion due to IMI penetration into the bilayer was included. The lateral packing densities and molecular areas of charged and uncharged lipids in the fluid
phase are approximately the same; the lipid cross sectional area of AL = 0.68 nm2
(Beschiaschvili and Seelig 1990; Cevc 1990; Ziegler et al. 2003) was assumed in all
our calculations. A considerable flexibility of the TCA molecules, both in the side
chain and in the ring system (Heimstad et al. 1991) has been demonstrated; we
estimated for IMI that AIMI ≈ 0.5 nm2 . Since loading of membranes with the drug
was rather low (BIMI ≤ 0.2), the accuracy of the value of AIMI is not critical and
σ can be evaluated using Eq. (11).
The surface charge density σ gives rise to electrostatic potential at the membrane surface, ψ0 , which can be calculated using Eqs. (2) and (3). The Debye length
(Eq. (3)) was determined (λ = 0.83 nm at concentration of monovalent electrolyte
in the bulk aqueous phase equal to 0.13 mol/l, 20 ◦C) and surface potentials of
PS or PC vesicles were calculated (Eq. (2)) both in absence of IMI and in presence of different IMI concentrations. Finally, the concentrations C0 (Eq. (5)) were
determined; the data was evaluated using Eq. (6), and parameters Bmax and K
were calculated. The results are summarized in Fig. 3 and in Tables 1 and 2. Experimental data (empty symbols in Fig. 3) deviate markedly from linearity, with
BIMI being smaller or bigger than predicted by the GC theory (filled symbols in
90
Fišar et al.
Table 1. Binding of imipramine to phosphatidylcholine membranes
Ceq
BIMI
(µmol/l) (mmol/mol)
0
0.0008
0.0014
0.0019
0.0023
0.0039
0.0069
0.013
0.026
0.052
0.10
0.16
0.27
0.48
0.88
2.0
3.7
5.4
8.0
16
30
60
122
232
0
0.0012
0.0016
0.0020
0.0021
0.0036
0.0058
0.011
0.014
0.032
0.049
0.057
0.11
0.13
0.34
0.81
1.1
1.7
2.6
2.3
5.8
8.1
12.5
18.8
σ
(µC/m2 )
0
0.00027
0.00036
0.00043
0.00046
0.00078
0.0013
0.0024
0.0030
0.0070
0.011
0.012
0.024
0.029
0.074
0.18
0.23
0.36
0.57
0.49
1.2
1.7
2.7
4.0
ψ0
(mV)
C0
(µmol/l)
0
0
0.00032
0.0008
0.00043
0.0014
0.00052
0.0019
0.00056
0.0023
0.00094
0.0039
0.0015
0.0069
0.0029
0.013
0.0036
0.026
0.0084
0.052
0.013
0.10
0.015
0.16
0.028
0.27
0.035
0.48
0.089
0.88
0.21
2.0
0.28
3.7
0.44
5.3
0.68
7.8
0.59
16
1.5
29
2.1
56
3.2
109
4.8
195
kp
(l/mol)
kp,app
(l/mol)
1602
1214
1037
940
931
844
836
527
614
474
362
407
280
386
410
291
314
337
144
202
145
115
97
1602
1214
1037
940
931
844
836
527
613
474
362
406
280
385
407
288
309
329
141
191
134
102
81
PC liposomes were incubated in buffer (pH 7.4) at 20 ◦C for 30 min with different IMI
concentrations. The final volume of samples was 0.8 ml, and the final concentrations was
0.36 mmol/l of PC; 0.7–20 nmol/l of [3 H]IMI was used as marker. 0.2 ml of the sample
was removed following incubation to measure the total sample activity and 0.4 ml was
centrifuged (30,000 × g, 20 ◦C, 15 min) and the activity of 0.2 ml of the supernatant was
subsequently measured. Ceq , the equilibrium IMI concentration in the bulk aqueous phase;
BIMI , the amount of IMI in milimoles bound per mole of PC; σ, the electric charge density
(Eq. (11)); ψ0 , the electrostatic surface potential (Eq. (2)); C0 , the concentration of IMI in
the aqueous phase at the PC membrane (Eq. (5)); kp , the hydrophobic partition coefficient
(Eq. (8)); kp,app , the apparent overall partition coefficient (Eq. (9)). The samples were
measured in doublets. Mean values were determined from 4 independent measurements.
Fig. 3), indicating that there is either an electrostatic repulsion of IMI as the PC
membrane surface becomes positively charged, or electrostatic attraction of IMI as
the PS bilayer is negatively charged.
“High-affinity” binding of TCAs to liposomes
Saturation experiment
The purpose of the following experiment was to determine the binding parameters
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
91
Table 2. Binding of imipramine to phosphatidylserine membranes
Ceq
BIMI
(µmol/l) (mmol/mol)
0
0.0002
0.0005
0.0008
0.0012
0.0016
0.0021
0.0029
0.0040
0.0060
0.0078
0.012
0.054
0.15
0.44
1.5
5.4
19
64
156
248
323
428
0
0.0029
0.0038
0.0071
0.0097
0.013
0.017
0.027
0.028
0.040
0.043
0.056
0.22
1.0
2.5
7.3
18
60
142
203
239
289
307
σ
(µC/m2 )
ψ0
(mV)
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−219
−218
−216
−212
−195
−165
−146
−135
−122
−117
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−119
−118
−117
−113
−105
−99
−95
−90
−89
C0
(µmol/l)
0
0.017
0.037
0.065
0.093
0.13
0.16
0.22
0.31
0.46
0.60
0.89
4.1
12
33
110
392
1174
2931
5782
8014
8692
10766
kp
(l/mol)
kp,app
(l/mol)
169
103
109
104
103
109
119
89
86
72
62
54
90
74
66
45
51
49
35
30
33
29
13008
7884
8392
7977
7893
8381
9169
6870
6632
5510
4798
4170
6902
5659
4974
3245
3167
2237
1297
966
894
716
PS liposomes were incubated in buffer (pH 7.4) at 20 ◦C for 30 min with different IMI
concentrations. The final volume of samples was 0.8 ml, and the final concentrations was
0.26 mmol/l of PS; 0.7–20 nmol/l of [3 H]IMI was used as marker. Symbols for quantities
have the same meaning as in Table 1. The samples were measured in doublets. Mean
values were determined from 7 independent measurements.
characterizing strong (“high-affinity”) binding of IMI to PC or PS membranes.
PC and PS liposomes were incubated with 20 different [3 H]IMI concentrations.
The final volume of samples was 0.25 ml; the final concentration was about 0.23
mmol/l of phospholipid. The binding experiment started by addition of [3 H]IMI in
concentration of 0.7–60 nmol/l, and the samples were incubated at 20 ◦C, pH 7.4,
for 30 min. Rapid filtration was used to separate bound and free ligand. Nonspecific
binding was measured at the same experimental conditions, but excess cold ligand
(50 µmol/l) was added before [3 H]IMI. The samples were measured in doublets.
Displaceable binding was used to determine the binding parameters Bmax and Kd
using Eqs. (6) or (7).
The same method was used to determine the binding of different tritiumlabelled TCA ([3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]DDMI, [3 H]AMI) to liposomes prepared from
crude lipid extract from white matter of bovine brain. The results are summarized
92
Fišar et al.
Table 3. Parameters of “high-affinity” binding of tricyclic antidepressants to lipid bilayers
prepared from PC, PS, or from the total lipids from white matter of bovine brain
lipid
ligand
Kd
(nmol/l)
Bmax
(µmol/mol)
Kd,app
(nmol/l)
Bmax.app
(pmol/mg)
n
PC
IMI
9.8 ± 3.6
3.1 ± 2.0
9.8 ± 3.6
4.0 ± 2.6
10
PS
IMI
1262 ± 568
34.5 ± 9.5
16.4 ± 7.4
45.3 ± 12.4
10
crude
lipid
extract
IMI
DMI
DDMI
AMI
20.0 ± 10.0
28.9 ± 3.9
19.3 ± 10.4
26.6 ± 2.8
3.3 ± 2.1
4.0 ± 1.0
3.4 ± 2.5
5.1 ± 2.1
3
3
3
3
Isothermal saturation curves were measured following incubation of liposomes composed
of phoshatidylcholine, PC, phosphatidylserine, PS, and of crude lipid extract from white
matter of bovine brain with tritium labelled imipramine, IMI, desipramine, DMI, didesmethylimipramine, DDMI, and amitriptyline, AMI, at 20 ◦C, pH 7.4, for 30 min. The
final volume of samples was 0.25 ml, the final phospholipid concentrations was about 0.23
mg/ml, and the radioligand concentration was between 0.7 and 60 nmol/l. Filtration was
used to separate bound and free radioligand. The samples were measured in doublets and
nonspecific binding was deducted. Binding to PC and PS membranes was evaluated using
the GC theory, and the dissociation constant, Kd = 1/K (nmol/l) and the amount of
IMI in micromoles bound per mole of phospholipid, Bmax , were determined from Eq. (6).
The apparent dissociation constant, Kd,app = 1/Kapp (nmol/l) and the apparent binding
capacity, Bmax.app , in picomoles of TCA bound per milligram of lipid, were calculated
using Eq. (7) to characterize binding to liposomes prepared from lipid mixture. Values
are reported as mean ± S.D.; the means were calculated from n values. Both Kd and
Bmax were found to be significantly higher in PS membranes than in PC membranes; as
determined by Mann–Whitney U-test.
in Table 3. No statistically significant differences were found between individual
antidepressants.
Competition curves
Competition curves were produced by incubating liposomes at a fixed concentration
of [3 H]IMI with increasing concentrations of unlabelled ligand. The concentration of
unlabelled ligand displacing 50 % of [3 H]IMI binding (half-maximum displacement,
IC50 ) was determined and its relation to phospholipid concentration was studied.
We tested the efficiency of unlabelled IMI, CMI or DMI to displace [3 H]IMI. The
same procedure was used to determine IC50 at different [3 H]IMI concentrations
(1.25–18 nmol/l) or different phospholipid concentrations (0.23–1.06 mmol/l of PC,
0.013–0.23 mmol/l of PS).
We found that major part of IMI binding to MLVs is displaceable and IC50
values are practically the same when using different TCAs as competitors. An
increase in IC50 values from 0.20 µmol/l to 3.4 µmol/l was found at the concentrations range of 0.23–1.06 mmol/l of PC, and IC50 increased from 0.22 µmol/l to
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
93
Figure 4. Inhibition of [3 H]IMI binding by clomipramine (CMI). Binding was determined
in liposomes prepared from PC or PS. The final volume of samples was 0.25 ml, the
final concentrations was 0.23 mmol/l of lipid, 5 nmol/l of [3 H]IMI and 0–400 µmol/l of
unlabelled CMI. The binding was started by the addition of [3 H]IMI and samples were
incubated at 20 ◦C, pH 7.4 for 30 min. Rapid filtration was used to separate bound and
free ligand. The figure shows a typical experiment repeated four times. S.D. of the means
ranged between 0.7 and 5.0 %. The IC50 calculated under these conditions was 0.20 µmol/l
of CMI for PC liposomes and 2.4 µmol/l of CMI for PS liposomes.
2.4 µmol/l at the concentration range of 0.013–0.23 mmol/l of PS. No significant
dependence of IC50 on [3 H]IMI concentration was observed and no marked differences in displacement efficiencies of IMI, CMI, and DMI were observed. Sample
displacement curves are shown on Fig. 4 (0.23 mmol/l of PC or PS and 5 nmol/l
of [3 H]IMI, with CMI used as a competitor to displace [3 H]IMI binding).
Discussion
Equilibrium binding of IMI to PC and PS membranes was studied by a radioligand
binding assay, using centrifugation to separate bound and free ligand. Binding of
IMI was described in terms of surface partition equilibrium and a partition constant (Eqs. (8), (9)), or using the parameters of the Langmuir or Stern adsorption
isotherms (Eqs. (6), (7)). Electrostatic effects were taken into account by means of
the GC theory (Cevc 1990; Stankowski 1991).
In the present analysis, the use of interfacial concentrations rather than bulk
concentrations of IMI did not lead to a simple partition model (Eq. (8)) for IMI
binding. The last two columns of Tables 1 and 2 demonstrate that the BIMI /C0
94
Fišar et al.
and BIMI /Ceq ratios vary considerably even in the low concentration range. Thus,
binding of IMI to PC or PS membranes cannot be described by a simple surface
partition equilibrium over the whole concentration range measured. The concentration dependence of the partition coefficients (kp , kp,app ) can not be explained by
self-association of IMI in solution, because the critical micellar concentration of IMI
is 47 mmol/l (Schreier et al. 2000). The concentration dependence of partitioning
at high IMI concentrations (>10 µmol/l) can be attributed to the low lipid-to-IMI
molar ratio; however, this does not explain the changes in the partition coefficients
at low IMI concentrations.
The hydrophobic partition coefficients were found to be significantly higher in
PC membranes compared to PS membranes in the whole concentration range (Tables 1 and 2); this finding can be interpreted as better accessibility of the hydrophobic core of PC bilayers to IMI. The apparent partition coefficients determined for
PC membranes were in good agreement with the hydrophobic partition coefficients
calculated using the GC theory (in particular, at low IMI concentrations). Hence,
the effect of bound IMI on the surface charge of PC membranes is negligible at
IMI concentrations below 1 µmol/l. To the contrary, the apparent partition coefficients for PS membranes were found to be much greater than the hydrophobic
coefficients. These results show that the electrostatic interaction between IMI and
PS membrane is prevailing; however, the interaction is not purely electrostatic in
nature and van der Waals forces and hydrophobic effects contribute to the total
binding.
The parameters of the Stern adsorption isotherm, Bmax and K, (Eq. (6))
provide a better description of IMI binding to lipid membranes than a simple
partition coefficient. A significantly higher binding capacity and a lower association
constant were found for binding to PS vesicles (Bmax = 608 mmol/mol, K = 93
l/mol) compared to binding to PC liposomes (Bmax = 35 mmol/mol, K = 5596
l/mol). Therefore, nature of the phospholipid strongly affects the drug partition.
Both a higher Bmax,app and a higher Kapp were found for binding to PS vesicles (384
mmol/mol, 8190 l/mol, respectively) compared to PC membranes (31 mmol/mol,
6077 l/mol, respectively). This demonstrates the role of the surface charge on PS
membranes in the binding process and the necessity of application of interfacial
(rather than bulk) cationic drug concentration in analyses of binding to negatively
charged lipid bilayers.
In simple terms, the reciprocal value of Bmax could be interpreted as the number of lipid molecules constituting a “specific” IMI binding site in PC membranes
(1/Bmax = 28.6) or PS membranes (1/Bmax = 1.6). In the first model, i.e. in the
terms of receptor binding studies, our results can be interpreted by referring to
low-affinity binding sites in the lipid bilayer. The second model is based on a nonspecific electrostatic accumulation of IMI near the membrane surface followed by
hydrophobic adsorption. Such electrostatic/chemical partition model is physically
more realistic (Ziegler et al. 2003).
The lipid binding constants are small compared to receptor binding constants,
which are of order 108 –1010 l/mol. However, assuming that each receptor molecule
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
95
is surrounded by some 106 lipid molecules, the product of “number of lipids” and
“binding capacity” and “binding constant” is close to a receptor binding constant.
Under these conditions, a significant proportion of IMI could be bound to lipid
bilayer and thus become lost for receptor binding if the receptor binding site was
accessible from the aqueous phase (Heirwegh et al. 1992; Seelig et al. 1993). This
effect can be compensated by the presence of negatively charged groups in the
vicinity of the receptor binding site. If the receptor binding site was localized in the
hydrophobic part of the lipid bilayer, the binding parameters would be calculated
using the intramembrane drug concentration rather than its concentration in the
aqueous phase (Heirwegh et al. 1992).
To discover a potential interference between IMI binding to lipid bilayer and
to a specific protein binding site in a biological membrane, we assayed the “highaffinity” part of the total IMI binding to PC or PS membranes in more detail. Filtration and nanomolar IMI concentrations (corresponding to free IMI in the plasma
at therapeutically active drug concentrations) were used in a set of experiments designed in analogy with the procedures used in receptor binding studies (saturation
experiments, time course of association and dissociation, displacement of ligand
bound). Accumulation of IMI molecules in the vicinity of negatively charged PS
membranes was taken into account using the GC theory.
We found that the filtration technique can yield misleading results, because
pure PC membranes show a saturable displaceable (specific) high-affinity binding
(Bmax = 3.07 µmol/mol and K = 1.02 × 108 l/mol), which is physically unrealistic. The apparent binding constant for membranes containing 100 % PS was much
greater (Kapp = 6.09 × 107 l/mol) than the intrinsic (hydrophobic) binding constant (K = 7.93 × 105 l/mol). In the latter case, binding was due to electrostatic
attraction of the cationic IMI to the negatively charged surface of a PS membrane.
Consequently, interference between binding to a specific protein binding site and
binding to a lipid bilayer may occur in receptor binding studies when IMI or a
similar amphiphilic ligand is used. The filtration assay is useful in the study of the
strong part of total binding of an amphiphilic drug to a lipid bilayer.
The difference between the total binding values, established by centrifugation
and filtration (Fig. 1), corresponds to the amount of bound ligand that can be
removed during sample filtration and washing, i.e., to the amount of very weakly
bound molecules. These molecules are probably adsorbed to the surface of MLVs
mainly through the van der Waals forces and long-range electrostatic interactions.
This weak surface adsorption can be regarded as non-specific, being common to
different amphiphilic ligands; hence, it cannot be related to specific therapeutic
effects of the drug. As the weakly bound molecules may affect the membrane electrostatic parameters, their contribution to side effects of the studied drug cannot
be ruled out.
Interactions of CADs with lipid bilayers were intensively studied in recent
years; it is therefore difficult to find something new in this field. We attempted to
characterize both the total and “high-affinity” binding of IMI, representing antidepressant drugs, to liposomes prepared from electroneutral or negatively charged
96
Fišar et al.
phospholipids. The radioligand binding assay, which is currently seldom used for
such experiments, enabled us to obtain some new results and the method described
can be used in other experiments with CADs and liposomes. The centrifugation
technique for separation of bound and free ligand can be used to determine binding parameters of total binding of IMI to lipid membranes; the filtration technique
provides characterization of “high-affinity” binding. Specification of different types
of forces participating in the “high-affinity” binding of TCAs to lipid membranes
is the subject of our following paper, where pH-dependence of this binding is analyzed.
Due to electrostatic attraction, binding of the positively charged IMI to the
negatively charged surface of PS membranes was augmented compared to binding
to neutral PC membranes. After correction for electrostatic effects by means of the
GC theory, the binding isotherms were described by binding parameters.
To sum up, there is a marked accumulation of antidepressants in lipid membranes, and binding of IMI consists from at least two components differing by
affinity. The capacity of both the total and “high-affinity” binding is significantly
higher in PS membranes than in PC membranes. This can be explained by the
high-capacity of surface binding of IMI to PS vesicles caused by the Coulomb interactions between charged groups. A significant part of the surface adsorption of
IMI to PC liposomes is very weak and can be easily released. It can be assumed
that the nature of “high-affinity” binding of IMI to PS vesicles is mainly electrostatic, whereas the “high-affinity” component of the IMI binding to PC liposomes
comprises molecules incorporated into the hydrophobic core of the lipid bilayer.
Acknowledgements. This work was supported by the GA UK No. 27/2000/C and MSM
111100001 grants.
References
Austin R. P., Davis A. M., Manners C. N. (1995): Partitioning of ionizing molecules
between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 84, 1180—1183
Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. C. (1965): Diffusion of univalent ions across
the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13, 238—252
Bartlett G. R. (1959): Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234,
466—468
Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J. (1990): Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline, and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 79,
897—901
Bäuerle H.-D., Seelig J. (1991): Interaction of charged and uncharged calcium channel
antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy,
and membrane location. Biochemistry 30, 7203—7211
Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor
binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura,
S. J. Enna and M. J. Kuhar), 2nd edition, pp. 61—89, Raven Press, New York
Beschiaschvili G., Seelig J. (1990): Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms
and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 29, 10995—11000
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
97
Beschiaschvili G., Seelig J. (1992): Peptide binding to lipid bilayers. Nonclassical hydrophobic effect and membrane-induced pK shifts. Biochemistry 31, 10044—10053
Boulanger Y., Schreier S., Leitch L. C., Smith I. C. (1980): Multiple binding sites for
local anesthetics in membranes: characterization of the sites and their equilibria
by deuterium NMR of specifically deuterated procaine and tetracaine. Can. J.
Biochem. 58, 986—995
Browning J. L., Seelig J. (1980): Bilayers of phosphatidylserine: a deuterium and phosphorus nuclear magnetic resonance study. Biochemistry 19, 1262—1270
Cater B. R., Chapman D., Hawes S. M., Saville J. (1974): Lipid phase transitions and
drug interactions. Biochim. Biophys. Acta 363, 54—69
Cevc G. (1990): Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1031, 311—382
Cevc G. (1993): Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 64, 163—
186
Choi Y. W., Rogers J. A. (1991): Characterization of distribution behavior of 2-imidazolines into multilamellar liposomes. J. Pharm. Sci. 80, 757—760
Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent
cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18,
5213—5223
Fišar Z., Krulík R., Beitlová D. (1991): Liposomes – model membranes to study the
binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabol. Drug Interact. 9, 269—281
Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and
purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509
Freisleben H.-J., Zimmer G. (1991): Influence of phenothiazines and tricyclic antidepressants on red cell membrane. In: Drug and Anesthetic Effects on Membrane Structure and Function (Eds. R. C. Aloia, C. C. Curtain, L. M. Gordon), pp. 153—182,
Wiley-Liss, Inc., New York
Hauser H. (1984): Some aspects of the phase behaviour of charged lipids. Biochim. Biophys. Acta 772, 37—50
Heimstad E., Edvardsen Ř., Ferrin T. E., Dahl S. G. (1991): Molecular structure and
dynamics of tricyclic antidepressant drugs. Eur. Neuropsychopharmacol. 1, 127—
137
Heirwegh K. P. M., De Smedt H., Vermeir M. (1992): Analysis of membrane-bound
acceptors. A correlation function for non-specific accumulation of poorly watersoluble hydrophobic or amphipathic ligands based on the ligand partition concept.
Biochem. Pharmacol. 43, 701—704
Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules
in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94
Jørgensen K., Ipsen J. H., Mouritsen O. G., Bennett D., Zuckermann M. J. (1991): The
effects of density fluctuations on the partitioning of foreign molecules into lipid
bilayers: application to anaesthetics and insecticides. Biochim. Biophys. Acta 1067,
241—253
Kelusky E. C., Boulanger Y., Schreier S., Smith I.C. (1986): A 2 H-NMR study on the
interactions of the local anesthetic tetracaine with membranes containing phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 856, 85—90
Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J. (1991): Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and
tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 29, 827—832
Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual of Membrane
Lipids (Ed. R. Prasad), pp. 37—51, Springer, Heidelberg
Langner M., Kubica K. (1999): The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids
101, 3—35
98
Fišar et al.
Lee A. G. (1978): Effects of charged drugs on the phase transition temperatures of phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 514, 95—104
Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Partition of chlorpromazine into lipid bilayer membranes:
the effect of membrane structure and composition. Biochim. Biophys. Acta 856,
274—282
Mason R. P., Campbell S. F., Wang S.-D., Herbette L. G. (1989): Comparison of location
and binding for the positively charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes. Mol.
Pharmacol. 36, 634—640
Mason R. P., Rhodes D. G., Herbette L. G. (1991): Reevaluating equilibrium and kinetic
parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction
with biological membranes. J. Med. Chem. 34, 869—877
McLaughlin S., Harary H. (1976): The hydrophobic adsorption of charged molecules to
bilayer membranes: a test of the applicability of the Stern equation. Biochemistry
15, 1941—1948
McLaughlin S. (1989): The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys.
Biophys. Chem. 18, 113—136
Miyazaki J., Hideg K., Marsh D. (1992): Interfacial ionization and partitioning of membrane-bound local anaesthetics. Biochim. Biophys. Acta 1103, 62—68
Mosior M., McLaughlin S. (1992): Electrostatics and reduction of dimensionality produce
apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes.
Biochim. Biophys. Acta 1105, 185—187
Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Lateral diffusion of small solutes and partition
of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 856,
283—289
New R. R. C. (1990): Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach (Ed.
R. R. C. New), pp. 33—104, Oxford Univ. Press
Razavi D., Mendlewicz J. (1982): Tricyclic antidepressant plasma levels: the state of the
art and clinical prospects. Neuropsychobiology (Engl. Transl.) 8, 73—85
Reith M. E. A., Sershen H., Lajtha A. (1984): Binding of imipramine and cocaine to a
model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem.
Res. 9, 965—977
Schreier S., Malheiros S. V. P., de Paula E. (2000): Surface active drugs: self-association
and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological
aspects. Biochim. Biophys. Acta 1508, 210—234
Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C. (1993): Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues
of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 32, 9714—9721
Seelig A., Gottschlich R., Devant R. M. (1994): A method to determine the ability of
drugs to diffuse through the blood-brain barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 68—72
Seelig A., Alt T., Lotz S., Hölzemann G. (1996): Binding of substance P agonists to lipid
membranes and to the neurokinin-1 receptor. Biochemistry 35, 4365—4374
Seelig A., Blatter X. L., Frentzel A., Isenberg G. (2000): Phospholipid binding of synthetic
talin peptides provides evidence for an intrinsic membrane anchor of talin. J. Biol.
Chem. 275, 17954—17961
Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992):
The importance of drug-membrane interaction in drug research and development.
Quant. Struct.–Act. Relat. 11, 205—210
Seydel J. K., Coats E. A., Cordes H. P., Wiese M. (1994): Drug membrane interaction
and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and
resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 327, 601—610
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
99
Stankowski S (1991): Surface charging by large multivalent molecules. Extending the
standard Gouy–Chapman treatment. Biophys. J. 60, 341—351
Thomas P. G., Seelig J. (1993): Binding of the calcium antagonist flunarizine to phosphatidylcholine bilayers: charge effects and thermodynamics. Biochem. J. 291,
397—402
Wagner H., Lissau A., Holzi J., Horammer L. (1962): The incorporation of 32 P into inositolphosphatides of the rat brain. J. Lipid Res. 3, 177—180
Zachowski A., Durand P. (1988): Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths
with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 937, 411—416
Ziegler A., Blatter X. L., Seelig A., Seelig J. (2003): Protein transduction domains of
HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and
thermodynamic analysis. Biochemistry 42, 9185—9194
Zimmer G., Schulze P. (1981): Membrane action of tricyclic drugs. Spectroscopic studies of
a series of phenothiazines compared with tricyclic antidepressive substances in red
cell membrane, using the spin labelling technique. Arzneimittelforschung – Drug.
Res. 31, 1389—1392
Final version accepted: October 20, 2003
Příloha 2:
FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer
membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 161—180
161
Interactions Between Tricyclic Antidepressants
and Phospholipid Bilayer Membranes
Z. Fišar
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University,
Prague, Czech Republic
Abstract. Participation of electrostatic and other noncovalent interactions in the
binding of tricyclic antidepressants (TCAs) to the lipid bilayers was estimated from
pH-dependencies of imipramine, desipramine, amitriptyline and nortriptyline binding to the lipid bilayers prepared from different phospholipids, both electroneutral
and acidic. The binding was studied using a radioligand binding assay. It was found
that the membrane phospholipid composition and methylation of the acyl side chain
of TCA has a decisive effect on participation of particular noncovalent interactions
in the binding. Apparent high-affinity binding of TCAs to the phosphatidylcholine
or phosphatidylethanolamine membranes are achieved mainly by incorporation of
uncharged drug molecules into the hydrophobic core of the bilayers. Van der Waals
forces and hydrophobic effect are responsible for this binding. Both charged and uncharged drug molecules bind to phosphatidylserine membranes, therefore coulombor ion-induced dipole interactions play a role in these binding. Different spatial
distribution of charged residues within the interface causes different electrostatic
interactions between charged TCAs and vesicles formed from phosphatidylserine
and phosphatidylinositol. The data supports the hypothesis under which TCAs
could have effect on affective disorders partially via binding to the lipid part of the
membrane and following changes of lipid-protein interactions.
Key words: Antidepressants — Liposomes — Noncovalent interactions — pHdependence — Phospholipids
Abbreviations: TCA, tricyclic antidepressant; IMI, imipramine; DMI, desipramine; AMI, amitriptyline; NOR, nortriptyline; PC, phosphatidylcholine; SM, sphingomyelin; PE, phosphatidylethanolamine; PS, phosphatidylserine; PI, phosphatidylinositol; PG, phosphatidylglycerol; GC, galactocerebroside; CH, cholesterol; CAD,
cationic amphiphilic drug; pK, equilibrium constants for acids and bases; kp , partition coefficient; Kd , equilibrium dissociation constant.
Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine,
Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic
E-mail: zfi[email protected]
162
Fišar
Introduction
Adaptive changes in neurotransmitter transduction systems seem to be the key element in therapeutic effects of antidepressants (Stahl 2000). There are hypotheses of
affective disorders supposing that both the disorder and therapeutic effects of antidepressants are connected with the alterations in the membrane lipid metabolism
and with the changes in the physical state of the lipid bilayers (Mueller et al.
1970; Heron et al. 1980; Sengupta et al. 1981; Block and Edwards 1987; Hibbeln
et al. 1989; Maes et al. 1994; Nakamura 1994; Rybakowski and Lehman 1994; Vinokur and Gubachev 1994; Hibbeln and Salem 1995; Penttinen 1995; Kunugi et
al. 1997; Peet et al. 1998; Frasure-Smith et al. 2004). So, the study of the role
of membrane lipids is necessary when understanding the nature of depression and
adaptive mechanisms induced by antidepressants.
Membrane lipids and the lipid bilayer itself was recognized as a potent enhancer and a regulator of the membrane receptors, transporters, ion channels and
enzymes (Srivastava et al. 1987; Cornelius 2001; Scanlon et al. 2001; Lee 2003). The
number of different charged or uncharged lipids containing a broad spectrum of acyl
chains and their distribution within the biological membrane suggests that the role
of the membrane lipids is far from being known. Generally, lipid bilayers are heterogeneous both in the horizontal and vertical direction and into the bargain there are
density fluctuations, regions with non-random lipid composition (domains, rafts)
and nonbilayer structures (Jain 1983; Hong et al. 1988; Devaux 1991; Mouritsen
and Jørgensen 1995; Mukherjee and Maxfield 2000; Barenholz 2002; Ohvo-Rekilä
et al. 2002; Fielding and Fielding 2003).
A simplified four region model of the lipid bilayer (Fig. 1) is proposed (Bauer
et al. 1990; Tieleman et al. 1997). The model includes the fact that the order
of the hydrocarbon chains is relatively high in the region near to the lipid-water
interface and decreases strongly towards the bilayer centre, however, the model
does not account for charged residue distribution. The headgroups of phospholipids may be divided into two regions: i) a negatively charged phosphate group
and ii) a positively, negatively, zwitterionic or uncharged group (Langner and Kubica 1999). Phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) and sphingomyelin (SM) are zwitterions with a negatively charged phosphate group and
positively charged choline or ethanolamine group. Phosphatidylglycerol (PG) and
phosphatidylinositol (PI) each have a single negative charge associated with the
phosphate group; however, the phosphate group is screened stearically by glycerol
or an inositol group. Phosphatidic acid contains a single negative charge associated
with its phosphate group; a charge, unlike those of PI and PG, is not separated
from the aqueous phase by any group. Phosphatidylserine (PS) has three residual
charges; two negative charges are associated with phosphate and carboxyl group,
one positive charge is located in the ammonium group; carboxyl group charge is
easily accessible from the aqueous phase. The role of cholesterol (polar, noncharged
molecule) can not be neglected both in direct action on the function of some membrane proteins (Scanlon et al. 2001; Fielding and Fielding 2003; Maekawa et al.
Antidepressant-Membrane Interactions
163
Figure 1. Schematic lipid bilayer division according to the four region model (Tieleman
et al. 1997) and examples of the outer leaflet of the plasma membrane components (PC,
SM, GC, and CH) and inner leaflet of plasma membrane (PE, PS, PI, and CH). Region 1
(“perturbed water”) consists of a layer in which water structure is affected by the bilayer
surface; this region ends where the lipid and the water densities are comparable. Region
2 (“interphase”) includes headgroups and part of the tail methylenes; this region has the
highest density in the bilayer. Region 3 (“soft polymer”) consists of partially ordered acyl
chains; it starts at the carbonyl groups and it is characterized by a high chain density and
low free volume. Region 4 (“decane”) is the centre of the bilayer which is characterized
by a low density and high free volume. Regions 1 and 2 form the interfacial region.
164
Fišar
2003; Pfrieger 2003) and in the membrane structure and fluidity (Shinitzky 1984;
Yeagle 1985; Silvius 2003).
It has been shown in many previous studies that liposomes are a suitable model
of the lipid part of the biological membranes for testing the potential biological
activity of compounds (Reith et al. 1984; New 1990) and that there is a good
agreement between the results obtained in the model systems and those obtained
in vivo. Large unilamellar vesicles are the best model of cell membranes; however,
it was demonstrated that multilamellar vesicles are also a good model (Choi and
Rogers 1991; Fišar et al. 1991, 2004).
Multiple noncovalent bonds impart specificity both to the protein-protein or
lipid-protein interactions and the drug-membrane interactions, so, it is remarkably
difficult to quantify separate contributions of individual noncovalent interactions to
the thermodynamics of drug-membrane interactions (Cooper 1999). There is known
only a limited menu of noncovalent interactions: 1. electrostatic (ionic, Coulomb)
interactions; 2. dispersion and repulsive van der Waals forces; 3. hydrogen bond,
and 4. hydrophobic effect (interaction). Hydrophobic and polar interactions are
collectively referred to as hydropathy. Van der Waals interactions rapidly decrease
with an increasing distance, but Coulomb interactions between dipoles, especially
between whole charges, are quite long-ranged.
The antidepressants belong to the group of the cationic amphiphilic drugs
(CADs). It is not known if accumulation of antidepressants in the lipid part of
biological membranes (Sikora et al. 1990; Krulík et al. 1991; Fišar et al. 1996) can
be related to their therapeutic or side effects, but the protein-lipid-antidepressant
interactions can influence the function of many membrane systems participating
in the nerve signal transduction (Bevan et al. 1989; Mason et al. 1991; Seydel
et al. 1992; Yang and Glaser 1995; Scanlon et al. 2001). Changes in the composition of the membrane lipids after the long-term administration of the antidepressants (Moor et al. 1988) indicate the role of membrane lipids in the mechanism of their action even if the phospholipids are not the specific target of the
drug molecules. Many antidepressants may induce the generalized phospholipidosis, i.e. excessive accumulation of different phospholipids within the cell (Xia et al.
2000).
As a consequence of membrane heterogeneity, drugs are distributed non-uniformly in the lipid bilayer (Herbette et al. 1986; Müller et al. 1986) and multiple
binding sites of CADs with membranes were described (Boulanger et al. 1980;
Kelusky et al. 1986; Zachowski and Durand 1988). The Gouy–Chapman theory
has been adopted to describe adsorption (incorporation) of drugs, hormones, peptides and proteins onto the lipid bilayer surface (McLaughlin and Harary 1976;
Eisenberg et al. 1979; McLaughlin 1989; Beschiaschvili and Seelig 1990; Cevc 1990,
1993; Stankowski 1991; Seelig et al. 1993; Langner and Kubica 1999; Averbakh and
Lobyshev 2000). Thermodynamic analysis of the binding equilibrium for various
amphiphilic or hydrophobic ligands led to the conclusion that the main driving
force for the binding of these drugs into lipid bilayer is either a change in enthalpy,
or enthalpy as well as entropy, it means van der Waals forces and a hydropho-
Antidepressant-Membrane Interactions
165
Figure 2. Chemical structures of tricyclic antidepressants used include IMI, DMI, AMI
and NOR.
bic effect (Bäuerle and Seelig 1991; Wimley and White 1993; Seelig et al. 2000).
Coulomb interactions are considered to explain surface adsorption of CADs.
Many biologically active molecules, including phospholipids and drugs, have
multiple acidic or basic groups; it is essential to know the state of dissociation of
each of these groups when their mutual interactions are studied. The Henderson–
Hasselbach equation describes the relations between pH and equilibrium constants
(pK) for acids and bases. The pK value of an ionisable drug in the membrane
differs from those in the bulk solution. It was shown that partition coefficients
(defined as ratio of molar concentration of drug in membrane to the concentration in
aqueous phase) of charged (kp+ ) and uncharged (kp◦ ) forms of the drugs are different,
which imply a pK shift of the partitioning compound (Lee 1978; Zachowski and
Durand 1988; Cevc 1990; Mason et al. 1991; Miyazaki et al. 1992; Pauletti and
Wunderli-Allenspach 1994; Hata et al. 2000; Schreier et al. 2000; Castro et al. 2001;
Hunziker et al. 2001; Rodrigues et al. 2001). The pK shift is generally given by a
polarity-induced shift (determined by thermodynamic differences in the ionization
equilibrium of drugs at the water and membrane location) and electrostatic shift
(determined by surface potential of charged membranes). Relation between the
difference of pK of the drug in the membrane (pKm ) and in water (pKw ) on the
one hand and kp◦ /kp+ on the other can be readily derived at low drug concentrations
(Lee 1978; Miyazaki et al. 1992):
∆pK = pKm − pKw = log(kp+ /kp◦ )
(1)
This pK shift can be estimated from a pH dependence of the drug binding to the
lipid membranes.
Tricyclic antidepressants (TCAs) are the most carefully searched group of antidepressants according to the fact that these drugs are therapeutically used almost
50 years. The primary biochemical effect of TCAs is the inhibition of the serotonin
or norepinephrine membrane transporters (Hirschfeld 2000). Chemically they are
dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes; e.g. imipramine (IMI), desipramine
(DMI), amitriptyline (AMI) and nortriptyline (NOR) are included in the TCAs
166
Fišar
group (Fig. 2). A molecular dynamics simulation of TCAs demonstrated considerable flexibility of the molecules, both in the side chain and in the ring system (Heimstad et al. 1991). It is generally thought that the TCAs are anchored at the lipid
membrane via the hydrophobic moiety of the molecules (aromatic rings) and with
their polar part (side chain inclusive charged amine group) being preferably localized in the vicinity of the phospholipid polar groups (glycerol backbone/phosphate),
however, different interactions with the membrane at low and at higher TCAs concentrations were observed (Bauer et al. 1990; Freisleben and Zimmer 1991).
At a physiological pH, about 99 % of TCAs molecules carry a positive charge
(pKNH+ = 9.4) and their binding to membranes is strongly dependent on lipid com3
position of the membranes (Fišar et al. 2004). Over a wide range of pH values, both
PC and PE molecules are completely electroneutral as the negative charge of the
phosphate group (pKPO− ≤ 1) is compensated by the positive charge of the choline
4
head (pKNH+ = 11.25); however, PC and PE become negatively charged at high
3
pH. PS may carry, in addition to a negative charge on the phosphate (pKPO− ≤ 1)
4
and a positive charge of the amino group (pKNH+ = 11.5), a negative charge on
3
the carboxyl group (pKCOO− = 5.5). As a result, PS will carry (under normal
conditions) a negative net charge increasing at a higher pH while PS becomes electroneutral at a low pH. PI is negatively charged practically over the whole studied
range of pH (pKPO− = 2.7; all pK values are adapted from Cevc (1990)).
4
Binding parameters of TCAs to lipid bilayers have been determined from saturation isotherms in our previous experiments (Fišar et al. 2004); data were analysed without and after correcting for electrostatic effects using the Gouy–Chapman
theory. We confirmed that binding of IMI consists from at least two components
differing by affinity and the strong part of the total binding (apparent high-affinity
binding) can be characterized using filtration to separate bound and free ligand.
The low-affinity component of the total binding can be related to the weak surface
adsorption of charged TCA molecules. Diversity of low-affinity binding was described and characterized for various CADs (Zachowski and Durand 1988; Bäuerle
and Seelig 1991; Austin et al. 1995); however, high-affinity binding was not identified and characterized in these studies. We supposed that both the Coulomb
interactions between charged groups and the drug incorporation into hydrophobic
core of lipid bilayer are responsible for apparent high-affinity binding.
The aim of the presented study is a more precise determination of the participation of different weak forces in the apparent high-affinity binding of TCAs to the
lipid bilayers. The pH-dependencies could be analyzed to size up a proportion of
Coulomb forces and other noncovalent interactions. To resolve between the effect of
the antidepressant and the phospholipid, the measurements were carried out with
4 different TCAs, IMI, DMI, AMI and NOR, and with 4 different phospholipids,
PC, PS, PE and PI; mixtures of phospholipids were used also. It is known that the
mutual interactions tend to destabilize the lipid bilayer at high amphiphilic ligand
concentrations (Zimmer 1984; Zachowski and Durand 1988; Balgavý and Devínsky
1996; Heerklotz and Seelig 2000; Sanganahalli et al. 2000; Schreier et al. 2000); that
Antidepressant-Membrane Interactions
167
is why very low (nanomolar) TCAs concentrations (i.e. a high molar phospholipid
to antidepressant ratios) were used in our study.
Materials and Methods
Chemicals and solutions
All samples were prepared in a physiological saline (0.9 g/l NaCl, pH 7.4) and their
pH were adjusted using 5 times concentrated buffers. The range of 2 to 12 was
covered by three types of buffers obtained by mixing accurate volumes of following
solutions: 0.5 mol/l citric acid and 1.0 mol/l disodium phosphate (pH 2, 3, 4); 0.33
mol/l monopotassium phosphate and 0.33 mol/l disodium phosphate (pH 5, 6, 7, 8);
0.5 mol/l glycine, 0.5 mol/l sodium chloride and 0.5 mol/l sodium hydroxide (pH 9,
10, 11, 12). Phospholipids in chloroform/methanol solvent mixture (2 : 1, vol/vol;
5–20 mg/ml) were isolated from total lipid extracts by column chromatography.
Crude extract of lipids was prepared by Folch method (Folch et al. 1957; Koul and
Prasad 1996). PC, PE and PS were isolated from the white matter of the bovine
brain and PI from green peas. The resulting purity, determined by two-dimensional
thin-layer chromatography, was over 95 %. Phospholipids were stored in a freezer
under nitrogen atmosphere.
The following stock solutions of tritium-labelled TCAs ([3 H]TCAs) in methanol were used: 80.37 µmol/l [3 H]IMI (specific activity 2.7 TBq/mmol, concentration
217 MBq/ml), 4.08 µmol/l [3 H]DMI (2.0 TBq/mmol, 8.16 MBq/ml), 3.00 µmol/l
[3 H]AMI (4.07 TBq/mmol, 12.2 MBq/ml), 324 µmol/l [3 H]NOR (0.08 TBq/mmol,
25.9 MBq/ml); radiochemical purity >96 %; labelled in our laboratories (Krulík et
al. 1991); 12.5 nmol/l of [3 H]TCA solutions in physiological saline were prepared
just before measurement and used in binding experiments. Tritium-labelled phospholipids, [3 H]PC and [3 H]PS (concentration 18.5 MBq/ml, radiochemical purity
>96 %) were prepared by catalytic tritiation of double bonds in hydrocarbon chains
of phospholipids with gaseous tritium. Non-labelled (cold) TCAs were used in the
form of hydrochlorides: 2 mmol/l stock solutions of IMI, DMI, AMI and NOR (all
from Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) in physiological saline were used as
displacement agents.
Preparation of liposomes
Lipid vesicles were prepared using Bangham method (Bangham et al. 1965; New
1990) shortly before measurement. Briefly, an aliquot part of phospholipid in chloroform/methanol solvent mixture containing less than 20 mg of phospholipid was
introduced into a 50-ml vessel and the liquid was completely evaporated from
the solution by nitrogen stream at temperature about 40 ◦C. The vessel was then
placed in vacuum for at least one hour to remove residual solvent. After releasing
the vacuum, 2 ml of buffer was added; the flask was filled with nitrogen, closed
and incubated at 50 ◦C for 5 min. The sample was agitated until all the lipid was
removed from the walls of the flask and a homogeneous milky-white suspension
168
Fišar
arose. The flask was shortly sonicated (for less then 10 s) in an XL 2020 sonicator (Misonix Inc.) to release all lipids from the walls and to break down large
clusters. After incubation of the sample at 50 ◦C for 30 min, the suspension was
left at room temperature for further 2 h and diluted by buffer solution to the required phospholipid concentration (0.5 mg/ml). Phospholipid concentrations were
checked by a phosphorus concentration determination (Bartlett 1959; Wagner et
al. 1962). The same technique was employed to prepare PC, PE, PS, PI and mixed
vesicles. However, because of the differences between the electroneutral and acidic
phospholipids, liposomes are not the same: unsonicated PC bilayers are characteristic by multilamellar packing; pH-induced destabilization, aggregation and fusion
of liposomes composed of PE was described (Ellens et al. 1984; Allen et al. 1990;
Hazemoto et al. 1990); the fundamental structure of charged lipids dispersed in
water is the unilamellar vesicle (Hauser 1984).
In our previous experiments (Fišar et al. 2004) we proved that the lipid bilayers
in PC or PS vesicles were sufficiently permeable for TCAs and a 30 min incubation
at 20 ◦C was sufficient to restore equilibrium, i.e., a uniform distribution of TCA
within liposomes.
Radioligand binding assay
Radioligand binding assay was employed by analogy with the receptor studies (Bennett and Yamamura 1985; Fišar et al. 2004). The tritium-labelled TCAs were used,
[3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]AMI and [3 H]NOR. Bound and free radioligand was separated by a rapid filtration using a device harvester MB 18 (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). The filtration time period (<10 s) was sufficiently short for the
measurement of the high-affinity binding processes with equilibrium dissociation
constant Kd < 10−8 mol/l. Resulting concentrations were 5 nmol/l [3 H]TCA and
0.2 mg/ml of phospholipids. Brief summary of the method: the pH values of the
liposome suspensions were adjusted (pH 2 to 12) using the 5 times concentrated
buffers; the binding was started by the addition of 100 µl [3 H]TCA to 150 µl of
the liposome suspension; following incubation at 20 ◦C for 30 min, samples were
filtered through glass microfibre filters (GF/F type; Whatman International Ltd.,
Kent, UK) impregnated previously in 0.1 % polyethyleneimine (Sigma) and washed
by 9 ml of saline and their activities were assayed in a scintillation cocktail using
an LS 6000IC liquid scintillation counter (Beckman Instruments Inc., Fullerton,
CA, USA). It was proved that the buffer composition did not affect the binding of
TCAs to vesicles. Samples were measured in doublets. Specific binding of TCAs to
lipid vesicles was calculated as the difference between total and nonspecific binding
with nonspecific binding determined in the presence of excess (50 µmol/l) of cold
ligand.
Capture efficiency of liposomes on GF/F filters at different pH values was
measured by the following technique. Trace amount (2 µl) of [3 H]PC or [3 H]PS was
added to the phospholipid in a chloroform/methanol solvent mixture and liposomes
were prepared by the standard procedure. The pH values of the liposome suspensions were adjusted, the total activity of 250 µl of the sample was measured and
Antidepressant-Membrane Interactions
169
250 µl of liposomes was filtered and washed. The percentage of vesicles captured
on filters was calculated; samples were measured in doublets.
pH dependencies of investigated parameters were measured over a wide variety
of pH (2 to 12) to evaluate interactions both of charged and uncharged drugs or
lipid molecules.
Data analysis
Data is expressed as the arithmetic mean ± standard deviation (S.D.). Selected
pH curves were analyzed using the four-parametric logistic model (ImmunoFit
EIA/RIA software, Beckman) to establish the pH values at which binding of TCA
to lipid vesicles attains the one half of the maximal value. Statistical analyses were
performed with the statistical package Statistica (StatSoft Inc.). Spearman R (nonparametric alternative to the Pearson product-moment correlation coefficient) was
used to quantify relation between two quantitative parameters.
Results
Capture efficiency of filters
First, the capture efficiency of GF/F filters was determined using the tritiumlabelled phospholipids as markers. We confirmed that the amount of vesicles captured on the filters did not depend on repeated washing of the filters. Rinsing of
filters by volumes 3–15 ml of saline did not change the percentage of trapped vesicles, which was practically the same (about 80 % at pH 7.4) for PC, PS, PE and
PI vesicles. The percentage of liposomes captured on the GF/F filter was found
practically constant in the range of pH between 2 to 10 but marked a decrease of
the capture efficiency was observed at pH above 10 (Fig. 3).
pH-dependencies of the binding
The radioligand binding assay was used to determine the pH-dependencies of the
binding of IMI, DMI, AMI and NOR to liposomes prepared from PC, PE, PS, PI
and mixtures (PC+PE) (1 : 1, w/w), (PC+PS) (1 : 1, w/w) and (PC+PI) (1 : 1,
w/w). Displaceable high-affinity binding was determined and adjusted according
to the percentage of phospholipid trapped on the filter; the corrected values were
used in the pH curve. Only data from the range of pH 2 to 10 was interpreted due
to low capturing efficiency of GF/F filters at higher pH (data points at pH 11 and
12 are shown in Figs. 4–6, but they are not used for curve fitting).
The binding at 5 nmol/l TCA concentration can be used to differentiate binding of charged from uncharged molecules (Fig. 4). The courses of pH-curves for PC
or PE or PI vesicles corresponded with change of positive charge on IMI molecules
both for binding to electroneutral PC or PE vesicles and for electronegative PI vesicles. However, the pH-dependence of IMI binding to the PC vesicles was shifted
to lower pH. The course of the binding to the PS vesicles was more complex and
reflected changes of positive charge on IMI and negative charges on PS molecules.
170
Fišar
Figure 3. The percentage of liposomes collected on GF/F filter as a function of pH. Filters
were impregnated in 0.1 % polyethyleneimine and a saline was used as a rinsing solution.
Tritium-labelled PC and PS were used as markers; final phospholipid concentration was
0.16 mg/ml. Values are reported as mean ± S.D. (n = 3).
The total binding of TCAs to lipid vesicles was dependent both on their lipid
composition and on pH, whereas, the nonspecific binding (in presence of 50 µmol/l
of cold TCA) was low and practically constant over the whole range of pH (Fig. 4).
The high-affinity binding of TCAs to vesicles was displaced at high concentrations
of unlabelled ligand; it is shown on Fig. 4 that inhibition of [3 H]IMI binding by cold
IMI (0.5 µmol/l) was higher in vesicles prepared from electroneutral phospholipids
(PC or PE) in comparison with acidic phospholipids (PS or PI). Similar results
were found with liposomes prepared from mixtures of phospholipids, i.e. [3 H]IMI
binding was displaced more markedly from (PC+PE) vesicles in comparison with
(PC+PS) or (PC+PI) vesicles (data not shown).
The pH-dependencies of [3 H]TCA high-affinity binding to lipid vesicles prepared from different phospholipid classes are shown on Figs. 5 and 6. Corrected
data were used in graphs, i.e. nonspecific [3 H]TCA binding to GF/F filters was
subtracted and data were re-counted to agree with 100 % collection of vesicles on
GF/F filters. The pK of TCAs or phospholipids are marked in graphs (vertical
dashed lines) and used in Discussion.
Antidepressant-Membrane Interactions
171
Figure 4. pH-dependencies of high-affinity IMI binding to the lipid vesicles prepared
from PC (A), PE (B), PS (C) and PI (D) in the presence of 5 nmol/l [3 H]IMI at a
phospholipid concentration about 0.2 mg/ml. Corrected data were used in graphs, i.e.
nonspecific [3 H]IMI binding to GF/F filters was subtracted and data were re-counted to
agree with 100 % collection of vesicles on GF/F filters. Only data from the range of pH
2–10 was used in curve fitting due to low capture efficiency of GF/F filters at higher pH
(data points at pH 11–12 are shown, but they were not interpreted). Displacement of
[3 H]IMI binding following addition of 0.5 µmol/l or 50 µmol/l of cold IMI is depicted.
Vertical doted lines indicate pH 7.4, vertical dashed lines represent pK values of TCAs
(pKNH+ = 9.4) or pK values of phospholipids (Cevc 1990), i.e. PC (pKNH+ = 11.25), PE
3
3
(pKNH+ = 11.25), PS (pKNH+ = 11.5, pKCOO− = 5.5) and PI (pKPO− = 2.7). The figure
4
3
3
shows mean data from experiment repeated at least three times.
Similar curves were observed using [3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]AMI or [3 H]NOR.
Relation between bindings of different TCAs to the same phospholipid vesicles was
determined as correlation coefficient (Spearman R). A significant positive correlations (at statistical significance p < 0.01) were discovered for PC, PE, PS, PI,
(PC+PE), (PC+PS) and (PC+PI) vesicles, except for binding of DMI or NOR to
the PC- and PI-derived vesicles.
172
Fišar
Figure 5. pH-dependencies of TCA binding to vesicles prepared from PC (A), PE (B),
PS (C) and PI (D). High-affinity binding of tritium labelled IMI (), DMI (), AMI ( )
or NOR (•) was measured; final concentrations were 5 nmol/l of TCA and 0.2 mg/ml of
phospholipid. Corrected data were used; the meaning of the vertical dotted and dashed
lines is the same as in Fig. 4. Values are means calculated from experiments repeated 3
to 9 times. S.D. are not shown due to graph lucidity.
Discussion
Our study was directed to the characterization of the apparent high-affinity binding
(characterized by dissociation constant ≤ 10−8 mol/l) of TCAs to the model lipid
bilayers prepared from different phospholipids. It was shown, that apparent highaffinity binding of TCAs to bilayer membranes is strongly dependent both on their
phospholipid composition and on the pH of the aqueous phase. Short range van der
Waals, electrostatic forces and the hydrophobic effect participate in these bindings.
To interpret the obtained results in the terms of weak interactions participating in
this binding, heterogeneity of lipid bilayer structure and the spatial distribution of
charged residues within the interface must be considered.
The study of interactions of TCAs with undisturbed lipid bilayers and the
differentiation of binding of charged vs. uncharged molecules was found useful only
Antidepressant-Membrane Interactions
173
Figure 6. pH-dependencies of TCA binding to vesicles prepared from mixture (1 : 1,
w/w): A. (PC+PE), B. (PC+PS) and C. (PC+PI). High-affinity binding of tritiumlabelled IMI (), DMI (), AMI ( ) or NOR (•) was measured; final concentrations
were 5 nmol/l of TCA and 0.2 mg/ml of phospholipid. Corrected data were used; the
meaning of the vertical dotted and dashed lines is the same as in Fig. 4. Values are means
calculated from experiments repeated 3 to 6 times. S.D. are not shown due to graph
lucidity.
at sufficiently low (nanomolar) drug concentrations (Fig. 4). So, the method used
in this paper provided the determination of binding at very low antidepressant
concentrations, i.e. near to the free TCA concentrations in plasma during the pharmacotherapy (<50 nmol/l).
A decrease in the displaceable binding in [3 H]TCA to the lipid bilayers towards
very low values corresponded with decrease in pH values from 10 to 2 (Figs. 5, 6).
The courses in pH-curves depended strongly on the phospholipid composition of
liposomes; however, they were very similar for different TCAs. As PC and PE
molecules are practically electroneutral over the whole studied range of pH values, and as the positive charge of TCAs disappears with pH elevation, these pHdependencies (Figs. 5A,B and 6A) can be interpreted as a facilitated incorporation
of uncharged TCA molecules into the hydrophobic core of the PC, PE or (PC+PE)
bilayers. It can be stated that the [3 H]TCA binding to liposomes prepared from
174
Fišar
electroneutral phospholipids follows the pH-dependent degree of dissociation of the
drug. However, the binding to the PC liposomes attained one half of the maximal value at a pH about 7.7 for IMI or AMI and at pH about 8.3 for DMI or
NOR (Fig. 5A), i.e. 1.7 and 1.1 pH unit lower in comparison with TCA in aqueous
medium (pKw = 9.4), which corresponds to a 50- and 13-fold higher partition coefficient of the uncharged drug compared with that of the charged form (Eq. (1)). So,
the k◦p /k+
p of methylated TCAs (IMI, AMI) to PC bilayers is significantly higher
than k◦p /k+
p of demethylated drugs (DMI, NOR). It seems that both the charge
and methylation of the acyl side chain of TCAs affect the apparent high-affinity
binding of TCAs to PC membranes. This result is valid only at nanomolar TCA
concentrations.
The pH-dependence of TCA binding to the PE vesicles (Figs. 4B, 5B) was
markedly different from binding to PC vesicles. It can be explained by differences
of PE from PC; the headgroup of PE is smaller than the phosphocholine of PC and
PE can readily constitute a nonbilayer structures. Therefore, mixture PC and PE
(1 : 1) was used to prepare lipid bilayers. It was demonstrated that pH-dependencies
of TCAs binding to (PC+PE) liposomes (Fig. 6A) are very similar to the curves
obtained with PC liposomes (Fig. 5A); however, the pK shift is greater. The binding
to the (PC+PE) vesicles attained one half of the maximal value at a pH about 6.7
for IMI or AMI and at pH about 7.0 for DMI or NOR, i.e. 2.7 and 2.4 pH unit
lower in comparison with TCA in aqueous medium, which corresponds to a 500and 250-fold higher partition coefficient of the uncharged drug compared with that
of the charged form. This could be related to the existence of nonbilayer structures
in PE membranes.
The pH-dependence of TCA binding to the PS vesicles (Figs. 4C, 5C) was
markedly different from binding to PC vesicles. It is done by the fact that both the
drug and the PS charges vary over the used range of pH values. The course of the
binding to the PS vesicles is clearly affected both by protonation and deprotonation
of interacting molecules. The initial increase in the binding with the rising of pH
from value 2 to 7, correlates with the addition of a negative charge to PS (pKCOO−
= 5.5); hence, this increase in binding of TCAs to the PS vesicles is caused predominantly by Coulomb interactions between charged TCA+ and serine group of
PS. For pH value between 7 and 10, the binding increases, the implication being
binding of an uncharged ligand to a charged PS is also significant. The data suggest
approximately equal fractional contributions of the charged and uncharged TCAs
to the PS membranes at physiological pH. A certain decrease in the binding for
pH > 10 is probably associated with the loss of the positive charge of the drug and,
consequently, a decrease in Coulomb interactions. These results confirm the significant role played by Coulomb interactions in apparent high-affinity TCA binding
to the PS vesicles at physiological pH. The magnitude of binding to the PS vesicles
even at a marked decrease in Coulomb interactions (at pH > 9) could mean that
both ion-induced dipole interactions and van der Waals forces and hydrophobic
effect play a role.
The difference between TCAs binding to PC vs. PS vesicles could reflect a
Antidepressant-Membrane Interactions
175
greater representation of nonbilayer structures in PS membranes. Therefore, binding to liposomes prepared from mixture PC and PS (1 : 1) was also measured. The
course of the pH-dependence of the high-affinity binding of TCAs to the mixed
(PC+PS) vesicles (Fig. 6B) was found very similar to the course obtained for PS
vesicles; so, eventual nonbilayer structures do not play significant role. It seems
that the binding to PS overlays the binding to the PC at lower pH and the contribution of the charged TCAs to the binding to (PC+PS) vesicles (i.e. electrostatic
interaction) is multiple higher than that of uncharged TCAs at physiological pH.
The pH-dependence of TCA binding to the vesicles prepared from PI was
executed to discover if binding of TCA to the PS vesicles is caused by a total
charge of phospholipid only, or if there exists some specificity of TCAs binding to
the PS membranes, i.e. if spatial distribution of charged groups and their masking
by noncharged groups play a role in the binding. It was found that the course of
TCAs binding to the PI vesicles (Figs. 4D, 5D) is very different from binding to
PS vesicles; it seems that binding is realized mainly by incorporation of uncharged
drug into PI vesicles. The difference between TCAs binding to PS and PI vesicles
may be caused by nonbilayer structures in PI vesicles rather than by different
spatial distribution of charged groups; this was confirmed by using mixture PC
and PI (1 : 1) to prepare liposomes. The pH-dependencies of TCAs binding to the
liposomes prepared from (PC+PI) (Fig. 6C), PS or (PC+PS) (Figs. 5C, 6B) are
similar. So, the binding of TCAs to (PC+PI) vesicles is realized both by charged
and non-charged form of TCAs. However, binding of positively charged TCA+ at
pH < 4 was very low, although PI is negatively charged over the whole studied
range of pH (pKPO− = 2.7). Probable cause is that a negatively charged phosphate
4
group of PI is shaded off stearically by an inositol group and Coulomb interaction is
too weak to constitute the high-affinity binding. This result implies the existence of
partial specificity in TCAs binding to the PS membranes, which is not determined
by a total negative charge of PS polar heads. It is obvious that different spatial
distribution of charged residues within the interface causes different electrostatic
interactions between charged TCAs and surfaces formed from PS and PI. Diverse
composition and conformation of uncharged groups may also contribute to the
specificity of TCAs binding to the PS vesicles.
It was shown in this study that both PS and PI play an important role in the
binding of TCAs to the lipid bilayers at physiological pH and there is some specificity of TCAs-serine group interaction. Because TCAs easily permeate through
the membrane, they can interact also with the PS or PI on the inner membrane
surface. PS is known as an acidic phospholipid affecting the activity of many membrane enzymes (including Na+ K+ -ATPase; phospholipases; protein kinase C etc.)
taking part in a signal transduction. It follows that phospholipid mediated action of
TCAs on nerve signal transduction need not be quite nonspecific as was supposed
and that the role of the lipid phase in the cell membrane is different, but no less
important than the role of membrane proteins.
It can be concluded that the proportion of Coulomb interactions, van der Waals
forces, ion-induced dipole interactions and the hydrophobic effect in apparent high-
176
Fišar
affinity binding of TCAs to the model lipid membranes is strongly dependent on
the phospholipid composition of lipid membranes; so, a various charged residue arrangement within phospholipid headgroups is the determining factor. Acidic phospholipids participate markedly in the binding at physiological pH. There is dependence of TCAs binding to lipid bilayers on the type of TCA also; the pK shifts
clearly reflect effect of methylation/demethylation of the acyl side chain of TCAs.
It can be supposed that the findings presented in this paper could be common to
most of the CADs.
Acknowledgements. This work was supported by GA UK 27/2000/C and MSM 111100001 grants. The author wishes to thank K. Fuksová for preparing tritium-labelled substances and Z. Hanuš for his technical assistance.
References
Allen T. M., Hong K., Papahadjopoulos D. (1990): Membrane contact, fusion, and hexagonal (HII) transitions in phosphatidylethanolamine liposomes. Biochemistry 29,
2976—2985
Austin R. P., Davis A. M., Manners C. N. (1995): Partitioning of ionizing molecules
between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 84, 1180—1183
Averbakh A., Lobyshev V. I. (2000): Adsorption of polyvalent cations to bilayer membranes from negatively charged lipid: estimating the lipid accessibility in the case
of complete binding. J. Biochem. Biophys. Methods 45, 23—44
Balgavý P., Devínsky F. (1996): Cut-off effect in biological activities of surfactants. Adv.
Colloid Interface Sci. 66, 23—63
Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. C. (1965): Diffusion of univalent ions across
the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13, 238—252
Barenholz Y. (2002): Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane
evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 41, 1—5
Bartlett G. R. (1959): Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234,
466—468
Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J. (1990): Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline, and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 79,
897—901
Bäuerle H. D., Seelig J. (1991): Interaction of charged and uncharged calcium channel
antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy,
and membrane location. Biochemistry 30, 7203—7211
Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor
binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura,
S. J. Enna and M. J. Kuhar), pp. 61—89 (2nd ed.), Raven Press, New York
Beschiaschvili G., Seelig J. (1990): Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms
and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 29, 10995—11000
Bevan J. A., Bevan R. D., Shreeve S. M. (1989): Variable receptor affinity hypothesis.
FASEB J. 3, 1696—1704
Block E., Edwards D. (1987): Effects of plasma membrane fluidity on serotonin transport
by endothelial cells. Am. J. Physiol. 253, C672—678
Boulanger Y., Schreier S., Leitch L. C., Smith I. C. (1980): Multiple binding sites for
local anesthetics in membranes: characterization of the sites and their equilibria
Antidepressant-Membrane Interactions
177
by deuterium NMR of specifically deuterated procaine and tetracaine. Can. J.
Biochem. 58, 986—995
Castro B., Gameiro P., Lima J. L., Matos C., Reis S. (2001): A fast and reliable spectroscopic method for the determination of membrane-water partition coefficients of
organic compounds. Lipids 36, 89—96
Cevc G. (1990): Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1031, 311—382
Cevc G. (1993): Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 64, 163—
186
Choi Y. W., Rogers J. A. (1991): Characterization of distribution behavior of 2-imidazolines into multilamellar liposomes. J. Pharm. Sci. 80, 757—760
Cooper A. (1999): Thermodynamic analysis of biomolecular interactions. Curr. Opin.
Chem. Biol. 3, 557—563
Cornelius F. (2001): Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steady-state kinetics. Biochemistry 40, 8842—8851
Devaux P. F. (1991): Static and dynamic lipid asymmetry in cell membranes. Biochemistry
30, 1163—1173
Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent
cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18,
5213—5223
Ellens H., Bentz J., Szoka F. C. (1984): pH-induced destabilization of phosphatidylethanolamine-containing liposomes: role of bilayer contact. Biochemistry 23, 1532—1538
Fielding C. J., Fielding P. E. (2003): Relationship between cholesterol trafficking and
signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 1610, 219—228
Fišar Z., Krulík R., Beitlová D. (1991): Liposomes – model membranes to study the
binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabol. Drug Interact. 9, 269—281
Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J. (1996): Imipramine distribution among red
blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 15, 51—64
Fišar Z., Fuksová K., Velenovská M. (2004): Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 23, 77—99
Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and
purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509
Frasure-Smith N., Lesperance F., Julien P. (2004): Major depression is associated with
lower omega-3 fatty acid levels in patients with recent acute coronary syndromes.
Biol. Psychiatry 55, 891—896
Freisleben H.-J., Zimmer G. (1991): Influence of phenothiazines and tricyclic antidepressants on red cell membrane. In: Drug and Anesthetic Effects on Membrane Structure and Function (Eds. R. C. Aloia, C. C. Curtain and L. M. Gordon), pp. 153—
182, Wiley–Liss, Inc., New York
Hata T., Sakamoto T., Matsuki H., Kaneshina S. (2000): Partition coefficients of charged
and uncharged local anesthetics into dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membrane: estimation from pH dependence on the depression of phase transition temperatures. Colloids Surf., B: Biointerfaces 22, 77—84
Hauser H. (1984): Some aspects of the phase behaviour of charged lipids. Biochim. Biophys. Acta 772, 37—50
Hazemoto N., Harada M., Komatsubara N., Haga M., Kato Y. (1990): pH-sensitive liposomes composed of phosphatidylethanolamine and fatty acid. Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo) 38, 748—751
Heerklotz H., Seelig J. (2000): Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning
and membrane solubilization. Biochim. Biophys. Acta 1508, 69—85
178
Fišar
Heimstad E., Edvardsen Ø., Ferrin T. E., Dahl S. G. (1991): Molecular structure and
dynamics of tricyclic antidepressant drugs. Eur. Neuropsychopharmacol. 1, 127—
137
Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules
in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94
Heron D., Shinitzky M., Hershkowitz M., Samuel D. (1980): Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin to mouse brain membranes. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 77, 7463—7467
Hibbeln J. R., Palmer J. W., Davis J. M. (1989): Are disturbances in lipid-protein interactions by phospholipase-A2 a predisposing factor in affective illness? Biol. Psychiatry
25, 945—961
Hibbeln J. R., Salem N. Jr. (1995): Dietary polyunsaturated fatty acids and depression:
when cholesterol does not satisfy. Am. J. Clin. Nutr. 62, 1—9
Hirschfeld R. M. (2000): Antidepressants in long-term therapy: a review of tricyclic antidepressants and selective serotonin reuptake inhibitors. Acta Psychiatr. Scand.
Suppl. 403, 35—38
Hong K., Baldwin P. A., Allen T. M., Papahadjopoulos D. (1988): Fluorometric detection
of the bilayer-to-hexagonal phase transition in liposomes. Biochemistry 27, 3947—
3955
Hunziker R. W., Escher B. I., Schwarzenbach R. P. (2001): pH dependence of the partitioning of triphenyltin and tributyltin between phosphatidylcholine liposomes and
water. Environ. Sci. Technol. 35, 3899—3904
Jain M. K. (1983): Nonrandom lateral organization in bilayers and biomembranes. In:
Membrane Fluidity in Biology (Ed. R. C. Aloia), Vol. 1, pp. 1—37, Academic
Press, New York
Kelusky E. C., Boulanger Y., Schreier S., Smith I. C. (1986): A 2 H-NMR study on the
interactions of the local anesthetic tetracaine with membranes containing phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 856, 85—90
Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual of Membrane
Lipids (Ed. R. Prasad), pp. 37—51, Springer, Heidelberg
Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J. (1991): Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and
tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 29, 827—832
Kunugi H., Takei N., Aoki H., Nauko S. (1997): Low serum cholesterol in suicide attempters. Biol. Psychiatry 41, 196—200
Langner M., Kubica K. (1999): The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids
101, 3—35
Lee A. G. (1978): Effects of charged drugs on the phase transition temperatures of phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 514, 95—104
Lee A. G. (2003): Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612, 1—40
Maekawa S., Iino S., Miyata S. (2003): Molecular characterization of the detergentinsoluble cholesterol-rich membrane microdomain (raft) of the central nervous system. Biochim. Biophys. Acta 1610, 261—270
Maes M., Delanghe J., Meltzer H. Y., Scharpé S., D’Hondt P., Cosyns P. (1994): Lower
degree of esterification of serum cholesterol in depression: relevance for depression
and suicide research. Acta Psychiatr. Scand. 90, 252—258
Mason R. P., Rhodes D. G., Herbette L. G. (1991): Reevaluating equilibrium and kinetic
parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction
with biological membranes. J. Med. Chem. 34, 869—877
Antidepressant-Membrane Interactions
179
McLaughlin S., Harary H. (1976): The hydrophobic adsorption of charged molecules to
bilayer membranes: a test of the applicability of the Stern equation. Biochemistry
15, 1941—1948
McLaughlin S. (1989): The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys.
Biophys. Chem. 18, 113—136
Miyazaki J., Hideg K., Marsh D. (1992): Interfacial ionization and partitioning of membrane-bound local anaesthetics. Biochim. Biophys. Acta 1103, 62—68
Moor M., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1988): Organspecific, qualitative changes in
the phospholipid composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 37, 2035—2039
Mouritsen O. G., Jørgensen K. (1995): Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid
bilayers and its influence on macroscopic membrane properties. Mol. Membr. Biol.
12, 15—20
Mueller P. S., Davis J. M., Bunney W. E. Jr., Weil-Malherbe H., Cardon P. V. Jr. (1970):
Plasma free fatty acids concentration in depressive illness. Arch. Gen. Psychiatry
22, 216—221
Mukherjee S., Maxfield F. R. (2000): Role of membrane organization and membrane domains in endocytic lipid trafficking. Traffic 1, 203—211
Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Lateral diffusion of small solutes and partition
of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 856,
283—289
Nakamura S. (1994): Effects of phospholipase A2 inhibitors on the antidepressant-induced
axonal regeneration of noradrenergic locus coeruleus neurons. Microsc. Res. Tech.
29, 204—210
New R. R. C. (1990): Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach. pp.
33—104, Oxford University Press
Ohvo-Rekilä H., Ramstedt B., Leppimäki P., Slotte J. P. (2002): Cholesterol interactions
with phospholipids in membranes. Prog. Lipid Res. 41, 66—97
Pauletti G. M., Wunderli-Allenspach H. (1994): Partition coefficients in vitro: artificial
membranes as a standardized distribution model. Eur. J. Pharm. Sci. 1, 273—282
Peet M., Murphy B., Shay J., Horrobin D. (1998): Depletion of omega-3 fatty acid levels
in red blood cell membranes of depressive patients. Biol. Psychiatry 43, 315—319
Penttinen J. (1995): Hypothesis: low serum cholesterol, suicide, and interleukin-2. Am. J.
Epidemiol. 141, 716—718
Pfrieger F. W. (2003): Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim.
Biophys. Acta 1610, 271—280
Reith M. E. A., Sershen H., Lajtha A. (1984): Binding of imipramine and cocaine to a
model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem.
Res. 9, 965—977
Rodrigues C., Gameiro P., Reis S., Lima J. L. F., Castro B. (2001): Derivative spectrophotometry as a tool for the determination of drug partition coefficients in
water/dimyristoyl-L-α-phosphatidylglycerol (DMPG) liposomes. Biophys. Chem.
94, 97—106
Rybakowski J. K., Lehmann W. (1994): Decreased activity of erythrocyte membrane
ATPases in depression and schizophrenia. Neuropsychobiology 30, 11—14
Sanganahalli B. G., Joshi P. G., Joshi N. B. (2000): Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics-a fluorescence spectroscopic study. Life
Sci. 68, 81—90
Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513
180
Fišar
Schreier S., Malheiros S. V. P., de Paula E. (2000): Surface active drugs: self-association
and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological
aspects. Biochim. Biophys. Acta 1508, 210—234
Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C. (1993): Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues
of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 32, 9714—9721
Seelig A., Blatter X. L., Frentzel A., Isenberg G. (2000): Phospholipid binding of synthetic
talin peptides provides evidence for an intrinsic membrane anchor of talin. J. Biol.
Chem. 275, 17954—17961
Sengupta N., Datta S. C., Sengupta D. (1981): Platelet and erythrocyte membrane lipid
and phospholipid patterns in different types of mental patients. Biochem. Med. 25,
267—275
Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992):
The importance of drug-membrane interaction in drug research and development.
Quant. Struct.-Act. Relat. 11, 205—210
Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity
(Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp.
Sikora J., Krulík R., Beitlová D., Příhoda P. (1990): Plasma levels of antidepressants after
their withdrawal. Endocrinol. Exp. 24, 221—227
Silvius J. R. (2003): Role of cholesterol in lipid raft formation: lessons from lipid model
systems. Biochim. Biophys. Acta 1610, 174—183
Srivastava L. K., Kazmi S. M., Blume A. J., Mishra R. K. (1987): Reconstitution of
affinity-purified dopamine D2 receptor binding activities by specific lipids. Biochim.
Biophys. Acta 900, 175—182
Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical
Applications (2nd ed.), Cambridge University Press
Stankowski S. (1991): Surface charging by large multivalent molecules. Extending the
standard Gouy-Chapman treatment. Biophys. J. 60, 341—351
Tieleman D. P., Marrink S. J., Berendsen H. J. C. (1997): A computer perspective of
membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys.
Acta 1331, 235—270
Vinokur V. A., Gubachev Iu. M. (1994): The effect of antidepressants on lipid metabolism
and the clinical course in IHD. Ter. Arkh. 66, 76—80 (in Russian)
Wagner H., Lissau A., Holzi J., Horammer L. (1962): The incorporation of 32 P into inositolphosphatides of the rat brain. J. Lipid Res. 3, 177—180
Wimley W. C., White S. H. (1993): Membrane partitioning: distinguishing bilayer effects
from the hydrophobic effect. Biochemistry 32, 6307—6312
Xia Z., Ying G., Hansson A. L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J. W.,
Nässberger L. (2000): Antidepressant-induced lipidosis with special reference to
tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 60, 501—512
Yang L., Glaser M. (1995): Membrane domains containing phosphatidylserine and substrate can be important for the activation of protein kinase C. Biochemistry 34,
1500—1506
Yeagle P. L. (1985): Cholesterol and the cell membrane. Biochim. Biophys. Acta 822,
267—287
Zachowski A., Durand P. (1988): Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths
with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 937, 411—416
Zimmer G. (1984): Fluidity of cell membranes in the presence of some drugs and inhibitors.
In: Membrane Fluidity (Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 169—203, Plenum
Publ. Corp.
Final version accepted: February 17, 2005
Příloha 3:
FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan.
Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol.
Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64.
Příloha 4:
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically
selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys.
2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 113—128
113
Effect of Pharmacologically Selective Antidepressants
on Serotonin Uptake in Rat Platelets
Z. Fišar, M. Anders and L. Kališová
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University,
Prague, Czech Republic
Abstract. We tested a hypothesis that a long-term administration of antidepressants acting through different primary biochemical mechanisms is associated with
changes in the platelet serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) transport. Laboratory rats were administered norepinephrine reuptake inhibitors (desipramine,
maprotiline), selective 5-HT reuptake inhibitor (citalopram), reversible monoamine
oxidase inhibitor (moclobemide), and lithium (inositol monophosphatase inhibitor
among others) during a 4-week period. Apparent kinetic parameters of platelet
5-HT transport were analyzed. Significant decrease in apparent Michaelis constant
(KM ) was found after the administration of all tested antidepressants except for
desipramine. There was certain increase in maximal velocity (Vmax ) values following the administration of desipramine, maprotiline, and citalopram; however, the
all Vmax changes were not significant. Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low extracellular concentrations of 5-HT was systematically increased in
all the tested drugs, but significant changes were occurred only in maprotiline- and
citalopram-treated rats. Adaptive changes in platelet 5-HT transport induced by
citalopram were opposite to the acute inhibitory effect of this drug on 5-HT transporter activity. An increase in limiting membrane permeability for 5-HT could be
included in the common adaptive effect of the long-term administration of antidepressants that differ in pharmacologic selectivity.
Key words: Antidepressant — Serotonin uptake — Platelets
Introduction
The mechanisms of antidepressants action that are linked to their therapeutic effects are not sufficiently explained. Though the primary biochemical effects of these
drugs are described very precisely, their therapeutic effects are associated with
adaptive cellular changes following their long-term (several weeks) administration.
Therefore it is difficult to decide, which cellular changes are actually responsible for
Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine,
Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic
E-mail: zfi[email protected]
114
Fišar et al.
therapeutic effects. Important group of antidepressants comprises of drugs primarily inhibiting reuptake of neurotransmitters from the synaptic cleft, particularly
serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) and/or norepinephrine (NE) reuptake inhibitors (Owens 2004). However, also drugs with different primary mechanisms
of action (monoamine oxidase inhibitors, 5-HT1A receptors agonists, 5-HT2 receptor or α2 -adrenoceptor antagonists, selective blockers of presynaptic dopamine
receptors, etc.) are effective in the treatment of affective disorders (Stahl 2000).
Moreover, mood disorders are classically treated with lithium, an ion whose mechanism of action is not fully understood. Lithium directly inhibits inositol phosphate
metabolism by inhibition of inositol monophosphatase and inhibits glycogen synthase kinase-3 (Harwood and Agam 2003); a number of other signal transduction
pathways are indirectly affected by lithium (Stahl 2000). There is general agreement that the clinical effect of antidepressants is caused by their ability to induce
adaptive changes of the monoaminergic neurotransmitter systems (Manji 1992;
Lachman and Papolos 1995; Duman et al. 1997; Duman 2002). Additional research
is necessary to determine final common pathway for different antidepressants in
specific brain regions.
There is evidence that pharmacologically selective antidepressants affect transmission mediated both by the targeted neurotransmitter and by the other neurotransmitters (Lucki and O’Leary 2004). Some early hypotheses of depression
proposed that there are interactions between the serotonergic and noradrenergic
systems (Caldecott-Hazard et al. 1991), or serotonergic and dopaminergic systems
(Bonhomme and Esposito 1998). However, interconnectivity between 5-HT system
and other neurotransmitter systems is not known sufficiently.
Based on findings of the presence of identical high affinity serotonin transporter (SERT) in the plasma membranes of neurons and platelets (Lesch et al.
1993) and on the similarities of platelets with 5-HT nerve terminals, particularly
for the mechanism for 5-HT uptake, storage and release as well as 5-HT2A receptor binding characteristics (Tuomisto et al. 1979; Stahl 1985; Murphy 1990; Maes
and Meltzer 1995), it is believed that platelet 5-HT uptake can be used to assess
brain serotonergic function. The SERT plays a pivotal role in maintaining of serotonergic function by regulation of the 5-HT level in the synaptic cleft (Haase et
al. 2001). This plasma membrane transport carrier is given a lot of attention in
5-HT hypotheses of affective disorders, because the primary biochemical effect of
some antidepressant drugs including today’s most commonly used antidepressants,
selective 5-HT reuptake inhibitors (SSRI), is SERT inhibition. The parameters of
kinetics of 5-HT platelet uptake are considered as relevant in reflecting changes in
the function of brain 5-HT system (Slotkin et al. 1986; Lesch et al. 1993; Bianchi et
al. 2002). There is considerable evidence that depression and suicide may be associated with alterations in platelet 5-HT parameters (Langer and Schoemaker 1988;
Mellerup and Langer 1990; Pandey et al. 1995; Franke et al. 2000), thus making
platelets a non-invasive model for study of the mechanism of action of antidepressants. In recent years, peripheral parameters of serotonergic transmission, such as
plasma and platelet 5-HT levels (Ortiz et al. 1988), have been used to examine the
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
115
mechanism of action of SSRIs and to predict the clinical response in depression
(Bakish et al. 1997; Bourdeaux et al. 1998; Alvarez et al. 1999a; Blardi et al. 2002;
Castrogiovanni et al. 2003; Maurer-Spurej et al. 2004).
In platelets, 5-HT is stored in dense-core granules (reserve pool) and shows a
slow turnover. In contrast, extracellular plasma 5-HT reveals a rapid turnover and
is pharmacologically active (Ortiz et al. 1988). Cationic amphiphilic drugs might
accumulate in platelets, inhibit their functions and liberate in part 5-HT (Turčáni
et al. 1982; Jančinová et al. 1996; Nosáľ and Jančinová 2002). It was demonstrated
that therapeutic concentrations of the SSRI as well as the selective NE reuptake
inhibitors decrease platelet and whole blood 5-HT concentrations (Alvarez et al.
1999b; Javors et al. 2000; Ashina et al. 2004). In contrast, 5-HT platelet content was
significantly increased following moclobemide treatment (Lestra et al. 1998). There
have been several review articles indicating that therapeutic effects of lithium can
be related to its enhancements of serotonergic brain function (Meltzer and Lowy
1987; Shiah and Yatham 2000; Pandey et al. 2003). However, there is conflicting
evidence with regard to the effect of lithium therapy on platelet 5-HT uptake.
Lithium-induced changes at the level of 5-HT uptake in platelets were not correlated
with concomitant variations in platelet 5-HT content (Glue et al. 1986; Poirier et
al. 1988; Artigas et al. 1989).
The binding parameters need not sufficiently reflect changes in function of
SERT because binding sites may be masked or reversible sequestered. Functional
parameters of SERT must be measured. 5-HT uptake is a saturable carrier-mediated endergonic transport process (active transport) obeyed simple Michaelis–
Menten kinetics with a maximal (limiting) velocity (Vmax ) and apparent Michaelis
constant (KM ) (defined as extracellular 5-HT concentration required for transport velocity equal to Vmax /2). The KM can be related to the reciprocal value of
affinity constant of binding site to the 5-HT. The uptake activity of SERT has
been suggested to be controlled through endogenous pathways, e.g. by phosphorylation/dephosphorylation and/or by trafficking to specific plasma membrane subdomains (Blakely et al. 1998; Ramamoorthy and Blakely 1999; Haase et al. 2001).
Effect of 5-HT reuptake inhibitors on SERT activity have been intensively studied; however, there is little known about the effect of long-term administration of
pharmacologically different antidepressants on adaptive changes in transmembrane
5-HT transport.
It is hypothesised that the SERT activity is poised on by cellular mechanisms
which are disturbed during depression and returned to the normal function following long-term antidepressant treatment. This mechanism may include the changes
both in the expression of SERT and in the state of actin cytoskeleton (Sakai et
al. 2000), cholesterol (Scanlon et al. 2001) and structure and composition of lipid
bilayers (Block and Edwards 1987; Sheridan and Block 1988).
For all of the above reasons, it is important to determine if antidepressants
that differ in pharmacologic selectivity produce a common in vivo effect on SERT
activity. The aim of the study was to determine how the long-term administration
of various antidepressants could affect active transmembrane transport of 5-HT in
116
Fišar et al.
platelets. To eliminate effects of depression on SERT activity and to avoid treatment of healthy human volunteer’s with antidepressants, we studied the effect of
long-term administration of selected antidepressants on the parameters of platelet
5-HT uptake in the blood of laboratory rats. The results were compared with acute
in vitro action of antidepressants on the platelet 5-HT uptake in untreated rats.
Potent nonselective NE reuptake inhibitor (desipramine), selective NE reuptake
inhibitor (maprotiline), SSRI (citalopram), reversible monoamine oxidase inhibitor
(moclobemide), and lithium were used in our study.
Materials and Methods
Chemicals and solutions
Water solutions of drugs were administered to rats: 2 mg/ml desipramine (SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA), 2 mg/ml maprotiline (Ciba Geigy Ltd., CH-4002
Basle, Switzerland), 1 mg/ml citalopram (H. Lundbeck A/S, DK-2500 CopenhagenValby, Denmark), 5 mg/ml moclobemide (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basle, Switzerland) and 10 mg/ml lithium carbonate (Sigma). Anticoagulant-citrate-dextrose
(ACD) solution (0.8 % citric acid, 2.2 % trisodium citrate, 2.4 % glucose, pH 4.3)
was used as anticoagulant. Platelets were incubated in modified Krebs–Ringer (KR)
bicarbonate physiologic solution without Ca2+ (118 mmol/l NaCl, 4.7 mmol/l KCl,
1.2 mmol/l KH2 PO4 , 1.2 mmol/l MgSO4 .7H2 O, 25 mmol/l NaHCO3 , 11.1 mmol/l
glucose; percolating with 95 % O2 and 5 % CO2 gas mixture was used during the
preparation to saturate solution with oxygen, pH 7.4). 8 µmol/l tritium-labelled
5-HT ([3 H]5-HT) solution with specific activity of approximately 25 kBq/ml was
prepared by mixing KR buffer with 1 mmol/l unlabelled (cold) 5-HT (5-hydroxytryptamine creatinine sulphate, Sigma) and [3 H]5-HT stock solution (specific activity of 500 to 1000 GBq/mmol, radioactive concentration 37 MBq/ml, radiochemical
purity by high performance liquid chromatography >97 %, Amersham Pharmacia
Biotech UK Ltd., England). In vitro effect of antidepressants on platelet 5-HT
transport was measured using 20 µmol/l stock solutions of desipramine, maprotiline, citalopram or moclobemide, and 4 mmol/l stock solution of LiCO3 (all in KR
solution).
Laboratory rats and blood collection
Specific pathogen-free Wistar strain of laboratory rats was used, total count of 49
males (19 in control group plus 5 groups by 6 animals) fed with standard diet under
defined conditions. Keeping and treatment of laboratory animals conformed to the
Declaration of Helsinki and was approved by the animal care committee of our Institution. Drugs were administered by gastric tube once a day for a total of 28 days.
Administered doses were set according to human daily doses, but recalculated, supposing about 60 times lower body surface area of a rat. The weight of the rats was
regularly monitored; initial weight was 180±20 g, final 329±27 g. The dosages were
adjusted continuously according to the actual weight of a rat so that the dose per
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
117
kilogram per day remained constant. Table 1 shows the dosages of administered
drugs. Control group of rats was administered by water. The last dose was administered one day before the rats were killed, which was done by exsanguinations
from aorta under thiopental anaesthesia using plastic syringe. Blood samples (6 ml)
were anticoagulated with ACD solution (1.5 ml), stirred and centrifuged in plastic
test tubes at 200 × g, 20 ◦C for 15 min. 2 ml of platelet rich plasma (PRP) was
transferred into a plastic container, platelets were counted under light microscope
and the PRP concentration was adjusted to 200 × 109 platelets/l with KR solution.
The 5-HT transport was assayed in intact platelets using modified Tuomisto et
al. (1979) and Meltzer et al. (1981) methods as described below. Analyses for the
5-HT uptake were performed within 3 h after blood collection.
Our blood sample withdrawal technique might be controversial; both thiopental anaesthesia and taking blood from aorta with a syringe may pre-activate platelets. Very light anaesthesia (during normal oxygen saturation) and taking blood
via plastic catheter (Van Den Berg et al. 1987; Kitamura et al. 2001; Dordoni et al.
2004) is recommended for these experiments. Although we did not proof whether
the sampling procedure activates platelets, we suppose that our technique can be
used to asses relative changes in platelet 5-HT transport induced by different antidepressants.
Dependence of platelet 5-HT transport on antidepressant concentration
After PRP from untreated rats (n = 4) was diluted, 0.2 ml of the sample (4 × 107
platelets) was mixed in plastic test tubes with KR solution and with 5 different antidepressant concentrations. The samples were preincubated at 37 ◦C for
60 min. The 5-HT uptake was started by addition of 0.5 ml [3 H]5-HT. The final sample volume was 4 ml (107 platelets/ml) and the final concentrations were:
1 µmol/l [3 H]5-HT; 0, 0.01, 0.1, 1, and 10 µmol/l of desipramine, maprotiline,
citalopram, or moclobemide; 0, 0.002, 0.02, 0.2, and 2 mmol/l of lithium. The
samples were incubated at 37 ◦C for 5 min, and reaction was terminated by rapid
filtration through glass microfiber filters GF/C type (Whatman) soaked previously
in 0.1 % polyethyleneimine (Sigma). Filters were washed rapidly 2 times with 3
ml of ice-cold saline. Filtration and washing were accomplished within 10 s. After
adding the scintillation cocktail, the filters were assayed on LS 6000IC scintillation counter (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA). The total uptake
of 5-HT is assumed to be the sum of the high affinity transport (specific uptake)
and the non-specific uptake, which was evaluated with 2 ◦C cold samples. Moreover, radiolabelled chemicals possess remarkable abilities to bind non-specifically
to both biological and non-biological substances (Bennett and Yamamura 1985),
e.g. to platelet surface or to filter. By subtracting the activity of filter that collected
sample incubated at 2 ◦C from the activity of filter that captured the same sample
incubated at 37 ◦C, the high affinity transport was determined. The samples were
measured in doublets.
118
Fišar et al.
Platelet 5-HT transport kinetics measurements
The technique employed in our study was method by analogy with receptor studies
(Bennett and Yamamura 1985). After PRP from controls or antidepressant-treated
rats was diluted, 0.2 ml of the sample (4 × 107 platelets) was mixed in plastic test
tubes with KR solution and preincubated at 37 ◦C for 12 min. The measurements
of platelet 5-HT uptake kinetics were initiated by adding 12 different [3 H]5-HT
volumes of 8 µmol/l [3 H]5-HT so that the resultant concentrations of [3 H]5-HT for
platelet uptake were in the range of 10 nmol/l and 1 µmol/l. The final volume of
the testing sample was 4 ml with platelet concentration of 107 per ml. After adding
labelled 5-HT the test tubes were filled with 95 % O2 and 5 % CO2 gas mixture,
sealed and incubated at 37 ◦C for 5 min. Free [3 H]5-HT was then removed by rapid
filtration as described above. The non-specific uptake and the non-specific binding
of [3 H]5-HT to platelet surface or to filter were determined from 2 ◦C cold samples
(see above). The samples at 37 ◦C were measured in doublets; the samples at 2 ◦C
were measured in singlets.
Data analysis
Inhibition of platelet 5-HT uptake by antidepressants was analysed using the fourparametric logistic model (Rodbard et al. 1976; ImmunoFit EIA/RIA software,
Beckman) to establish the values of drug concentration inhibiting 50 % of 5-HT
uptake (IC50 ). To calculate the parameters of kinetics of 5-HT platelet transport
(Vmax and KM ), we used AccuFit Saturation Two-Site nonlinear regression analysis
software (Beckman). Limiting permeability at low (physiological) 5-HT concentrations was calculated as Vmax /KM ratio (Franke et al. 2000). Vmax /KM corresponds
to second-order rate constant for transport mechanism multiplied by SERT molar concentration. Although we do not know SERT concentration, Vmax /KM can
be considered as efficiency criterion of transport system (apparent 5-HT uptake
efficiency).
Data are expressed as the arithmetic means. Standard deviation (SD) was
calculated to characterize group variability. Hypothesis testing was performed using analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Duncan test. Statistical
analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft, Inc.).
Results
Different acute in vitro effects of antidepressants on the 5-HT uptake are demonstrated on Figure 1. As was to be expected, the platelet in vitro treatment with
different antidepressant concentrations resulted in decrease of the 5-HT uptake for
citalopram (IC50 = 0.015 ± 0.002 µmol/l) > desipramine (IC50 = 0.191 ± 0.007
µmol/l) > maprotiline (IC50 = 3.48 ± 0.06 µmol/l), and no significant decrease
was observed for moclobemide and lithium.
The assessment of changes in the activity of platelet SERT following longterm administration of 5 pharmacologically selective antidepressants was based on
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
119
Figure 1. Dependence of 5-HT uptake on antidepressant concentration. Platelets from
untreated rats were used; the 5-HT uptake was related to the value in absence of the drug.
The final sample volume was 4 ml with platelet concentration of 107 per ml. The samples
were incubated with antidepressants at 37 ◦C for 60 min and the uptake was started by
the addition of 1 µmol/l [3 H]5-HT; following incubation at 37 ◦C for 5 min, the rapid
filtration was used to separate free radioligand. The samples were measured in doublets
and non-specific binding was deducted. The figure shows mean values of four repetitions
of the experiment ± SD. The 4-parameter logistic model was used for fitting data and
calculating results; the IC50 of 5-HT uptake was achieved at 0.015 µmol/l of citalopram,
0.191 µmol/l of desipramine or 3.48 µmol/l of maprotiline.
measurements of kinetic parameters of 5-HT uptake in rat platelets ex vivo. The
adaptive changes in transmembrane 5-HT transport were studied. Eventual direct
inhibitory effect of antidepressants on SERT function ex vivo was eliminated by the
decrease in free drug concentration (see Discussion) which was achieved both by
24-h wash-out period before blood collection and by dilution of PRP before 5-HT
uptake measurement (the final dilution of PRP by KR solution was about eighty
times); remaining concentrations of antidepressants (including citalopram) were
too low to affect platelet SERT activity. The results are summarized in Table 1.
A significant decrease in KM compared to control group values was discovered
following maprotiline (p = 0.024), citalopram (p = 0.0098), moclobemide (p =
0.026) and lithium (p = 0.0061) administration; administration of desipramine had
120
Fišar et al.
Table 1. Platelet 5-HT uptake in laboratory rats following 4-week administration of
various antidepressants
Group
Controls
Dose
Primary
(mg/kg
biochemical
per day)
effect
0
KM
Vmax
Vmax /KM
(nmol/l)
(pmol/min·107
(ml/min·107
platelets)
platelets)
68.0 ± 28.0
6.6 ± 3.5
0.110 ± 0.060
0.176 ± 0.094
Desipramine
10
NE reuptake
inhibitor
62.9 ± 14.0
10.3 ± 4.5
Maprotiline
10
selective NE
40.8 ± 5.7*
reuptake inhibitor
9.4 ± 3.2
0.227 ± 0.059**
Citalopram
5
selective 5-HT
36.1 ± 7.6**
reuptake inhibitor
9.0 ± 1.6
0.264 ± 0.082***
Moclobemide
25
reversible MAO-A 42.0 ± 6.0*
inhibitor
5.4 ± 1.2
0.131 ± 0.031
LiCO3
50
inositol monophos- 33.6 ± 4.5**
phatase inhibitor
and other effects
6.2 ± 1.1
0.187 ± 0.031
Values are means ± SD; the means were calculated from 19 values in case of control group
and from 6 values in all other groups. NE, norepinephrine; 5-HT, 5-hydroxytryptamine,
serotonin; MAO-A, monoamine oxidase type A; Vmax , maximal velocity of platelet 5-HT
uptake; KM , Michaelis constant; Vmax /KM , ratio representing limiting permeability at
low (physiological) extracellular concentrations of 5-HT. Values different from those of
control group are marked in case the difference is statistically significant: * p < 0.05,
** p < 0.01, *** p < 0.001; determined by ANOVA and post hoc Duncan test.
no significant influence on KM values. There was certain increase in Vmax values
following the administration of desipramine (p = 0.058), maprotiline (p = 0.14),
and citalopram (p = 0.17); however, the all Vmax changes were not significant.
Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low (i.e. physiological)
extracellular concentrations of 5-HT was calculated (Table 1). Although there was
systematic increase in the Vmax /KM ratio in all the tested drugs, significant changes
were occurred only in maprotiline- (p = 0.0054) and citalopram- (p = 0.00035)
treated rats.
Discussion
Our study is a contribution to the understanding of SERT role in the treatment of
depressive disorder. We measured both acute and long-term effects of pharmacologically selective antidepressants on the platelet 5-HT uptake. Experimental animals
were used because capacity of a drug to alter monoamine uptake in vitro does not
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
121
predict its potential to modulate monoamine transporters after administration in
vivo (Fleckenstein et al. 1999). Interpretation of our results is aggravated by the
facts that both the biochemical response of the rat after long-term administration
of antidepressants need not be equal to the response in man and the action of
antidepressants on disturbed neurotransmitter systems during depression can be
rather different from their action in normal physiological conditions. There are also
dissimilarities between platelets and neurons with respect to the turnover of 5-HT.
Nevertheless, we relied on the previous findings that platelets can be used as a
peripheral model of central serotonergic function.
Changes in platelet 5-HT transport produced by administration of antidepressants were determined by measurements of [3 H]5-HT uptake. Relative decrease in
the amounts of [3 H]5-HT entrapped into platelets was determined after in vitro
addition of drugs to platelets from untreated rats (Figure 1). Adaptive changes in
platelet 5-HT transport following long-term administration of antidepressants with
different pharmacological selectivity were determined in ex vivo experiment, when
platelet [3 H]5-HT uptake was measured at different [3 H]5-HT concentrations and
parameters KM and Vmax that characterize transport properties of the SERT were
calculated (Table 1). It is known, that the kinetic of 5-HT transport in platelets
is determined mostly by the properties of the SERT (Stahl and Meltzer 1978).
The density of SERT molecules in the cell membrane is not the only factor which
determines the Vmax ; e.g. storage granules which accumulate 5-HT very rapidly
(Costa et al. 1977) may be of importance for the overall 5-HT uptake. Moreover,
the capability to release the 5-HT after the transport has been completed was not
taken into consideration in our experiments. Therefore, the calculated KM and
Vmax reflect the net transport in intact platelets rather than true SERT activity.
Both density of SERT molecules in the plasma membrane and the endogenous
level of 5-HT in platelets could affect 5-HT transport. No significant relationship
between Vmax and platelet 5-HT content was found in previous study (Franke
et al. 2000); however, the existence of a functional relationship between platelet
5-HT content and apparent 5-HT uptake efficiency was established. An observed
changes in the values of Vmax constant (Table 1) corresponded with antidepressantinduced changes of the 5-HT platelet content as mentioned in the Introduction; i.e.
desipramine, maprotiline and citalopram decreased platelet 5-HT concentrations
(Alvarez et al. 1999b; Javors et al. 2000; Ashina et al. 2004) and increased Vmax ,
moclobemide increased platelet 5-HT concentrations (Lestra et al. 1998) and decreased Vmax , and lithium had no effect both on platelet 5-HT concentrations (Glue
et al. 1986; Poirier et al. 1988; Artigas et al. 1989) and Vmax . It seems that the
variation in Vmax induced by long-term administration of pharmacologically selective antidepressants could be accounted both for density of 5-HT uptake sites
(Maguire et al. 1993) and for platelet 5-HT levels. It can be hypothesised that both
SSRI and non-SSRI antidepressants may exhibit their effect on 5-HT transport by
increase in limiting permeability of membranes for 5-HT, which could be evoked
by lowering of the 5-HT concentration gradient across the platelet membrane. This
conclusion is rather speculative, because changes in Vmax observed in our study
122
Fišar et al.
were not statistically significant and we relied on previously published data about
the effect of antidepressants on platelet 5-HT concentrations.
The activity of SERT also depends on the modulation of substrate affinity
by several endogenous factors. A registered decrease in the values of KM constant
(Table 1) can be interpreted as an increase in the SERT affinity, which leads to
more effective clearance of extracellular 5-HT, resulting in its increased intrasynaptic availability and decreased extracellular 5-HT concentration, if serotonergic
synapse is inactive and SERT is not inhibited. Considering variable receptor affinity
hypothesis (Shinitzki 1984; Bevan et al. 1989), we suppose that effect of antidepressants on lipid-protein interactions (Seydel et al. 1992) could be responsible for
changes in KM . The finding of significantly reduced apparent KM is in opposition
to the general view that KM constant is not changed during pharmacotherapy of
depression.
Our results show that in spite of the 5-HT uptake inhibition observed in the
acute in vitro experiments with citalopram, desipramine, and maprotiline (Figure 1), enhancement of the SERT activity is indicated by the observed changes
in Vmax /KM ratio following the 4-week premedication with these drugs (Table 1).
This can be accounted for the fact that adaptive changes in 5-HT transport were
measured, which can be opposite to the acute effect of antidepressants on SERT
activity. The most marked difference between in vitro and ex vivo results was found
for citalopram.
Citalopram is the most selective and the most potent inhibitor of 5-HT reuptake. SSRI increase brain extracellular 5-HT concentrations in animals acutely
following administration (Fuller 1994). However, the clinical effects are delayed for
several weeks (Baumann 1992). This notion suggests the occurrence of adaptive
changes triggered by the sustained elevated 5-HT levels. These changes involve
desensitization of inhibitory 5-HT autoreceptors. The final increase in the overall
serotonergic neurotransmission has been hypothesized to underlie the therapeutic
effects of SSRIs (Blier and de Montigny 1994). The clinically effective plasma levels
of citalopram in humans range between 0.12–0.84 µmol/l (Baumann 1992). In rats,
similar plasma levels of citalopram were obtained at doses used in the present study
(Cremers et al. 2000a). Elimination of drugs is, in general, much faster in rodents
than in humans. Due to rapid drug elimination in rats, citalopram plasma levels
dropped below 1/7 of stable citalopram level after 24 wash-out period (Cremers et
al. 2000b) and extracellular levels of 5-HT in control and citalopram-treated rats
were similar (Moret and Briley 1996). In our ex vivo uptake experiments, we used 24
wash-out period and PRP was diluted about 80 times before measurement; final free
citalopram concentrations dropped below the threshold of the pharmacologically
active plasma concentrations (Cremers et al. 2000b). Therefore, we really measured
adaptive changes in platelet 5-HT transport evoked by long-term citalopram administration and direct effect of citalopram remaining in highly diluted PRP samples
can be ruled out. The same conclusion is valid also for desipramine, maprotiline,
moclobemide, and lithium-treated rats, because direct inhibitory effects of these
drugs on SERT activity are much less when compared with citalopram.
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
123
Baseline levels of 5-HT in dialysate samples obtained from different brain areas varied between 0.1 and 1.0 nmol/l (Bel and Artigas 1999; Eriksson et al. 1999;
Hjorth and Auerbach 1999) and uptake inhibitors cause about a 3- to 5-fold increase in extracellular 5-HT (Fuller 1994) so SERT is unsaturated at physiological
conditions (KM > 30 nmol/l), except for SERT in synaptic membrane immediately after 5-HT release. Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low
extracellular concentrations of 5-HT may be a proper parameter describing relative changes in total SERT activity. We found an increase in this ratio after a
long-term administration of all antidepressants used including lithium. Citalopram
and maprotiline induced the significant increase in Vmax /KM ratio while moclobemide showed the least effect (Table 1), which reflect potent effect of long-term
administration of both selective 5-HT and selective NE reuptake inhibitors on the
platelet 5-HT transport. The SERT is associated not only with synaptic membranes but also with axons (Zhou et al. 1998) so the increase in Vmax /KM may
also affect the extrasynaptic 5-HT transmission. Because desipramine (potent NE
reuptake inhibitor), citalopram (SSRI antidepressant), maprotiline (selective NE
reuptake inhibitor antidepressant), moclobemide (reversible monoamine oxidase
type A inhibitor antidepressant) and lithium (mood stabilizer with various effects
on signal transduction) had qualitatively the same effect on Vmax /KM values, it
can be assumed that this might be integral part of the adaptive changes in platelet
5-HT transport following long-term administration of pharmacologically selective
antidepressants. Whether this is significant in the mechanism of therapeutic action
of non-SSRI antidepressants it remains to be established.
Our results support 5-HT hypothesis of affective disorders, which is based on
the assumption that insufficient 5-HT activity is an important factor of vulnerability to depression and that one of the manifestation of long-term antidepressant
therapy is the increase in brain serotonergic activity (Meltzer and Lowy 1987;
Caldecott-Hazard et al. 1991; Siever et al. 1991; Charney and Delgado 1992; Stahl
1992, 1994; Maes and Meltzer 1995). This antidepressant-induced increase in 5-HT
activity is probably based both on desensitisations of inhibitory 5-HT autoreceptors
and on adaptive changes in transmembrane 5-HT transport. Changes in SERT affinity and transport velocity cannot fully manifest during the administration of SSRI,
because the transport is largely blocked and 5-HT concentration is increased in
extracellular space and reduced in cytoplasm. When final free SSRI concentrations
dropped below the threshold of the pharmacologically active plasma concentrations
(after a sufficient wash-out period or dilution), the combination of increased SERT
affinity and unchanged or increased transport velocity results in more complete
5-HT clearance from the extracellular space and in increased possibility of its reuse. From this point of view, the increases in extracellular 5-HT concentrations
during administration of SSRI could participate in induction of their therapeutic
effects, and increase in 5-HT transport after drug withdrawal could participate
in the maintenance of effects of pharmacotherapy. The increase in limiting permeability of the membrane for 5-HT could be included in the common adaptive
effect of the long-term administration of different antidepressants (both SSRI and
124
Fišar et al.
non-SSRI). If such 5-HT uptake changes occur in the brain, therapeutic effects of
desipramine, maprotiline, moclobemide or lithium might be partially due to action
on SERT function.
Acknowledgements. This work was supported by the GA UK 27/2000/C and MSM
111100001 grants.
References
Alvarez J. C., Gluck N., Fallet A., Gregoire A., Chevalier J. F., Advenier C., SpreuxVaroquaux O. (1999a): Plasma serotonin level after 1 day of fluoxetine treatment:
a biological predictor for antidepressant response? Psychopharmacology (Berl.)
143, 97—101
Alvarez J. C., Sanceaume M., Advenier C., Spreux-Varoquaux O. (1999b): Differential changes in brain and platelet 5-HT concentrations after steady-state achievement and repeated administration of antidepressant drugs in mice. Eur. Neuropsychopharmacol. 10, 31—36
Artigas F., Sarrias M. J., Martinez E., Gelpi E., Alvarez E., Udina C. (1989): Increased
plasma free serotonin but unchanged platelet serotonin in bipolar patients treated
chronically with lithium. Psychopharmacology (Berl.) 99, 328—332
Ashina S., Bendtsen L., Jensen R. (2004): Analgesic effect of amitriptyline in chronic
tension-type headache is not directly related to serotonin reuptake inhibition. Pain
108, 108—114
Bakish D., Cavazzoni P., Chudzik J., Ravindran A., Hrdina P. D. (1997): Effects of
selective serotonin reuptake inhibitors on platelet serotonin parameters in major
depressive disorder. Biol. Psychiatry 41, 184—190
Baumann P. (1992): Clinical pharmacokinetics of citalopram and other selective serotonergic reuptake inhibitors (SSRI). Int. Clin. Psychopharmacol. 6 (Suppl. 5), 13—20
Bel N., Artigas F. (1999): Modulation of the extracellular 5-hydroxytryptamine brain
concentrations by the serotonin and noradrenaline reuptake inhibitor, milnacipran.
Neuropsychopharmacology 21, 745—754
Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor
binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura,
S. J. Enna and M. J. Kuhar), pp. 61—89 (2nd ed.), Raven Press, New York
Bevan J. A., Bevan R. D., Shreeve S. M. (1989): Variable receptor affinity hypothesis.
FASEB J. 3, 1696—1704
Bianchi M., Moser C., Lazzarini C., Vecchiato E., Crespi F. (2002): Forced swimming test
and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich
plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets
mirrors neuronal 5-HT changes. Exp. Brain Res. 143, 191—197
Blakely R. D., Ramamoorthy S., Schroeter S., Qian Y., Apparsundaram S., Galli A.,
DeFelice L. J. (1998): Regulated phosphorylation and trafficking of antidepressantsensitive serotonin transporter proteins. Biol. Psychiatry 44, 169—178
Blardi P., De Lalla A., Leo A., Auteri A., Iapichino S., Di Muro A., Dell’Erba A., Castrogiovanni P. (2002): Serotonin and fluoxetine levels in plasma and platelets after
fluoxetine treatment in depressive patients. J. Clin. Psychopharmacol. 22, 131—
136
Blier P., de Montigny C. (1994): Current advances and trends in the treatment of depression. Trends Pharmacol. Sci. 15, 220—226
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
125
Block E. R., Edwards D. (1987): Effect of plasma membrane fluidity on serotonin transport
by endothelial cells. Am. J. Physiol. 253, C672—678
Bonhomme N., Esposito E. (1998): Involvement of serotonin and dopamine in the mechanism of action of novel antidepressant drugs: a review. J. Clin. Psychopharmacol.
18, 447—454
Bourdeaux R., Desor D., Lehr P. R., Younos C., Capolaghi B. (1998): Effects of fluoxetine
and norfluoxetine on 5-hydroxytryptamine metabolism in blood platelets and brain
after administration to rats. J. Pharm. Pharmacol. 50, 1387—1392
Caldecott-Hazard S., Morgan D. G., DeLeon-Jones F., Overstreet D. H., Janowsky D.
(1991): Clinical and biochemical aspects of depressive disorders: II. transmitter/receptor theories. Synapse 9, 251—301
Castrogiovanni P., Blardi P., De Lalla A., Dell’Erba A., Auteri A. (2003): Can serotonin
and fluoxetine levels in plasma and platelets predict clinical response in depression?
Psychopharmacol. Bull. 37, 102—108
Charney D. S., Delgado P. L. (1992): Current concepts of the role of serotonin function in
depression and anxiety. In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications (Eds. S. Z. Langer, N. Brunello, G. Racagni and
J. Mendlewicz), Vol. 1., pp. 89—104, Int. Acad. Biomed. Drug Res., Karger, Basel
Costa J. L., Silber S. A., Murphy D. L. (1977): Effects of reserpine and imipramine on
vesicular serotonin uptake and storage in intact human platelets. Life Sci. 21,
181—188
Cremers T. I. F., de Boer P., Liao Y., Bosker F. J., den Boer J. A., Westerink B. H.,
Wikström H. V. (2000a): Augmentation with a 5-HT1A , but not a 5-HT1B receptor
antagonist critically depends on the dose of citalopram. Eur. J. Pharmacol. 397,
63—74
Cremers T. I. F., Spoelstra E. N., de Boer P., Bosker F. J., Mørk A., den Boer J. A.,
Westerink B. H., Wikström H. V. (2000b): Desensitisation of 5-HT autoreceptors
upon pharmacokinetically monitored chronic treatment with citalopram. Eur. J.
Pharmacol. 397, 351—357
Dordoni P. L., Frassanito L., Bruno M. F., Proietti R., de Cristofaro R., Ciabattoni G.,
Ardito G., Crocchiolo R., Landolfi R., Rocca B. (2004): In vivo and in vitro effects
of different anaesthetics on platelet function. Br. J. Haematol. 125, 79—82
Duman R. S. (2002): Synaptic plasticity and mood disorders. Mol. Psychiatry 7 (Suppl.
1), S29—34
Duman R. S., Heninger G. R., Nestler E. J. (1997): A molecular and cellular theory of
depression. Arch. Gen. Psychiatry 54, 597—606
Eriksson E., Engberg G., Bing O., Nissbrandt H. (1999): Effects of mCPP on the extracellular concentrations of serotonin and dopamine in rat brain. Neuropsychopharmacology 20, 287—296
Fleckenstein A. E., Haughey H. M., Metzger R. R., Kokoshka J. M., Riddle E. L., Hanson
J. E., Gibb J. W., Hanson G. R. (1999): Differential effects of psychostimulants
and related agents on dopaminergic and serotonergic transporter function. Eur. J.
Pharmacol. 382, 45—49
Franke L., Schewe H.-J., Müller B., Campman V., Kitzrow W., Uebelhack R., Berghöfer
A., Müller-Oerlinghausen B. (2000): Serotonergic platelet variables in unmedicated
patients suffering from major depression and healthy subjects. Relationship between 5HT content and 5HT uptake. Life Sci. 67, 301—315
Fuller R. W. (1994): Uptake inhibitors increase extracellular serotonin concentration measured by brain microdialysis. Life Sci. 55, 163—167
Glue P. W., Cowen P. J., Nutt D. J., Kolakowska T., Grahame-Smith D. G. (1986): The
126
Fišar et al.
effect of lithium on 5-HT-mediated neuroendocrine responses and platelet 5-HT
receptors. Psychopharmacology (Berl.) 90, 398—402
Haase J., Killian A.-M., Magnani F., Williams C. (2001): Regulation of the serotonin
transporter by interacting proteins. Biochem. Soc. Trans. 29, 722—728
Harwood A. J., Agam G. (2003): Search for a common mechanism of mood stabilizers.
Biochem. Pharmacol. 66, 179—189
Hjorth S., Auerbach S. B. (1999): Autoreceptors remain functional after prolonged treatment with a serotonin reuptake inhibitor. Brain Res. 835, 224—228
Jančinová V., Májeková M., Nosáľ R., Petríková M. (1996): Inhibition of blood platelet
functions by cationic amphiphilic drugs in relation to their physico-chemical properties. Blood Coagul. Fibrinolysis 7, 191—193
Javors M. A., Houston J. P., Tekell J. L., Brannan S. K., Frazer A. (2000): Reduction of
platelet serotonin content in depressed patients treated with either paroxetine or
desipramine. Int. J. Neuropsychopharmacol. 3, 229—235
Kitamura R., Hirakata H., Okuda H., Sato M., Toda H., Nakamura K., Hatano Y., Urabe
N., Fukuda K. (2001): Thiopental enhances human platelet aggregation by increasing arachidonic acid release. Can. J. Physiol. Pharmacol. 79, 854—860
Lachman H. M., Papolos D. F. (1995): A molecular model for bipolar affective disorder.
Med. Hypotheses 45, 255—264
Langer S. Z., Schoemaker H. (1988): Effects of antidepressants on monoamine transporters. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 12, 193—216
Lesch K.-P., Wolozin B. L., Murphy D. L., Riederer P. J. (1993): Primary structure
of the human platelet serotonin uptake site – identity with the brain-serotonin
transporter. J. Neurochem. 60, 2319—2322
Lestra C., d’Amato T., Ghaemmaghami C., Perret-Liaudet A., Broyer M., Renaud B.,
Dalery J., Chamba G. (1998): Biological parameters in major depression: effects
of paroxetine, viloxazine, moclobemide, and electroconvulsive therapy. Relation to
early clinical outcome. Biol. Psychiatry 44, 274—280
Lucki I., O’Leary O. F. (2004): Distinguishing roles for norepinephrine and serotonin in
the behavioral effects of antidepressant drugs. J. Clin. Psychiatry 65 (Suppl. 4),
11—24
Maes M., Meltzer H. Y. (1995): The serotonin hypothesis of major depression. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress (Eds. F. E. Bloom and D.
J. Kupfer), pp. 933—944, Raven Press, New York
Maguire K., Tuckwell V., Pereira A., Dean B., Singh B. (1993): Significant correlation
between 14 C-5HT uptake by and 3 H-paroxetine binding to platelets from healthy
volunteers. Biol. Psychiatry 34, 356—360
Manji H. K. (1992): G proteins: implications for psychiatry. Am. J. Psychiatry 149, 746—
760
Maurer-Spurej E., Pittendreigh C., Solomons K. (2004): The influence of selective serotonin reuptake inhibitors on human platelet serotonin. Thromb. Haemost. 91,
119—128
Mellerup E., Langer S. Z. (1990): Validity of imipramine platelet binding-sites as a biological marker of endogenous-depression – A World Health-Organization-Collaborative
Study. Pharmacopsychiatry 23, 113—117
Meltzer H. Y., Lowy M. T. (1987): The serotonin hypothesis of depression. In: Psychopharmacology: The Third Generation of Progress. pp. 513—526, Raven Press, New York
Meltzer H. Y., Arora R. C., Baber R., Tricou B. J. (1981): Serotonin uptake in blood
platelets of psychiatric patients. Arch. Gen. Psychiatry 38, 1322—1326
Moret C., Briley M. (1996): Effects of acute and repeated administration of citalopram
on extracellular levels of serotonin in rat brain. Eur. J. Pharmacol. 295, 189—197
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
127
Murphy D. L. (1990): Peripheral indices of central serotonin function in humans. Ann. N.
Y. Acad. Sci. 600, 282—295
Nosáľ R, Jančinová V. (2002): Cationic amphiphilic drugs and platelet phospholipase A2
(cPLA2 ). Thromb. Res. 105, 339—345
Ortiz J., Artigas F., Gelpi E. (1988): Serotonergic status in human blood. Life Sci. 43,
983—990
Owens M. J. (2004): Selectivity of antidepressants: from the monoamine hypothesis of
depression to the SSRI revolution and beyond. J. Clin. Psychiatry 65 (Suppl. 4),
5—10
Pandey G. N., Pandey S. C., Dwivedi Y., Sharma R. P., Janicak P. G., Davis J. M. (1995):
Platelet serotonin-2A receptors: a potential biological marker for suicidal behavior.
Am. J. Psychiatry 152, 850—855
Pandey G. N., Pandey S. C., Ren X., Dwivedi Y., Janicak P. G. (2003): Serotonin receptors
in platelets of bipolar and schizoaffective patients: effect of lithium treatment.
Psychopharmacology (Berl.) 170, 115—123
Poirier M. F., Galzin A. M., Pimoule C., Schoemaker H., Le Quan Bui K. H., Meyer P.,
Gay C., Loo H., Langer S. Z. (1988): Short-term lithium administration to healthy
volunteers produces long-lasting pronounced changes in platelet serotonin uptake
but not imipramine binding. Psychopharmacology (Berl.) 94, 521—526
Ramamoorthy S., Blakely R. D. (1999): Phosphorylation and sequestration of serotonin
transporters differentially modulated by psychostimulants. Science 285, 763—766
Rodbard D., Lenox R. H., Wray H. L., Ramseth D. (1976): Statistical characterization of
the random errors in the radioimmunoassay dose-response variable. Clin. Chem.
22, 350—358
Sakai N., Kodama N., Ohmori S., Sasaki K., Saito N. (2000): Involvement of the actin
cytoskeleton in the regulation of serotonin transporter (SET) activity: possible
mechanism underlying SET regulation by protein kinase C. Neurochem. Int. 36,
567—579
Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513
Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992):
The importance of drug-membrane interaction in drug research and development.
Quant. Struct.-Act. Relat. 11, 205—210
Sheridan N. P., Block E. R. (1988): Serotonin transport and fluidity in plasma membrane
vesicles: effect of hyperoxia. Am. J. Physiol. 254, C781—787
Shiah I.-S., Yatham L. N. (2000): Serotonin in mania and in the mechanism of action of
mood stabilizers: a review of clinical studies. Bipolar Disord. 2, 77—92
Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity
(Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp., New York
Siever L. J., Kahn R. S., Lawlor B. A., Trestman R. L., Lawrence T. L., Coccaro E. F.
(1991): II. Critical issues in defining the role of serotonin in psychiatric disorders.
Pharmacol. Rev. 43, 509—525
Slotkin T. A., Whitmore W. L., Dew K. L., Kilts C. D. (1986): Uptake of serotonin into rat
platelets and synaptosomes: comparative structure-activity relationships, energetics and evaluation of the effects of acute and chronic nortriptyline administration.
Brain Res. Bull. 17, 67—73
Stahl S. M. (1985): Peripheral models for the study of neurotransmitter receptors in man.
Psychopharmacol. Bull. 21, 663—671
Stahl S. M. (1992): Serotonin receptors and the mechanism of action of antidepressant
drugs: postmortem, platelet, and neuroendocrine studies in depressed patients. In:
128
Fišar et al.
Serotonin IA Receptors in Depression and Anxiety (Eds. S. M. Stahl, M. Gastpar,
J. M. Keppel Hesselink and J. Traber), pp. 119—134, Raven Press, New York
Stahl S. M. (1994): 5HT1A receptors and pharmacotherapy. Is serotonin receptor downregulation linked to the mechanism of action of antidepressant drugs? Psychopharmacol. Bull. 30, 39—43
Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical
Applications. (2nd ed.), Cambridge University Press, Cambridge
Stahl S. M., Meltzer H. Y. (1978): A kinetic and pharmacologic analysis of 5-hydroxytryptamine transport by human platelets and platelet storage granules: comparison
with central serotonergic neurons. J. Pharmacol. Exp. Ther. 205, 118—132
Tuomisto J., Tukiainen E., Ahlfors U. G. (1979): Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with endogenous depression. Psychopharmacology 65, 141—147
Turčáni P., Nosáľ R., Turi-Nagy L. (1982): On the serotonin liberation from rat platelets
due to betaadrenoceptor blocking drugs. Thromb. Res. 28, 213—221
Van Den Berg E. K. Jr., Schmitz J. M., Benedict C. R., Prewitt J. B., Malloy C. R.,
Willerson J. T., Dehmer G. J. (1987): Plasma serotonin concentrations: validation
of a sampling technique using long catheters. Am. J. Med. Sci. 294, 324—327
Zhou F. C., Tao-Cheng J. H., Segu L., Patel T., Wang Y. (1998): Serotonin transporters
are located on the axons beyond the synaptic junctions: anatomical and functional
evidence. Brain Res. 805, 241—254
Final version accepted: January 25, 2005
Příloha 5:
FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora.
Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain
plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 221—236
221
Effect of Long-Term Administration of Antidepressants
on the Lipid Composition of Brain Plasma Membranes
Z. Fišar1 , M. Anders1 , E. Tvrzická2 and B. Staňková2
1
2
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine,
Charles University, Prague, Czech Republic
4th Medical Department, Clinical Department of Gastroenterology and Hepatology,
1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic
Abstract. The connection between changes in lipid pattern in brain plasma membranes and long-term administration of therapeutically effective doses of antidepressants has not been sufficiently demonstrated so far. Therefore, we analyzed
effect of antidepressants that differ in pharmacological selectivity on membrane
lipid composition in the rat brain tissue. Laboratory rats were given desipramine,
maprotiline, citalopram, moclobemide or lithium for a 4-week period. We observed
a significant decrease in phosphatidylethanolamine representation after administration of maprotiline, citalopram and moclobemide when compared with controls.
Membrane cholesterol content was decreased after desipramine administration and
increased after citalopram or lithium treatment. Electroneutral phospholipids were
decreased after the administration of all tested antidepressants except for desipramine. Decrease in phosphatidylserine was found following long-term administration of maprotiline or desipramine; relative representation of phosphatidylinositol was reduced after lithium treatment. Statistically significant negative correlation
between cholesterol and electroneutral phospholipids was discovered. Membrane
microviscosity evaluated by fluorescence anisotropy of membrane probes was only
slightly decreased after desipramine and increased after citalopram administration.
Hypothesis was supported that changes in brain neurotransmission produced by
antidepressants could be, at least partially, associated with adaptive changes in
membrane cholesterol and phospholipids.
Key words: Antidepressant — Phospholipid — Cholesterol — Plasma membrane
— Rat brain
Introduction
Antidepressants are known to realize their primary biochemical actions through
the binding to specific binding sites of neurotransmitter receptors, transporters
Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine,
Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic
E-mail: zfi[email protected]
222
Fišar et al.
or catabolizing enzymes. However, most of antidepressants belong to the cationic
amphiphilic drugs group and interact more or less specifically with lipid bilayer also
(Herbette et al. 1986; Seydel et al. 1994; Fišar et al. 2004). It results in changes
of rotational and lateral diffusion, ordering and mutual interactions of membrane
molecules, which can influence transmembrane signal transduction and play a part
in effects of antidepressants. There is insufficient knowledge as regards the extent
in which the accumulation of antidepressants in lipid part of brain cell membranes
contributes to their therapeutic or adverse effects.
Phosphatidylcholine (PC), sphingomyelin (SM) and phosphatidylethanolamine (PE) are the most abundant lipids in the biological membranes; however, acidic
phospholipids, such as phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycerol, phosphatidic acid and gangliosides, play a key role in direct activation of various enzymatic and receptor systems (Tsakiris and Deliconstantinos 1984; Rando 1988; Sandermann and Duncan 1991; Lee 2003). The role of
cholesterol consist both in direct action on the function of some membrane proteins (Scanlon et al. 2001; Fielding and Fielding 2003; Pfrieger 2003) and in regulation of the membrane structure, lateral organization, free volume distribution
and “fluidity” (Shinitzky 1984; Burger et al. 2000; Barenholz 2002). Cholesterol is
most likely associated with PCs and SMs in the membranes (Ohvo-Rekilä et al.
2002).
A lot of abnormalities related to lipid homeostasis were described in depression
(Maes et al. 1997; Kato et al. 1998); however, little is known about ability of antidepressants to induce alterations in the brain membrane phospholipid turnover at
therapeutic drug concentrations. Phospholipid methylation in synaptic membranes
or in vivo phospholipid administration can possibly influence receptor adaptation to
chronic administration of antidepressants (Sulser et al. 1983; Racagni and Brunello
1984). Several papers reported that tricyclic antidepressants had a stimulatory effect on PS synthesis in cell cultures (Singh et al. 1992; Bobeszko et al. 2002);
however, this effect was significant at relatively high drug concentrations. Many
antidepressants, including tricyclic antidepressants and selective serotonin reuptake inhibitors, may induce excessive intracellular accumulation of different phospholipids (generalized phospholipidosis, phospholipid storage disorder) in cultured
cells or in several organs of experimental animals. However, drug concentrations
far from therapeutical plasma levels were used in these experiments (Honegger et
al. 1983; Lüllmann-Rauch and Nassberger 1983; Stoffel et al. 1987; Xia et al. 2000).
Organspecific changes in the phospholipid composition were observed in rats after the long-term administration of therapeutical doses of the desipramine, but no
changes were found in whole brain (Moor et al. 1988). Changes in anisotropies
of the superficial membrane layers and in lipid composition (PC/PE ratios) were
observed following exposure of cultured human fibroblasts to high desipramine concentrations (Toplak et al. 1990). The synthesis of PI was inhibited in vitro by a
great number of antidepressants; however, pharmacological significance of this inhibitory action is doubtful due to very high concentration of the drugs required (Li
et al. 1988).
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
223
More data were reported on action of prophylactic drug lithium on membrane
lipids. Data suggest that lithium exert both multiple effects on signal transduction
and neuroprotective effects (Jope 1999; Manji et al. 1999). Lithium at therapeutic
concentrations has been shown to have a strong inhibitory effect on arachidonic acid
specific phospholipase A2 (PLA2 ) in the rat brain in vivo, i.e. it reduces turnover of
the major n-6 polyunsaturated fatty acids in several brain phospholipids (Chang
and Jones 1998). Brief chronic lithium administration to rats led to the subtle
depressing the biosynthesis of PI as well as PE in the brain (Navidi et al. 1991).
Likewise, lithium treatment induced small decreases (by several percent) in PS and
PI brain levels (Pettegrew et al. 2001); it should be noted that even small changes
in the quantity of these key membrane phospholipids could influence the function of
many membrane proteins. No significant changes on the cholesterol/phospholipid
ratio were observed in the synaptosomal plasma membranes after chronic administration of lithium (Lopez-Corcuera et al. 1988). Clinically relevant concentrations
of lithium have been reported to affect membrane molecular dynamics both on the
erythrocyte membrane surface (Pettegrew et al. 1987) and on the synaptosomal
plasma membrane (Lopez-Corcuera et al. 1988).
Though the primary biochemical effects of antidepressants are described very
precisely, their therapeutic effects are associated with adaptive cellular changes
following their long-term (2–4 weeks) administration (Stahl 2000). All antidepressants have a common action on monoamine neurotransmission, leading to changes
in gene expression in the neurons targeted by monoamine neurotransmitters. We
suppose that this includes not only desensitization of neurotransmitter receptors
but also regulation of the composition of brain lipids. The aim of our experiments
was to determine how the long-term administration of various antidepressants affects the lipid composition of plasma membranes in rat brain. We decided to study
the effect of five widely used antidepressants, desipramine (potent nonselective
norepinephrine reuptake inhibitor), maprotiline (selective norepinephrine reuptake
inhibitor), citalopram (selective serotonin reuptake inhibitor), moclobemide (reversible monoamine oxidase inhibitor), and lithium (mood stabilizer with various
effects on signal transduction).
Materials and Methods
Chemicals and solutions
Water solutions of following concentrations of antidepressants were administered
to rats: 2 mg/ml desipramine (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 2 mg/ml
maprotiline (Ciba Geigy Ltd., CH-4002 Basle, Switzerland), 1 mg/ml citalopram
(H. Lundbeck A/S, DK-2500 Copenhagen-Valby, Denmark), 5 mg/ml moclobemide
(F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basle, Switzerland) and 10 mg/ml lithium carbonate
(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). Sucrose buffer (0.32 mol/l sucrose, 10
mmol/l Tris HCl, 1 mmol/l MgCl2 , pH 7.4) with protease inhibitors (0.5 mmol/l
phenylmethanesulfonyl fluoride, 0.5 mmol/l benzamidine HCl, 1 mmol/l EDTA,
224
Fišar et al.
2 mmol/l dithiothreitol) was used as grinding medium. Buffer was prepared one
day in advance, it’s pH was adjusted and following the filtration through 0.45 µm
filter, it was stored at 4 ◦C. Dichloromethane/methanol (2 : 1, v/v) containing 0.25 %
HCl (conc.) was used as an extraction mixture to remove lipids from membranes.
Buffer A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7.4) and
the membrane probes 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA) and 1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene
(TMA-DPH; Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402, USA) were used for the
measurement of relative changes of plasma membrane microviscosity. DPH was
dissolved in 6 mmol/l acetone solution, TMA-DPH in 3 mmol/l methanol solution,
and these stock solutions were stored in a freezer. Fresh 6 µmol/l solutions of probes
in buffer A were prepared for every measurement.
Laboratory rats
Specific pathogen-free Wistar strain of laboratory rats was used, total count of 45
males (15 in control group plus 5 groups by 6 animals) fed with standard diet under
defined conditions (room temperature 22 ◦C, relative humidity 65 %, lighting 12
h/day). Keeping and treatment of laboratory animals conformed to the Declaration
of Helsinki and was approved by the animal care committee of our Institution.
Desipramine, maprotiline, citalopram, moclobemide and lithium carbonate were
given with gastric tube once daily in doses of 10, 10, 5, 25 and 50 mg/kg per day,
respectively, for the period of 4 weeks (period sufficient for realization of adaptive
cellular changes related to therapeutic action of antidepressants). Administered
doses were set according to human daily doses (75–150 mg/day for desipramine or
maprotiline, 20–60 mg/day for citalopram, 100–400 mg/day for moclobemide, and
600–900 mg/day for lithium), but recalculated, supposing about 60 times lower
body surface area of a rat. The weight of the rats was regularly monitored; initial
weight was 180 ± 20 g, final 329 ± 27 g. The dosages were adjusted continuously
according to the actual weight of a rat so that the dose per kg per day remained
constant. The control group of rats was given water. The last dose was given one day
before the rats were killed, which was done by exsanguinations from aorta under
thiopental (Spofa, Czech Republic) anaesthesia. The whole brains were removed
and immediately processed as described below.
Isolation of plasma membranes
Plasma membranes were isolated according to the method of Scott et al. (1993)
with our modification. Briefly, after the weight was checked, whole brain was cut
into pieces and placed in ice-cold sucrose buffer with protease inhibitors. Fine
homogenization of the brain tissue was made in a glass homogenizer with teflon
piston. Homogenate was replenished with grinding medium to 6 ml and centrifuged
at 280 × g for 10 min at 4 ◦C. Supernatant was attentively removed so that 1/3 of
total volume was left down to avoid stirring up of pellet. Supernatant was stored in
an ice-cold bath. Pellet was re-suspended in 5 ml of the sucrose buffer with protease
inhibitors, centrifuged at 280×g for 10 min at 4 ◦C, and supernatant was attentively
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
225
removed. Both supernatants were put together and centrifuged at 20,000 × g for 20
min at 4 ◦C. Supernatant was decanted and pellet was homogenized using UltraTurrax (Janke & Kunkel, IKA Werk) with 5 ml of icy distilled water. Sample was
centrifuged at 5000 × g for 20 min at 4 ◦C. Supernatant was stored, pellet was again
turraxed with 5 ml of icy distilled water and sample was centrifuged (5000 × g, 20
min, 4 ◦C). Supernatants were put together and centrifuged (50,000 × g, 20 min,
4 ◦C). Pellet was re-suspended in 1 ml of buffer A and sample was rapidly frozen
and stored at −50 ◦C.
Enrichment of the samples with plasma membranes was monitored during their
isolation by determining ecto-5 -nucleotidase activity (Mitchell and Hawthorne
1965). Enrichment of samples by plasma membranes was about threefold when
compared with crude membrane fraction of the brain homogenate. Protein concentrations were measured by Lowry method (Lowry et al. 1951). Lipidic phosphorus
was assessed by Bartlett method (Bartlett 1959) following sample combustion with
perchloric acid (60 min, 180 ◦C).
Isolation of membrane lipids
Modified Folch et al. (1957), Koul and Prasad (1996) methods were used to isolate membrane lipids. Briefly, samples were homogenized in Ultra-Turrax and centrifuged for 10 min at 20,000 × g. Supernatant was discarded and pellet was diluted
in dichloromethane/methanol mixture (2 : 1, v/v, acidified by 0.25 % HCl), which
volume was 20 times the original pellet volume. Test tubes content was gently
stirred in dry bath at room temperature for 15–30 min under nitrogen atmosphere.
Denatured proteins were removed by filtration through a mull and the filtrate (approximately 5 ml) was transferred into a calibrated test tube, circa 1 ml (20 volume
percent) of water was added and the mixture was stirred. Phases were separated by
5-min centrifugation at 1000 × g. Top layer was carefully disposed off and the pure
bottom layer containing most of lipids was transferred into labelled pre-weighted
vial and evaporated under nitrogen. The vial was then weighted again and stored
in freezer under nitrogen atmosphere.
Membrane lipid analysis
Membrane lipids were analyzed by two-dimensional thin-layer chromatography
(TLC) on glass plates. Epicoprostanol (30 percentage by weight) was added to
sample as internal standard for determination of cholesterol using gas chromatography. The samples in chloroform/methanol (2 : 1, v/v) solvent were spotted (40
µl, 10 mg/ml) on TLC plates and allowed to develop for 1 h and 20 min in the
first dimension (chloroform/methanol/ammonium hydroxide/water, 70 : 25 : 4 : 1,
v/v/v/v) and then for 1 h and 30 min in the second dimension (chloroform/methanol/acetone/acetic acid/water, 70 : 12.5 : 17.5 : 10 : 4.5, v/v/v/v/v). Lipids were visualized by exposing the plates to iodine vapours; fractions were scraped off for
phosphorus (Bartlett 1959) and cholesterol assessment (Tvrzická et al. 1991).
226
Fišar et al.
Method of fluorescent probes
Relative changes in membrane fluidity were assessed by the method of fluorescent probes with membrane probes DPH and TMA-DPH (Prendergast et al. 1981;
Plášek and Jarolím 1987; Lakowicz 1999). Fresh 6 µmol/l DPH or TMA-DPH solution in buffer A was mixed with aliquots of buffer A and membrane suspension, so
that the resultant concentration of fluorescent probe was 2 µmol/l, and the phospholipid concentration was about 100 µmol/l. Following 60 min incubation at 37 ◦C,
the fluorescence polarization was measured on SLM 4800 spectrofluorometer using
an excitation wavelength of 360 nm and an emission wavelength of > 405 nm. The
fluorescence anisotropy was then calculated; increase in fluorescence anisotropy can
be interpreted as an increase in the extent of probe movement restriction in the
anisotropic membrane environment.
Data analysis
Data are expressed as the arithmetic means. Standard deviation (S.D.) was calculated to characterize group variability. Hypothesis testing was performed using
analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Duncan’s multiple range test.
Spearman R (nonparametric alternative to the Pearson product-moment correlation coefficient) was used to quantify relation between two quantitative parameters.
Normality of distribution has been verified by the Shapiro–Wilk’s W test. Statistical analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft Inc.,
Tulsa, USA).
Results
Male Wistar rats were dosed for four weeks with desipramine, maprotiline, citalopram, moclobemide and lithium (5 groups by 6 animals) and compared with control
group (n = 15). During the course of experiment, the weight of the rats was regularly monitored in order to calculate antidepressant dosage and to determine its
influence on the weight of laboratory rats. The final body weight (329 ± 27 g,
n = 45) did not differ between all groups except for maprotiline (343 ± 17 g)
and moclobemide (308 ± 30 g, p = 0.047) treated rats. The relative weight gain
(85 ± 20 % of initial body weight, n = 45) was found significantly increased after
citalopram (100 ± 15 %, p = 0.0056) or lithium (98 ± 12 %, p = 0.0078) treatment
when compared to controls (69 ± 7 %).
Both the whole brain weight (1.91 ± 0.16 g, n = 45) and the relative brain
weight (0.593 ± 0.047 %, n = 45, related to final body weight) did not differ significantly between all groups.
Lipid composition of plasma membranes in a rat brain
Total lipid (TL) was determined by weighing dried lipid extract, total phospholipid (PL) weight was determined from the phosphorus content in lipid extract,
and cholesterol (CH) was measured by gas chromatography. We did not find statistically significant changes in ratios of these parameters (Fig. 1). The mean ratios
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
227
Figure 1. Ratios of weight to weight concentrations of total lipids (TL), total phospholipids (PL) and cholesterol (CH) in rat plasma membranes following 4-week administration
of antidepressants. Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values
in case of control group and from 6 values in all other groups. Values after antidepressant
treatment are not significantly different from controls; determined by ANOVA and post
hoc Duncan’s test.
(weight/weight) in the control group were found PL/TL = 0.68 ± 0.12, CH/TL
= 0.22 ± 0.06, and CH/PL = 0.34 ± 0.12. A decrease both in PL/TL (by 16 %)
and CH/TL (by 20 %) ratios were found after the treatment with maprotiline. The
CH/PL ratio was decreased by 20 % after desipramine administration. The increase
both in CH/TL (by 24 %) and CH/PL (by 16 %) ratios were observed after lithium
administration also.
To interpret the changes in the relative representation of individual lipids in
brain plasma membranes due to administration of antidepressants, we used the
sum of CH+PL molar concentrations as the 100 % value (Table 1). Low values
of relative representation of PE, which was observed in all groups, are caused by
a method used in the isolation of membrane lipids, i.e. by acidification of ini-
0.017
0.011
0.003 *
0.005 *
0.005 *
0.020
0.075
0.076
0.065
0.061
0.068
0.063
±
±
±
±
±
±
0.016
0.024
0.020
0.014
0.010
0.010
SM
0.044
0.038
0.036
0.041
0.039
0.033
±
±
±
±
±
±
PI
0.012
0.012
0.011
0.006
0.014
0.011
0.043
0.033
0.025
0.047
0.048
0.040
±
±
±
±
±
±
PS
0.018
0.018
0.012
0.017
0.021
0.009
0.369
0.331
0.373
0.402
0.374
0.419
±
±
±
±
±
±
0.102
0.101
0.056
0.078
0.108
0.098
CH
Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups.
PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; SM, sphingomyelin; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine; CH,
cholesterol; PL, total phospholipids. Sum of (CH+PL) molar concentrations was used as the 100 % value. Low values of relative
representation of PE are caused by a method used in the isolation of membrane lipids. Marked values are significantly different from
controls at * p < 0.05; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
0.042
0.036
0.024
0.024
0.024
0.031
±
±
±
±
±
±
0.057
0.055
0.038
0.026
0.026
0.032
±
±
±
±
±
±
Controls
Desipramine
Maprotiline
Citalopram
Moclobemide
Lithium
0.208
0.202
0.167
0.181
0.186
0.166
PE
PC
Group
Table 1. Relative representation of molar concentrations of individual phospholipids or cholesterol in plasma membranes isolated
from the brain of laboratory rats following 4-week administration of various antidepressants (in relation to total molar concentration
of phospholipids and cholesterol)
228
Fišar et al.
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
229
tial dichloromethane/methanol mixture. We observed a significant decrease in PE
representation after administration of maprotiline, citalopram and moclobemide
compared to control group. No statistically significant changes were found both in
other phospholipids and in cholesterol representation although it seemed that there
was a decrease in PC, PE and SM after the administration of all tested antidepressants except for desipramine. PS was nonsignificantly decreased after maprotiline
and desipramine, PI was decreased after lithium treatment. Cholesterol representation was decreased after desipramine and increased after citalopram or lithium
administration compared to controls.
Other ratios of molar concentrations of membrane lipids were calculated to
discover a relation between CH, PC, PE, SM, PI and PS. Data had shown no significant decrease in SM/PC ratio after citalopram administration (0.333 ± 0.036,
n = 6) in comparison with controls (0.375 ± 0.075, n = 15, p = 0.348). Statistically significant increase was found in ratio of main electroneutral phospholipids
(PC+PE+SM) and sum of individual phospholipids molar concentrations (SUM
= PC+PE+SM+PI+PS) after treatment with desipramine (0.820 ± 0.048, n = 6,
p = 0.036) or maprotiline (0.814 ± 0.037, n = 6, p = 0.05) in comparison with
citalopram administration (0.749 ± 0.058, n = 6). It is exactly the opposite for
(PI+PS)/SUM ratio (Fig. 2). It seems that representation of PS is responsible for
this effect because statistically significant decrease was found in ratio of PS/SUM
after treatment with desipramine (0.082 ± 0.040, n = 6, p = 0.038) or maprotiline
(0.080 ± 0.032, n = 6, p = 0.034) in comparison with citalopram administration
(0.135 ± 0.048, n = 6).
Plasma membranes microviscosity
The results for DPH and TMA-DPH probes in membranes isolated from the brain
are shown in Table 2. There were no significant changes in fluorescence anisotropy
of DPH or TMA-DPH after antidepressant administration in comparison with controls. Relatively most change in fluorescence anisotropy of DPH was observed after the desipramine administration (decrease by 1.5 %). Statistically significant increase in fluorescence anisotropy of DPH was found after treatment with citalopram
in comparison with desipramine administration (p = 0.018) and in fluorescence
anisotropy of TMA-DPH after treatment with citalopram (p = 0.011) or moclobemide (p = 0.046) compared with desipramine.
Mutual relations between variables
Mutual relations between variables given in Table 1 were tested by means of a
correlation coefficients matrix (Table 3). Spearman correlations that were calculated from 45 cases consist of controls plus antidepressants administered rats. In
accordance with what had been expected, a significant positive correlation between
the relative representations of individual phospholipids and their sum was found.
A significant negative correlation between the relative representation of CH and
electroneutral phospholipids (PC, PE, and SM) was discovered. Correlations between CH and acidic phospholipids (PS, PI) were negative but statistically no
230
Fišar et al.
Figure 2. Relative representation of molar concentrations of main electroneutral phospholipids (PC+PE+SM), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), and PI+PS,
respectively, in plasma membranes isolated from rat’s brains following 4-week administration of various antidepressants (in relation to sum of individual phospholipids molar
concentrations; SUM = PC+PE+SM+PI+PS). Values are means ± S.D. The means were
calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups.
Marked values are significantly different from citalopram-treated rats at * p < 0.05; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
significant. Fluorescence anisotropy both in DPH and TMA-DPH probe did not
correlate with other variables due to very small changes in this parameter after antidepressant administration; there was only a significant mutual relation between
DPH and TMA-DPH fluorescence anisotropy characterized by correlation coefficient R = 0.782 (p < 0.0001).
Discussion
Our study is a contribution to the understanding the role of membrane lipids in the
treatment of depressive disorder. Disturbances in the lipid metabolism in depression
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
231
Table 2. Fluorescence anisotropy of DPH and TMA-DPH in plasma membranes isolated
from rat’s brains following 4-week administration of various antidepressants
Group
DPH
Controls
Desipramine
Maprotiline
Citalopram
Moclobemide
Lithium
0.2074
0.2043
0.2055
0.2090
0.2079
0.2054
±
±
±
±
±
±
TMA-DPH
0.0036
0.0020
0.0017
0.0038 *
0.0025
0.0016
0.2547
0.2529
0.2540
0.2570
0.2560
0.2534
±
±
±
±
±
±
0.0023
0.0025
0.0022
0.0031 *
0.0019 *
0.0021
Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups. DPH, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene;
TMA-DPH, 1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene. Values after antidepressant treatment are not significantly different from controls. Marked values are
significantly different from desipramine-treated rats at * p < 0.05; determined by ANOVA
and post hoc Duncan’s test.
Table 3. Relation between relative representation of molar concentrations of phospholipids and cholesterol in brain plasma membranes (Table 1) determined as correlation
coefficients (Spearman R)
PE
PC
PE
SM
PI
PS
PI+PS
SUM
0.523***
1.000
SM
0.701***
0.548***
1.000
PI
0.520***
0.297*
0.457**
1.000
PS
0.455**
0.302*
0.245
0.434**
1.000
PI+PS
SUM
0.569***
0.401**
0.386**
0.829***
0.841***
1.000
0.921***
0.623***
0.783***
0.632***
0.603***
0.722***
1.000
CH
−0.719***
−0.315*
−0.404**
−0.230
−0.276
−0.270
−0.573***
Spearman correlations between each pair of variables were calculated from 45 cases
(controls plus antidepressants administered rats). PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; SM, sphingomyelin; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine; SUM, sum of individual phospholipid molar concentrations (PC+PE+SM+PI+PS);
CH, cholesterol. Marked correlations are significant at * p < 0.05, ** p < 0.01 or ***
p < 0.001.
and restoration of balance by antidepressants are supposed by many hypotheses
of affective disorders. However, the connection between changes in lipid pattern in
brain plasma membranes and long-term administration of therapeutically effective
doses of antidepressants has not been sufficiently demonstrated so far.
In this study, hypothesis was tested that the changes in the lipid composition of
plasma membranes from brain could be included in the common adaptive effect of
long-term administration of antidepressants. We investigated the effects of five an-
232
Fišar et al.
tidepressants (that differ in primary pharmacological selectivity) on the cholesterol
and phospholipid composition and “microviscosity” of brain membranes. Antidepressants were given to laboratory rats for the period of 28 days, which is sufficient
for realization of adaptive cellular changes owing to drugs. Changes in the length
and saturation of acyl chains of membrane phospholipids were not measured in our
study and interpretation of results is aggravated by the facts that the biochemical
response of the rat after long-term administration of antidepressants need not be
equal to the response in man.
Plasma membranes isolated from the whole brain of experimental animals were
analyzed. Unfortunately, there is no single procedure that results in the quantitative recovery of all membrane lipids, so the absolute values of ratios determined can
be shifted. We acidified the initial dichloromethane/methanol mixture for the recovery of acidic phospholipids, but the acidity leads to cleavage of PE plasmalogen.
We did not solve this problem because the aim of our study was the determination of relative changes in lipid composition in membrane lipids after long-term
administration of antidepressants and because lipids were extracted by the same
technique for all groups. The results summarized in Table 1 and Fig. 2 showed that
long-term administration of antidepressants had influence on lipid composition of
cell membranes in the brain. However, the variability of individual results, as reflected by S.D., is rather high, which limits the statistical significance. The reason
for the high variability is not known, as both non-normally distribution of values
and dietary or seasonal variations can be ruled out in our study.
We have demonstrated that treatment with antidepressants evidently influenced the composition of lipid classes in the brain plasma membranes. Maprotiline, citalopram and moclobemide significantly decreased PE representation when
compared to control group (Table 1). Although it is known that some antidepressants stimulate PS synthesis (Singh et al. 1992; Bobeszko et al. 2002) we did not
observe any significant increase in PS in the brain plasma membranes (Table 1).
Statistically significant decrease in ratio PS to sum of individual phospholipids
was found after treatment with desipramine or maprotiline when compared with
citalopram-treated group (Fig. 2).
The decrease in relative representation of electroneutral phospholipids was
found systematically decreased after administration of all tested antidepressants
except for desipramine; reduction of the conversion of PS to PE by amphiphilic
cationic antidepressants (Kanfer and McCartney 1993) could participate in this
effect.
No statistically significant but apparent decrease in cholesterol representation
in brain membranes after long-term administration of desipramine and the increase
in cholesterol after citalopram or lithium (Table 1) may be of great importance,
as cholesterol strongly affects the properties of lipid bilayer and function of some
membrane transporters, including serotonin transporter (Scanlon et al. 2001).
Based on these findings, we can assume that the effects of lithium and antidepressants differing in pharmacological selectivity could be related partly to
the changes of cholesterol and phospholipids content in cell membranes and hence
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
233
resulting changes in the membrane proteins (e.g. serotonin or norepinephrine receptors and transporters) function. This cell membrane impact may be brain specific
due to the fact that the concentration of antidepressants in the brain significantly
exceeds their concentration in the periphery (Fišar et al. 1996). The opposite effects
of desipramine administration in comparison with citalopram or with other tested
antidepressants could be related to a nonspecificity of desipramine biochemical
action.
Method of fluorescent probes with hydrophobic DPH and amphiphilic TMADPH membrane probes was used to determine relative changes in structural and
physicochemical properties of specific membrane regions following long-term administration of various antidepressants. The rotational flexibility of DPH or TMADPH within the membrane expressed as steady-state fluorescence anisotropy gives
information on the surrounding of the lipid environment of the probes (Lentz
1993). TMA-DPH showed fluorescence anisotropy values that were significantly
higher with respect to DPH, suggesting a localization of the fluorescent portion of
TMA-DPH in a more ordered region of membrane. Surprisingly, DPH and TMADPH fluorescence anisotropy measurements in plasma membranes isolated from
the brain did not show any marked changes when compared to controls except for
desipramine effect (Table 2).
Decrease in the fluorescence anisotropy after the desipramine administration
was observed in usage of both DPH and TMA-DPH probe. It emerges from in vitro
experiments (Sanganahalli et al. 2000) that predominant cause of the desipramine
effect on membrane dynamic is not direct influence of drug on membrane structure. This result can be interpreted as a change in membrane dynamic properties
both in the hydrophobic core of the membrane, where the DPH probe is localized (Kaiser and London 1998), and in the membrane/water interface, which is the
target of TMA-DPH probe (Prendergast et al. 1981). Fluorescence anisotropy of
both DPH and TMA-DPH was slightly increased after citalopram administration
(Table 2). This increase was statistically significant when compared to desipramine
administration, which could be related to the opposite effect of drugs on membrane cholesterol and/or phospholipids (Table 1). However, the increase in relative
cholesterol content after lithium administration (Table 1) was not expressed in the
expected increase in fluorescence anisotropy. Our results do not clearly indicate the
reason for this fact.
Overall, the changes in steady-state fluorescence anisotropy of DPH or TMADPH produced by antidepressants cannot be assessed as very distinct. Accordingly,
there are no substantial changes in dynamic properties of brain plasma membranes.
However, both the time-resolved fluorescence spectroscopy and fatty acid analysis is
required for detailed study of the effect of long-term treatment with antidepressants
on membrane dynamic properties.
Long-term administration of antidepressants has rather small effect on relative representation of cholesterol and individual phospholipids in brain plasma
membrane; the structure and dynamic properties of the brain plasma membrane
does not show significant impairment compared to controls. Possible changes in cell
234
Fišar et al.
membranes fluidity could be considered as non-specific signs of a depressive disorder
even in the case they were registered during the administration of antidepressants.
We found in previous experiments that the increase in limiting permeability of
the platelet membranes for serotonin could be included in the common adaptive
effect of the long-term administration of antidepressants that differ in pharmacological selectivity (Fišar et al. 2005). Our results indicate that increased activity
of serotonin transporter is caused rather by changes in cholesterol-transporter or
phospholipid-transporter interactions, then by changes in membrane microviscosity.
It is difficult to interpret relation between changes in the composition brain
lipids and therapeutic effects of antidepressants, because membrane lipids affect
great number of cellular processes resulting in very different physiological effects.
Nevertheless, our results support hypothesis about the role of adaptive changes
of membrane cholesterol and phospholipids in mechanisms of action of antidepressants.
Acknowledgements. This work was supported by GA UK No. 27/2000/C and MSM
111100001 grants.
References
Barenholz Y. (2002): Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane
evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 41, 1—5
Bartlett, G. R., 1959. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234,
466—468
Bobeszko M., Czajkowski R., Wójcik M., Sabala P., Lei L., Nalepa I., Barańska J. (2002):
Modulation by cationic amphiphilic drugs of serine base-exchange, phosholipase D
and intracellular calcium homeostasis in glioma C6 cells. Pol. J. Pharmacol. 54,
483—493
Burger K., Gimpl G., Fahrenholz F. (2000): Regulation of receptor function by cholesterol.
Cell. Mol. Life Sci. 57, 1577—1592
Chang M. C., Jones C. R. (1998): Chronic lithium treatment decreases brain phospholipase
A2 activity. Neurochem. Res. 23, 887—892
Fielding C. J., Fielding P. E. (2003): Relationship between cholesterol trafficking and
signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 1610, 219—228
Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J. (1996): Imipramine distribution among red
blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 15, 51—64
Fišar Z., Fuksová K., Velenovská M. (2004): Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 23, 77—99
Fišar Z., Anders M., Kališová L. (2005): Effect pharmacologically selective antidepressants
on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 24, 113—128
Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and
purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509
Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules
in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94
Honegger U. E., Roscher A. A., Wiesmann U. N. (1983): Evidence for lysosomotropic
action of desipramine in cultured human fibroblasts. J. Pharmacol. Exp. Ther.
225, 436—441
Jope R. S. (1999): Anti-bipolar therapy: mechanism of action of lithium. Mol. Psychiatry
4, 117—128
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
235
Kaiser R. D., London E. (1998): Location of diphenylhexatriene (DPH) and its derivatives within membranes: comparison of different fluorescence quenching analyses
of membrane depth. Biochemistry 37, 8180—8190
Kanfer J. N., McCartney D. G. (1993): Modulation of the serine base exchange enzyme
activity of rat brain membranes by amphiphilic cations and amphiphilic anions. J.
Neurochem. 60, 1228—1235
Kato T., Inubushi T., Kato N. (1998): Magnetic resonance spectroscopy in affective disorders. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 10, 133—147
Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual on Membrane
Lipids. pp. 37—51, Springer, Heidelberg
Lakowicz J. R. (1999): Principles of Fluorescence Spectroscopy (2nd ed.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York
Lee A. G. (2003): Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612, 1—40
Lentz B. R. (1993): Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions
within liposome bilayers. Chem. Phys. Lipids 64, 99—116
Li P. P., Warsh J. J., Stanacev N. Z. (1988): In vitro and ex vivo effects of antidepressants on rat brain membrane-bound phosphatidylinositol synthetase activity.
Neurochem. Res. 13, 789—795
Lopez-Corcuera B., Gimenez C., Aragon C. (1988): Change of synaptic membrane lipid
composition and fluidity by chronic administration of lithium. Biochim. Biophys.
Acta 939, 467—475
Lowry O. H., Rosbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. (1951): Protein measurement
with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265—275
Lüllmann-Rauch R., Nassberger L. (1983): Citalopram-induced generalized lipidosis in
rats. Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh.) 52, 161—167
Maes M., Smith R., Christophe A., Vandoolaeghe E., Van Gastel A., Neels H., Demedts P.,
Wauters A., Meltzer H. Y. (1997): Lower serum high-density lipoprotein cholesterol
(HDL-C) in major depression and in depressed men with serious suicidal attempts:
relationship with immune-inflammatory markers. Acta Psychiatr. Scand. 95, 212—
221
Manji H. K., Moore G. J., Chen G. (1999): Lithium at 50: have the neuroprotective effects
of this unique cation been overlooked? Biol. Psychiatry 46, 929—940
Mitchell R. H., Hawthorne J. N. (1965): The site of diphosphoinositide synthesis in rat
liver. Biochem. biophys. Res. Commun. 21, 333—338
Moor M., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1988): Organspecific, qualitative changes in
the phospholipids composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 37, 2035—2039
Navidi M., Yoa F. G., Sun G. Y. (1991): Brief chronic effects of lithium administration
on rat brain phosphoinositides and phospholipids. J. Neurosci. Res. 28, 428—433
Ohvo-Rekilä H., Ramstedt B., Leppimäki P., Slotte J. P. (2002): Cholesterol interactions
with phospholipids in membranes. Prog. Lipid Res. 41, 66—97
Pettegrew J. W., Short J. W., Woessner R. D., Strychor S., McKeag D. W., Armstrong J.,
Minshew N. J., Rush A. J. (1987): The effect of lithium on the membrane molecular
dynamics of normal human erythrocytes. Biol. Psychiatry 22, 857—871
Pettegrew J. W., Panchalingam K., McClure R. J., Gershon S., Muenz L. R., Levine J.
(2001): Effects of chronic lithium administration on rat brain phosphatidylinositol
cycle constituents, membrane phospholipids and amino acids. Bipolar Disord. 3,
189—201
Pfrieger F. W. (2003): Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim.
Biophys. Acta 1610, 271—280
Plášek J., Jarolím P. (1987): Interaction of the fluorescent probe 1,6-diphenyl-1,3,5hexatriene with biomembranes. Gen. Physiol. Biophys. 6, 425—437
236
Fišar et al.
Prendergast F. G., Haugland R. P., Callahan P. J. (1981): 1-[4-(trimethyamino)phenyl]6-phenylhexa-1,3,5-triene: synthesis, fluorescence properties, and use as a fluorescence probe of lipid bilayers. Biochemistry 20, 7333—7338
Racagni G., Brunello N. (1984): Transynaptic mechanisms in the action of antidepressant
drugs. Trends Pharmacol. Sci. 5, 527—531
Rando R. R. (1988): Regulation of protein kinase-C activity by lipids. FASEB J. 2, 2348—
2355
Sandermann H., Duncan T. M. (1991): Lipid-dependent membrane enzymes – kinetic
modeling of the activation of protein-kinase-C by phosphatidylserine. Biochim.
Biophys. Acta 1069, 235—240
Sanganahalli B. G., Joshi P. G., Joshi N. B. (2000): Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics – a fluorescence spectroscopic study. Life
Sci. 68, 81—90
Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513
Scott L., Schell M. J., Hubbard A. L. (1993): I. Isolation and analysis. In: Methods in
Molecular Biology (Eds. J. M. Graham and J. A. Higgins), Biomembrane Protocols,
Vol. 19, Humana Press, Totowa, New Jersey
Seydel J. K., Coats E. A., Cordes H. P., Wiese M. (1994): Drug membrane interaction
and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and
resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 327, 601—610
Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity
(Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp., New York
Singh I. N., Massarelli R., Kanfer J. N. (1992): Modulation of phosphatidylserine homeostasis by amphiphilic cations in a human neuronal cell line, LA-N-2. J. Lipid
Mediat. 5, 301—311
Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical
Applications (2nd ed.), Cambridge University Press, Cambridge
Stoffel P., Burkart T., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1987): Subcellular distribution of the antidepressant drug desipramine in cultured human fibroblasts after
chronic administration. Drug-effect on the subcellular distribution of accumulated
phospholipids. Biochem. Pharmacol. 36, 655—662
Sulser F., Janowsky A. J., Okada F., Manier D. H., Mobley P. L. (1983): Regulation
of recognition and action function of the norepinephrine (NE) receptor-coupled
adenylate cyclase system in brain: implications for the therapy of depression. Neuropharmacology 22, 425—431
Toplak H., Zuehlke R., Loidl S., Hermetter A., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1990):
Single and multiple desipramine exposures of cultured cells. Changes in cellular
anisotropy and in lipid composition of whole cells and of plasma membranes.
Biochem. Pharmacol. 39, 1437—1443
Tsakiris S., Deliconstantinos G. (1984): Influence of phosphatidylserine on (Na+ /K+ )stimulated ATPase and acetylcholinesterase activities of dog brain synaptosomal
plasma-membranes. Biochem. J. 220, 301—307
Tvrzická E., Mareš P., Písaříková A., Novakovic J., Hrabák P. (1991): Simplified gas
chromatographic method for the simultaneous determination of phytosterols and
cholesterol. J. Chromatogr. 563, 188—192
Xia Z., Ying G., Hansson A. L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J. W.,
Nässberger L. (2000): Antidepressant-induced lipidosis with special reference to
tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 60, 501—512
Final version accepted: January 25, 2005
Příloha 6:
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ,
Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in
depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173.
Příloha 7:
KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ, Zdeněk and
VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of
depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print].
Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression
Kališová – Stárková Lucie, Fišar Zdeněk, Paclt Ivo, Hanuš Zdeněk, Vevera Jan
Department of Psychiatry, First Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 128
01, Prague 2, Czech Republic
Tel.: +420-224965313 fax: +420-224923077
E-mail address: [email protected]
Short title: Erythrocyte L-T3 uptake as parameter of depression
Summary
We tested the hypothesis considering the role of hypothalamic-pituitary-thyroid axis
(HPT), L-triiodothyronine (L-T3) uptake into erythrocytes, and the role of the membrane
lipids in the development and treatment of affective disorders. Changes in kinetic parameters
(Vmax, maximal velocity and KM, apparent Michaelis constant) of L-T3 uptake into red blood
cells (RBCs) and changes in membrane fluidity in a group of 24 patients with major
depression before treatment and after 1 month of treatment with citalopram were measured.
Parameters Vmax and KM, as well as membrane microviscosity, were significantly increased in
depressed patients both before and after treatment in comparison with healthy subjects. We
concluded that the function of the membrane transporter for L-T3 in RBC is changed in
depression. This change is probably connected with the alteration of membrane fluidity and/or
transporter–lipid interactions. We did not find any normalization of the measured parameters
after 1 month of treatment. Results show the importance of composition and physical
properties of lipid bilayer in transmembrane transport of L-T3 and support the hypothesis of
HPT axis disturbance in depression.
Keywords: Depression; Erythrocyte; Fluidity; Triiodothyronine; Uptake
2
Introduction
The aetiology of affective disorders has not yet been sufficiently clarified. One of the
possible factors influencing the development of mood disorders might be a modified function
of hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. Numerous researches focusing on patients who
suffer from affective disorders, repeatedly confirmed aberrations of the HPT axis function
(Joffe et al.1993, Sullivan et al. 1997). In thyrotropin releasing factor (TRF) tests
approximately 30% of clinically euthyroid depressive patients showed e.g. an altered response
of thyroid stimulating hormone (TSH) to TRF, transient hyperthyroxinemia in serum and a
flattening of the TSH diurnal rhythm. In some cases there was also a lowered transthyretin
level in the cerebrospinal fluid, an increased level of antibodies against thyroid peroxidase
and other responses (Bauer and Whybrow 2001, Kirkegaard et al. 1998, Loosen 1988, Pop et
al.1998, Styra et al. 1991). All the presented parameters seem to be “state markers” since after
a patient is cured of depression the parameters tend to return to normal levels. The basic cause
of the changes, however, is not quite clear.
There is evidence that the mediator-system function is affected by the membrane transfer.
The changes in the cell membranes may then reflect the changes on the system level. The
present scientific knowledge suggests that erythrocytes, though they are not the target cells for
the thyroid hormones, can participate in their transport (Crispell et al. 1956, Angel et al. 1990,
Yamauchi et al. 1989). Thyroxine (T4) enters the red blood cells (RBC) by free diffusion
(Galton et al. 1996); L-T3 permeates through the erythrocyte membrane by facilitated
diffusion, via the Na+ independent stereo-specific saturable transport system (Holm and
Jacquemin 1979, Docter et al. 1982, Osty et al. 1990). Red blood cells seem to function as a
reservoir pool of the hormone (Osty et al. 1988, 1990).
3
The function of membrane transport systems - velocity and efficiency of the L-T3 uptake
into the erythrocytes - can be evaluated by two kinetic parameters: Vmax - maximal transport
velocity into the cells, reflecting the existence of the saturable amount of membrane
transporters; and KM - apparent Michaelis constant, defined as extracellular concentration of
the transported substance, when the transport velocity into the cell equals ½ Vmax. The KM
value is close to the value of dissociation binding constant of transporter–L-T3 complex, and
KM is also the affinity criterion between the transporter and substrate.
The activity of the membrane transporters can be equally influenced by the properties of
the lipid membrane component, mainly by the composition, structure and ordering of the lipid
bilayer. The membrane microviscosity (reciprocal value of fluidity) is the parameter which
characterizes rotational motility and average ordering of membrane molecules; the changes of
the microviscosity can be qualitatively determined by means of measurement of fluorescence
anisotropy of an hydrophobic fluorescence probe. The parameter concerned serves to express
relative changes of the membrane dynamic properties caused by alteration of membrane lipid
composition or by physical or chemical factors (including effects of psychotropic drugs).
An important modulator of microviscosity is the proportion of membrane phospholipids
and cholesterol, presence of unsaturated fatty acids side chains in membrane lipids, and the
amount of oligosaccharides in membrane glycolipids and glycoproteins. 1,6-Diphenyl-1,3,5hexatriene (DPH) is the hydrophobic fluorescence probe most frequently used to study
changes in the lipid bilayer microviscosity. Membrane microviscosity is a factor affecting
both the lateral and transversal motion of membrane proteins (receptors, ion channels,
enzymes, transporters). Specific changes in their function can be caused by the lipid – protein
interactions. Special attention is paid to the role of cholesterol and acidic phospholipids
(phosphatidylserine and phosphatidylinositol) in the activation of membrane components of
signal transduction systems. As far as the L-T3 transporter in erythrocyte membranes is
4
concerned, the dependence of their L-T3 binding parameters on phospholipid membrane
composition has been described by a previous author (Samson et al. 1996).
Our experiments used RBCs isolated from peripheral human blood. Radiolabelled L-T3
uptake into erythrocytes was measured by the method we had modified, and the kinetic
parameters were measured before treatment, and after one month of treatment with citalopram
(an antidepressant functioning primarily as a selective serotonin reuptake inhibitor).
Consequently, the results were compared with the healthy controls. As the activity of the LT3 transporter can be affected by the properties of the lipid part of the cell membrane, plasma
membranes (ghosts) were isolated from erythrocytes, and using the fluorescence probe,
changes in their lipid bilayer fluidity were identified. We tried to determine to what extent
depression and administration of citalopram could affect the L-T3 uptake into erythrocytes,
and whether there exists a correlation between the membrane changes that have been
mentioned, L-T3 uptake parameters, and clinical evaluation. These results evoked discussion
of the hypothesis considering the role of HPT axis, L-T3 uptake into erythrocytes, and the
role of the membrane lipids in development and treatment of the affective disorders.
In our project we sought to verify the following assumptions: 1. The L-triiodothyronine
membrane transport of the depressive patients differs from that of the healthy controls, and
reflects the changes on the system level; 2. The membrane transport system function is
influenced by the change of membrane fluidity; 3. By taking antidepressants, the depressive
patients’ parameters return to normal levels.
Methods
Patients and the clinical evaluation of depression
5
Twenty-four people suffering from major depression participated in the project (diagnoses
F 32.0-F 32.3.; F 33.1-F33.2 according to ICD 10; major depressive disorder single episode or
recurrent mild, moderate or severe – DSM IV). In this group (mean age ± S.D. = 37 ± 13
years, range: 19-60 years) there were 12 females (mean age ± S.D. = 39 ± 10) and 12 males
(mean age ± S.D. = 36 ± 15). None of them, at the time of their joining the project, had been
taking any antidepressants for at least five months. The majority of them were diagnosed as
suffering from depression for the first time; 20 of them were ‘drug naive’. The patients were
clinically evaluated on the base of a structured interview regarding valid diagnostic criteria
with the psychiatrist at Psychiatric Clinic Prague, who made diagnose of major depression.
Patients were then assessed using the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD) (Hamilton
1960) and with the Beck Self-Assessment Depression Rating Scale (BECK) (Beck et al.
1974). All the participants were comprehensively informed about the project, consented to the
conditions and provided written consent. Between 8:00 and 10:00 am, after the clinical checkup, we took 7 ml of blood from them to examine free thyroxine (fT4) and TSH levels and 4
ml of non-coagulable blood to measure the kinetic parameters of L-T3 uptake into
erythrocytes and for the subsequent measurement of membrane fluidity in the ghosts. The
study included clinically euthyroid persons only; none of them had ever been treated with any
HPT axis affecting medication. The standard values fall into interval 9.8 – 23.1 pmol/l for fT4
and 0.500 – 6.00 mIU/l for TSH. After the clinical check-up and the initial sampling, all the
depressive patients were medicated with citalopram (Seropram, Citalec) at a dose of 20 – 60
mg/day. One month later (28-31 days) all the patients were clinically assessed with the
HAMD and BECK and 4 ml of blood was taken for measurement of kinetic parameters of LT3 uptake and for measurement of erythrocyte ghosts’ membrane fluidity. In the course of the
second evaluation and sampling five people were withdrawn from the project, as they no
6
longer fulfilled the criteria of the study (for example they had changed antidepressant, had
discontinued the drug, were unable to attend the clinic at the planned time; etc.).
The control group consisted of people of corresponding age and the same nutritional status,
who had not been treated either for psychiatric disorders or for thyroid gland dysfunction.
There were 19 subjects in the control group, all of whom were screened during interviews
with a psychiatrist for the presence of depressive symptoms. None of controls fulfilled the
criteria for major depression. A 4 ml sample of blood was taken from the controls for
measurement of the L-T3 erythrocyte uptake kinetic parameters, and subsequent measurement
of the erythrocyte ghosts’ membrane fluidity.
Chemicals and solutions
800 nM [125I] L-T3 solution with specific activity 16 kBq/ml was prepared by mixing of
buffer T (125 mM NaCl, 20 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM glucose, 4.05 mM Na2HPO4,
0.95 mM NaH2PO4; before use effervesced with 95% O2 and 5% CO2, pH 7) with unlabelled
(cold) L-T3 (Sigma) solution and [125I]L-T3 stock solution (specific activity of 114 MBq/µg,
Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., England). Samples were filtered through the glass
microfiber filters (Whatman, type GF/C), which were impregnated in 0.1% polyethyleneimine
(Sigma) and filters were washed with buffer A (120 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM Tris, 10
µM L-T3, pH 7.4). The hydrophobic membrane probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH,
Sigma) was used for the measurement of relative changes of plasma membrane fluidity.
Erythrocyte L-T3 uptake
Non-coagulable blood sample was mixed thoroughly and gently centrifuged in plastic test
tubes; then the platelet rich plasma was taken away together with the upper layer of sediment,
7
the RBCs pellet was washed three times with cold buffer T. The RBC triiodothyronine uptake
was measured using modified Osty et al. (1990) and Moreau et al. (1998, 2000) methods.
Briefly, RBCs in buffer T were preincubated at 37°C for 12 minutes and the reaction was
started by addition of various volumes of 800 nM [125I] L-T3 solution. The final volume of
the sample for the uptake measurement was 2 ml with concentration of the cells 108 RBC/ml
and the final L-T3 concentrations were in the range of 4 nM and 240 nM. The test tubes were
filled with 95% O2 and 5% CO2 gas mixture, sealed and incubated at 37°C for 15 min. It was
verified that even after the time concerned the increase of the L-T3 uptake into the cells is
approximately linear (Fig. 1). Free and non-specifically bound L-T3 was removed by rapid
filtration through the GF/C filters and the filters were measured on scintillation counter LS
6000IC (Beckman). Non-saturable L-T3 uptake (passive transport) was determined by
measurement of the samples incubated in 2°C.
Erythrocyte ghosts fluidity
Plasma membranes from RBCs (ghosts) were isolated using the technique reported by
Dodge et al. (1963). The ghosts were re-suspended in 1.5 ml of buffer, 10 µl were taken out
for measuring phosphorus (Bartlett 1959, Wagner et al. 1962) and the sample was frozen.
Membrane fluidity was measured using method of fluorescence probes (Lakowicz 1999). The
resultant DPH concentration was 2 µM, and the concentration of phospholipids was
approximately 100 µM. Fluorescence anisotropy was measured on the spectrofluorometer
FluoroMax-3 (Jobin Yvon, Horiba) after the 60 minutes incubation at 37°C.
Data analysis
8
Erythrocyte L-T3 uptake is a passive saturable carrier-mediated transport process
(facilitated diffusion) obeying simple Michaelis-Menten kinetics with an apparent Michaelis
constant KM and maximal velocity Vmax. For calculation of the required kinetic parameters we
used nonlinear regression analysis - the AccuFit Saturation Two-Site software (Beckman).
Limiting permeability at low (physiological) L-T3 concentrations was calculated as Vmax/KM
ratio. Vmax/KM is an efficiency criterion of the transport system.
Statistical Analysis
All the values are presented as mean ± standard deviation (S.D.), or ± 95% confidence
interval (CONF95). Wilcoxon matched pairs test was used to compare the responses from the
depressed patients before and after treatment with citalopram. The Mann-Whitney U test was
used to compare the responses from the controls and from the depressed patients both before
and after treatment with citalopram. Spearman R was used to quantify relation between two
quantitative parameters; pairwise deletion of missing data in correlation matrix was used.
Normality of distribution has been verified by the Chi-square test of goodness of fit and by
the Kolmogorov-Smirnov one sample test. Application of t-tests and Pearson correlation
coefficient results in very similar statistics as nonparametric methods mentioned above.
Results
Clinical assesment and parameters of erythrocyte L-T3 uptake were determined in 24
depressive patients before the beginning of the treatment and in 19 of them after 1 month of
pharmacotherapy with citalopram taken at a daily dose 20-60 mg. Following one month
9
treatment with citalopram the depressive patients showed a significant decrease in BECK
(p=0.00013) and HAMD (p = 0.00013) score (Table 1). The depressive patients before
treatment showed significantly enhanced kinetic parameters of RBC L-T3 uptake in
comparison with the controls (Table 2) both for KM (p=0.026) and Vmax (p=0.0077). After
one-month treatment with citalopram the values of uptake parameters remained significantly
increased compared to the control values (p=0.0090 for KM; p=0.015 for Vmax). We detected
no statistically significant change of the measured parameters after one-month treatment in
comparison with the values before the beginning of citalopram administration both for KM
(p=0.63) and Vmax (p=0.65). When the data from the females and males were processed
separately, the results remained qualitatively unchanged.
From the values KM and Vmax the limiting permeability was calculated (Vmax/KM) at low
(physiological) L-T3 concentrations (Table 2). Compared to the controls, there were no
significant changes of this parameter either in depression before the treatment (p = 0.54), or
after the treatment with citalopram (p = 0.34). The relatively greatest, although statistically no
significant, change of Vmax/KM appeared in comparison of values before and after the
treatment (p = 0.21).
Fluorescence anisotropy of DPH (rDPH) in ghosts of depressive patients before the
treatment was found statistically significantly increased compared to the controls (p = 0.030;
Table 2). After one-month of treatment with citalopram only a slight decrease in this
parameter was observed (p = 0.11).
Mutual relations between the measured parameters were tested by means of correlation
coefficients matrix (Table 3). A significant correlation between the clinical evaluation before
treatment and after the one-month citalopram administration was discovered; the correlation
was determined using the score of HAMD or BECK. Significant correlations were also
observed between KM and Vmax values, both before, and after the treatment; the same relation
10
between KM a Vmax also is valid for the controls. No significant correlation between
fluorescence anisotropy of DPH in ghosts and other measured variables was found.
Discussion
The data presented here confirms the significance of RBCs in blood transport and
homeostasis of L-T3. The data we collected show that kinetic parameters of L-T3 uptake into
erythrocytes are increased in the depressive patients before the treatment when compared with
the group of controls. In the course of the pharmacotherapy, these parameters did not
significantly change (Table 2). All the patients were euthyroid and were responding well to
the treatment (Table 1). Further on, we detected enhanced fluorescence anisotropy of the DPH
probe in erythrocyte membranes in the depressive persons both before and after the onemonth treatment with citalopram (Table 2). As fluorescence anisotropy of DPH reflects the
degree of the probe movement restriction in anisotropic membrane environment, and by the
same token, the degree of movement restriction of membrane molecules, we can assume that
the change of kinetic parameters of L-T3 uptake into erythrocytes in depression is to an extent
affected by the change of the interaction lipid-L-T3 transporter.
We found no significantly diverse values of KM, Vmax or rDPH in patients diagnosed as
depressive for the first time (N=20), and in patients who had already been treated ( but more
than 5 months before the beginning of the project without medication; N=4).
The interpretation of the enhanced kinetic uptake parameters is not fully unequivocal.
Higher Vmax can mean higher density of transporters in the membrane, or it can mean only
their higher activity while the density is unchanged. The enhanced activity might be caused
e.g. by specific interaction with certain membrane molecules and/or by altered dynamic
11
properties of the lipid bilayer, in which transporters are embedded. The enhanced KM value
corresponds qualitatively to the decrease in L-T3 transporter affinity, i.e. it corresponds to the
decrease in its capacity to bind free L-T3, in particular when in low concentrations. The
decrease in affinity of the binding site for L-T3 can be conceived of either as a result of the
conformation change of the binding site caused by allosteric interaction with other molecules,
or as a result of the deeper embedding of the whole carrier protein into the lipid bilayer, and
consequently altered accessibility of the binding site.
While interpreting the changes of the uptake kinetic parameters, it is necessary to take into
account the physiological concentrations of transported ligand. As for the free L-T3, the
standard values move within the interval 3.28-8.20 pmol/l, considering that the detected KM
constants lie within the range of tens to hundreds of nmol/l, the L-T3 transporter is in the
entirely non-saturated state. In low (physiological) concentrations of free L-T3, the role of
effectiveness of its uptake characterized by affinity of the L-T3 transporter rises. Vmax
enhancement in depressive patients can then be easily compensated by the increase of KM
(lowering of affinity). Then there can appear the situation when significantly different kinetic
parameters of uptake signify higher velocity of transport into erythrocytes at nanomolar
concentrations of free L-T3, while in its picomolar concentrations the velocity of the transport
is virtually unchanged (Fig. 2). The change of the kinetic parameters of L-T3 uptake into
RBC in depression is, according to our findings, compensated in this way and it is possible to
ask to what extent the Vmax and KM change is the starting factor, or just an associated
symptom of depression.
The data we received enable us to discuss the role of L-T3 uptake into RBC in the
development and treatment of depressive disorder, both for the changes of kinetic parameters
of uptake, and the changes of dynamic properties of lipid bilayer, in which the transport
protein for L-T3 is embedded. Our study draws on the results published by Moreau et al.
12
(1998, 2000), though it does not entirely confirm them. The differences in absolute values of
the measured kinetic parameters KM and Vmax in our and Moreau’s study can be easily
explained: each of us used a different method of separation of extracellular and intracellular
L-T3. Our technique of rapid filtration has, compared to the centrifugation technique, a
certain advantage: we could wash away the nonspecifically surface-bound L-T3 more rapidly.
A different method, however, should not influence the prominent qualitative decrease in
measured parameters detected by Moreau et al. (2000) after a four-week treatment with
fluvoxamine. Our results confirm, in accordance with Moreau’s study, a significant increase
in kinetic parameters of L-T3 uptake into RBC in patients suffering from depression before
the beginning of the treatment (drug-free state); all the patients engaged in our study were
responders. However, after one-month treatment with citalopram we did not find any
significant changes in the measured parameters, i.e. they were not normalized, though the
score of HAMD and BECK in all the cases dropped remarkably. By comparing both the sets
in terms of the clinical parameters, we find out that Moreau’s study dealt with a slightly
different group of patients – the level of depression may have been equally chosen (HAMD ±
S.D. was 33.7 ± 9.6) (but Moreau used a 26 degree Hamilton scale, we used a 21 degree),
only 8 patients were drug-naive, the wash out period prior to the treatment was only 7 days,
and after one month 9 patients were qualified as non-responders.
Our data does not sufficiently answer all the questions, although they enable a
summarization that the kinetics of L-T3 uptake into RBC can be seen as a process, which gets
altered in depression, however, it does not correlate directly with depressive symptoms. Most
probably the point is the change of activity of membrane L-T3 transporter that is caused by
altered properties of the lipid bilayer, in which carrier protein is embedded. This conclusion is
supported by the evidence of the measurement of fluorescence anisotropy of DPH in plasma
membranes from erythrocytes, which shows that the depressive disorder is accompanied by a
13
lowered fluidity of the membranes concerned. The cell membrane dynamic is the magnitude
that affects a number of membrane enzymes, receptors, ion channels and transporters; one of
the manifestations of its change could be increase in kinetic parameters of L-T3 uptake. This
conclusion is supported by the results of another project we initiated (in progress), in which
we measured [125I]L-T3 uptake into erythrocytes in people with hypercholesterolaemia. The
increased plasma levels of cholesterol significantly correlated with the increased anisotropy of
fluorescence of DPH in erythrocyte membranes compared to controls (mean ± S.D.; rDPH =
0.2376 ± 0.0071 to 0.2279 ± 0.0066, p < 0.001), and kinetic parameters of [125I]L-T3 uptake
into erythrocytes were also significantly increased compared to controls (KM = 224.1 ± 127.1
to 116.1 ± 62.1 nM, p = 0.00057; Vmax = 5.91 ± 2.97 to 3.67 ± 1.77 pmol/min·108 cells, p =
0.0072). The velocity of L-T3 uptake into erythrocytes was generally decreased at increased
membrane microviscosity, which was determined by limiting permeability reflecting kinetics
of uptake at physiological L-T3 concentration (Vmax/KM = 0.0278 ± 0.0062 compared to
0.0345 ± 0.0105 min-1, p = 0.024). It has not yet been fully elucidated, whether the
characteristics of L-T3 transporter are influenced by specific lipid-protein interactions (e.g.
cholesterol-transporter, phosphatidylserine-transporter and so on), rather than by the overall
dynamic state of the lipid bilayer, i.e. by arrangement and rotational and translational motility
of the membrane molecules.
Clinically, the work supports the hypothesis according to which we can evaluate the
triiodothyronine uptake into erythrocytes as a peripheral membrane marker of a depressive
disorder. The hypothesis of the altered function of the HPT axis in development and
maintaining depression points towards medication of thyroid hormones for effective therapy
for depression.
14
Our results support the hypothesis that even clinically euthyroid patients with depression
show the change of L-T3 uptake into erythrocytes. It can be speculated that L-T3 uptake into
erythrocytes can be used as subclinical marker reflecting the dysfunction of the hypothalamicpituitary-thyroid axis in pathophysiology of affective disorders. Yet the kinetic parameters of
L-T3 uptake into erythrocytes do not correlate with depressive symptoms and are affected by
properties of the lipid bilayer. At the same time we inter-related the hypothesis concerning the
erythrocyte L-T3 uptake alteration with the membrane hypothesis of affective disorders,
according to which the vulnerability to depression can originate as a result of the changes in
composition and biophysical properties of the lipid component of the cell membranes.
Acknowledgments
This work was supported by GA UK No. 27/2000/C and MSM 111100001 grants.
15
References
ANGEL RC, BOOTTA JA, MORERO RD, FARIAS RN: Solubilization and Purification of a
membrane erythrocytes associated 3,3’,5 triiodo-L-thyronine binding protein from rat.
Biochem J 270: 577-82, 1990.
BARTLETT GR: Phosphorus assay in column chromatography. J Biol Chem 234: 466-468,
1959.
BAUER M, WHYBROW PC: Thyroid hormone, neural tissue and mood modulation. World J
Biol Psychiatry 2: 59-69, 2001.
BECK AT, BEAMESDERFER A: Assessment of Depression Inventory. In:
Psychopharmacology, P PICHOT (ed), Basel, 1974, pp 151-169.
CRISPELL KR, COLEMAN J: A study of the relative binding capacity of plasma proteins,
intact human red cells, and human red cell stroma for radioactive I-131 labeled L-thyroxine. J
Clin Invest 35: 475-80, 1956.
DOCTER R, KRENNING EP, BOS G, FEKKES DF, HENNEMANN G: Evidence that the
uptake of triiodo-L-thyronine is carrier–mediated, but not energy-dependent. Biochem J 208:
27-34, 1982.
DODGE JT, MITCHELL C, HANAHAN DJ: The preparation and chemical characteristics of
hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys 100: 119-130, 1963.
DOZIN B, CAHNMANN HJ, NIKODEM VM: 1985. Comparative characterization of
thyroid hormone receptors and binding proteins in rat liver nucleus, plasma membrane and
cytosol by photoaffinity labeling with L-thyroxine. Biochemistry 24: 5203-8, 1985.
GALTON VA, ST GERMAIN DL, WHITTEMORE S: Celular uptake of cells. 3,5,3’
triiodothyronine and thyroxine by red blood and thymus cells. Endocrinology 118: 1918-23,
1996.
HAMILTON MA: A rating scale for depression. J Neurol Neurosurg Psychiat 23: 56-62,
1960.
HILLIER AP: The binding of thyroid hormone to phospholipid membranes. J Physiol 211:
585-97, 1970.
HOLM AC, JACQUEMIN C: Membrane transport of L-triiodothyronine by human red cell
ghosts. Biochem Biophys Res Commun 89: 1006-1017, 1979.
JOFFE RT, LEVITT AJ: The thyroid axis and psychiatric ilness. American Psychiatry Press,
Washington, DC, 1993, p 339.
KIRKEGAARD C, FABER J: The role of thyroid hormone indepression – review. J
Endocrinol 138: 1-9, 1998.
16
LAKOWICZ JR: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second Edition. Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow, 1999.
LOOSEN PT, ARTHUR J, PRANGE JR: 1988. Serum thyrothropine response to thyrotropine
releasing hormone in psychiatric patients: a review. Am J Psychiatry 139:4: 405-410, 1988.
MOREAU X, AZORIN JM, LEJEUNE PJ, JEANNINGROS R.: Red blood cell
triiodothyronine uptake in unipolar major depression: effect of a chronic antidepressant
treatment. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry 24: 23-35, 2000.
MOREAU X, AZORIN JM, MAUREL M, JEANNINGROS R: Increase in red blood
cell triiodothyronine uptake in untreated unipolar major depressed patients compared to
healthy volunteers. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry 22: 293-310,1998.
OSTY J, JEGO L, FRANCON J, BLONDEAU JP: Characterization of triiodothyronine
transport and accumulation in rat erythrocytes. Endocrinology 123: 2303-2311, 1988.
OSTY J, VALENSI P, SAMSON M, FRANCON J, BLONDEAU JP: Transport of thyroid
hormones by human erythrocytes: kinetic characterization in adults and newborns. J Clin
Endocrinol Metab 71: 1589-1595, 1990.
POP JK, LUC HM, LEUSINK G, VAN SON MJ, KOTTNERUS AJ, WARD M: Are
autoimmune thyroid dysfunction and depression related? J Clin Endocrinol Metab 83: 31943197, 1998.
SAMSON M, OSTY J, BLONDEAU JP: Identification by photoaffinity labeling of a
membrane thyroid hormone binding protein associated with the triiodothyronine transport
systém in rat erythrocytes. Endocrinology 132: 2470-2476, 1993.
SAMSON M, OSTY J, FRANCON J, BLONDEAU JP: Triiodothyronine binding sites in the
rat erythrocyte membrane: involvement in triiodothyronine transport and relation to the
tryptophan transport system T. Biochim Biophys Acta 1108: 91-98, 1992.
SAMSON M, OSTY J, THIBOUT H, BLONDEAU JP: Solubilization, reconstitution and
molecular properties of the triiodothyronine transport protein from rat erythrocyte
membranes. Eur J Endocrinol 134: 660-668, 1996.
STYRA R, JOFFE R, SINGER W: Hyperthyroxinemia in major affective disorders. Acta
Psychiatr Scand 81: 61-63, 1991.
SULLIVAN PF, WILSON DA, MULDER RT, JOYCE PR: The hypotalamic-pituitarythyroid axis in major depression. Acta Psychiatr Scand 93: 370-378, 1997.
WAGNER H, LISSAU A, HOLZI J, HORAMMER L: The incorporation of 32P into
inositolphosphatides of the rat brain. J Lipid Res 3: 177-180, 1962.
YAMAUCHI K, HORIUCHI R, TAKIKAWA H: Uptake of 3,5,3’-triiodothyronine in human
erythrocytes. J Endocrinol 121: 585-591, 1989.
17
Table 1
Age and clinical assessment of depression in depressed patients before and after one month
treatment with citalopram
N
Age
BECK score
HAMD score
(years)
Depressed patients before
treatment
Depressed patients treated
1 month with citalopram
Controls
24
37.3 ± 12.6
16.1 ± 7.5
21.3 ± 4.0
19
38.5 ± 12.3
7.8 ± 4.8***
6.8 ± 3.1***
19
35.6 ± 10.5
-
-
Values are reported as mean ± S.D. Marked values are significantly different from patients
before treatment at ‫٭٭٭‬p<0.001; determined by Wilcoxon test.
18
Table 2
Kinetic parameters of RBC L-T3 uptake and fluorescence anisotropy of DPH in ghosts of
depressed patients before and after one month of treatment with citalopram
KM
Vmax
mean
166.5*
Depressed patients before
S.D.
treatment
Vmax/KM
rDPH
5.77**
0.0356
0.2323*
68.2
2.49
0.0101
0.0065
CONF95
27.3
0.99
0.0040
0.0026
N
24
24
24
24
mean
176.0**
5.48*
0.0315
0.2316
Depressed patients treated
S.D.
68.4
2.44
0.0095
0.0083
1 month with citalopram
CONF95
30.8
1.10
0.0043
0.0039
N
19
Controls
19
19
18
mean
116.1
3.67
0.0345
0.2279
S.D.
62.1
1.77
0.0105
0.0066
CONF95
27.9
0.80
0.0047
0.0029
N
19
19
19
20
Vmax – maximal velocity of L-T3 uptake to RBC (pmol/min·108 cells ); KM – apparent
Michaelis constant reflecting extracellular concentration of L-T3, when the transport velocity
into cells equals ½ Vmax (nM); Vmax/KM – limiting permeability at low L-T3 concentrations
(min-1); rDPH - fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), S.D. –
standard deviation, N – number of values, CONF95 – 95% confidence interval for the mean.
Marked values are significantly different from controls at ‫٭‬p<0.05 or ‫٭٭‬p<0.01; determined
by Mann-Whitney U test. There were no significant differences in uptake parameters and
fluorescence anisotropy before and after treatment.
19
Table 3
Relations between clinical evaluation, parameters of L-T3 uptake and fluorescence anisotropy of DPH of depressed patients before and after
treatment with citalopram determined as correlation coefficients (Spearman R).
HAMD1
BECK1
KM1
Vmax1
Vmax1/KM1
rDPH1
HAMD2
BECK2
KM2
Vmax2
Vmax2/KM2
BECK1
0.652**
1.000
Before treatment
KM1
Vmax1
Vmax1/KM1
-0.268
-0.080
0.226
-0.464*
-0.466*
-0.086
1.000
0.850**
-0.178
0.292
1.000
1.000
rDPH1
0.372
0.212
0.097
-0.058
-0.293
1.000
HAMD2
0.666**
0.339
-0.176
0.034
0.202
0.166
1.000
After one month treatment with citalopram
BECK2
KM2
Vmax2
Vmax2/KM2
0.428
0.053
-0.258
-0.436
0.583**
-0.089
-0.075
-0.301
-0.339
0.223
0.119
0.114
0.225
-0.337
0.174
0.117
-0.172
-0.088
-0.040
0.153
0.344
-0.172
-0.360
-0.284
0.543*
-0.041
-0.229
-0.405
1.000
-0.001
-0.008
-0.108
1.000
0.783**
-0.016
1.000
0.591**
1.000
rDPH2
-0.063
-0.065
0.164
0.026
-0.172
0.061
0.031
0.143
0.094
-0.172
-0.360
HAMD – Hamilton Depressive Rating Scale score, BECK – Beck Self-Assessment Depression Rating Scale score, KM – apparent Michaelis
constant for L-T3 uptake to RBC (nM), Vmax – maximal velocity of L-T3 uptake to RBC (pmol/min·108 cells), Vmax/KM – limiting permeability
at low L-T3 concentrations (min-1), rDPH – fluorescence anisotropy of DPH in erythrocyte ghosts; variables measured before treatment are marked
with No.1, after one month treatment with citalopram are marked with No.2.
Marked correlations are significant at ‫٭‬p<0.05 or ‫٭٭‬p<0.01
20
Fig. 1. Time course of L-T3 uptake into human erythrocytes. Intact erythrocytes (108 cells/ml)
were incubated in buffer T in the presence of 40 nM [125I]L-T3. One millilitre aliquots were
rapidly filtered through GF/C glass fiber filters at selected time intervals. The filters were
washed twice with ice-cold buffer A and measured by means of scintillation counter.
Fig. 2. Uptake L-T3 into erythrocytes at low and high concentrations of free L-T3. Velocities
of L-T3 transport are calculated from KM and Vmax values stated above in Table 2.
† – Depressive patients before treatment (KM = 166.5 nM, Vmax = 5.77 pmol/min·108 cells),
U – depressive patients after one month of citalopram administration (KM = 176.0 nM, Vmax
= 5.48 pmol/min·108 cells), z – controls (KM =116.1 nM, Vmax = 3.67 pmol/min·108 cells).
21
L-T3 UPTAKE (rel. u.)
1500
1000
500
0
0
10
20
30
TIME (min)
40
50
60
UPTAKE VELOCITY
8
(fmol/10 RBC per min)
8
7
UPTAKE VELOCITY
8
(pmol/10 RBC per min)
6
5
0,3
0,2
0,1
0
3
4
5
7
FREE L-T3 (pM)
9
3
2
BEFORE TREATMENT
AFTER 1 MONTH
1
CONTROLS
0
0
100
200
FREE L-T3 (nM)
300
400
Příloha 8:
VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk;
STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering
therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005,
vol. 133, no. 2-3, p. 197-203.
Psychiatry Research 133 (2005) 197 – 203
www.elsevier.com/locate/psychres
Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes
in serotonergic transmission
Jan Veveraa,b,*, Zdeněk Fišara, Tomáš Kvasničkac, Hanuš Zdeněka, Lucie Stárkováa,
Richard Češkac, Hana Papežováa
a
Psychiatric Clinic, First Faculty of Medicine of Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague, Czech Republic
b
School of Public Health, University of California at Berkeley, Berkeley, CA, USA
c
Third Medical Department, Clinical Department of Endocrinology and Metabolism, First Faculty of Medicine Charles University,
Prague, Czech Republic
Received 24 February 2004; received in revised form 24 September 2004; accepted 26 November 2004
Abstract
A number of studies have reported an increased risk for violent deaths and depression in subjects with reduced serum
cholesterol concentrations. Links with hypothesized impairment of serotonin neurotransmission have not been satisfactorily
tested. In this investigation, the serum and membrane cholesterol, microviscosity of erythrocyte membranes, platelet serotonin
uptake, and clinical parameters were determined during pharmacotherapy of 17 hypercholesterolemic patients. A significant
decrease in serum cholesterol and a nonsignificant decrease in membrane cholesterol concentration were found after 2 months
of simvastatin therapy. Serotonin transporter (SERT) activity was significantly increased following 1 month of simvastatin; the
tendency to decrease the initial increase in SERT activity was evident following 2 months of therapy. Both membrane
cholesterol and SERT activity returned to pre-treatment levels after more than 1 year of therapy. Microviscosity of plasma
membranes, impulsivity, empathy, adventure, sensation seeking, and depressed mood were not markedly changed. These data
indicate that long-term therapy has different effects on serotonin transmission from short-term (1- to 2-month) therapy. A
significant increase in SERT activity was detected only during the first month of simvastatin therapy. This finding suggests that
within this period some patients could be vulnerable to depression, violence, or suicide.
D 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
Keywords: Serotonin uptake; Microviscosity; Depression; Impulsivity
1. Introduction
* Corresponding author. Psychiatric Clinic, First Medical
Faculty, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague, Czech
Republic.
E-mail address: [email protected] (J. Vevera).
Since Muldoon et al. (1990) reported that
cholesterol-lowering interventions are associated
with a significant increase in male deaths from
accidents, violence or suicide, a large body of
0165-1781/$ - see front matter D 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.psychres.2004.11.005
198
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
studies have confirmed a relationship between lower
cholesterol levels, depression, and suicide (Balon,
2000; Huang et al., 2003; Vevera et al., 2003).
However, contradictory results have also been
reported (Tanskanen et al., 2000). Increased cholesterol levels have been found in patients with painrelated syndromes (Krikava et al., 2004). Other
randomized trials on hypercholesterolemic patients
have not found adverse effects on mood of
cholesterol-lowering treatment (Muldoon et al.,
2001; Deisenhammer et al., 2004).
Cholesterol is the main membrane-active sterol,
which has an effect on cell growth and on the function
of many membrane proteins. The functioning of a
receptor or a transporter could be directly modulated
by specific molecular interactions (Scanlon et al.,
2001) or indirectly affected by cholesterol induced
changes in membrane microviscosity and permeability. The widely accepted theory of Engelberg (1992;
modified by Terao et al., 2000) states that central
serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) neurotransmission is decreased via the altered microviscosity
of plasma membranes caused by lowered blood
cholesterol levels. Serotonin pathways function as a
behavioral restraint system that inhibits impulsive
behavior (Volavka, 2002). Reduced cholesterol levels
could thus facilitate such complex behavior as
violence towards the self or others.
In the maintenance of normal serotonergic neurotransmission, a crucial role is played by the serotonin
transporter (SERT), which controls the concentration
of free serotonin in the brain. An important mechanism for the modulation of SERT activity is the
density of transporter molecules at the cell membrane
and their affinity to 5-HT. Kinetic parameters of
serotonin uptake, maximal velocity (V max) and apparent Michaelis constant (K M) are used to characterize
SERT activity. Previous findings indicate that SERT is
regulated both by membrane cholesterol (Scanlon et
al., 2001) and several regulatory proteins (Haase et al.,
2001).
Brain cholesterol synthesis could be affected by
cholesterol-lowering medication that can cross the
blood–brain barrier. Simvastatin (an inhibitor of the
hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase) penetrates the blood–brain barrier (Saheki et al., 1994),
and it has been demonstrated that treatment with
simvastatin decreases levels of cholesterol in synap-
tosomal membranes, affects transbilayer cholesterol
distribution (Kirsch et al., 2003), and reduces
cholesterol turnover in the brain (Locatelli et al.,
2002).
Given the hundreds of studies discussing the role
of cholesterol-lowering therapy on serotonin transmission (the Engelberg theory was cited in 187
articles indexed in Web of Science—January 2004),
there have been surprisingly few studies examining
the underlying biological mechanisms. Furthermore,
the studies that have been conducted have yielded
conflicting results (Ringo et al., 1994; Delva et al.,
1996; Hibbeln et al., 2000; Sarchiapone et al., 2001;
Papakostas et al., 2003).
The aim of our study was to elucidate the effect
of cholesterol-lowering therapy on membrane microviscosity and serotonin uptake and behavioral
changes (depression, impulsivity, empathy, adventure). SERT activity in platelets was used as a model
of SERT function in the brain (Tuomisto et al.,
1979). Changes in the lipid composition of erythrocyte membranes were used to estimate changes in
brain lipid composition (Chin et al., 1978; Agrawal
et al., 1995).
2. Methods
2.1. Subjects and clinical assessment
The study included 17 consecutively diagnosed
patients with familial hypercholesterolemia (8
females, 9 males) with a mean age of 63 (S.D.=10).
All patients who were diagnosed with hypercholesterolemia during the period of enrolment participated in
the study. None had been diagnosed with a mental
disorder. A complete psychiatric and internal medicine examination, including blood sampling, was
performed before the first administration of simvastatin, after 1 and 2 months of treatment, and in nine
patients, also after 13–16 months. All of the patients
were medicated with simvastatin (Simvor, Ranbaxy
Laboratories, London) with a 20-mg/day dosage in the
evening.
A clinical evaluation of the patients was
performed by an experienced psychiatrist (JV).
The Structured Clinical Interview MINI 5.0 was
used for assessment of patients. Impulsivity, empa-
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
thy, and adventurousness were evaluated using the
Eysenck IVE (impulsiveness/venturesomeness/empathy questionnaire) test, and depressive symptomatology using the 21-point Hamilton Rating Scale for
Depression (HRSD). Data from the Zuckerman
Sensation Seeking Scale, form V (a 40-item selfreport), and the Lecrubier et al. (1995) impulsivity
rating scale (IRS) were also collected, but these two
scales have not been validated in the Czech
Republic.
The study was approved by the ethics committee of
the First Faculty of Medicine, Charles University of
Prague, Czech Republic. All participants gave written
informed consent.
199
the samples by measurement of phosphorus (Bartlett, 1959) concentrations.
2.3. Data analysis
To calculate kinetic parameters of serotonin uptake,
we used AccuFit Saturation Two-Site nonlinear
regression analysis software (Beckman). Limiting
permeability at low (physiological) 5-HT concentrations was calculated as the V max/K M ratio, which more
properly reflects the function of the serotonin transporter (V max/K M is an efficiency criterion of transport
system).
2.4. Statistical analysis
2.2. Blood processing and biochemical
determinations
Peripheral blood samples were obtained from the
cubital vein of fasting subjects. Seven milliliters of
blood were collected between 07:00 and 10:00 h into
Vacutainerk vacuum test tubes (BD Vacutainer), with
no additive for cholesterol and triacylglycerol determination. Levels of serum total cholesterol (TC),
HDL cholesterol (HDL), and triacylglycerols (TG)
were determined using enzymatic kits (Cobas, Mira,
ROCHE). LDL cholesterol (LDL) was calculated by
Friedewald’s formula.
Four milliliters of non-coagulable blood (BD
Vacutainer 9NC with 0.5 ml of 0.129 M trisodium
citrate used as anticoagulant) were collected to
measure the kinetic parameters of 5-HT uptake into
platelets using tritium-labelled 5-HT (Tuomisto et
al., 1979) and for erythrocyte ghost preparation
(Dodge et al., 1963). Hydrophobic membrane probe
1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma) was
used to determine changes in erythrocyte membrane
microviscosity (Lakowicz, 1999). Fluorescence anisotropy (r DPH), which reflects the extent of probe
movement restriction in an anisotropic membrane
environment, was measured. Modified Folch (Koul
and Prasad, 1996) methods were used to isolate
total lipids from erythrocyte ghosts. Membrane
cholesterol was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) by chromatographic rods (silica-coated
glass rods, type Chromarod SIII) with Iatroscan
TH-10 (Iatron Laboratories) flame ionization detection (FID). Total phospholipids were determined in
Data are expressed as the arithmetic means.
Standard deviations (S.D.) were calculated to characterize group variability. Comparisons between patients
before and after cholesterol-lowering therapy were
performed using analysis of variance (ANOVA),
followed by post hoc Duncan’s test. Pearson correlation coefficients were used to quantify the relation
between two quantitative parameters. Statistical analyses were performed with the statistical package
Statistica (StatSoft, Inc.).
3. Results
3.1. Clinical evaluation
Seventeen patients were examined before and
after 1 and 2 months of cholesterol-lowering therapy,
and nine of them were also examined after 13–16
months of therapy. No significant changes were
found in impulsivity, empathy, adventurousness, and
depressive symptomatology based on the Eysenck
IVE, the IRS and the HRSD. The Zuckerman
Sensation-Seeking Scale did not reveal any significant changes in Thrill and Adventure Seeking
(TAS), Experience Seeking (ES), Disinhibition
(Dis), Boredom Susceptibility (BS), or the total
score (TS).
Eight patients did not continue in the study because
of time constraints (patients were not compensated for
their time). No psychiatric disorder or suicidal attempt
was reported for these patients.
200
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
Table 1
Serum cholesterol and triacylglycerol concentrations before and
after treatment of hypercholesterolemia with simvastatin
Period of TC
treatment
(month)
TG
HDL
0
1
2
13–16
2.08F0.94
1.98F0.74
2.02F0.60
1.65F0.37
1.18F0.13
4.18F0.91
1.20F0.15
3.94F0.79
1.19F0.10 ***3.00F0.37
1.20F0.09 ***2.98F0.20
6.57F1.26
6.20F0.89
***5.10F0.42
***5.02F0.39
LDL
Values are meansFstandard deviations. The means were calculated
from 17 values. TC, total cholesterol; TG, triacylglycerols; HDL,
HDL cholesterol; LDL, LDL cholesterol; all in mmol/l.
Marked values are significantly different from values before
treatment with simvastatin at ***Pb0.001.
3.2. Serum cholesterol
Total cholesterol, TG, HDL cholesterol, and LDL
cholesterol were monitored before treatment with
simvastatin and during pharmacotherapy (Table 1 and
Fig. 1). A decrease of TC was found after 1 month of
simvastatin therapy ( P=0.21), and a highly significant
decrease was observed after 2 months ( P=0.000061) or
more than 1 year ( P=0.000053) of simvastatin therapy
compared with pre-treatment values. Similar changes
were observed for LDL cholesterol. Neither TG nor
HDL cholesterol was significantly changed.
3.3. Kinetics of platelet serotonin uptake
The kinetics of platelet serotonin uptake were described by the V max/K M ratio. When changes in 5-HT
uptake during treatment were compared with pretreatment values (Table 2 and Fig. 1), the V max/K M
ratio was found to be significantly increased after 1
month of treatment only ( P=0.0082); no significant
increase in this ratio was observed after 2 months ( P=
0.067), and almost the same value as before treatment
was observed after more than 1 year of therapy
( P=0.87). The V max value was found to have almost
doubled after 1 month ( P=0.00027) and 2 months
( P=0.00013) of treatment compared with pre-treatment values. The K M value was significantly increased
after 2 months ( P=0.024) of simvastatin therapy. Both
K M and V max values returned to nearly the initial value
Fig. 1. Parameters measured in hypercholesterolemic patients as percentage of value before treatment with simvastatin. Values are
meansFstandard deviations. The means were calculated from 17 values except for data from more than 1 year, when means were counted from
only nine cases. TC, total cholesterol; LDL, LDL cholesterol; all in mmol/l; K M (nmol/l), apparent Michaelis constant characterizing affinity of
serotonin transporter and calculated as extracellular serotonin concentration when the velocity of its transport equals to 50% of V max (pmol/
mind 107 platelets), maximal velocity of platelet serotonin uptake; V max/K M, ratio representing limiting permeability at low (physiological)
extracellular concentrations of 5-HT (ml/min107 platelets); r DPH, fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene; CH/PL, molar ratio
of membrane cholesterol to total phospholipid. Marked values are significantly different from values before treatment with simvastatin at
**Pb0.01, ***Pb0.001.
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
201
Table 2
Platelet serotonin uptake and fluorescence anisotropy of DPH in erythrocyte membranes and molar ratio cholesterol/phospholipid before and
after treatment of hypercholesterolemia with simvastatin
Period of treatment (month)
0
1
2
13–16
Platelet serotonin uptake
Ghosts
KM
V max
V max/K M
r DPH
CH/PL
189F83
224F75
**258F68
186F47
3.68F2.09
***6.60F1.91
***6.85F1.87
3.63F0.69
0.0210F0.0103
**0.0315F0.0090
0.0279F0.0103
0.0204F0.0049
0.2363F0.0065
0.2344F0.0063
0.2314F0.0109
0.2314F0.0059
0.755F0.115
0.779F0.098
0.688F0.098
0.786F0.198
Values are meansFstandard deviations. The means were calculated from 17 values except for data from more than 1 year, when means were
counted from only nine cases. K M (nmol/l), apparent Michaelis constant characterizing affinity of serotonin transporter and calculated as
extracellular serotonin concentration when the velocity of its transport equals 50% of V max (pmol/min107 platelets), maximal velocity of platelet
serotonin uptake; V max/K M, ratio representing limiting permeability at low (physiological) extracellular concentrations of 5-HT (ml/min 107
platelets); r DPH, fluorescence anisotropy of the membrane probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene; CH, cholesterol; PL, total phospholipid. Values
different from values before treatment are marked in case the difference is statistically significant (**Pb0.01, ***Pb0.001).
(before treatment) after more than 1 year of simvastatin
therapy.
V max (r= 0.32, P=0.015), and between and LDL
cholesterol and K M (r= 0.27, P=0.040).
3.4. Membrane cholesterol and microviscosity
4. Discussion
When fluorescence anisotropy changes during
treatment were evaluated in comparison to values
before treatment (Table 2 and Fig. 1), we found that
fluorescence anisotropy of DPH (r DPH) in erythrocyte
membranes had not significantly decreased following
1 month, 2 months, or more than 1 year of simvastatin
therapy.
To interpret the changes in the relative representation of cholesterol in erythrocyte membranes due to
the administration of simvastatin, we used the ratio of
cholesterol/total phospholipid (CH/PL, mol/mol). The
results are summarized in Table 2. A nonsignificant
decrease in CH/PL was found after 2 months of
simvastatin therapy ( P=0.17). The CH/PL ratio
returned to a value close to the pre-treatment value
after more than 1 year of therapy.
3.5. Mutual relations
Mutual relations between each pair of variables
were tested by means of a correlation coefficient
matrix. Pearson’s correlations (r) were calculated
from 57–68 cases consisting of simvastatin-treated
patients. There was a significant positive correlation
between V max and K M (r=0.48, Pb0.001) and between
TC and LDL cholesterol (r=0.94, Pb0.001). A
negative correlation was found between TC and V max
(r= 0.29, P=0.028), between LDL cholesterol and
Our study finds that, in vivo, SERT functioning
and membrane composition are influenced by serum
cholesterol levels. The microviscosity of plasma
membranes was not significantly changed by simvastatin treatment. SERT activity was significantly
increased following 1 month of simvastatin therapy.
However, longer-term therapy has a different effect on
SERT activity (Fig. 1). The tendency for the initial
increase in SERT activity to subsequently decline was
evident after 2 months of therapy and especially after
more than 1 year of therapy (13–16 months). A
decreased relative membrane cholesterol representation was observed after 2 months of therapy. Serum
cholesterol (TC, LDL) was markedly decreased after 1
month of simvastatin therapy; neither TC nor LDL
cholesterol levels changed significantly in the period
of 2–16 months of therapy. It is of interest that most of
the biochemical parameters showed lower variance
after treatment. Psychometric tests did not reveal any
changes in depression, impulsivity, empathy, adventurousness, and sensation seeking.
An increase in V max was used to explain increased
serotonin uptake. The V max value appears to be more
significantly modulated by cholesterol than the K M
value. Similar to Scanlon et al. (2001), we found an
increase of K M, i.e., a decrease of the affinity of SERT
to 5-HT, following depletion of cholesterol; however,
202
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
we observed significantly increased V max, and total
serotonin uptake was consequently increased. This
conflicting finding can be explained by the different
designs of the two experiments; we measured in vivo
the effect of therapeutic cholesterol-lowering medication in humans, whereas Scanlon et al. used
cultured kidney cells and a much greater reduction
in cholesterol content. We hypothesize that the direct
effect of cholesterol on SERT activity is compensated
for by other homeostatic mechanisms that maintain
SERT activity in the normal range, e.g., by changes in
SERT affinity for serotonin.
Our results suggest that SERT activity is more
sensitive to an initial change in cholesterol concentration than to its stable level. This interpretation is
consistent with a recent report that found an increase
in impulsivity after 4 weeks of cholesterol-lowering
therapy that dissipated over a longer (52 weeks)
course of therapy (Ormiston et al., 2003).
These findings did not support Engelberg’s (1992)
hypothesis. Decreased cholesterol did not significantly
lower membrane microviscosity as postulated in the
theory, and opposite results in serotonin uptake were
found. Increased uptake of serotonin was reported.
The fact that changes in SERT activity were
observed after 1 month of treatment has important
theoretical and practical implications. The implication
for clinical practice is that patients could be vulnerable
to depression, violence, or suicide during the first
month of cholesterol-lowering therapy. In biochemical
and behavioral studies, attention should be paid to 1
month of therapy because, at later stages, the changes
are no longer apparent.
Acknowledgments
This work was supported by grants from GA UK
No. 27/2000/C and MSM 111100001 and NIH
Fogarty Program Finance and Mental Health Services
Training in the Czech Republic, School of Public
Health, UC Berkeley, D43 TW05810-01.
References
Agrawal, D., Subramoniam, A., Afaq, F., 1995. Influence of
hexachlorocyclohexane on phosphoinositides in rat erythrocyte
membranes and brain. Toxicology 95, 135 – 140.
Balon, R., 2000. Cholesterol, mental illness and violence. Psychiatrie 2, 83 – 90.
Bartlett, G.R., 1959. Phosphorus assay in column chromatography.
Journal of Biological Chemistry 234, 466 – 468.
Chin, J.H., Parsons, L.M., Goldstein, D.B., 1978. Increased
cholesterol content of erythrocyte and brain membranes in
ethanol-tolerant mice. Biochimica et Biophysica Acta 513,
358 – 363.
Deisenhammer, E.A., Kramer-Reinstadler, K., Liensberger, D.,
Kemmler, G., Hinterhuber, H., Fleischhacker, W., 2004. No
evidence for an association between serum cholesterol and the
course of depression and suicidality. Psychiatry Research 121,
253 – 261.
Delva, N.J., Matthews, D.R., Cowen, P.J., 1996. Brain serotonin (5HT) neuroendocrine function in patients taking cholesterollowering drugs. Biological Psychiatry 39, 100 – 106.
Dodge, J.T., Mitchell, C., Hanahan, D.J., 1963. The preparation and
chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human
erythrocytes. Archives of Biochemistry and Biophysics 100,
119 – 130.
Engelberg, H., 1992. Low serum cholesterol and suicide. Lancet
339, 727 – 729.
Haase, J., Killian, A.M., Magnani, F., Williams, C., 2001.
Regulation of the serotonin transporter by interacting proteins.
Biochemical Society Transactions 29, 722 – 728.
Hibbeln, J.R., Umhau, J.C., George, D.T., Shoaf, S.E., Linnoila, M.,
Salem Jr., N., 2000. Plasma total cholesterol concentrations do
not predict cerebrospinal fluid neurotransmitter metabolites:
implications for the biophysical role of highly unsaturated fatty
acids. American Journal of Clinical Nutrition 71 (1 Suppl.),
331S – 338S.
Huang, T.L., Wu, S.C., Chiang, Y.S., Chen, J.F., 2003. Correlation
between serum lipid, lipoprotein concentrations and anxious
state, depressive state or major depressive disorder. Psychiatry
Research 118, 147 – 153.
Kirsch, C., Eckert, G.P., Mueller, W.E., 2003. Statin effects on
cholesterol micro-domains in brain plasma membranes.
Biochemical Pharmacology 65, 843 – 856.
Koul, A., Prasad, R., 1996. Extraction of membrane lipids. In:
Prasad, R. (Ed.), Manual on membrane lipids. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, New York, pp. 35 – 37.
Krikava, K., Kalla, K., Yamamotova, A., Rokyta, R., 2004. Blood
serum changes in patients with pain during bone fractures and
acute pancreatitis. Neuroendocrinology Letters 25, 62 – 69.
Lakowicz, J.R., 1999. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second
edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.
Lecrubier, Y., Braconnier, A., Said, S., Payan, C., 1995. The
Impulsivity Rating Scale (IRS): preliminary results. European
Psychiatry 7, 331 – 338.
Locatelli, S., Lutjohann, D., Schmidt, H.H., Otto, C., Beisiegel, U.,
von Bergmann, K., 2002. Reduction of plasma 24S-hydroxycholesterol (cerebrosterol) levels using high-dosage simvastatin
in patients with hypercholesterolemia: evidence that simvastatin
affects cholesterol metabolism in the human brain. Archives of
Neurology 59, 213 – 216.
Muldoon, M.F., Manuck, S.B., Matthews, K.A., 1990. Lowering
cholesterol concentrations and mortality: a quantitative review
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
of primary prevention trials. British Medical Journal 301,
309 – 314.
Muldoon, M.F., Manuck, S.B., Mendelsohn, A.B., Kaplan, J.R.,
Belle, S.H., 2001. Cholesterol reduction and non-illness mortality: meta-analysis of randomized clinical trials. British Medical
Journal 322, 11 – 15.
Ormiston, T., Wolkowitz, O.M., Reus, V.I., Manfredi, F., 2003.
Behavioral implications of lowering cholesterol levels: a
double-blind pilot study. Psychosomatics 44, 412 – 414.
Papakostas, G.I., Petersen, T., Mischoulon, D., Hughes, M.E.,
Alpert, J.E., Nierenberg, A.A., Rosenbaum, J.F., Fava, M.,
2003. Serum cholesterol and serotonergic function in major
depressive disorder. Psychiatry Research 118, 137 – 145.
Ringo, D.L., Lindley, S.E., Faull, K.F., Faustman, W.O., 1994.
Cholesterol and serotonin: seeking a possible link between
blood cholesterol and CSF 5-HIAA. Biological Psychiatry 35,
957 – 959.
Saheki, A., Terasaki, T., Tamai, I., Tsuji, A., 1994. In vivo and in
vitro blood-brain barrier transport of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG CoA) reductase inhibitors. Pharmaceutical Research 11, 305 – 311.
Sarchiapone, M., Camardese, G., Roy, A., Della Casa, S., Satta,
M.A., Gonzalez, B., Berman, J., De Risio, S., 2001. Cholesterol
203
and serotonin indices in depressed and suicidal patients. Journal
of Affective Disorders 62, 217 – 219.
Scanlon, S.M., Williams, D.C., Schloss, P., 2001. Membrane
cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 3, 10507 – 10513.
Tanskanen, A., Vartiainen, E., Tuomilehto, J., Viinamaki, H.,
Lehtonen, J., Puska, P., 2000. High serum cholesterol and risk
of suicide. American Journal of Psychiatry 157, 648 – 650.
Terao, T., Nakamura, J., Yoshimura, R., Ohmori, O., Takahashi, N.,
Kojima, H., Soeda, S., Shinkai, T., Nakano, H., Okuno, T.,
2000. Relationship between serum cholesterol levels and metachlorophenylpiperazine-induced cortisol responses in healthy
men and women. Psychiatry Research 96, 167 – 173.
Tuomisto, J., Tukiainen, E., Ahlfors, U.G., 1979. Decreased uptake
of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with
endogenous depression. Psychopharmacology 65, 141 – 147.
Vevera, J., Zukov, I., Morcinek, T., Papezova, H., 2003. Cholesterol
concentrations in violent and non-violent women suicide
attempters. European Psychiatry 18, 23 – 27.
Volavka, J., 2002. Neurotransmitters, hormones, and genes. Neurobiology of Violence, 2nd ed. American Psychiatric Press,
Washington, DC, pp. 45 – 81.