Materiály k výuce - oddělení molekulární biologie crh

Transkript

Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty
Univerzity Palackého
LABORATORNÍ CVIČENÍ
Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Mária Šmehilová
Lenka Dzurová
Ivo Frébort a Petr Galuszka
Olomouc 2014
34
(technická tiráž)
Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D.
RNDr. Lenka Dzurová, Ph.D.
prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.
doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.
Laboratorní cvičení z molekulární biologie
Výkonný redaktor prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D.
Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová
Technická redakce
Návrh a grafické zpracování obálky Jiří Jurečka
Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci
Křížkovského 8, 771 47 Olomouc
www.vydavatelstvi.upol.cz
www.e-shop.upol.cz
[email protected]
1. vydání
Olomouc 2014
Ediční řada – Skripta
ISBN 978-80-244-4039-2
Neprodejná publikace
č.z. 2014/180
(rub titulky)
Oponenti: doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D.
Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
Logo/projekt
1. vydání
© Mária Šmehilová, Lenka Dzurová, Ivo Frébort, Petr Galuszka, 2014
© Univerzita Palackého v Olomouci, 2014
Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní,
popř. trestněprávní odpovědnost.
ISBN 978-80-244-4039-2
2
Předmluva
Skripta byla vytvořena pro laboratorní cvičení z molekulární biologie, které je
určeno studentům navazujícího studijního oboru biochemie. Je proto
předpokladem, že studenti jsou již teoreticky obeznámeni s metodami molekulární
biologie v rámci přednášek předcházejících tomuto cvičení. Skripta představují
soubor základních experimentálních technik molekulární biologie, přičemž se jedná
o cvičení velice pokročilé a náročné. V rámci cvičení se studenti naučí ovládat
postupy v dnešní době široce používané v celé řadě různě orientovaných
diagnostických laboratoří. Není proto pochyb, že toto cvičení tak přispěje ke
zlepšení konkurenceschopnosti budoucích absolventů oboru biochemie nejen na
trhu práce ale i při jejich potenciální další vědecké kariéře.
Autoři skript se při sestavování úloh zaměřili na různorodost představovaných
metod, které dohromady tvoří základní výbavu každého molekulárního biologa.
Skripta studentům nabízí pět atraktivních úloh, kde aplikace vysvětlované metody
vede k vyřešení konkrétního úkolu. Pro ilustraci, v úloze č. 3 se studenti naučí
izolovat genomovou DNA z potravin, kterou pak následně ověří v PCR a díky tomu
potvrdí nebo vyvrátí, zda-li se jedná o potravinu vyrobenou z produktů s obsahem
geneticky modifikovaných organismů (GMO). Stejnou metodu lze aplikovat
například na průkaz patogenů v zemědělských plodinách, potvrzení infekčního
agens v krvi pacienta nebo identifikaci pachatele. Prioritou kolektivu autorů skript
bylo zpracovat dané metody do co nejaktuálnější podoby a to proto, že molekulární
biologie je oborem relativně mladým a rychle se vyvíjejícím. Studenti se tak
například díky úloze č. 5 mají možnost naučit kvantifikovat DNA v reálném čase
pomocí Real-time PCR na speciálním termocykléru s detektorem fluorescence,
přičemž právě tato metoda přinesla obrovský progres v analýze nukleových kyselin.
Na závěr každé úlohy jsou studentům nabídnuty otázky k zamyšlení a prohloubení
získaných znalostí.
Techniky molekulární biologie jsou v porovnání s jinými analytickými
metodami zábavné, zkoumavé a tvořivé a my bychom chtěli studentům popřát
hodně entusiasmu a podpořit jejich vlastní invenci neboť právě toto jsou hnadla
pokroku.
V Olomouci 2014
Autoři:
Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D.
RNDr. Lenka Dzurová, Ph.D.
Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.
Prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.
3
Obsah
Předmluva .......................................................................................................... 3
Obsah ................................................................................................................. 4
Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři ...................................... 5
Pokyny pro práci s GMO .................................................................................... 6
Laboratorní úloha č. 1........................................................................................ 9
Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza
Laboratorní úloha č. 2...................................................................................... 20
Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR
Genetická transformace kvasinek a ověření exprese pomocí měření aktivity
rekombinantního enzymu
PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene
Izolace RNA z rostlin a následná kvantitativní RT-PCR vybraných genů
Vysvětlivky ...................................................................................................... 52
Přílohy ............................................................................................................. 53
4
Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři
1)
Během práce v laboratoři molekulární biologie musí být zavřená veškerá
okna a dveře.
2)
Osoba pracující v laboratoři musí být oblečená v pracovním plášti či jiném
laboratorním oblečení. Pokud to situace vyžaduje, musí mít rukavice a
ochranné brýle.
3)
V laboratoři je přísně zakázána konzumace jídel, pití, kouření, šňupání
tabáku, aplikace kosmetických přípravků a skladování pití, jídel a
tabákových výrobků.
4)
Je zakázáno pipetovat ústy a doporučuje se používat především mechanické
typy pipet.
5)
Minimalizujte vznik aerosolu.
6)
Po ukončení práce si vždy umyjte ruce.
7)
Udržujte laboratoř uklizenou a čistou. Na pracovním stole mějte jen materiál
a pomůcky nutné k práci. Zásoby materiálu skladujte ve zvláštní místnosti.
8)
Na práci se sterilním materiálem používejte vždy zapnutý laminární box. Po
skončení práce ve v laminárním boxu flowboxu pusťte UV lampu.
9)
Veškerou práci s karcinogenním ethidium bromidem provádějte ve vyhrazené
místnosti či prostoru a chraňte se nitrilovými rukavicemi.
10) Při práci s RNA používejte vždy rukavice a speciálně označený materiál a
pomůcky „RNase Free“. Takto označených věcí se nedotýkejte holýma
rukama.
11) Používané chemikálie a reagencie vracejte vždy na místo odkud jste je vzali.
12) Veškeré sklo umývejte jarovou vodou a poté oplachujte v destilované vodě.
5
Pokyny pro práci s GMO
1) opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu
V případě požáru předměty zasažené požárem je možno považovat za zbavené
geneticky modifikovaných organismů. Po uhašení požáru osoby zodpovědné za
likvidaci havárie týkající se GMO vyhledají na pracovišti pouze částečně poškozené
kultury GMO a ty pak posléze schválenými postupy inaktivují. V případě vynášení
předmětů mimo budovu vedoucí katedry rozhodne, které předměty nebudou
vynášeny, pokud by mohly být kontaminovány geneticky modifikovanými
organismy. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie řídí požárním a
havarijním řádem (umístěným v každé GMO laboratoři).
2) povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postupů
sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postupů dekontaminace
nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů).
Postup sanitace prostorů a zařízení a postup dekontaminace nástrojů při
ukončení pracovní činnosti se řídí podle charakteru činnosti a určuje jej vedoucí
katedry.
Ochranné
oděvy,
kontaminované
geneticky
modifikovanými
mikroorganismy, se budou prát jako infekční materiál. Totéž se vztahuje na
ochranné pláště pro studenty poskytnuté přírodovědeckou fakultou. Samostatný
sběr a oddělená, isolovaná přeprava do prádelny Olomouc adresa: Prádelnamandlovna, Sovová Martina, Neředínská 55, 779 00 Olomouc. Používané ochranné
rukavice na jedno použití budou likvidovány s ostatním GMO odpadem.
3) systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření
Kontroly budou prováděny proškolenými pracovníky paralelně s požární
kontrolou s četností 4x ročně. Zápis o každé kontrole bude parafován vedoucím
příslušné katedry.
4) povinnosti pracovníků při údržbě
Pracovníci údržby jsou při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO
povinni dbát pokynů vedoucího katedry, v jejíchž prostorách údržbu provádějí.
Pracovníci údržby jsou povinni při údržbářských pracích v prostorách pro práci
s GMO používat pláště pro práci s rekombinantní DNA (se značkou Biohazard),
které není možno používat mimo laboratoře pro GMO.
5) zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních
právních předpisů
Pracovníci, včetně studentů, mají povinnost používat v prostorách pro práci
s rekombinantní DNA pláště.
6) způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty,
zejména postupy zneškodnění geneticky modifikovaného organismu a způsob
kontroly jejich účinnosti
Geneticky modifikované rostliny jsou likvidovány autoklávováním ve
speciálních plastových pytlích. Geneticky modifikované bakterie jsou likvidovány
autoklávováním nebo desinfekčním roztokem (chlornan sodný, chloramin, Ajatin
Incidur v koncentracích doporučených výrobcem).
6
7) seznam povinných pracovních pomůcek a prostředků osobní ochrany
s uvedením činností, ke kterým musí být používány
Ochranný plášť při práci v prostorech s GMO nesmí být používán mimo
prostory určené pro práci s rekombinantní DNA. Jednorázové gumové rukavice jsou
používány při práci s mikroorganismy a s elektroforézou DNA.
8) zakázané činnosti na pracovišti
V laboratořích a prostorách pro geneticky modifikované rostliny je zakázáno
jíst, pít a kouřit.
9) zásady vedení pracovních protokolů
Každá činnost s GMO musí být denně zapisována do pracovního protokolu s
vyznačením data zápisu. Každý pracovník si vede svůj pracovní protokol.
10) zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a
kontrolách zabezpečovacích prvků
Ke každému nákladnému investičnímu přístroji patří sešit, do kterého se
zapisuje pracovník, datum a hodiny využití přístroje. Tamtéž se zapisují záznamy o
prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků.
11) opatření k zabránění vstupu nepovolaných osob
Laboratorní prostory jsou rozděleny na laboratorní komplexy a funkční
jednotky pracující s GMO a jsou označeny. Součástí laboratorního komplexu je i
kultivační místnost. Proškolení zaměstnanci umožní do prostor vstup pouze
proškoleným studentům PřF UP, kteří v rámci studia v jednotce pracují. Kultivační
místnosti a boxy jsou uzamčeny a na dveřích označeny značkou Biohazard.
Pověření pracovníci do nich mají přístup pouze ve speciálních pláštích, označených
značkou Biohazard, které jsou nošeny pouze v těchto prostorách. Pro běžné
návštěvy jsou vyhrazeny klidové pracovny.
12) režim v laboratořích
V laboratořích se pracuje jak s mikrobiálními kulturami, tak s kulturami
rostlin, ošetřenými geneticky modifikovanými (GM) bakteriemi Agrobacterium.
Plasmidy jsou udržovány v kmenech bakterie Escherichia coli nebo kvasinek
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris. K vědeckým účelům se experimentuje s
transgenními GM bakteriemi, rostlinnými pletivy a dále se sterilně i nesterilně
kultivovanými transgenními (GM) rostlinami. Proto je třeba zachovávat pravidla
platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak pro práci s transgenním
rostlinným materiálem.
Likvidace tekutých odpadů a GMO: Agarové a tekuté kultury je možno
likvidovat až po autoklávování nebo jiném vhodném ošetření (např. u tekutých
kultur po sterilizaci účinným desinfekčním prostředkem, např. roztokem chlornanu
sodného, Incidur). Pevné odpady, obsahující GMO, jakož i nádoby a pomůcky, které
přišly do kontaktu s GMO je nutno bezprostředně po manipulaci umístit do
sterilizačních pytlů a poté inaktivovat v parním sterilizátoru. Odpadní vody,
obsahující GMO je nutno vylévat do nádob s chloraminem či chlornanem sodným.
V laboratořích není dovoleno jíst, pít a kouřit. V laboratořích kde se pracuje s GMO
je nutno nosit plášť k této práci určený. Při práci s GMO budou používány ochranné
rukavice.
7
13) režim v kultivačních místnostech
V kultivačních místnostech se pracuje s mikrobiálními kulturami, rostlinnými
pletivy a s kulturami rostlin, které obsahují vnesenou cizorodou DNA. Tyto rostliny
jsou kultivovány ve sterilních i nesterilních podmínkách. Proto je třeba zachovávat
pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak pro práci s
transgenním rostlinným materiálem. Kultivační místnosti jsou označeny popisem
„Zákaz vstupu nepovolaným osobám“. Vstup do těchto prostor je povolen jen
v pracovním plášti. O likvidaci tekutých a pevných odpadů a odpadní vody platí
totéž, co pro práci v laboratořích. Přeprava geneticky modifikovaných rostlin do
laboratoří a z kultivační místnosti se provádí jen v uzavřených nádobách.
14) přepravování GMO materiálu mezi jednotlivými prostorami, určenými pro
práci s GMO na pracovišti PřF UP v Olomouci
Přeprava bakteriálních kultur: bakteriální kultury ve skleněných nádobách je
nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech. Přeprava rostlin kultivovaných
v půdě a obsahujících semena, květy nebo části, schopné vegetativní reprodukce
(výhony, oddenky, semena): Nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech. Přeprava
GMO mimo areál pracoviště PřF UP v Olomouci – Holice je možná jen v uzavřených
kontejnerech.
15) ostatní zásady
Se všemi transgenními rostlinami zacházet jako s potencionálně nebezpečným
transgenním materiálem až do té doby, než se bezpečně prokáže, že jím nejsou.
Pokud jsou rostlinná pletiva, pěstována in vitro v suspenzích nebo agarových
kulturách, kultivována společně s bakteriemi A. tumefaciens nebo obsahující
bakterie, je třeba s nimi zacházet jako s bakteriálním materiálem. Musí se proto
autoklávovat veškeré sklo a nástroje, které přišly do styku s tímto materiálem.
Pracovníci by se měli převlékat, uchovávat protokoly po dobu 10-ti let, předběžně
schvalovat pokusy a znát havarijní plán. Pokusy musí být řádně označeny a musí
být zabráněno vstupu nepovolaným a neinformovaným osobám.
8
Laboratorní úloha č. 1
Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její
restrikční analýza
Cíl laboratorní úlohy
Naučit se izolovat plasmidovou DNA, naučit se pracovat s DNA in silico za
pomocí dostupného softwaru, naplánovat, nastavit a vyhodnotit restrikční analýzu
plasmidové DNA.
Očekávaný výsledek
Identifikace plasmidu a genu v neznámém bakteriálním kmeni.
Teoretický úvod
Bakterie Escherichia coli stejně jako ostatní prokaryota obsahují kromě velké
jaderné genomové DNA (milióny nukleotidů) ještě menší kruhové DNA nazývané
plasmidy. Ty jsou mnohem menší, řádově tisíce nukleotidů a jejich uměle
syntetizované napodobeniny se často využívají při klonování a genetických
manipulacích. Při těchto manipulacích je často potřeba narušit kruhovou strukturu
plasmidů tak, aby bylo možné do plasmidu integrovat další fragment DNA –
nejčastěji gen z jiného organismu. Pro linearizaci plasmidů a obecně štípání
uvnitř molekul DNA se využívá tzv. restrikčních enzymů neboli endonukleas. Ty
jsou schopny štěpit na určitých pozicích DNA a to specificky, rozpoznávaje krátkou
sekvenci po sobě jdoucích nukleotidů označovaných jako palindrom. Restrikčních
endonukleas přitom existuje celá řada, pochází většinou z různých bakterií a každá
z nich je specifická pro štípání jedinečné sekvence palindromu uvnitř DNA. Tyto
enzymy jsou připravovány komerčně a označují se zkratkami a to kurzívou podle
rodu a druhu původního organismu (bakterie), velkým písmenem podle kmene a
římskou číslicí podle pořadí v organismu:
např. EcoRI:
Zkratka
E
co
R
I
Popis
Escherichia
coli
RY13
první identifikovaný
Význam
rod
druh
kmen
pořadí identifikace
Restrikční endonukleasy se liší způsobem štípání dvouvláknové molekuly DNA
a na základě toho je můžeme rozdělit do dvou skupin. První skupinu tvoří
endonukleasy, které po štípání vytvářejí lepivé konce, což znamená, že jedno
z vláken naštípané DNA je delší, přesahující přes druhé. Druhou skupinu pak tvoří
endonukleasy, které vytvářejí tupé konce, kdy obě vlákna jsou naštípána na stejné
pozici sekvence a konce jsou tedy stejně dlouhé, žádný nukleotid nepřesahuje
dvouvláknovou DNA.
Příklad vzniku lepivých konců:
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
po štípání
9
G
CTTAA
AATTC
G
Příklady restrikčních endonukleas:
BsaI GGTCTCnnnnn
CCAGACnnnnn
EcoRI GAATTC
CTTAAG
EcoRV GATATC
CTATAG
HindIII AAGCTT
TTCGAA
PstI CTGCAG
GACGTC
SmaI
SphI
XbaI
CCCGGG
GGGCCC
GCATGC
CGTACG
TCTAGA
AGATCT
Při separaci malých množství DNA a jejích fragmentů se dnes rutinně používá
elektroforéza v agarosovém gelu, která se stala jednou ze základních technik
molekulární biologie. Agarosa je součástí agaru, což je směs polysacharidů
obsažených v některých mořských řasách. Vedle agarosy (rozvětvený polysacharid
složený z D-galaktopyranosy a 3,6-dehydro-L-galaktopyranosy) obsahuje agar ještě
rozvětvený polysacharid agaropektin. Vizualizace DNA se provádí většinou pomocí
ethidium bromidu, který se interkaluje do zářezů ve šroubovici DNA a při ozáření
UV světlem fluoreskuje. Již po několikaminutové inkubaci je pak možné detekovat
DNA o množství od 5 ng. S výhodou se toto barvení používá i při izolacích
specifických fragmentů DNA při klonování, protože vazba ethidium bromidu je
reverzibilní. Jedná se ovšem o karcinogenní látku, a proto při práci s ní je nutné
dodržovat zvýšená bezpečnostní opatření!
Materiál a chemikálie

LB-Amp médium (1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, pH upraveno
na 7,5 pomocí NaOH, autoklávováno, po ochlazení přidat ampicilin do výsledné
koncentrace 100 g/ml). Uchovávat při +4°C.

Kultury E. coli obsahující plasmidy s Ampr genem (resistence vůči ampicilinu)
rozpěstované na pevném LB-Amp médiu (Petriho misce)

Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno
0,1 mg/ml Rnasy A)

Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno)

Roztok P3 (3 M octan draselný, pH 5,5; autoklávováno)

Isopropanol 100%

Ethanol 70%, vychlazený v mrazničce, uchovávat při -20°C

TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA)

Agarosa 1% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM EDTA)

Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM
EDTA, pH 8,0)

Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0;
0,125% bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť

DNA standard GeneRuler 1 kb marker a DNA standard GeneRuler 100 bp
marker

Ethidium bromid 10%
10
Vybavení a pomůcky

UV spektrofotometr, křemenná kyveta, mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky),
stojan na mikrozkumavky, sterilní párátka, termobloky 2x, elektroforéza:
horizontální elektroforetická komůrka s hřebínky, zdroj, transiluminátor,
AlphaDigiDoc software, systém pro digitální fotodokumentaci gelů;
automatické mikropipety, špičky, PC vybavené programem BioEdit,
inkubovaná orbitální třepačka 37°C, stolní pikofuga, stopky, vortex, chlazená
mikrocentrifuga pro izolaci plasmidové DNA, mrazící stojánek -20°C.
Experimentální postupy
1. DEN
a) Napěstování bakteriální kultury nesoucí plasmid

Ve sterilních podmínkách laminárního boxu si do sterilní zkumavky
napipetujeme 2 ml LB-Amp média, které inokulujeme sterilním párátkem
neznámou bakteriální kolonií nesoucí plasmid s resistencí k ampicilinu (misku
s neznámým kmenem vydá vedoucí cvičení). Každý student si připraví
minimálně dvě kultury.

Kulturu inkubujeme přes noc při 37°C na třepačce při 160 rpm.
2. DEN
b) Mikroizolace plasmidové DNA
Následující izolace plasmidové DNA je založena na principu metody izolace
nukleových kyselin pomocí lýze buněk (roztoky P1 a P2), vysrážení nežádoucích
proteinů s následující neutralizací DNA pomocí roztoku P3 a precipitací pomocí
isopropanolu.

1,5 ml kultury inkubované přes noc přeneseme do mikrozkumavek,
centrifugujeme při 5.000 g 5 min (separace buněk od média), médium
odlijeme.

Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet resuspendujeme pomocí vortexu
do úplné homogenizace.

Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme převrácením mikrozkumavky 6x,
ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.

Přidáme 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým
mikrozkumavky v ruce, ponecháme stát 5 min v ledové tříšti.

Centrifugujeme při 13.000 g, 4°C, 10 min, supernatant přelijeme do nových
mikrozkumavek.

K supernatantu přidáme 0,6 ml isopropanolu, centrifugujeme při 14.000 g, 10
min, supernatant odlijeme. Při vkládání mikrozkumavek do centrifugy dbáme
jejích orientace tak, abychom věděli, kde očekávat téměř neviditelný pelet
plasmidové DNA. Přítomnost peletu ověříme překlopením obsahu
mikrozkumavky, pelet na stěně mikrozkumavky mění lom světla jako
povrchová nerovnost, což je často jediným příznakem jeho přítomnosti.

Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20°C), čímž nám pelet
nepatrně zbělá. Centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, supernatant odlijeme,
jeho zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme. Dbáme
11
převrácením
dokonalého odpipetování veškerých zbytků ethanolu. Pelet DNA ponecháme
sušit 10-15 min v laminárním boxu.

Sraženinu DNA resuspendujeme pipetováním v 20 µl TE pufru.
c) Spektrální stanovení DNA
Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance
je při 260 nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší
přítomnost proteinů (280 nm) a aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý,
poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 1,9. Při naší preparační metodě lze množství
získané DNA přibližně vypočítat podle vztahu (vyplývajícího z Lambert Beerova
zákona se započtením korekce čistoty):
cDNA (g/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280 * 100
Do 0,1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA
(10-100x). Na stanovení koncentrace spotřebujeme maximálně třetinu objemu
izolované DNA. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340
nm proti TE pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm.
d) Restrikční analýza DNA
Cílem je nejprve se naučit pracovat se sekvencemi nukleových kyselin in silico
(bude provedeno vedoucím cvičení hromadně před začátkem laboratorního cvičení).
Úkolem studenta v této úloze je navrhnout restrikční analýzu tak, aby bylo možné
z velikosti fragmentů po elektroforéze určit, o který ze šesti možných kombinací
plasmidů s genem se jedná a popřípadě jak je gen v plasmidu orientovaný.
Studenti mají k dispozici následující restrikční enzymy: BsaI, EcoRI, EcoRV,
PstI, SmaI a XbaI a jejich příslušné reakční pufry. Enzymy je nutné během
pipetování reakcí udržovat neustále při teplotě -20°C pro uchování jejich aktivity –
použij mrazicí stojánek!
Samotné plánování restrikční analýzy spočívá v citlivém zvážení veškerých
podmínek, které musí být splněny pro úspěšnost analýzy. To zahrnuje ideální
objem reakce, vhodnou koncentraci správného pufru, ideální koncentraci DNA,
množství použitých enzymů případně jejich vzájemný poměr při štípání více enzymy
naráz. Rovněž doba štípání hraje v analýze roli. Pozor, ne všechny restrikční
endonukleasy štěpí při 37°C.
V případě potřeby štěpit dvěma či více enzymy současně se studenti seznámí
se strategií pro tento typ analýz v on-line aplikacích firem vyrábějících restrikční
enzymy, DoubleDigest (New England Biolabs) nebo Thermo Scientific, a k dispozici
jim bude univerzální restrikční pufr YTango®.
Příprava reakce:
Do 0,5 ml ependorfky pipetujeme (v tomto pořadí):
2,0 μl
x μl
x μl
0,3 μl
pufru (optimálního pro danou restrikci)
izolovaného vzorku DNA (0,8-2,0 μg DNA)
vody pro PCR do celkového objemu 20 μl
vhodné restrikční endonukleasy (během
v mrazícím stojánku!)
pipetování
uchovávat
Reakce inkubujeme 2 h nebo přes noc při 37°C (v případě SmaI při 30°C). Pro naše
potřeby není nutné enzymy inaktivovat.
12
TIP: Enzymy jsou skladovány v glycerolu, při pipetování je nutné dbát postupu pro
pipetování viskózních roztoků!!!
e) Agarosová elektroforéza DNA

Poskládáme si vnitřní část horizontální elektroforetické komůrky, utěsníme
kraje a připravíme si potřebný hřebínek pro vytvoření jamek v gelu.

Do Erlenmayerovy baňky si odlijeme 50 ml 1% agarosy v 1x TAE (uložena
v inkubátoru na 65°C), přidáme 40 μl 10% ethidium bromidu (POZOR
KARCINOGEN, DBÁT BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ, POUŽÍT NITRILOVÉ
RUKAVICE, PRACOVAT V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!) a dobře promícháme.
Pracujeme rychle, agarosa začíná tuhnout při 50°C.

Do připravené komůrky nalijeme asi 0,5 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1
cm od čela komůrky vložíme hřebínek a ujistíme se, že hřebínek zasahuje
minimálně polovinou výšky zubů do vrstvy nalité agarosy. Gel ponecháme
ztuhnout asi 20 min.

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorku DNA (20 l) pipetujeme 5
l vzorkovacího pufru.

Po ztuhnutí gelu opatrně odstraníme hřebínek a postranní plastové desky a
připravený gel na podnosu vložíme do elektroforetické vany.

Nalijeme cca 200 ml elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s
agarosovým gelem. Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.

Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA GeneRuler 1 kb marker.

Pipetujeme 15 μl každého vzorku. Nezapomeneme si zaznamenat pořadí a
polohu nanesených vzorků.

Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 100bp
GeneRuler.

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke
zdroji napětí 120 V po dobu 30 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat
podle pohybu pásů barev obsažených ve vzorkovacím pufru, přičemž spodní
pás odpovídá DNA o velikosti 300 bp a horní 3000 bp.

Vypneme zdroj, odpojíme elektrody, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel
pomocí plastového podběráku. Přeneseme na UV transiluminátor a pořídíme
snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení. Používáme
ochranné rukavice a dbáme předpisů pro práci s ethidium bromidem,
který je obsažen v gelu!
Uchovávání získaného materiálu
Pokud nepokračujeme v experimentu týž den, zamrazíme DNA při -20°C. Po
ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA
zlikvidujeme dle pokynů o nakládání s GMO.
13
Vyhodnocení výsledků
Na základě pohyblivosti vzorku DNA v elektroforéze je možné porovnáním se
standartem metodou kalibrační křivky (použijeme software) zjistit její velikost. Ta se
udává v počtu nukleotidů, obvykle označovaném jako kb (tzv. "kilo base pair").
1) Zjistěte koncentraci DNA ve vašich vzorcích.
2) Určete velikost izolované plasmidové DNA na základě její elektroforetické
pohyblivosti a velikosti jednotlivých naštípaných fragmentů (ilustruje Obr. 1).
3) Na základě získaných výsledků a s pomocí informací získaných z obrázků 2 až
5 rozhodněte, který plasmid jste izolovali a který ze tří možných genů a v jaké
orientaci nesl.
4) Zjistěte z literatury, co znamenají zkratky ocDNA a cccDNA, uvedené u
vzorového snímku DNA elektroforézy (Viz. Obr. 1).
5) Jak lze matematicky popsat závislost velikosti DNA na její elektroforetické
pohyblivosti?
Obrázek 1. Agarosová elektroforéza DNA, barvení ethidium bromidem. DNA
izolovaná z E. coli DH5 nesoucí plasmid pAO101: 1) vzorek štěpený restrikční
endonukleasou EcoRI, 2) vzorek štěpený restrikčními endonukleasami HindIII a
PstI, 3) nenaštěpený vzorek, M) marker - DNA bakteriofága  štěpená HindIII.
genomová DNA
1
1
2
2
ocDNA
cccDNA
3 3
M
kbp
23,1
9,4
6,6
4,4
2,3
2,0
0,5
0,12
14
Obrázek 2. Mapy dvou klonovacích vektorů pYES2 (Invitrogen) a pDRIVE (Qiagen)
s vyznačenou klonovací kazetou obsahující specifická místa pro klonovací restrikční
enzymy (multiple cloning site). Sekvence plasmidů jsou dostupné v databázi
GenBank, případně na stránkách uvedených firem.
15
Obrázek 3. Sekvence genu AtCKX2 (GenBank kód: AF303978), HvCKX2 (AF540382) a
gHvCKX2 (AF490591). Uvedené kódy genů použijte pro získání sekvencí genů
z databáze GenBank.
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ATGGCTAATC TTCGTTTAAT GATCACTTTA ATCACGGTTT TAATGATCAC CAAATCATCA AACGGTATTA AAATTGATTT ACCTAAATCC CTTAACCTCA
CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT
CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
CCCTCTCTAC CGATCCTTCC ATCATCTCCG CAGCCTCTCA TGACTTCGGA AACATAACCA CCGTGACCCC CGGCGGCGTA ATCTGCCCCT CCTCCACCGC
ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CTGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC
ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CAGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
TGATATCTCT CGTCTCCTCC AATACGCCGC AAACGGAAAA AGTACATTCC AAGTAGCGGC TCGTGGCCAA GGCCACTCCT TAAACGGCCA AGCCTCGGTC
CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT
CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
TCCGGCGGAG TAATCGTCAA CATGACGTGT ATCACTGACG TGGTGGTTTC AAAAGACAAG AAGTACGCTG ACGTGGCGGC CGGGACGTTA TGGGTGGATG
CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG
CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
TGCTTAAGAA GACGGCGGAG AAAGGGGTGT CGCCGGTTTC TTGGACGGAT TATTTGCATA TAACCGTCCG AGGAACGTTG TCGAATGGTG GAATTGGTGG
GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA
GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
TCAAGTGTTT CGAAACGGTC CTCTTGTTAG TAACGTCCTT GAATTGGACG TTATTACTGG GAAAGGTGAA ATGTTGACAT GCTCGCGACA GCTAAACCCA
GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT
GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610
620
630
640
650
660
670
680
690
700
GAATTGTTCT ATGGAGTGTT AGGAGGTTTG GGTCAATTTG GAATTATAAC GAGAGCCAGA ATTGTTTTGG ACCATGCACC TAAACGGGCC AAATGGTTTC
TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGAAGAGGTG ATATTGTCAC
TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGTATGAACT GGCCTTTATA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
710
720
730
740
750
760
770
780
790
800
GGATGCTCTA CAGTGATTTC ACAACTTTTA CAAAGGACCA AGAACGTTTG ATATCAATGG CAAACGATAT TGGAGTCGAC TATTTAGAAG GTCAAATATT
TTGCTCACCA GAACAGAACT CTGATCTCTT CCGTGCTGCT CTTGGTGGTC TGGGTCAGTT TGGCATCATT ACTCGGGCCA GGATCGCACT TGAGCCTGCT
TTAAGTTGAT TTGAATAACT CGAAGAGTAA AGAATGTAGC TAACTTTGTA CCATGATTTT CAAATGCAGG AAGAGGTGAT ATTGTCACTT GCTCACCAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
810
820
830
840
850
860
870
880
890
900
TCTATCAAAC GGTGTCGTTG ACACCTCTTT TTTCCCACCT TCAGATCAAT CTAAAGTCGC TGATCTAGTC AAGCAACACG GTATCATCTA TGTTCTTGAA
CCACAAATGG TGAGGTGGAT AAGAGTTCTC TACTTAGATT TCATGAGCTT CACCGAGGAT CAGGAGATGC TTATTTCAGC AGAGAAGACC TTCGACTACA
ACAGAACTCT GATCTCTTCC GTGCTGCTCT TGGTGGTCTG GGTCAGTTTG GCATCATTAC TCGGGCCAGG ATCGCACTTG AGCCTGCTCC ACAAATGGTA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
910
920
930
940
950
960
970
980
990
1000
GTAGCCAAGT ATTATGATGA TCCCAATCTC CCCATCATCA GCAAGGTTAT TGACACATTA ACGAAAACAT TAAGTTACTT GCCCGGGTTC ATATCAATGC
TTGAAGGTTT CGTTATCATA AACAGAACAG GCATCCTAAA CAACTGGAGG TCATCGTTCA ATCCACAGGA CCCAGAGCGG GCTAGCCGGT TCGAAACAGA
AATCGCGAGA ACTCATCTGT GACAACCCCA TGCTAGTACA TCTTAGTAAG CATATGCTCA TGAGTTCATT GGATGTACAA TAGGTGAGGT GGATAAGAGT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1010
1020
1030
1040
1050
1060
1070
1080
1090
1100
ACGACGTGGC CTACTTCGAT TTCTTGAACC GTGTACATGT CGAAGAAAAT AAACTCAGAT CTTTGGGATT ATGGGAACTT CCTCATCCTT GGCTTAACCT
CAGAAAAGTG CTCTTCTGCC TCGAGATGAC AAAGAACTTC AACCCTGAAG AAGCTGACAT CATGGAACAG GAGGTCCATG CACTACTATC TCAACTTAGA
TCTCTACTTA GATTTCATGA GCCTCACCGA GGATCAGGAG ATGCTTATTT CAGCAGAGAA GACCTTCGAC TACATTGAAG GTTTCGTTAT CATAAACAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1110
1120
1130
1140
1150
1160
1170
1180
1190
1200
CTACGTTCCT AAATCTCGGA TTCTCGATTT TCATAACGGT GTTGTCAAAG ACATTCTTCT TAAGCAAAAA TCAGCTTCGG GACTCGCTCT TCTCTATCCA
TACACACCAG CCTCCTTATT CCACACGGAC GTCACTTACA TTGAGTTCTT GGATAGGGTG CACTCCTCTG AGATGAAGCT GAGAGCTAAG GGCTTGTGGG
ACAGGCATCC TAAACAACTG GAGGTCATCG TTCAATCCAC AGGACCCAGA GCGGGCTAGC CGGTTCGAAA CAGACAGAAA AGTGCTCTTC TGCCTCGAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1210
1220
1230
1240
1250
1260
1270
1280
1290
1300
ACAAACCGGA ATAAATGGGA CAATCGTATG TCGGCGATGA TACCAGAGAT CGATGAAGAT GTTATATATA TTATCGGACT ACTACAATCC GCTACCCCAA
AAGTCCCACA CCCATGGCTT AATCTCATCA TACCAAGAAG CACTATCCAT ACATTTGCAG AGCAGGTCTT TGGGAAAATC CTCGAAGATA ACAACAATGG
TGACAAAGAA CTTCAACCCT GAAGAAGCTG ACATCATGGA ACAGGTAAGC CGACGATTAA TCCTTGTGTT ACTAAAGATG TTTATGTATG AAGTGCTATC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1310
1320
1330
1340
1350
1360
1370
1380
1390
1400
AGGATCTTCC AGAAGTGGAG AGCGTTAACG AGAAGATAAT TAGGTTTTGC AAGGATTCAG GTATTAAGAT TAAGCAATAT CTAATGCATT ATACTAGTAA
TCCCATATTG CTCTACCCAG TGAAGAAGTC CAGATGGGAC AACCGAACGT CAGTGGTCAT ACCAGATGAG GAAGTTTTCT ACCTGGTGGG ATTCCTATCC
AGGTGGCCTG AGTGGTTGAA TTCCATATGT ATATGTGTTT ACAGGAGGTC CATGCACTAC TATCTCAACT TAGATACACA CCAGCCTCCT TATTCCACAC
16
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1410
1420
1430
1440
1450
1460
1470
1480
1490
1500
AGAAGATTGG ATTGAGCATT TTGGATCAAA ATGGGATGAT TTTTCGAAGA GGAAAGATCT ATTTGATCCC AAGAAACTGT TATCTCCAGG GCAAGACATC
TCGGCGATAG GCCCCCACAG CATCGAACAT ACATTGAACC TGAACAACCA GATAATAGAG TTCTCTAACA AAGCAAGTAT TGGGGTGAAG CAATATCTTC
GGACGTCACT TACATTGAGT TCTTGGATAG GGTGCACTCC TCTGAGATGA AGCTGAGAGC TAAGGGCTTG TGGGAAGTCC CACACCCATG GCTTAATCTC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1510
1520
1530
1540
1550
1560
1570
1580
1590
1600
TTTTGA.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
CAAACTACAC CACAGAACCC GAGTGGAAGG CCCACTATGG GGCTAGGTGG GACGCATTTC AACAGAGGAA AAACACCTAT GACCCCCTGG CAATCCTAGC
ATCATACCAA GAAGCACTAT CCATACATTT GCAGAGCAGG TCTTTGGGAA AATCCTCGAA GATAACAACA ATGGTCCCAT ATTGCTCTAC CCAGTGAAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1610
1620
1630
1640
1650
1660
1670
1680
1690
1700
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TCCAGGACAG AAAATATTTC AAAAGAAACC AGCATCACTA CCCTTGTCCT CGTTACAGTA CCTACTGTAA AAAATATATA TGTGGAGCAA TATGTCTATG
AGTCCAGGTA AGTTAGCTAA TGTCCCGTAA TAACAAATCC CATTCAGAAA CTATTATACA CCACGCCATA GTGTTGCCAA GTGAATGATT CATCTTGTTT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1710
1720
1730
1740
1750
1760
1770
1780
1790
1800
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TTAGTATGGA ACTATAGTCG CTTTGCAAAA GATAACGAAC TGCAGCGTGA AGGACACTGT ACAGAGTAGT GACTATTAGT AGTGGTGATG CTCAAAATAC
CATGCAGATG GGACAACCGA ACGTCAGTGG TCATACCAGA TGAGGAAGTT TTCTACCTGG TGGGATTCCT ATCCTCGGCG ATAGGCCCCC ACAGCATCGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1810
1820
1830
1840
1850
1860
1870
1880
1890
1900
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TTTTAGCACT GAGATCAATG AAGATCAGC. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
ACATACATTG AACCTGAACA ACCAGATAAT AGAGTTCTCT AACAAAGCAA GTATTGGGGT GAAGCAATAT CTTCCAAACT ACACCACAGA ACCCGAGTGG
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1910
1920
1930
1940
1950
1960
1970
1980
1990
2000
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AAGGCCCACT ATGGGGCTAG GTGGGACGCA TTTCAACAGA GGAAAAACAC CTATGACCCC CTGGCAATCC TAGCTCCAGG ACAGAAAATA TTTCAAAAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2010
2020
2030
2040
2050
2060
2070
2080
2090
2100
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AACCAGCATC ACTACCCTTG TCCTCGTTAC AGTACCTACT GTAAAAAATA TATATGTGGA GCAATATGTC TATGTTAGTA TGGAACTATA GTCGCTTTGC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2110
2120
2130
2140
2150
2160
2170
2180
2190
2200
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AAAAGATAAC GAACTGCAGC GTGAAGAACA CTGTACAGAG TAGTGACTAT TAGTAGTGGT GATGCTCAAA ATACTTTTAG CACTGAGATC AATGAAGATC
...
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
...
...
AGC
17
Obrázek 4. Sekvence klonovací kazety vektoru pDRIVE (Qiagen) s vyznačenými
restrikčními místy. (Poznámka: všechny tři geny byly do vektoru naklonovány
pomocí TA klonování).
18
Obrázek 5. Sekvence klonovací kazety vektoru pYES2 (Invitrogen) s vyznačenými
restrikčními místy (Poznámka: v případě genů HvCKX2 a gHvCKX2 byly do vektoru
překlonovány z vektoru pDRIVE pomocí restrikčních enzymů SphI a HindIII, v
případě genu AtCKX2 byl gen do vektoru naklonován pomocí restrikčního enzymu
KpnI).
Literatura

Harwood A.J. (1996). Basic DNA and RNA Protocols. Methods in Molecular
Biology Vol.58, Humana Press Totowa, NJ, USA.
19
Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách
pomocí PCR
Naučit se izolaci DNA z potravin a surovin a analyzovat vzorky pomocí PCR
s klasickou end-point detekcí v agarosové elektroforéze. Studenti si mohou donést
k analýze vlastní vzorky potravin obsahující sóju anebo kukuřici.
Zjistit přítomnost GMO ve vzorcích potravin.
Teoretický úvod
Důležitým aspektem studia biochemie je získat zkušenosti s novými
metodikami molekulární biologie, které mohou být využity v biotechnologickém
průmyslu. Detekce geneticky modifikovaných organismů (GMO) je typickým
příkladem, který má široké uplatnění v zemědělství a potravinářství.
Názory na geneticky modifikované organismy jsou v současné době
rozporuplné nejen mezi laickou veřejností, ale i mezi vědeckou komunitou.
Geneticky modifikované rostliny mohou například vést ke zvýšení výnosů
prostřednictvím zvýšené resistence k chorobám a škůdcům. Na druhou stranu,
mohou takovéto organismy ohrožovat životní prostředí svojí umělou vysokou
resistencí a možným rozšířením do přírody. Sekundární efekty na životní prostředí a
na lidstvo mohou být dlouhodobé a lze je zatím jen velmi těžko odhadovat. Toto je
jedním z hlavních důvodů, proč v některých zemích lobující skupiny prosadily
důslednou kontrolu produkce geneticky modifikovaných rostlin a snaží se zamezit
jejich širšímu používání. V Evropských zemích musí být přítomnost geneticky
modifikovaných organismů v potravinách v současné době uvedena. Výrobci tak
musí garantovat, že geneticky modifikované organismy nejsou přítomny v jejich
surovinách, pokud uvádějí na trh výrobek deklarovaný jako GMO free.
Kromě spolehlivosti detekce GMO v surovinách je kladen důraz i na rychlost
průkazu. Proto jsou v referenčních laboratořích využívány metody molekulární
biologie, konkrétně PCR (Polymerázová řetězová reakce, z anglického Polymerase
Chain Reaction) se specifickými primery detekujícími standardně používané
transgeny.
V tomto experimentu je použito PCR k určení
v analyzovaných vzorcích. PCR probíhá ve třech fázích:
přítomnosti
GMO
1) tepelná denaturace dvouvláknové DNA,
2) navázání/nasednutí primerů na specifické sekvence ochlazením (annealing)
3) narůstání řetězců DNA prodlužováním primerů (elongace).
Tyto tří kroky představují jeden cyklus a PCR je založena na opakování
takovéhoto cyklu, při němž dochází k exponenciálnímu nárůstu (2n, kde n je počet
cyklů) množství specifického úseku DNA ohraničeného primery. To znamená, že po
30 cyklech je tento úsek amplifikován více než 109x a může být snadno detekován
v elektroforéze na agarosovém gelu.
20
K detekci GMO v analyzovaných vzorcích budou používány primery specificky
navržené pro detekci dvou typů genů - rostlině vlastních a cizorodých transgenů.
Rostlině vlastní geny jsou detekovány jako kontrola přítomnosti rostlinné DNA. Pro
tyto účely se nejčastěji používají tzv. endogenní geny (housekeeping genes).
V našem případě budou použity primery pro následující geny: konzervovaný gen pro
tRNA-leucinu kódovaný na chloroplastové DNA, gen sojového lektinu a kukuřičného
aktinu. Druhá sada primerů amplifikuje sekvence, které se v rostlinách normálně
nevyskytují, ale jsou vnášeny genetickou transformací. V našem případě jsou těmito
cizími transgeny DNA konstitutivně aktivní 35S promotor viru květákové mozaiky
(35S CaMV) a terminátor genu nopalin syntetasy (NOS) z Agrobacterium
tumefaciens. Pokud je kterákoliv z těchto sekvencí amplifikována, znamená to, že
vzorek obsahuje cizorodý transgen, GMO. Všechny povolené geneticky upravené
zemědělské plodiny byly transformovány s konstrukty obsahujícími jeden nebo oba
tyto prvky. PCR primery byly navrženy tak, aby pásy detekované na agarosovém
gelu měly různou pohyblivost (velikost, viz. Tab. 1) a byly tak snadno odlišitelné.
Tabulka 1. Primery použité pro PCR detekci geneticky modifikovaných rostlin.
Velikost
(bp)
Gen
Primery
Sekvence (5’-3’)
Chloroplastová DNA
CP3fw
CP4rev
CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
530
Sojový lektin
LEC1fw
LEC2rev
GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG
118
Kukuřičný aktin
ACTfw
ACTrev
AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA
CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA
101
35S promotor
CaMV1fw
CaMV2rev
GAAGGTGGCTCCTACAAATGCC
GTGGGATTGTGCGTCATCCC
199
NOS terminátor
NOS_Afw
NOS_Drev
GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG
GCGGGACTCTAATCATAAAAACCC
127
 Roztok S1 (10 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 0,5% Triton X-100,
autoklávováno)
 Roztok S2 (1% SDS, autoklávováno)
 Směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0)
 Isopropanol 100%
 Ethanol 70%, vychlazený v mrazničce (-20oC)
 TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA)
 Primery dle Tab. 1 (10 µM)
 Taq DNA polymerasa
 10 mM dNTP mix
 10x PCR pufr
21
 Agarosa 3% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM M EDTA, pH
8,0)
 Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM EDTA,
pH 8,0)
 Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0; 0,125
% bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť
 Ethidium bromid 10%
 DNA standard GeneRuler 50 bp marker a DNA standard GeneRuler 100 bp
marker nebo λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI
 Mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), PCR mikrozkumavky, PCR stripy s víčky,
stojánky, PCR box, termoblok, chladící stojánek pro PCR, mrazící stojánek (20°C), termocyklér (Biometra), elektroforéza: horizontální elektroforetická
komůrka s hřebínky, zdroj, AlphaDigiDoc software, systém pro digitální
fotodokumentaci gelů; automatické mikropipety, špičky, stolní pikofuga,
stopky, vortex, chlazená mikrocentrifuga pro izolaci DNA.
1. DEN
a) Extrakce DNA z rostlinného materiálu
Pro izolaci genomové DNA z potravin bude použita základní metoda pro izolaci
nukleových kyselin využívající směsi fenol/chloroformu/isoamylalkoholu. Ten, jako
nepolární rozpouštědlo rozděluje buněčný lyzát na dvě fáze, přičemž nukleové
kyseliny přecházejí do horní, vodné, ze které jsou v dalším kroku vysráženy
koncentrovaným ethanolem.

V třecí misce pomocí tloučku homogenizujeme připravený materiál na prach
(vlastní vzorky, nebo dodá vedoucí cvičení).

K 0,1 g vzorku přidáme 450 µl roztoku S1 a 250 µl roztoku S2, necháme
protřepávat 10 min na třepačce, centrifugujeme při 14.000 g 5 min při
laboratorní teplotě a supernatant přelijeme do čisté mikrozkumavky.

Přidáme 700 µl směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0; těsně
před odebráním směs protřepeme, SE SMĚSÍ PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ
DIGESTOŘI!!!), vortexujeme 15 s a centrifugujeme při 14.000 g 5 min, horní
vodnou fázi přepipetujeme do čisté mikrozkumavky.

Přidáme stejný objem isopropanolu (300 - 700 µl) jako byl objem horní vodní
fáze, vortexujeme 15 s a necháme stát 2 min při laboratorní teplotě.

Centrifugujeme při 14.000 g 10 min, supernatant odlijeme.

Precipitát promyjeme 500 µl 70% ethanolu (-20°C), centrifugujeme při 14.000
g 5 min, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a
odpipetujeme, ponecháme sušit 10-15 min v laminárním boxu.

Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 30 µl TE pufru.
22
b) PCR

Pro detekci jednotlivých fragmentů DNA nastavíme PCR pro každou z pěti sad
primerů viz. Tab. 1. Nezapomeneme napipetovat kontrolní reakce pro každý set
primerů, a to bez templátové DNA, kterou nahradíme vodou!

Do 0,2 ml PCR zkumavek na chladícím stojánku pro PCR pečlivě pipetujeme
(v PCR boxu) následující reagencie v tomto pořadí:
17,5
2,5
0,5
1,0
1,0
2,0
0,5
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
vody pro PCR
10x PCR pufru
dNTP mix
pozitivního (fw) primeru jako kapku na stěnu mikrozkumavky
negativního (rev) primeru jako kapku na stěnu mikrozkumavky
vzorku DNA
Taq DNA polymerasy (udržovat v mrazicím stojánku při -20°C !!!)

Vortexujeme a krátkou centrifugací dopravíme všechny reagencie na dno
zkumavek.

Na termocykléru nastavíme následující program pro PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Počáteční denaturace 94°C, 7 min
Denaturace 94°C, 30 sec
Navázání primerů (annealing) 60°C, 30 sec
Růst řetězce (elongace) 72°C, 1 min
Kroky 2-4 opakovat 40x
Koncová elongace 72°C, 10 min
Chlazení 10°C, 10 min
Vzorky vložíme do termocykléru pro amplifikaci a v mezičase si připravíme
agarosovou elektroforézu.
TIP: Taq DNA polymerasa je uchovávána jako každý enzym molekulární biologie
v pufru o vysoké koncentraci glycerolu. Při pipetování proto dbáme doporučení
pipetování viskózních roztoků. PCR je vysoce citlivá metoda, kterou je možno
odhalit již 1 molekulu DNA ve vašem vzorku. Dbáme proto zvýšené opatrnosti pro
zamezení vzájemné kontaminace vzorků a chemikálií.
c) Agarosová elektroforéza DNA



Do připravené komůrky nalijeme asi 0,8 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1
ztuhnout, cca 20 min.

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorkům po PCR (25 l)
pipetujeme 5 l vzorkovacího pufru.

23

agarosovým gelem.

Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.

Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA 100 bp GeneRuler
marker.


Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 50 bp
GeneRuler.


Pokud nepokračujeme v experimentu týž den, zamrazíme DNA při -20°C. Po
ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA
24
1) Porovnáme výsledek elektroforézy s Obr. 6 a z kalibrační křivky markeru
určíme přítomnost a velikost jednotlivých PCR produktů. Porovnáme
s očekávanou velikostí dle Tab. 1.
Obrázek 6. Výsledky PCR pro vzorky obsahující původní a transgenní rostliny
(sója).
2) Vyhodnoťte, který z předložených vzorků obsahuje transgenní rostliny a jaké?
3) Proč se pro PCR používá DNA polymerasa z termofilních organismů?
4) Zdůvodněte, proč byste v případě primerů CP3 a CP4 měli vždy u každé
rostliny dostat pozitivní výsledek a v případě primerů pro kukuřičný aktin
nikdy neamplifikujete aktin sójový?
5) Zamyslete se, proč jsou na vzrovém obrázku „čmouhy“ (anglicky smears) a
zda-li je něco podobného pozorovatelné rovněž na vašem gelu a proč?
Literatura

Thion L. et al. (2002). Detection of genetically modified organisms in food by
DNA extraction and PCR amplification. Biochem. Mol. Biol. Edu. 30, 51-55.
25
Genetická transformace kvasinek a ověření exprese pomocí
měření aktivity rekombinantního enzymu
Naučit se pracovat s kvasinkami, transformovat cizorodou DNA do
hostitelského organismu, připravit rekombinantní enzym v expresním systému,
měřit spektrofotometricky enzymovou aktivitu.
Příprava stabilní transgenní linie kvasinek Pichia pastoris nadexprimující
aktivní rekombinantní protein.
Teoretický úvod
Až donedávna mohly být studovány jen proteiny, které jsou v buňce přítomny
v relativně velkém množství. Pro detailní studium proteinu včetně krystalizace a
určení trojrozměrné struktury je třeba alespoň 0,1 g čistého proteinu což je v drtivé
většině nereálně obrovské množství. Pokud se totiž protein vyskytuje v zastoupení
kolem 1%, je nutné začít jeho purifikaci z několika set gramů buněk. Většina
z mnoha tisíců proteinů eukaryotní buňky včetně těch, které jsou pro život zcela
nezbytné, však tvoří jen zlomek tohoto zastoupení a je velice obtížné, ne-li nemožné,
získat byť jen několik mikrogramů čistého proteinu. Možnost přípravy většího
množství rekombinantního proteinu pomocí klonovacích technik genového
inženýrství tak byla revolucí v biochemii proteinů.
Pro produkci proteinů byly zkonstruovány speciální tzv. expresní vektory, které
jsou dnes již komerčně běžně dostupné v celé řadě speciálních variant. Obecně tyto
vektory (plasmidy) obsahují vhodné regulační sekvence a promotor pro daný
organismus (bakterie, kvasinky, kultury hmyzích nebo savčích buněk). Za sekvenci
promotoru se pak v těsné blízkosti vnáší (klonuje) sekvence genu pro protein
našeho zájmu. Připravené vektory pro expresi jsou vnášeny do hostitelských buněk
pomocí transformace. Promotor společně s regulačními sekvencemi zajišťuje
produkci
velkého
množství
mRNA
pro proteosyntézu
našeho
proteinu
v hostitelském organismu. Protože se vektory s každým buněčným dělením
replikují, vzniká populace buněk schopná vytvořit velké množství rekombinantního
proteinu (Viz. Obr. 7).
Pomocí technik molekulární biologie je v dnešní době připravována celá řada
enzymů používaných v medicíně (jako například insulin nebo plášťové proteiny virů
používané při očkování) nebo potravinářství (rekombinantní chymotrypsin
používaný v sýrařství).
26
Obrázek 7. Schéma přípravy rekombinantního proteinu.
V této laboratorní úloze připravíme rekombinantní enzym polyaminoxidasu
(PAO; EC 1.5.3.14) z kukuřice. Rostlinné polyaminoxidasy katalyzují katabolickou
oxidaci polyaminů sperminu a spermidinu za tvorby 1,3-diaminopropanu, peroxidu
vodíku a příslušných aminoaldehydů.
spermidin + O2 + H2O → 1,3-diaminopropan + 4-aminobutanal + H2O2
Obrázek 8. Katalytická reakce polyaminoxidasy (PAO) se substrátem spermidinem.
27
Pro expresi genu PAO v kvasinkách Pichia pastoris použijeme přenosový
expresní vektor mezi E. coli a P. pastoris. To znamená, že vektor obsahuje regulační
sekvence spolu s geny pro resistenci pro kvasinky i bakterie zároveň. V našem
případě se jedná o gen resistence k bleomycinovému typu antibiotika – zeocinu. Pro
expresi genu MPAO je použit silný konstitutivní kvasinkový promotor GAP (pro
enzym glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu) a terminátor AOX1 (pro enzym
alkoholoxidasa 1) (Viz. Obr. 9). Transformaci kvasinek provedeme linearizovaným
plasmidem metodou elektroporace, po které dojde k integraci linearizované DNA do
genomu hostitele v procesu homologní rekombinace (Viz. Obr.10).
Lokalizaci peptidu na úrovni buněčných organel zajišťuje signální peptid
obsažený přirozeně v sekvenci genu. Pro přípravu rekombinantních enzymů je
vhodné zvážit způsob/místo exprese pro další purifikaci. Ideálním způsobem je
exprimovat protein ven z buňky, do růstového média. To je možné v případě
přirozeně se vyskytujícího sekrečního signálního peptidu. Ten však obsahuje
naprosté minimum proteinů. Sekvenci pro sekreční signální peptid je však možné
zahrnout do expresního vektoru a gen našeho proteinu vklonovat tak, aby byl ve
stejném čtecím rámci se signálním peptidem a tudíž byla jeho exprese řízena ven
z buňky. V našem případě je pro tento účel použit tzv. -faktor z kvasinky
Saccharomyces cerevisiae vylučovaný kvasinkami do růstového média. Úspěšnou
expresi proteinu lze tedy snadno ověřit měřením enzymové aktivity rekombinantní
PAO přímo v médiu. Pro tu se využívá jednoduchá spektrofotometrická metoda
stanovení založená na oxidaci aminoantipyrinu křenovou peroxidasou a tvorbě
následného barevného aduktu. Oxidace křenovou peroxidasou je podmíněna
přítomností peroxidu vodíku, který se vytváří v primární reakci působením enzymu
polyaminoxidasy.
Obrázek 9. Schéma
rekombinantní PAO.
expresního
vektoru
28
pGAPZ
(Invitrogen)
pro
přípravu
Obrázek 10. Schéma principu homologní rekombinace expresního vektoru do
genomu kvasinky Pichia pastoris.

P. pastoris kmen X-33 (Invitrogen)

Plasmidová DNA pGAPZ-MPAO, 10 g

YPD médium (1% kvasnicový extrakt, 2% pepton, 2% D-glukosa)

YPD médium expresní (1% kvasnicový extrakt, 2% pepton, 2% D-glukosa, 50
mM Tris-HCl, pH 7,2)

YPDS médium pevné pro selekci na zeocinu (1% kvasnicový extrakt, 2%
pepton, 2% D-glukosa, 2% agar, 1 M sorbitol, 100 g/ml zeocin)

1M sorbitol, autoklávováno

Deionizovaná voda, autoklávováno

QIAquick Gel Extraction Kit, pufr PB

Premix AAP/DCHBS (30 ml 0,2 M fosfátový pufr pH 6,5; 0,5 ml 6 mM
aminoantipyrine; 0,5 ml 66 mM DCHBS; 1,0 ml křenová peroxidasa-6 mg/50
ml ve vodě)

50 mM spermidin

Restrikční endonukleasa BlnI
29

UV spektrofotometr, kyvety, křemenná kyveta, termoblok, stopky, inkubované
třepačky a inkubátory 30 a 37oC, mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky),
stojánky, chlazená mikrocentrifuga, stolní pikofuga, elektroporátor, kyvety,
ultraúzké Pasteurovy pipety, chladicí box na led, drcený led, automatické
mikropipety, špičky, sterilní falkonky 50 ml, mrazící stojánek -20°C.
1. DEN
a)

Linearizace plasmidu pGAPZ-MPAO
Plasmidovou DNA pGAPZ-MPAO ponecháme štěpit restrikční endonukleasou
BlnI přes noc při 37ºC. K linearizaci použijeme 10 g DNA, 0.2 l enzymu BlnI
a 5 l pufru vhodného pro danou reakci. Výsledný objem reakční směsi
doplňte na 50 l sterilní deionizovanou vodou.
TIP: BlnI je skladována v glycerolu, při pipetování je nutné dbát postupu pro
pipetování viskózních roztoků!!! Enzym udržujte při pipetování při -20°C v mrazícím
stojánku pro udržení aktivity enzymu!!!
b) Příprava kompetentních buněk kvasinek

20 µl ze suspenze kultury P. pastoris X-33 (připraví vedoucí cvičení) pěstované
přes noc zaočkujeme do 2 ml YPD média ve čtyřech zkumavkách a ponecháme
kultivovat přes noc při 30°C na třepačce při 200 rpm.
2. DEN

Ráno před začátkem práce dáme chladit sterilní vodu a 1 M sorbitol do
polystyrenové krabice s ledem.

Ze suspenze kultury P. pastoris X-33 pěstované přes noc sterilně odebereme
vhodný objem a na spektrofotometru stanovíme OD600. Optimální hodnota
OD600 by se měla pohybovat v rozmezí 1,3-1,5. Pokud je hodnota nižší,
ponecháme kulturu inkubovat ještě další hodinu a měření zopakujeme.
c) Purifikace plasmidu pGAPZ-MPAO

Před purifikací plasmidové DNA nejprve ověříme, že opravdu došlo k linearizaci
DNA působením enzymu BlnI. Odebereme 1 l z reakční směsi, která byla
ponechána přes noc při 37ºC, a vzorek analyzujeme na 1% agarosovém gelu
spolu s vhodným DNA standardem (viz ostatní úlohy).

Pokud došlo k linearizaci plasmidu, je možno přistoupit k purifikaci DNA;
k přečistění DNA použijeme dodaný QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), který
využívá principu izolace nukleových kyselin pomocí schopnosti vazby na
silikát.

K reakční směsi obsahující linearizovaný plasmid přidáme pětinásobek objemu
pufru PB (250 l) a promícháme.

Vložíme jednu centrifugační kolonku QIAquick do připravené 2 ml
mikrozkumavky (součást kitu) a naneseme vzorek do středu centrifugační
kolonky.

Centrifugujeme na stolní centrifuze při 14.000 g po dobu 60 sekund.
30

DNA se zachytí na silikátové vrstvě centrifugační kolonky; proteklou frakci na
dně mikrozkumavky odstraníme.

Kolonku promyjeme pufrem PE; pipetujeme 750 l do středu kolonky a
následně centrifugujeme 60 sekund při 14.000 g.

Proteklou frakci opět odstraníme, vrátíme kolonku do stejné mikrozkumavky a
znovu centrifugujeme 60 sekund.

Připravíme si novou 1,5 ml mikrozkumavku, u které ustřihneme víčko a to
vyhodíme. Po skončení centrifugace v předchozím kroku vložíme centrifugační
kolonku do připravené 1,5 ml mikrozkumavky a kolonku zcentrifugujeme ještě
jednou naprázdno (zbavíme se tak veškerých zbytků ethanolu z pufru PE).

Připravíme si novou 1,5 ml mikrozkumavku, u které rovněž ustřihneme víčko
(které si ponecháme!). Po skončení centrifugace v předchozím kroku vložíme
centrifugační kolonku do připravené 1,5 ml mikrozkumavky.

Provedeme eluci DNA: přímo do středu centrifugační kolonky (špička je nad
středem membrány, ale nedotýká se!) pipetujeme 10 l zahřáté sterilní
deionizované vody nebo EB pufru (v inkubátoru na 65°C), ponecháme
inkubovat 1 min a stáčíme při 14.000 g 2 minuty.

Centrifugační kolonku odstraníme, mikrozkumavku s eluční frakcí obsahující
plasmidovou DNA popíšeme, uzavřeme víčkem a necháme chladit na led.
d) Příprava buněk Pichia pastoris pro elektroporaci
Všechny centrifugace prováděj v řádně vychlazené centrifuze (4°C), POZOR,
prodlevy v procesu vedou ke snížení účinnosti transformace! Pokud je OD600
kultury pěstované přes noc vyšší než 1,5 je třeba zvýšit opakování následujících
promývacích kroků.

Kultury P. pastoris X-33 pěstované přes noc přelijeme do 2 ml sterilních
mikrozkumavek a centrifugujeme při 750 g, 5 min a pelety resuspendujeme ve
2 ml vychlazené vody (na ledu).

Centrifugaci opakujeme a pelety resuspendujeme v 2 ml vychlazené vody.

Znovu centrifugujeme a pelety resuspendujeme v 2 ml vychlazeného 1 M
sorbitolu.

Centrifugujeme naposledy a pelety tentokrát rozpustíme v 80 µl vychlazeného
1 M sorbitolu, ponecháme chladit na ledu po celou dobu experimentu.
e) Elektroporace kvasinek
Nejprve si necháme na ledové tříšti vychladit elektroporační cely. Pak jako
první otestujeme připravené elektrokompetentní buňky. Pokud je koncentrace
buněk příliš vysoká nebo se v roztoku nachází příliš mnoho nečistot (hlavně solí!),
při elektroporaci dojde ke vzniku elektrického oblouku (charakteristické "střílení") a
k transformaci nedojde. V tomto případě je nutné znovu opakovaně promývat
buňky 1 M sorbitolem (Viz. Poslední bod předchozí části) a případně snížit jejich
množství. Při zkratu může dojít i k vystřelení víčka cely a hrozí nebezpečí
zranění např. oka, proto dbej opatrnosti a při udělení elektropulzu chraň svůj
zrak!
31

80 l připravených elektrokompetentních buněk přepipetujeme na dno předem
vychlazené elektroporační cely. Pro každou transformaci použijeme vždy novou
vychlazenou celu.

Připravíme si novou sterilní 1,5 ml mikrozkumavku, do které napipetujeme
300 μl 1M sorbitolu a zároveň si vybalíme ultraúzkou Pasteurovu pipetu.

Celu důkladně osušíme (papírovým ručníčkem) a vložíme do elektroporátoru
nastaveného na 1.500 kV. Udělíme pulz a výsledek konzultujeme s vedoucím
cvičení. Pokud jsou hodnoty pulzu dostatečné (ideální je 5 ms), je možno
přistoupit k vlastní transformaci buněk. V opačném případě znovu promýváme
buňky ledovým 1 M sorbitolem a znovu otestujeme hodnoty elektropulzu.

K transformaci buněk použijeme dvě množství připravené linearizované DNA: 1
l a 5 l. Nejprve provedeme transformaci s nižším množstvím, a pokud budou
hodnoty pulzu dostatečné, transformaci zopakujeme s vyšším množstvím DNA.

80 l připravených elektrokompetentních buněk přepipetujeme na dno předem
vychlazené elektroporační cely a k buňkám přidáme zvolené množství
linearizované plasmidové DNA, důkladně promícháme špičkou a ponecháme
inkubovat 5 min na ledu.

Celu důkladně osušíme, vložíme do elektroporátoru a provedeme pulz při
1.500 kV.

POZOR! Okamžitě po proběhnutí elektropulzu napipetujeme do cely
připravených 300 μl 1 M sorbitolu a jemně promícháme pipetováním. Buňky
v sorbitolu přeneseme zpět do mikrozkumavky.

Inkubujeme při 30°C 1-2 hod bez třepání.

Buňky rozetřeme tyčinkou ve tvaru L (hokejkou) na YPDS selekční agarové
Petriho misky se zeocinem v množstvích 80, 120 a 200 μl. Pro selekci
použijeme transformaci s větším množstvím plasmidové DNA (pokud byla
úspěšná).

YPDS Petriho misky inkubujeme při 30°C 3 dny.
5. DEN

Pro proteinovou expresi použijeme expresní YPD médium, pH 7.2. Ve sterilních
zkumavkách inokulujeme 1,5 ml média jednotlivými koloniemi kvasinek po
transformaci (3 kolonie = 3 zkumavky) a dvě další zkumavky inokulujeme
netransformovanými kvasinkami.

Všechny zkumavky necháme inkubovat dva dny na třepačce při 30°C exprimuje se rekombinantní enzym.
7. DEN
f) Měření aktivity rekombinantního enzymu
Po 2-3 dnech změříme aktivitu PAO v médiu vybraných transformantů.

Kultury kvasinek přeneseme do 1,5 ml mikrozkumavky.

Centrifugujeme při 5.000 g, 5 min, supernatant použijeme pro stanovení
enzymové aktivity.

Nastavíme měření počáteční rychlosti na spektrofotometru, použijeme
následující hodnoty: vlnová délka 515 nm, doba měření 300 sekund, počáteční
32
čas 10 sekund, čas jednoho cyklu 15 sekund. Rychlost bude stanovena v
časovém rozmezí 10-150 sekund.

Provedeme měření počáteční rychlosti reakce ve spektrofotometrické kyvetě: k
0,1 ml supernatantu z každé nastavené exprese v mikrozkumavkách přidáme
1,55 ml premixu AAP/DCHBS. Důkladně promícháme a odečteme pozadí
(BLANK).

Enzymovou reakci iniciujeme přidáním 50 mM spermidinu: stiskneme tlačítko
START a do kyvety okamžitě přidáme 35 μl substrátu, promícháme
pipetováním.

Měříme rychlost reakce v daném časovém rozmezí (10-150 sekund), případné
nejasnosti konzultujeme s vedoucím cvičení.
Misky a tekuté kultury s kvasinkami uchováváme po inkubaci v lednici při
4°C. Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA
1) Vypočítáme aktivitu PAO v nkat (nmol vznikajícího produktu za sekundu)
exprimované kvasinkami v 1 ml média. Barevný adukt, který stanovujeme, má
ε515 = 2,6.104 M-1cm-1.
2) Co je to GAP promotor, jmenujte aspoň jeden další konstitutivní promotor,
který by se dal využít v expresním systému Pichia pastoris? Jaké jiné typy
promotorů by šlo v tomto systému použít?
3) Navrhněte postup, metodu, jak by se dala potvrdit integrace linearizovaného
plasmidu do genomu kvasinky?
Literatura

Cona A. et al. (2006). Flavin-containing polyamine oxidase is a hydrogen
peroxide source in the oxidative response to the protein phosphatase inhibitor
cantharidin in Zea mays, L. J Exp Bot. 57(10), 2277-2289.

Ausubel F.M. et al. (1990). Current Protocols in Molecular Biology. Greene
Publishing Associates, New York.

Artiss J.D. & Entwistle W.M. (1981). The application of a sensitive uricase–
peroxidase couple reaction to a centrifugal fast analyser for the determination
of uric acid. Clinica Chimica Acta 116, 301–309.
33
PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové
knihovny ječmene
Naučit se pracovat s genomovou knihovnou, namnožit ji za použití
bakteriofága, stanovit titr bakteriofága, identifikovat vybrané geny v připravené
genomové knihovně pomocí PCR.
Potvrzení přítomnosti vybraných genů v genomové
(Hordeum vulgare) namnožené pomocí bakteriofága lambda.
knihovně
ječmene
Teoretický úvod
V poslední době se pro hledání konkrétních genů daného organismu začalo
využívat jejich DNA knihoven. DNA knihovna je soubor fragmentů DNA příslušného
organismu naklonovaný do určitého vektoru. Podle původu DNA lze knihovny dělit
na dva základní typy: genomové knihovny - představují soubor fragmentů
získaných štěpením celého genomu a cDNA knihovny připravené z fragmentu
cDNA získaných zpětnou transkripcí mRNA izolované z buněk určité tkáně v daném
vývojovém stádiu organismu. Jeden organismus proto může mít pouze jednu
genomovou knihovnu kdežto cDNA knihoven lze připravit mnoho typů.
Dalším kritériem pro klasifikaci DNA knihoven pak může být použitý typ
klonovacího vektoru. Při konstrukci genomových knihoven závisí výběr vektoru na
velikosti genomu. Plasmidy jako vektor se používají hlavně pro virové genomy,
jelikož umožňují nést pouze krátké fragmenty cizorodé DNA. Pro konstrukci
knihoven eukaryotických organismů se nejčastěji používají vektory odvozené od
bakteriofága lambda a kosmidy, případně umělé kvasinkové a bakteriální
chromosomy (YAC, BAC) s velkou klonovací kapacitou. V závislosti na použitém
vektoru je pak plasmidová nebo kosmidová knihovna tvořená suspenzí bakterií,
fágová knihovna suspenzí fágových částic a knihovna YAC souborem kvasinkových
kmenů.
Důležitou charakteristikou každé genomové knihovny je její velikost, která
udává minimální počet klonů, který zaručuje, že v ní bude obsažen celý genom.
Velikost knihovny určitého organismu lze vypočítat podle vzorců, do nichž je
dosazována průměrná velikost insertů použitého vektoru, celková velikost genomu
a faktor vyjadřující pravděpodobnost s jakou bude knihovna obsahovat celý genom.
Např. genomová knihovna člověka, jehož genom má velikost 2,8x109 bp, připravená
pomocí bakteriofága lambda jako vektoru s průměrnou velikostí klonovaných
fragmentů 20 kb, musí obsahovat alespoň 6,5x105 klonů, aby bylo s 99%
pravděpodobností zaručeno, že nese celý genom.
34
Obrázek 11. Konstrukce genomové knihovny v substitučním vektoru bakteriofága
Lambda FIX II vektor patří mezi substituční vektory, u nichž cizorodá DNA
nahrazuje střední úsek genomu bakteriofága, který je z něj restrikčními
endonukleasami před vložením cizorodé DNA vyštěpen (Viz. Obr. 11). Klonovací
kapacita vektoru je mezi 9-23 kb. Systém lambda FIX II využívá selekce založené na
citlivosti k inhibici profágem P2 hostitele. Lambda fágy obsahující aktivní geny red a
gam nejsou schopný růst na hostitelském kmeni obsahující P2 lysogeny. Lambda
fágy bez těchto genů rostou na P2 lysogenních kmenech, jako je např. kmen E. coli
XL1-Blue MRA (P2). Red a Gam geny jsou situovány v substitučním středním
fragmentu fágova genomu, proto divoký typ lambda FIX II fága nemůže růst na
bakteriálních buňkách XL1-Blue MRA (P2). Po vložení fragmentů genomu cílového
organismu se fág stává Red-/Gam-. Proto pěstování knihovny na XL1-Blue MRA (P2)
kmeni selektuje pouze rekombinantní fágy a umožňuje tak množit a používat
knihovnu aniž by docházelo ke ztrátám insertů. Nedoporučuje se však knihovnu
přepěstovávat více než jednou, jelikož pomaleji rostoucí klony (ty s většími inserty)
mohou být v knihovně výrazně potlačeny. Komerčně získaná lambda FIX II
genomová knihovna z ječmene byla připravená z genomové DNA izolované
z etiolovaných listů osmidenních semenáčků Hordeum vulgare varieta Igri.
Izolovaná DNA byla před vložením do vektoru naštípána restrikční endonukleasou
Sau3A I.
35
Obrázek 12. Princip hybridizace kolonií plasmidové knihovny s radioaktivně
značenou DNA sondou.
Pro vyhledávání konkrétních genů v knihovně existuje několik způsobů.
Nejčastěji se využívají DNA sondy. Ty mohou být připravené přepisem mRNA
z tkáně, v níž dochází k silné expresi hledaného genu. Fragment této DNA je pak
označen buď radioaktivně, nebo fluorescenčně a použit jako hybridizační sonda.
Popřípadě může být jako základ pro sondu použita sekvence DNA genu příbuzného
organismu. Řada genů vyznačujících se stejnou funkcí obsahuje konzervativní
sekvence s vysokým stupněm homologie. Lze také využít synteticky připravených
oligonukleotidů odvozených ze sekvence aminokyselin proteinu, kódovaného
hledaným genem. Vzhledem k degeneraci genetického kódu je obvykle třeba použít
několika alternativních sekvencí dohromady tzv. degenerované oligonukleotidy.
Rozpěstováním knihovny na Petriho miskách a následnou hybridizací s DNA
sondou po přenesení plaku či bakteriální kolonie na vhodnou membránu lze pak
vybrat konkrétní klon mající v insertu hledaný gen (Viz. Obr. 12). Fágovou částici či
plasmid rostoucí na vybrané kolonii lze pak namnožit, lambda DNA či plasmidovou
DNA izolovat a sekvenovat. Alternativní cestou pro hledání konkrétního genu je pak
amplifikace genové DNA pomocí PCR, kde je jako matrice použitá lambda DNA
izolovaná z rekombinantních bakteriofágů dané knihovny. Pokud známe 5´ a 3´
konce genu, lze na základě jejich sekvence navrhnout nedegenerované
oligonukleotidy (primery) a jednou amplifikací získat celý gen. Většinou však známe
pouze část sekvence a v takovém případě pak lze pro amplifikaci využít specifických
primerů odpovídajících sekvenci T3 a T7 promotorů bakteriofága v kombinaci
s jedním genově specifickým primerem. Výsledkem je často nespecifická
amplifikace. Selekci lze pak provést následnou odstupňovanou tzv. nested PCR, kdy
se použije pro amplifikaci genově specifický primer vzdálený několik desítek bází od
prvního primeru ve směru amplifikace. Amplifikovaný úsek však může dosahovat
délky až 23 kb (velikost insertu), v takovém případě je pak vhodné pro PCR používat
speciálně upravené rekombinantní Taq DNA polymerasy v tzv. LA-PCR (LA - long
and accurate).
36

Genomová knihovna z ječmene v lambda FIX II vektoru – zásobní titr,
uchováván při -80C

Bakteriální kultura E. coli XL1-blue MRA (P2) rozpěstovaná na LB agarové
plotně

NZY agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a
1,5% agar, pH 7,5)

SM médium (50 mM Tris/HCl, pH 7,5; 0,1 M NaCl, 0,01 M MgSO4.7H2O,
0,01% želatina)

LB médium (1,0% trypton, 1,0% NaCl, 0,5% kvasnicový extrakt, pH 7,0)

10 mM MgSO4.7H2O

NZY Top agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5%
NaCl a 0,7% agar, pH 7,5)

Roztok polyethylenglykolu 6000 30% s 3M NaCl

RNasa A

Chloroform

DMSO (dimethyl sulfoxid)

PCR reagencie: PCR voda, 10x PCR pufr, dNTP mix, primery pozitivní (fw) a
negativní (rev), Taq DNA polymerasa

Agarosa 3% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM M EDTA, pH
8,0)

Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM
EDTA, pH 8,0)

Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50% glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0;
0,125% bromfenolová modř, 0,125% xylenová violeť

Ethidium bromid 10%

DNA standard GeneRuler 50 bp marker a DNA standard GeneRuler 100 bp
marker

Petriho misky  90 mm a  150 mm, sterilní mikrozkumavky 1,5 ml, 0,5 ml,
0,2 ml, sterilní skleněné zkumavky 10 ml, sterilní kultivační baňky a sterilní
centrifugační kyvety, mikrovlnná trouba, inkubátor 37C a 30C, mrazící
stojánek -20°C, chladící PCR stojánek, třepačka, elektroforéza, horizontální
elektroforetická komůrka s hřebínky, zdroj, stolní pikofuga, stopky, vortex,
chlazená mikrocentrifuga pro izolaci DNA, ledová lázeň, termocykler,
termoblok,
transluminátor,
AlphaDigiDoc
(systém
pro
digitální
fotodokumentaci gelů), automatické pipety a špičky, Hamiltonova pipeta,
spektrofotometr, kyveta.
37
0. DEN (provede vedoucí cvičení)
a) Příprava hostitelského kmene E. coli XL1-blue MRA (P2)
Pracujeme sterilně v laminárním boxu!

Na LB agarovou Petriho misku sterilní kličkou rozetřeme ze zamražené zásobní
mikrozkumavky E. coli XL1-blue MRA (P2).

Inkubujeme přes noc při 37ºC (připraveno v lednici).
1. DEN
b) Příprava hostitelského kmene E. coli XL1-blue MRA (P2)
Pracujeme sterilně v laminárním boxu!

Z LB agarové Petriho misky inokulujeme sterilní kličkou jednu kolonii E. coli
XL1-blue MRA (P2) do 2 ml LB média s 0,2% maltosou a 10 mM MgSO4 a
necháme růst přes noc při 30ºC na třepačce 150 rpm.

Pěstování na 30C zajišťuje, že buňky nedorůstají do stacionární fáze a
neumírají. Bakteriofág je totiž schopen adheze na mrtvé buňky stejně dobře
jako na živé a snižoval by se tím titr.
2. DEN

Narostlou kulturu přelijeme do 2 ml mikrozkumavky a centrifugujeme 10 min
při 2.000 g.

Opatrně odlijeme medium a buňky jemně suspendujeme ve 2 ml 10 mM
MgSO4. Nevortexujeme!

Buňky naředíme na OD600=0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 200 μl do
5 sterilních mikrozkumavek.
c) Stanovení titru bakteriofága obsahujícího genomovou knihovnu

Připravíme si Petriho misky s pevnou půdou NZY agaru pro kultivaci plaků
rekombinantního lambda fága na lysogenním kmeni E. coli XL1-blue MRA
(P2).

Pod dohledem vedoucího cvičení si v mikrovlnné troubě rozpustíme NZY agar
v zásobní láhvi.

V laminárním boxu si nachystáme 5 sterilních Petriho misek a po ochlazení na
zhruba 60C na ně nalijeme NZY agar, tak aby kompaktně pokryl dno.

Po ztuhnutí agaru Petriho misky dáme vyschnout do zadní části laminárního
boxu, tak že víko misky nepatrně nadzvedneme. Pracujeme sterilně!

Připravíme si ředící řadu bakteriofága.

Nachystáme si pět 0,5 ml mikrozkumavek do první napipetujeme 18 l SM
média a přidáme 2 l zásobního titru bakteriofága.
38

Do dalších mikrozkumavek pak pipetujeme 18 L SM média a přenášíme vždy
2 l roztoku z předchozí mikrozkumavky. Vytvoříme tím řádu 5 roztoků
bakteriofága vždy s desetkrát nižší koncentrací.

Podíl 10 l z každé mikrozkumavky pak přeneseme do nové čisté a sterilní
mikrozkumavky a přidáme 200 l bakteriálních buněk lysogenního kmene
XL1-blue MRA (P2) suspendovaných v 10 mM MgSO4 a naředěných na
OD600=0,5.

Buňky s fágem pak necháme inkubovat 15 minut při 37C za mírného třepání.

Mezitím si rozpustíme v zásobní láhvi NZY Top agar v mikrovlnné troubě.

Do pěti sterilních skleněných 10 ml zkumavek si napipetujeme 2,5 ml horkého
NZY Top agaru a poté, co se agar ochladí přibližně na 50°C (poznáme tak, že
na zkumavce jsme schopni udržet ruku) přidáme bakterie s fágem, rychle
rozmícháme a okamžitě naléváme na NZY agarové Petriho misky.

Opatrným krouživým pohybem rozlijeme agar kompaktně po celé ploše a
necháme ztuhnout.

Po ztuhnutí Petriho misky obrátíme a inkubujeme přes noc při 37C.
d) PCR amplifikace vybraného genu

Jako templáty pro PCR použijeme zbylých 8 l ředící řady amplifikované
genomové knihovny, kterou předem povaříme 5 min v termobloku při teplotě
95°C.

Povařením narušíme kapsidu bakteriofága a umožníme tak jeho DNA kontakt
s ostatními reagenciemi v PCR zkumavce.

Nastavíme si dvě řady po sedmi PCR reakcích: pro pět různých koncentrací
templátu (bakteriofága), zásobní titr knihovny a negativní kontrolu bez
templátu.

Do 0,2 ml PCR zkumavek na chladicím PCR stojánku pečlivě pipetujeme
(v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí:
15,00 μl PCR vody
2,50 μl 10x PCR pufru
0,50 μl 10 mM dNTP mix
1,00 μl fw primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky
1,00 μl rev primeru
4,00 μl DNA templátu z ředící řady bakteriofága

Reakci zahájíme přídavkem 1 μl Taq DNA polymerasy (pozor, enzym
udržujeme během pipetování v mrazícím stojánku!), PCR zkumavku krátce
vortexujeme, stočíme a okamžitě vložíme do vyhřátého termocykléru
s následujícím PCR programem:
1. Počáteční denaturace 94°C, 3 min
2. Denaturace 94°C, 30 s
3. Navázání primerů (annealing) x °C, 30 s
4. Růst řetězce (elongace) 72°C, 1 min
8. Kroky 2-4 opakovat 30-35x
9. Koncová elongace 72°C, 10 min
10. Chlazení 10°C, 3 min
39

Provedeme tzv. „Hot Start“, který zabraňuje nespecifickému navázání primerů
na templát během počátečního vyhřívání termocykléru. PCR zkumavky
uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocyklér zahřátý na
počáteční 3 min denaturace při 94°C, poté otevřeme víko a opatrně vložíme
PCR zkumavky.

Teplotu annealingu zvolíme podle Tm použitých primerů.
Sekvence použitých primerů:
pro gen rRNA 18S podjednotky ribosomu:
pozitivní 18srrRNAfw
negativní 18srrRNArev
5´-CCA TCC CTC CGT AGT TAG CTT CT-3´
5´-CCT GTC GGC CAA GGC TAT ATA C-3´
Tm= 62°C
Tm= 62°C
pro gen tRNA-leucinu:
pozitivní CP3
negativní CP4

5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’
5’-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3’
Tm= 59°C
Tm= 59°C
Během PCR si připravíme elektroforézu v 3% agarosovém gelu.
e) Agarosová elektroforéza DNA



Do připravení komůrky nalijeme asi 0,8 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1
ztuhnout, cca 30 min.

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorkům po PCR (25 l)
pipetujeme 5 l vzorkovacího pufru.


agarosovým gelem.

Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.

Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA 100 bp GeneRuler
marker.


Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 50 bp
GeneRuler.
40


Veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA zlikvidujeme dle pokynů o
nakládání s GMO.
1) Stanovení titru genomové knihovny: Poté co nám narostou plaky na Petriho
miskách, vybereme vhodnou Petriho misku a spočteme na ní celkový počet
plaků. Lze si pomoci rozdělením prostoru Petriho misky na několik sektorů.
Podle následujícího vzorce pak spočteme hodnotu pfu (plaque forming unit):
pfu/ml = N x f/ d
- kde N je počet plaků na Petriho misce
- kde f je hodnota ředění pro přepočet na ml, čili jaký objem knihovny fágového
lyzátu, který byl na Petriho misku použit
- d je hodnota ředění zásobní knihovny fágového lyzátu
2) Určete při jak velké koncentraci virových částic (pfu) lze ještě detekovat v
knihovně geny pro ječmennou 18srRNA a tRNA leucinu.
3) Pomocí DNA markeru a softwaru AlphaDigiDoc 1206 určete velikost
amplifikovaných úseků genů a hodnotu ověřte v databázi GenBank na
internetu.
4) Proč se pro rozpěstování knihovny používá ředění v několika koncentracích?
Literatura

Sambrook J. et al. (2001). Molecular Cloning: A laboratory Manual, Third Ed.,
Vol. 1, pp. 2.69 – 2.81. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York.

Ausubel F.M. et al. (1990). Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing Associates, New York.

Alberts B. et al. (1998). Essential Cell Biology, Garland Publishing, New York.

Rozsypal S. a kol. (2002). Úvod do molekulární biologie, třetí vydání, díl čtvrtý,
Grafex, Blansko.
41
Izolace RNA z rostlin a následná kvantitativní RT-PCR
vybraných genů
Naučit se izolaci RNA, přepis do DNA, nastavit experiment pro real-time qPCR,
detekovat expresi genů, analyzovat expresní profil.
Stanovení exprese vybraných genů v kukuřici v odpovědi na aplikovaný
cytokinin.
Teoretický úvod
Reverzně přepisovaná polymerasová řetězová reakce (neboli RT-PCR) je metoda
používaná pro amplifikaci cDNA (jednovláknová, tzv. single stranded - ssDNA,
komplementární ke specifické RNA). Pomocí RT-PCR se nejčastěji amplifikují a
následně klonují 5´ a 3´ konce mRNA (tzv. EST klony, expressed sequence tag) nebo
cDNA knihovny, využívané pro hledání nových genů. RT-PCR může být také velmi
snadno adaptována pro identifikace mutací a polymorfismu v přepisovaných
genových sekvencích anebo pro kvantifikaci exprese jednotlivých genů, když je
množství izolované mRNA malé a nedostačující pro techniku Northern blotu.
Prvním krokem RT-PCR je vždy enzymová konverze RNA nebo specifické mRNA
do jednovláknové cDNA kdy je deoxyribonukleotidový primer hybridizován s RNA a
řetězec DNA následně prodloužen RNA-dependentní DNA polymerasou (EC 2.7.7.49,
reverzní transkriptasou). Druhým krokem pak je klasická PCR se dvěma genově
specifickými primery, pro kterou je jako templát využita RT reakcí vzniklá cDNA.
Deoxyribonukleotidové primery pro RT mohou být trojího typu (Viz. Obr. 13):

Oligo(dT) primer, který se specificky váže na polyA konec, který je přítomen
v 98% procentech všech zralých eukaryotických mRNA. RT reakcí pak vzniká
cDNA obsahující kompletní informaci mRNA.

Genově specifický primer, který hybridizuje pouze s jednou konkrétní mRNA
nebo příbuznou skupinou mRNA. Genově specifické primery pro následující
PCR pak musí samozřejmě ležet uvnitř přepsané sekvence po RT. Pokud je to
možné, doporučuje se také navrhnout každý primer (negativní i pozitivní) tak,
aby ležely každý na jiném exonu. Touto strategií lze pak velice jednoduše při
vyhodnocení PCR rozlišit mezi správnou RT-PCR amplifikací a amplifikací,
která vznikla na podkladě kontaminující genomové DNA, která se často v RNA
vzorcích nachází.

Náhodné hexanukleotidové primery (random hexamers) jsou schopny se
vázat a zahajovat syntézu cDNA na mnoha místech podél celého RNA
templátu. Jedná se o směs krátkých šestinukleotidových fragmentů, ve
kterých jsou vygenerovány všechny možnosti kombinací čtyř nukleotidů
(A,G,C,T). Používá se především, pokud je templát mRNA extrémně dlouhý
(přes 3.000 bp) nebo když má cílová mRNA komplikovanou sekundární
strukturu.
42
Ve většině případů je cílem vytvořit co nejdelší cDNA a proto se pro navržení
genově specifického primeru nejčastěji využívá nekódující sekvence 3´ konce.
Druhou volbou je použití nespecifického oligo(dT) primeru. Pokud oba přístupy
selžou, přichází na řadu použití random hexamer primerů.
Nejrychlejším způsobem provedení RT-PCR je tzv. jednozkumavková reakce
s genově specifickým primerem pro RT, kdy po proběhnutí RT reakce se pouze přidá
druhý genově specifický primer a termostabilní polymerasa a pokračuje se s PCR.
Nejčastějším problémem RT-PCR je izolace kvalitní RNA. Jednovláknová
molekula RNA je daleko méně stabilní než DNA a proto je i její životnost velice
limitována. Navíc všudypřítomné RNA endonukleasy (RNasy), které RNA likvidují,
jsou velice aktivní enzymy, které pracují v široké škále pH, teplot, a to i bez
přítomnosti kofaktoru. Během izolace a při následné RT reakci je proto nutno
vzorek RNA před vlivem těchto enzymů chránit dodržováním specifických podmínek
manipulace a používáním pouze speciálně ošetřeného skla a plastiku, viz
Laboratorní řád molekulárně-biologické laboratoře (Nutno mít na paměti, že
největším zdrojem RNas jsme my sami! Proto pracujeme v rukavicích, kterými se
nedotýkáme naší pokožky!). Přesto často dochází k degradaci a fragmentaci mRNA
populace a to hlavně od 5´ konce, který není tak dobře chráněn a stabilizován polyA
sekvencí jako 3´ konec. U některých genů je proto velice těžké získat a amplifikovat
genetickou informaci jejich počátku.
Obrázek 13. Princip RT-PCR reakce s využitím genově specifického primeru,
oligo(dT) primeru nebo random hexamer primerů.
43
Klíčovým enzymem RT-PCR je reverzní transkriptasa, enzym sloužící jako
hlavní katalytická jednotka RNA virů, které s jeho pomocí přepisují svou genetickou
informaci z RNA do DNA pro její následné začlenění do genomu napadeného
hostitele. V současné době se v molekulární biologii využívají reverzní transkriptasy
ze tři zdrojů:

AMV RT: enzym izolovaný z viru ptačí myeloblastosy (avian myeloblastosis
virus). Kromě RT aktivity, má enzym navíc RNasa H aktivitu, která může
rozštěpit delší fragmenty RNA templátů. Optimální teplota enzymu je 42°C.

MoMLV RT: enzym z Molonyho viru myší leukémie (Moloney strain of murine
leukemia virus). Aktivita RNasy H je daleko slabší, jeho teplotní optimum je
nižší (37°C), proto není příliš vhodný pro templáty se složitou sekundární
strukturou.
Komerčně dostupné jsou i mutované verze obou enzymů, které mají
inhibovanou RNasovou aktivitu a vyšší teplotní stabilitu (do 50°C). Tyto
rekombinantní enzymy jsou proto vhodnější pro RT delších RNA templátů se
složitou sekundární strukturou.

Termostabilní Tth DNA polymerasa: vykazuje aktivitu reverzní transkriptasy
v přítomnosti Mn2+ iontů a je proto využívaná hlavně tam, kde je třeba
provádět rutinní a rychlé RT-PCR. Pro oba kroky totiž stačí jediný enzym a obě
reakce běží současně. Nevýhodou tohoto enzymu je krátká délka
syntetizovaných cDNA (do 2 kb) a nemožnost využití oligo(dT) a random
hexamer primerů z důvodu jejich nízké teploty hybridizace (při optimální
teplotě enzymu a PCR se tak netvoří stabilní RNA-DNA hybrid).
Pomocí RT-PCR lze kvantifikovat míru exprese jednotlivých genů, tzn. zjistit
množství molekul jejich specifické mRNA zastoupené v populaci mRNA izolované
z určitého ontogenetického stádia organismu, specifické tkáně či pletiva. Nutností je
ovšem společně se specifickými geny analyzovat i expresi genu srovnávacího neboli
referenčního. Jako srovnávací geny se nejčastěji používají tzv. provozní (housekeeping) geny. Jsou to geny kódující proteiny, které jsou v organismech esenciální,
tzn. zastoupeny ve všech stádiích života organismu ve většině tkání či pletiv. Tyto
geny jsou vždy exprimovány pod konstitutivními promotory, což znamená, že jejich
exprese je za všech podmínek stejná a nebývá ničím ovlivňována. Nejčastěji
používanými srovnávacími geny v rostlinné říši jsou geny kódující strukturní
protein β-aktin, nebo klíčový enzym glykolýzy glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenasu
(GAPDH).
Pro kvantifikaci genové exprese se dříve používalo (vedle metody Northern
blotu) semikvantitativní RT-PCR, kdy se na agarosovém gelu vizuálně porovnávaly
intenzity amplifikovaných produktů vůči produktům provozního genu v jednotlivých
vzorcích. V současnosti jsou tyto metody intenzivně nahrazovány PCR s odečtem
produktu v reálném čase. Aby bylo možno kvantitativně odečítat signál DNA
vznikajícího produktu, přidává se ke vzorku fluorescenční barvivo a to ve dvou
různých formách – nespecificky nebo specificky.
V prvním případě je barvivo přítomno v premixu pro PCR kdy nespecificky
interkaluje s jakoukoli dvouřetězcovou DNA včetně predominantního amplikonu.
Nejčastěji používaným nespecifickým fluorescenčním barvivem je tzv. SybrGreen, se
kterým budeme pracovat v této úloze.
V druhém případě je barvivo vázáno na specifickou sondu komplementární
k amplikonu, ze které se uvolňuje fluorescence po rozštěpení 5´-3´exonukleasovou
aktivitou termostabilní DNA polymerasy po specifickém navázání na templát. DNA
specifických sond se používá celá řada a jakkoli se od sebe strukturně liší, fungují
44
všechny na stejném principu využívajícím exonukleasové aktivity termostabilní DNA
polymerasy používané v kvantitativní RT-PCR. Nejčastěji používanými sondami jsou
pak sondy TaqMan.
V případě chemismu SybrGreen vzniká fluorescence v přímé úměře na
množství vznikajícího amplikonu. Ta je však detekovatelná pouze během
denaturační fáze každého amplifikačního cyklu, kdy je z dvoušroubovice vlivem
vysoké teploty fluorescence uvolněna díky oddělení obou vláken amplikonu od sebe.
Odečet uvolňované kumulující se fluorescence umožňuje speciální typ
termocykléru (tzv. real-time termocyklér), do kterého jsou kromě standardního
termobloku nainstalovány i excitační lampy a detekční zařízení (fotodiody nebo CCD
kamera) umožňující indukci a detekci fluorescenčního signálu. Software
termocykléru vyhodnocuje vznikající fluorescenci v jednotlivých zkumavkách
v závislosti na počtu cyklů. U výsledných křivek se určují tak zvané Ct (treshold
cycle) hodnoty, což je počet cyklů, kdy křivka překročí limit detekce fluorescence.
Vzájemným porovnáním Ct hodnot mezi sledovanými vzorky pro studovaný gen a
gen provozní pak lze získat relativně přesný údaj o změně exprese genů ve
studovaném vzorku vůči vzorku kontrolnímu. Existuje pak řada metod pro
vyhodnocení míry exprese, kdy nejjednodušší je vyhodnocení metodou tzv. deltadelta Ct :
R=2
–ΔΔCt
Kde  Ct =  Ct vzorek -  Ct kontrola
 Ct = Ct studovaný gen - Ct gen provozní
Výsledná míra exprese sledovaných genů je pak vyjádřena jako násobek
hodnoty exprese kontrolního vzorku. Předpokladem úspěšného použití této
vyhodnocovací metody je shodná efektivita amplifikace všech používaných primerů.
Výhodou použití chemismu SybrGreen oproti DNA specifickým sondám je
možnost analýzy denaturačních křivek, která nám umožňuje posoudit i kvalitu
vzniklých amplikonů. Jednoduše řečeno, dva různé amplikony (vznikající současně
v jednom vzorku) lišící se od sebe počtem párů bazí a jejich zastoupením v sekvenci
potřebují ke své denaturaci různě vysokou teplotu. A právě tato rozdílná teplota
vypovídá o kvalitě vzorku. Analýza denaturační křivky následuje po skončení
cyklování PCR, kdy již reakce obsahuje veškeré množství vzniklého produktu
(amplikonu). Poté následuje fáze, ve které je reakce postupně po mírných
přírůstcích zahřívána v rozsahu teplot předpokládaných pro denaturaci amplikonu.
Při zahřátí reakce na teplotu denaturace amplikonu dochází k oddělení DNA vláken
a tím k uvolnění fluorescence. Při této teplotě tak vzniká maximum v množství
uvolněné fluorescence odpovídající kvalitě amplikonu. Jednomu amplikonu náleží
vždy pouze jedna teplota denaturace a proto, pozorujeme-li ve vzorku více maxim
detekované fluorescence, vypovídá to např. o nespecifitě použitých primerů, kdy
dochází ke vzniku více produktů.

Směs fenol/chloroform (5:1, pH 4,8)

RNA extrakční reagencie TriReagent (Ambion)

1 M octová kyselina (autoklávováno)
45

Absolutní ethanol, 70% ethanol, 100% isopropanol

Chloroform

7,5 M chlorid litný s 50 mM EDTA, pH 8,0

3 M octan sodný, pH 5,2 (autoklávováno)

RNase free voda
autoklavováno)

100 mM DTT (sterilizováno filtrem)

10 mM dNTP mix

5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu,10x PCR pufr

50 μM oligo(dT) primer

M-MuLV reverzní transkriptasa, Taq DNA polymerasa

1,2 μM směs pozitivního (fw) a negativního (rev) primeru specifických pro daný
gen

2x SybrGreen qPCR směsi obsahující koktejl všech potřebných komponent
(včetně polymerasy) v optimální koncentraci

Kapalný dusík s termonádobou

Rostlinný materiál – kukuřice (Zea mays)

10 μM N6-benzyladenin s přídavkem smáčedla Silwett77 (finální koncentrace
0,05%) v rozprašovači
(deionizovaná
voda
s 0,1%
diethyl
pyrokarbonátem,

Třecí misky s tloučkem, termocyklér StepOnePlus (Life-technologies),
termoblok, UV spektrofotometr, křemenná kyveta, chlazená mikrocentrifuga,
stolní pikofuga, vortex, stopky, chladící PCR stojánek, automatické
mikropipety, špičky s filtrem, PCR, chladící destička, kovová špachtle,
mikrozkumavky 1,5 ml, PCR stripy, stojánky, mrazící stojánek -20°C.
(1. DEN) Eventuálně provede vedoucí cvičení
a) Příprava biologického vzorku

V kultivačním boxu na pěstování rostlin si vybereme dva květináče se
semenáčky kukuřice a označíme si je jako kontrolu a vzorek.

Na rostlinu označenou jako vzorek aplikujeme zhruba ze vzdálenosti 15 cm
z rozprašovače 10 μM roztok cytokininu (N6-benzyladenin), rozprašování
aplikujeme 3x po sobě ve 3-minutových intervalech.

Takto ošetřené rostliny kultivujeme do následujícího dne.
(2. DEN) Eventuálně provede vedoucí cvičení
b) Homogenizace biologického vzorku

Připravíme si termonádobu s dusíkem pro homogenizaci a nádobu s tekutým
dusíkem pro uchovávání homogenizovaných vzorků.
46

Z připravených rostlin odebereme přibližně 2 gramy listů, rozetřeme ve třecí
misce na prach za pomoci tekutého dusíku a navážíme na analytických
vahách pomocí vymražené kovové špachtle do 1,5 ml vymražených
mikrozkumavek po 100 mg. (homogenizovaný vzorek nesmí rozmrznout!
Vzorky po homogenizaci ihned uložíme do tekutého dusíku!)
1. DEN
S KAPALINOU TRI-REAGENT™ PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!
CHRÁNÍME RNA PŘED DEGRADACÍ VŠUDYPŘÍTOMNÝCH RNas POUŽÍVÁNÍM
RUKAVIC!!! NEDOTÝKAT SE VLASTNÍ POKOŽKY!!!DBÁT ČISTOTY PRÁCE!!!
c) Izolace RNA
Pro izolace RNA bude použita metoda založená na principu extrakce nukleových
kyselin pomocí lyzačního a zároveň stabilizačního činidla Tri-Reagent a následné
extrakci pomocí fenol/chloroformu.

Ke vzorkům rychle přidáme 10-násobek (w/v) Tri-Reagentu.

Intenzivně vortexujeme po dobu 5 minut při laboratorní teplotě.

Centrifugujeme 5 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a supernatant
kvantitativně přeneseme do nových 2 ml mikrozkumavek.

Přidáme pětinu objemu chloroformu (0,2 ml/1,0 ml) a pořádně promícháme
(vortex) a necháme inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě.

Centrifugujeme 10 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a horní vodnou
fázi opatrně přeneseme do nové mikrozkumavky.

Přidáme 0,5 ml isopropanolu na 1 ml výchozího množství Tri-reagentu, 10 s
vortexujeme a necháme 10 minut stát při laboratorní teplotě.

Centrifugujeme 8 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a supernatant
opatrně odlijeme do odpadu. Před odlitím zkontrolujeme přítomnost pelety.

K peletě přidáme 1 ml 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut
centrifugujeme při 8.000 g.

Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na
pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak, abychom neporušili peletu.

Peletu necháme vyschnout v laminárním boxu a rozpustíme v 45 μl RNase free
vody. V tomto kroku by bylo možné stanovit koncentraci izolované RNA. Ta
však může být kontaminována zbytky DNA a proto je nutné tuto kontaminující
genomovou DNA nejprve ze vzorků odstranit inkubací s enzymem DNasaI.
d) Ošetření RNA DNasouI

K připraveným reakcím přidáme 5 μl 10x DNase pufru a 2 μl DNasy,
promícháme a necháme inkubovat 30 minut při 37°C.
TIP: Enzymy molekulární biologie jsou skladovány v glycerolu, při pipetování je
nutné dbát postupu pro pipetování viskózních roztoků!!! Enzymy udržujeme při
pipetování při -20°C pro udržení jejich aktivity!!!
e) Přečištění RNA vzorku pomocí chloridu lithného
 Ke vzorkům RNA ošetřených DNasouI přidáme polovinu objemu 7,5 M
chloridu litného.
47
 Na 30 minut uložíme vzorky do mrazicího boxu na -20°C, poté 30 minut
centrifugujeme při 14.000 g.
 Supernatant opatrně odlijeme do odpadu. Před odlitím zkontrolujeme
přítomnost pelety.
 K peletě přidáme 1 ml 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut
centrifugujeme na 8.000 g.
 Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na
pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak abychom neporušili peletu.
 Peletu necháme vyschnout v laminárním boxu a rozpustíme ve 20 μl RNase
free vody.
f) Spektrální stanovení RNA

Odebereme 1 μl z celkové izolované RNA a vhodně naředíme do kyvety (5-10x),
měříme absorbanci na 260 a 280 nm.

Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2,1.

Přibližnou koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak
je v kyvetě 40 μg/ml RNA.
g) Reverzní transkripce

Dbáme na to, aby ve všech připravovaných vzorcích pro kvantitativní RT-PCR
bylo stejné výchozí množství RNA.

Pro každý vzorek současně připravíme kontrolu, kde všechny komponenty
kromě vstupního množství RNA nahradíme Rase-free vodou, kontrolní vzorky
držíme na ledové tříšti, nebo zamražené na -20°C až do nastavování
kvantitativní PCR reakce.

Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 μg celkové RNA (maximálně
v objemu 6 μl) a přidáme 0,5 μl 50 μM oligo(dT) primeru, doplníme celkový
objem vodou na 6,5 μl a špičkou pipety zamícháme. Inkubujeme 5 minut při
70°C.

Ochladíme na ledu a ke vzorku přidáme 2 μl 5x koncentrovaného pufru pro MMVL reverzní transkriptasu a 1,0 μl dNTP mixu.

Mikrozkumavku krátce vortexujeme a krátce stočíme v pikofuze, inkubujeme 5
minut v inkubátoru na 37°C.

Ke vzorku přidáme 0,5 μl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek/μl),
krátce vortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.

Inkubujeme 90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce.

Reakci inaktivujeme zahřáním na 70°C po dobu 10 minut. Vzniklou cDNA
zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na ledovou tříšť a pokračujeme
v kvantitativním RT-PCR.
48
3. DEN
h) Kvantitativní PCR

Seznámíme se se softwarem StepOne v.2.0 na PC stanici připojené k real-time
termocykléru StepOnePlus a s pomocí vedoucího cvičení si vytvoříme nový
experiment pro SYBR Green chemismus.
Tabulka 2. Genově specifické primery pro SYBR Green chemismus pro kvantifikaci
vybraných genů metabolismu a percepce cytokininů u kukuřice.
Gen
Cytokininový receptor 1
Regulátor cytokininové
odpovědi 1
Regulátor cytokininové
odpovědi 7
Aktin 2
Elongační faktor 1
Název
Sekvence (5’-3’)
ZmHK1rt_fw
ZmHK1rt_rev
ZmRR1rt_fw
ZmRR1rt_rev
GGCTGCACTCAAGAAGTATGGT
CCTCAAACCCGTCCATCTCT
TGGATGGATTTGAAGCCACAA
TCTCCACGTTCTATTTGCTCATTT
ZmRR7rt_fw
ZmRR7rt_rev
ZmACTrt_fw
ZmACTrt_rev
EFrt_fw
EFrt_rev
CAGAGGATCAGCAGATGCCTAA
CCTTGGTCTTGAGTGGCTTGA
CGACAACCTGATGAAGATCCTTACT
GCAACGTAGGCAAGTTTTTCCTT
GCTTCACGTCCCAGGTCATC
GGGCATAGCCATTGCCTATC
Tm (°C)
81,6
81,5
80,7
80,1
79,6

V experimentu si zadáme potřebný počet vzorků a počet genů (target), které
chceme detekovat (4), z čehož dvě reakce budou pro endogenní kontrolu (Aktin
2 a elongační faktor 1). Každou reakci provedeme ve třech technických
replikátech. Pro každý vzorek a každou kombinaci primerů (target) nastavíme
negativní reakci s RNA nepřepsanou do cDNA (netřeba dělat replikáty). Pro
každou kombinací primerů nastavíme navíc negativní reakci s vodou jako
templátem. Pokud máme dva biologické vzorky, nastavíme celkem 36 reakcí.

cDNA i kontrolní nepřepsanou RNA z předchozího kroku vhodně naředíme tak,
aby nám její množství stačilo na všechny reakce.

Do stripů nebo PCR destičky nepipetujeme reakce v následujícím složení:
Celkový objem
10,0 μl
cDNA (RNA)
2,5 μl
1,2 μM směs primerů
2,5 μl
2x SybrGreen qPCR směs 5,0 μl

Stripy nebo PCR destičku správně uzavřeme, obsah krátce centrifugujeme,
umístíme do bloku real-time termocykléru a spustíme amplifikaci.

Průběh reakce sledujeme v analytickém okně softwaru a po skončení
vyhodnotíme.
Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý materiál zlikvidujeme dle
laboratorního řádu.
49
1) V softwaru StepOne převeďte amplifikační křivky do logaritmické podoby a
zkontrolujte proložení „threshold“ přímek tak, že procházejí lineární oblastí
všech amplifikačních křivek.
2) Odečtěte výsledné Ct hodnoty pro všechny vzorky a zapište si je.
3) Metodou delta delta Ct vypočítejte změnu exprese jednotlivých genů
v rostlině, na kterou byl aplikován cytokinin oproti rostlině kontrolní.
4) Pokud jste vzorky amplifikovali v chemismu SYBRGreen, zkontrolujte
denaturační křivky produktů a porovnejte získané denaturační teploty
s teplotami v tabulce 3.
5) Zamyslete se a zhodnoťte fyziologický význam reakce rostliny (změny exprese
sledovaných genů) na exogenní aplikaci hormonu.
6) Předpokládejte, že jste dostali u sledovaného genu hodnotu Ct vzorku přesně
o tři jednotky vyšší než u kontroly. Kolikrát se změnila exprese genu ve
vzorku oproti kontrole za předpokladu, že Ct hodnoty provozního genu
vzorku i kontroly měly stejné Ct?
970
980
990
1000
1010
1020
1030
1040
ZmEF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
CCTGCCAAGG AGGCTGCCAG CTTCACGTCC CAGGTCATCA TCATGAACCA CCCTGGGCAG ATAGGCAATG GCTATGCCCC
1050
1060
1070
1080
1090
1100
1110
1120
ZmEF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AGTGCTGGAC TGCCACACCT CCCACATCGC TGTCAAGTTT GCTGAGCTCA TTACCAAGAT CGACAGGCGC TCTGGCAAGG
1130
1140
1150
1160
1170
1180
1190
1200
ZmEF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AGCTTGAGAA GGAGCCAAAG TTCCTGAAGG ACGGTGATGC TGGTATGGTG AAGATGATAC CCACCAAGCC TATGGTGGTG
1210
1220
1230
1240
1250
1260
1270
1280
ZmEF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
GAGACATTCT CCGCGTTTCC TCCCCTTGGT AGGTTTGCTG TCCGCGACAT GAGGCAGACA GTTGCTGTTG GAGTCATCAA
ZmEF1
1290
1300
1310
1320
1330
1340
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....
GAGTGTGGAG AAGAAGGACC CGACCGGCGC CAAGGTGACC AAGGCGGCCG CCAAGAAGAA ATGA
Obrázek 14: Příklad navržení primerů a TaqMan próby pro kvantitativní PCR pro
provozní gen kódující elongační faktor 1. Zobrazená je pouze 3´-terminální část
ORF genu, tučně a dvojitě podtrženy jsou pozice forward a reverse primerů, místo
nasednutí TaqMan próby je šedě zvýrazněno.
Literatura

Sambrook J. et al. (2001). Molecular Cloning: A laboratory Manual. Third Ed.,
Vol. 2, pp. 8.46 – 8.65. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York.

Logemann J. et al. (1987). Improved Method for Isolation of RNA from Plant
Tissues. Anal Biochem 163, 16-20.
50

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Reagent
Guide,
manuál
Applied
Biosystems
(2008),
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/
generaldocuments/cms_046739.pdf

TRI Reagent® Solution RNA/DNA/Protein Isolation Reagent, manuál Ambion
(2008), http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_9738.pdf
51
Vysvětlivky
F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA, kóduje protein tvořící tzv. pilus na
vnější membráně E. coli
tetR gen pro tetracyklinový represor, kmen roste na tetracyklinu
mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i
methylované genomové DNA
lacZΔM15 element potřebný pro komplementaci β-galaktosidasy pro blue/white
screening na miskách s X-gal, je vložený na profágové částici Φ80
ΔlacX74 kóduje lac represor, který brání expresi z lac operonu, dereprese probíhá
pomocí IPTG
deoR umožňuje příjem velkých plasmidu (přes 10kb)
recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA
endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA
rpSL (strR) gen pro resistenci ke streptomycinu
lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru,
zrušení přídavkem IPTG
galK, galU mutace v genu pro galaktokinasu, blokuje metabolismus galaktosy
araD139, Δ(ara, leu) 7697 mutace v ara operonu, blokuje metabolismus arabinosy
supE44 supresor amber (UAG) mutace
thi- mutace v genu metabolizující thiamin, kmen na minimálním médiu neroste bez
thiaminu
gyrA96 mutace v genu DNA gyrasy, způsobuje resistenci k antibiotiku - kyselině
naxilové
relA mutace umožňující syntézu RNA bez navazující proteosyntézy
MATα/MATa diploidní kmen schopný pohlavního rozmnožování
ura3-52 mutace v genu podílející se na biosyntéze uracilu, kvasinka neroste na
minimálním médiu bez uracilu
P2 lysogen slouží pro lysogenní selekci, kmen může být napaden pouze
bakteriofágem s genotypem red/gam-, tzn. bakteriofágen nesoucí fragment
genomové knihovny, nikoli wild-typovým
Mut+ (methanol utilization +) zachovány oba geny pro alkohol oxidasu (AOX1 a
AOX2), schopný růst na médiu, které má jako jediný zdroj uhlíku methanol
52
Přílohy
λ DNA standardy: GeneRuler™ DNA ladders (Thermo Scientific)
50 bp
100 bp
1 kb
Používané kmeny Escherichia coli a Pichia pastoris
Escherichia coli TOP10F´
Genotyp: F' (tetR), mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80 Δlac ΔM15, lacIq, deoR, recA1,
araD139, Δ(ara, leu) 7697, galU, galK, rpSL (strR) endA1
Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2 lysogen)
Genotyp: Δ(mcrA)183 Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi- gyrA96 relA1
Pichia pastoris X-33Genotyp: wild type/MutS (Invitrogen)
53

Materiály k výuce - oddělení molekulární biologie crh

Transkript

Podobné dokumenty

Expresní systémy - oddělení molekulární biologie crh

návody do cvičení

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely

Skripta návodů do cvičení z laboratorní techniky

2011 - Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

2010 - Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely