Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití

Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití

Sortování savčích chromozomů a
jejich praktické využití
Svatava Kubíčková, Jan Fröhlich, Halina Černohorská
2
gene specific



FISH sondy
flow sorting
conventional microdissection
laser microdissection
centromere specific
Flowcytometrické karyotypování a sorting
chromozomů - Historie

Užívána od pol. 70. let 20.stol

První experimenty na chromozomech křečka barvené jen ethidium bromidem
(Jednokanálové experimenty).

Konec 70.let - zaveden systém dvou laseru => možnost užití 2 barev vedlo ke
zlepšení rozlišovací schopnosti (Dean and Pinkel, 1978, Langlois and Jensen 1979).

Na počátku 90. let sortované chromozomy sloužily pro konstrukci DNA
knihoven pro počáteční fáze Human Genome Project (Van Dilla and Deaven 1990).

Navzdory všem vylepšením za posledních 20 let se stále nedaří rozeznat
celou řadu chromozomu u různých druhů zvířat => využití FISHIS
(Fluorescence in situ hybridization in suspension).
4
(Gray et al., 1975, Wray and Stubblefield, 1970).
Flowcytometrické karyotypování a sorting
chromozomů - aplikace
5

Detekce delecí, aneuploidii, translokací, markerových chromozomů nebo
jiných chromozomových abnormalit (Gray et al., 1988).

Využití v genomových evolučních studiích (tvorba FISH sond) (Carter et al., 1992).

Flow-sortování chromozomu je jednoduchou a levnou metodikou pro získání
velkých množství určitého chromozomu v karyotypu o vysoké čistotě (více jak
90 %) => užití k vytvoření DNA knihoven.

„Sexation“ – pohlaví potomstva založeno na oplodnění spermiemi, které byly
rozděleny dle přítomnosti chromozomů X a Y.

Aplikace I - Identifikace derivovaných nebo
markerových chromozomů
A)
B)
Figure. Pictures shows flow karyotypes of two patients with derivated chromosomes. The peaks
representing the normal chromosomes and additionally in case A) chromosomes X, 8, and 7, and the
derivative chromosome 8 are indicated. In B) the peaks representing the normal and derivative
chromosomes 21 (Carter et al., 1992).
6
Aplikace II - Chromosome painting and genomové
evoluční studie

Chromosome painting je metoda využívající principy FISH (fluorescence in situ
hybridization).

Malovací sondy vytvořené z chromozomu jednoho druhu jsou hybridizovány na
chromozomy příbuzného druhu.

Reciproký chromozomový painting umožňuje zobrazení chromozomových
homologií, translokací, delecí a popřípadě inverzí, ke kterým došlo během
evoluce (Wienberg et al., 1990, 1992; Jauch et al., 1992, Korstanje 1999).
Figure. Color-banded chromosomes
of human and the great apes
arranged according to the numbering
system of the human idiogram.
Chromosomes in each cases colorbanded using multicolor gibbon probe
set (Harlequin FISH, Cambio)
(Ferguson-Smith et al.,2000).
7
MoFlo™ XDP
DNA specific fluorescent dyes
Hoechst 33258 (A-T), Chromomycin A3 (G-C)
8
Karyotyp Homo sapiens
10
Flow kayryotyp - člověk (Homo sapiens)
Figure. Human bivariate flow karyotype from a normal male
individual. Different peaks represent chromosomes of varying size
and base pair content. Using modern high-end machines, quality
preparations have made it possible to resolve two parental alleles
for certain chromosomes (NG and Carter, 2006).
11
Figure. Human bivariate flow karyotype of the normal male
Lymphocyte cells.
Karyotyp Sus scrofa
12
Flow karyotyp - prase (Sus scrofa)
Figure. Pig bivariate flow karyotype from a normal male (Yerle
et al., 1993)
13
Figure. Izolace prasečích chromosomů z linie IPEC
(Intestinal Porcine Epitelial Cells )
Karyotyp Bos taurus
14
Flow karyotyp - kráva (Bos taurus)
?
28
Figure. Buňky z linie MDBK (Madine-Darby Bovine
Kidney)
15
Figure.Bivariate flow karyotype of the bovine
cell culture. (Schmitz et al.,1995)
Karyotyp Vulpes vulpes
16
Flow analýza karyotypu – liška (Vulpes vulpes)
17
Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal
assignments. Cell line derivated from Red Fox skin
fibroblasts.
Figure. Flow karyotype of the red fox
chromosomal assignments. (Yang et. al, 1999)
with
PALM® MicroLaser system
slide 0,17 mm
objective 100x
150x
18
LMM (laser microbeam microdissection)
19
Laser microdissection and catapulting
20
Chromozomové malovací sondy





21
100-500 kopií chromozomů izolovaných průtokovou cytometrií
10-20 kopií chromozomů ( nebo jejich částí) izolovaných
mikrodisekcí
DNA je amplifikovaná metodou DOP PCR
( primer 5`-CCG
ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3`)
značení amplifikačních produktů v sekundární PCR za využití
značených nukleotidů: biotin-dUTP, digoxigenin-dUTP, orangedUTP, fluorescein -dUTP
ověření sondy FISH
Chromozomové malovací sondy Sus scrofa
sus 3 + 7 + 6 + 1 + 14
Sus scrofa - subchromosomální sondy
Chromozomové malovací sondy Homo sapiens
homo 2
homo 21
Chromozomové malovací sondy Bos taurus
bos 14 + 16 + 20
bos 5tel
Detekce chromozomálních aberací
sus 7 + 18
tranlokace
inzerce
family Bovidae
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
subfamily
28
Caprinae
Cephalophinae
Reduncinae
Alcelaphinae
Hippotraginae
Peleinae
Aepycerotinae
Bovinae
Tragelapinae
Antilopinae
Neotraginae
kráva 2n=60
29
sitatunga 2n=30
stanovení fúzí
Bongo
30
Nyala
Lesser
kudu
Greater
kudu
Bongo
Common
eland
Derby
eland
Bushbuck
Sitaunga
11; 22; 2
1; 5
24; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
2; 10
4; 5
6; 10
5; 10
5; 10
6; 11
6; 11
4; 7
3; 10
1; 29
4; 12
1; 29
5; 10
5; 10
3; 11
1; 29
4; 15
1; 29
4; 19
4; 12
4; 12
6; 16
6; 20
5; 17
8; 15
6; 21
1; 29
1; 29
12; 18
7; 18
8; 16
6; 24
7; 28
9; 20
9; 20
8; 20
8; 17
11; 20
11; 18
8; 15
8; 24
8; 24
9; 27
12; 16
7; 28
7; 26
9; 23
15; 16
15; 16
15; 22
11; 23
9;26
16; 20
11; 20
7; 28
7; 28
14; 29
9; 27
23; 12
14; 19
14; 27
18; 19
18; 19
19; 21
18; 21
9; 28
16; 17
14; 26
14; 26
14; 26
19; 25
21; 23
18; 26
21; 23
21; 23
17; 27
17; 27
15; 28
17; 27
X
X; 13
X
X
X; 13
XX
X
X
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Fylogenetické stromy
Y;13
1
2;22
Tragelaphus imberbis kudu malý
Tragelaphus angasii nyala nížinná
2
1;29
Tragelaphus strepsiceros kudu velký
3
3(2;22)
4
5;10
Tragelaphus scriptus lesoň
5
4;12
Rubes et al. 2008
17;27
21;23
Tragelaphus eurycerus bongo
8
Tragelaphus spekei sitatunga
Taurotragusus oryx a.losí
15
T. derbianus a.Derbyho
Antilopa čtyřrohá (Tetracerus quadricornis ) – tandemové fúze
Ropiquet et al. 2010
Dik-Dik ( Madoqua kirkii) stanovení cytotypu
BOS 11 qd (green)
cen
cen
BOS 26 qd (red)
BOS 23 qd (green)
BOS 27 qd (red)
BOS 28 qd (green)
BOS 1 qd (red)
A1 q: BTA 1, BTA 28, BTA 27, BTA 23, BTA 26,
A1 p: BTA 11
Cernohorska et al. 2011
Žirafa (Giraffa camelopardalis) a vidloroh (Antilocapra
americana ) - přestavby chromozomů BTA1 a BTA3
sondy bos 1tel a bos 3tel
Cernohorska et al. 2013
Antilopini (Bovidae) fúze X;BTA5 - přestavby
GLE, NDA, ETH – tandemová fúze
ACE – centrická fúze
Cernohorska et al. 2015
translokace rob(1;29) u skotu
normalní
rob(1;29)
rob(1;29)
Y
37
X
X
X
Antilopa jelení - polymorfismus
fúzovaný a disociovaný chromozom 8 a 14
38
Mountain
Reedbuck (Redunca
fulvorufula), 2n=56
Chromozomální
mosaicismus
X
Y
Y
Bahnivec horský ( Redunka fulvorufula ) - extra Y chromozom v 11% buněk
39
Orangutan bornejský
a sumaterský
Orangutan
bornejský
( Pongo pygmeus )
a sumaterský ( Pongo abelii )
Tsend-Ayush et al. 2004
stanovení druhu ( bornejský x sumaterský ):
40
FISH sonda homo 3dist
Komparativní FISH a malovací sondy
•
• průtoková cytometrie
+ efektivní, velice rychlé
- omezena na Flowcytometricky
rozlišitelné chromosomy
- sondy pouze pro celé
chromosomy
41
laserová mikrodisekce
+ možnost subchromosomálních sond
(specifické pro ramena, oblasti
chromosomu)
- pomalé, zisk málo chromozomů
- nutná znalost karyotypu
Shrnutí

FISH - dobré využití v oblasti detekce chromozomových abnormalit
(delecí, translokací, inserce).

Flow-sorting poskytuje vysoká množství specifického chromozomu o
vysoké čistotě za relativně krátký čas – vhodné pro FISH sondy
konstrukci BAC klonů, NGS.

Flow-sorting chromozomů je silnou metodou pro identifikaci a
rozlišení chromozomů u celé řady druhů organismů.

Flow-sorting i laserová mikrodisekce – bezkontaktní získání
chromozomů snižuje riziko kontaminace – podstatné u metod
založených na PCR

Laserová mikrodisekce – izolace subchromozomálních fragmentů >
1µm
42