Poruchy funkce krevních destiček laboratorní vyšetření pomocí

Poruchy funkce krevních destiček
laboratorní vyšetření pomocí
agregometrie
Vypracoval: Mgr. Michaela Kneiflová
Trombocyty
 Bezjaderné krevní elementy, tvar disků o průměru 2– 4 μm,
objem 4–8 fl
 Vznikají v KD fragmentací nebo odštěpováním periferní
cytoplazmy megakaryocytů – 5 dní
 Dvě třetiny celkového počtu kolují v periferní krvi, 1/3 je
deponována ve slezině
 Regulace – nejdůležitější růstový faktor trombopoetin,
cytokininy – IL-1,3,6,11, EPO, ….
 Zánik po 8–12 dnech - pohlceny endotelem cév
Megakaryopoéza 8 - 10 dní
Morfologie
 Mitochondrie, Golgiho aparát, Denzní tubulární systém,
lysozomy, Destičková granula
 alfa granula obsahují: von Willebrandův faktor (vWF),
destičkový faktor 4, fibrinogen, trombospondin,, faktor V,…
 denzní granula obsahují: ADP, ATP, Ca2+, serotonin…
 Cytoplazma – aktin, myozin (konstrikce destiček má význam
pro uvolnění obsahu granul).
 Membrána je tvořena lipoproteinovou dvojvrstvou
s negativně nabitými fosfolipidy na „rubové straně“. V zevní
vrstvě jsou umístěny specifické glykoproteiny (GP).
 Na povrchu destiček se nacházejí antigeny skupiny ABO,
antigeny HLA I. třídy a specifické destičkové antigeny (HPA)
Fyziologické parametry a jejich
význam





v periferní krvi dospělého člověka rozmezí
150- 400 x10 exp 9/l
Střední objem MPV v rozsahu 7,8 - 11,0 fl - mikrotrombocyty,
makrotrombocyty
Distribuční šíře destiček PDW v rozsahu 9,0-17,0 fl – anisocytóza
trombocytů
Destičkový hematokrit PCT – poměr Plt v celkovém objemu krve
0,12 - 0,35 % - trombocytémie, trombocytopenie
IPF (frakce nezralých trombocytů) jsou mladé 1-2 dny staré destičky, větší
se zbytky RNA , informace o rychlosti trombopoezy v KD, velký
diagnostický význam pro diagnostiku trombocytopenií způsobených
zvýšenou spotřebou nebo při útlumu KD 1,1-6,1%
Funkce trombocytů
Trombocyty mají významnou úlohu při HEMOSTÁZE
 Aktivace - proces mnoha intracelulárních pochodů, při nichž se uplatňuje
vliv trombinu, TXA2, ADP, adrenalinu, serotoninu, kolagenu
 Adheze – Interakce mezi kolagenem a destičkami je zprostředkována
glykoproteinovými receptory na povrchu destiček, cirkulujícími
plazmatickými proteiny (vWF a Fbg) a reologickými vlastnostmi krve.
 Agregace – destičky agregují prostřednictvím fibrinogenu, pro který
exprimují receptory.
 Konstrikce – díky kontraktilním bílkovinám dochází ke změně tvaru
destiček a uvolnění účinných látek.
 Tvorba trombu → vzniká bílý neboli destičkový trombus (provizorní
hemostatická zátka). Jeho další přeměny jsou součástí procesu
hemokoagulace
 Hojení – trombocyty obsahují látky jako např. PDGF (Platelet Derived
Growth Factor, destičkový růstový faktor), které mají proliferativní účinky a
uplatňují se při regeneraci poraněné tkáně.
Proces Agregace
•
•
•
•
•
•
cesta k místu poškození
adheze
aktivace
uvolňovací reakce
agregace
tvorba destičkového trombu
Poruchy počtu trombocytů
TROMBOCYTOPENIE pokles počtu pod 150x10exp9/l
A. Vrozené - porucha megakaryopoezy v kostní dřeni, krvácivé stavy
B. Získané – různé etiopatogenetické mechanismy
C. Pseudotrombocytopenie – tvorba shluků fenomén EDTA,
destičkový satelismus
D. ITP – zvýšená destrukce v monocyto –makrofágovém systému
E. TTP, HUS, HELLP syndrom, HIT
TROMBOCYTÉMIE zvýšená tvorba krevních destiček
Trombóza, okruh tzv. myeloproliferací
léčba cytostatiky, interferonem, aferézou destiček, antiagregační léky
Poruchy funkce trombocytů
TROMBOCYTOPATIE
A. Vrozené - adheze, aktivace, agregace, sekrece a prokoagulačních




mechanismů
Bernard-Soulierův syndrom – porucha adheze, nedostatek GPIb
Glanzmanova trombastenie – porucha agregace, defekt GPIIb/IIIa
receptroru
Porucha sekrece – Wiskott- Aldrichův s., Chediak – Higashi s., Syndrom
šedých destiček - nedostatek alfa granulí, Heřmanského - Pudlákův s.
Von Willebrandova choroba – defekt vWF,FVIII, porucha adhezivity
destiček, 3typy
B. Získané – spojené s myeloproliferativní onemocnění, MDS, ledviny,
játra, MM, leukemie, lymfoproliferace,
léky – ASA, kortikoidy, peniciliny, prostaglandiny aj.
Využití agregometrie
 Součástí komplexní hemostatické diagnostiky - sníženou i
zvýšenou funkční aktivitu krevních destiček
 Testy agregace krevních destiček jsou nepostradatelné při
všech procesech, kdy se krev dostavá mimo tělo do kontaktu
s cizími povrchy (umělé srdce a plíce, dialýza, atd.),
 pro kontrolu kvality destičkových koncentrátů transfuziologie
Agregace trombocytů - Agregometr
APACT 4004
Princip měření
 Stimulovaná agregace krevních destiček podle Gustava
Borna - induktory
 Samovolná agregace – spontánní, bez induktorů
 Plazma bohatá na destičky PRP se michá magnetem při
teplotě 37° rychlosti 700-1 000 rpm v kyvetě, paprsek
fotometru měří a zaznamenavá změnu optické hustoty
(extinkce) vyvolanou induktorem
 Agregometr APACT uloží naměřene hodnoty PPP a PRP pro
každý vzorek a automaticky vypočítá výsledek % agregace
minimalní i maximalní
APACT 4004 – schéma měření
Vyšetření
• Citrátová krev ( ředění 1 : 10 )
• PRP - centrifugujeme 15 minut při 150 x g při pokojové
teplotě (nesmi být žádné erytrocyty)
• PPP - centrifugujeme 15 minut při 2000 x g
• Rozsah měřeni PRP: 30 000-600 000 krevních destiček /μl
• Rozsah měřeni PPP: < 5 000 krevních destiček /μl
• Stabilita PRP a PPP: max. 2 hodiny při pokojové teplotě
• V kyvetě – 200 μl PRP + 20 μl reagencie (použitý induktor
příslušné koncentrace)
Přehled induktorů
• Induktory
Arachidonová kyselina,Ristocetin,Kolagen, ADP,CPG , Trombin,
Epinefrin
• Fyziologické hodnoty
Ma - 60 -100% stimulovaná agregace
0 - 10% samovolná agregace
Slope - monitorování ASA pomocí CPG
nad 65%/min nedostatečná léčba
pod 35%/min nadměrná léčba
ADP
ADP se váže na dva Gproteinem spojené
receptory: P2Y1 a P2Y12.
Tato vazba vede k
uvolnění intracelulárního
vápníku a změně tvaru
destičky a to má za
následek primární vlnu
agregace. Druhá vlna
agregace odráží uvolnění
dalšího ADP ze zásobních
granulí destičky.
Adrenalin
• Adrenalin se váže na alfa-2
adrenoreceptor na povrchu
destiček, což vede
k uvolnění intracelulárního
Ca a změně tvaru destičky to
má za následek a primární
vlnu agregace. Druhá vlna
trvalé agregace odráží
uvolnění ADP ze zásobních
granulí destičky.
Trombin
• Trombin je nejúčinnější
aktivátor destiček a
receptorů aktivovaných
proteázami. PAR1 a PAR4
jsou aktivovány trombinem.
PAR1 a PAR4 patří do
skupiny transmembránových
G proteinem spojených
receptorů, které jsou
aktivovány jedním štěpením
na N-konci, tím se vytvoří
nové N zakončení a aktivuje
se G podjednotka a dochází
k signalizaci do buňky
Kolagen
• Kolagen se váže na GpIV
a GpIa/IIa receptory
indukující uvolňovací
reakci, TXA2 generaci a
pak trvalou GPIIb-IIIa
aktivaci.
• Po přídavku kolagenu
k PRP se dá pozorovat
lag fáze na agregační
křivce, obvykle do jedné
minuty od přidání
Ristocetin
• Ristocetin pokud je
navázaný na destičkový
GPIb protein způsobí
aglutinaci destiček tím,
že iniciuje navázání vWF
přes GPIb-IX-V komplex.
• Agregace vyžaduje
navázání fibrinogenu na
destičku přes GpIIb-IIIa
komplex
• Ristocetin je
antibiotikum
AA
• Arachidonová kyselina je
prekurzorem TXA2 uvnitř
destiček.
• Arachidonová kyselina je
převedena na TXA2
cyklooxygenázou a
tromboxansyntetázou.
• TXA2 je potenciálním
induktorem agregace,
jednak se TXA2 uvolní
granulí a navíc tvorba
TXA2 následně trvale
aktivuje GpIIb-IIIa
z
Hodnocení kalibrační křivky
 Maximální amplituda Ma – maximální možná agregační
odpověď, výpočet rozdíl transmise PPP a PRP v %
 Maximální sklon Ms – rychlost nárůstu transmise světla
v důsledku tvorby agregátů, výpočet - tangenta úhlu,
který svírá křivka s hodnotou transmise PRP
 Doba latence T lat – čas od přidání induktoru do doby
změny transmise světla
 Druhá vlna agregace ( ADP - chybí porucha sekrece )
 Deagregace ( porucha uvolňovací reakce )
Kalibrační křivka
• Baseline – PRP - 0% agregace
• Přídavek agonisty – ten má za následek
změnu tvaru destiček a tím dojde k poklesu
absorbance.
• Primární agregační vlna
• Uvolnění nukleotidů
• Druhá vlna agregace
• Adrenalin a malé dávky ADP klasicky
poskytují dvoufázové křivky zatímco u
ostatních agonistů bývá vidět pouze jedna
vlna a je nemožné rozlišit primární a
sekundární vlnu.
Kalibrační křivka
Procento maximální agregace
Slope – Strmost křivky
Interference
 Počet destiček
Ideálně v rozmezí mezi 200 – 300 x 109/L
Počet destiček nižší než 100 x 109/L může vést
k zmenšení agregační odpovědi
 Hladina fibrinogenu
 Potraviny (česnek, kurkuma, ananas, ženšen, jinan,
kofein,….)
 chylózní plazma - interferenci tukových kapének při
světelné transmisi
Léky
 mohou ovlivnit funkci destiček - ASA, léky proti zánětu,
specifické léky proti destičkám
 léky jejichž prvotní rolí není inhibovat funkci destiček antibiotika, antidepresiva, betablokátory
 Pacient by neměl být na léčbě 7-14 dní před odběrem.
Pacient bez léčby agregace ve fyziologickém rozmezí
Pacient - antiagregační léčbě ASA 100mg denně,
trombofilní stav( trombosa vena centralis rethinae) FVL
heterozygot
Přehled vybraných defektů
Defekty funkce destiček
Defekt
Trombasthenia
Trobocytopatie
VW choroba
Nesteroidní a
protizánětlivé léky
ADP
↓
N ( 1 vlna )
N
N (1 vlna )
Colagen
↓
↓
N
↓
Ristocetin
N
N
Abnormální
Abnormální
Agregační odpovědi u vybraných abnormalit
Reagencie
koncentrace
Aspirin
efekt
VW +
BSS
Glansmanova
thrombastenie
N
N
Skladovací
pool/sekreční
defekt
N,R
( inhibice
2vlny)
N
N
ADP
5-10µM
N
AA
Colagen
0,5mM
2-5µg/ml
Ristocetin
0,25 1,5mg/ML
N,R
(inhibice
2vlny)
↓↓
2µg/ml –R
5µg/ml - N
Kvalitativní
defekt
↓↓,R,H
N
N
↓↓( absent)
↓↓
↓↓
Závěr – využití agregometrie
Děkuji za pozornost