Studijní materiály pro bioinformatickou část ViBuChu – úloha III

Studijní materiály pro bioinformatickou část ViBuChu – úloha III

Studijní materiály pro
bioinformatickou část ViBuChu
–
úloha III
Jan Komárek, Gita Jančaříková
Rekombinantní proteiny
rekombinantní DNA – uměle připravená sekvence, která
vznikla kombinací různých sekvencí DNA
q  rekombinantní proteiny – proteiny získané vnesením
rekombinantní DNA do hostitelského organismu (bakterie,
kvasinky) odlišného od organismu, ze kterého daná DNA
pochází
q 
výhodou technologie rekombinantních proteinů je
produkce proteinů ve vysokých množstvích
q  v průmyslovém měřítku je takto produkována řada látek
používaných v medicíně, např. insulin, faktory srážení
krve, některé hormony
q 
Klonování genu
1. příprava rekombinantní molekuly DNA
- štěpení vektoru a inzertu restrikčními
enzymy, vložení inzertu do vektoru, ligace
fragment DNA
plasmidový
vektor
inzerce fragmentu DNA
do vektoru
rekombinantní
plasmid
transformace do
bakteriálních buněk
2. přenos rekombinantní DNA do buňky
(např. bakteriální, kvasinkové)
bakteriální chromozóm
transformované buňky přežívají
3. selekce buněk obsahujících rekombinantní
DNA – vysetí buněčné kultury na agarovou
misku s určitým antibiotikem
replikace
buňky bez plasmidu v
přítomnosti
antibiotika umírají
dělení buněk
kolonie buněk obsahující
kopie stejného plasmidu
http://bioinfo2010.wordpress.com/
Restrikční endonukleasy
restrikční endonukleasy (restriktasy) – enzymy, které
rozpoznávají specifické sekvence (restrikční místa) v
jednořetězcové nebo dvouřetězcové DNA a DNA v nich
štěpí
q  restrikční místa – dlouhá asi 4-8 nukleotidů, často mají
charaker palindromů (obrácených repetic)
q 
5´GTTAAC 3´
3´CAATTG 5´
q 
palindromatické sekvence – stejné
čtení od začátku jedné sekvence a
konce druhé sekvence
označování restriktas: EcoRI
pořadové číslo
podle rodového, respektive
druhového
jména organismu,
první
písmeno
ze kterého restriktasa pochází,
podle
rodu
např. Escherichia coli
označení kmene
Restrikční endonukleasy
štěpení za vzniku kohezních (lepivých) konců
XmaI
5´C 3´
5´ CCGGG 3´
3´GGGCC 5´
3´ C 5´
za vzniku 5´ CCGG přečnívajících konců
...využití v molekulární biologii a
genovém inženýrství
5´CCCGGG 3´
3´GGGCCC 5´
SmaI
5´CCC 3´
3´GGG 5´
5´ GGG 3´
3´ GGC 5´
štěpení za vzniku tupých konců
NEBcutter
http://tools.neb.com/NEBcutter2/
nástroj k provedení restrikční
analýzy sekvence DNA
(vyhledávání restrikčních
míst)
kromě běžných zkratek
nukleotidů (A, G, C, T) se v
sekvencích, které rozpoznávají
restriktasy setkáte i s dalšími
zkratkami (pokud specifita
restriktas není úplně striktní),
například:
N = jakákoliv báze
R = A nebo G (purinové báze)
Y = C nebo T (pyrimidinové báze
vložení nukleotidové sekvence, buď
jako holý text nebo ve FASTA formátu...
zvolení sady enzymů,
která se mají použít...
NEBcutter
grafické znázornění restrikčních míst
krátké info o pozici štěpení a povaze
vzniklých konců (zobrazení kurzorem)
= vznikají tupé konce
= lepivé konce s 5´ přesahy
= lepivé konce s 3´ přesahy
= štěpí jenom jeden řetězec
znázornění podle komerční
dostupnosti
vliv methylace DNA na aktivitu
restriktas
podrobné informace o enzymu se
zobrazí po rozkliknutí odkazu...
NEBcutter
grafické znázornění štěpícího místa
enzymy rozpoznávající
stejnou sekvenci jako BfaI
enzymy produkující
kompatibilní konce
k BfaI
Spojování fragmentů DNA s
lepivými konci
pro klonování se nejčastěji
používá dvojice restrikčních
endonukleas, které z
vektoru vyštěpují krátký
fragment DNA
konce linearizovaného
vektoru a vkládaného
genu štěpené stejnými
restriktasami jsou si
navzájem komplementární
a hybridizují spolu (vážou
se na sebe), nakonec jsou
enzymaticky spojeny
(ligovány)
Metody molekulární biologie: Šmarda, J., Doškař, J., Pantůček, R., Růžičková,
V., Koptíková, J. (2005)
PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction
q  metoda umožňující in vitro enzymatickou amplifikaci
templátové DNA
q  k PCR reakci jsou zapotřebí: DNA polymerasa, templátová
DNA, jeden nebo dva primery, deoxynukleosidtrifosfáty, pufr
a kationty Mg2+
q 
termostabilní DNA polymerasa – umožňuje replikaci s exponenciálním
nárůstem kopií specifických DNA úseků (např. Taq polymerasa
izolovaná z bakterie Termobacillus aquaticus)
q  primery - krátké syntetické oligonukleotidy (10 – 25 bp), které jsou
komplementární k 5' a 3' koncům DNA sekvence a iniciují syntézu
DNA
q  deoxynukleosidtrifosfáty (dNTPs) – stavební kameny, z nichž DNA
polymerasa syntetizuje nový řetězec DNA
q  pufr - vytváří vhodné prostředí pro stabilitu a aktivitu DNA polymerasy
q  kationty Mg2+ - kofaktor nezbytný pro funkci enzymu
q 
PCR
založena na cyklickém střídání teplot, skládá se z
několika kroků:
1.  denaturace dsDNA zvýšením teploty reakční směsi na
94 – 98 °C (20 – 45 s) → oddělení řetězců
2.  Připojení primerů k ssDNA templátu snížením teploty na
30 – 65 °C (po dobu 30 – 90 s) - tzv. „annealing“
3.  nastolení podmínek vhodných pro samotnou replikaci
zvýšením teploty na 72 – 75 °C (45 – 90 s)
q 
q 
q 
doba trvání jednotlivých cyklů závisí na délce
replikovaného fragmentu a na typu polymerasy
jednotlivé cykly se ve stejném sledu opakují zpravidla 30
– 35 x
Průběh PCR
UPPER - FORWARD - LEFT
5´
+ 5´
-
3´
5´
3´
5´
Návrh primerů
LOWER - REVERSE - RIGHT
5´ CTT CTG CTC AAT CTT TCT AC 3´ FORWARD
CTCAATCTTT CTACAACCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA
+• 5´511 ATGGCTTCTG
TGTCATGGTT GTGGACGATG ATCATGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA
101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT
151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT
201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT
251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA
301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT
351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA
401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA
451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA
501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT
551 AAAAAAAAAA AAAAAATTGT AAATCGTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA
601 TCTTAGTTTA AAACTAGCTG ATATTCTTCA AATCGACTGT TCTTATAAGT
651 AATCAACCAA TTAGCATCAA TCACAATAAA TTGTAAACAC TTCAATGAAA
701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT
751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC
801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA
851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT
901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG
951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT
1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC
1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA
1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA
3´
•
5´ TGA AGA ATA TCA GCT AGT TT 3´
REVERSE
Konečná, H.: Podklady k přednáškám ze Základů genomiky.
červený a modrý obdélník
vymezuje oblast sekvence DNA,
která má být amplifikována
„forward“ primer odpovídá
červené oblasti (primer je
komplementární k druhému
řetězci DNA, který je
komplementární k sekvenci
prvního řetězce), „reverse“
primer se váže na modrou oblast
sekvence a odpovídá
komplementární sekvenci k
modré oblasti čtené odzadu
Primery
q 
k návrhu a ověření vlastností primerů se využívá volně
dostupná webová aplikace OligoAnalyzer
q 
Obecné parametry (vlastnosti) primerů:
q 
velikost: 18 – 30 nukleotidů (optimálně 20 – 25 nukleotidů)
q 
obsah G+C: 40 – 60 %
q 
Tm („teplota tání“ – udává teplotu, při které je polovina DNA v
dvouřetězcové formě a polovina ve formě jednořetězcové): 55 –
80 °C
q 
primery by neměly vytvářet stabilní dimery (jak dvě molekuly
téhož primeru - homodimery, tak dvě molekuly různých primerů heterodimery)
q 
primer by neměl vytvářet stabilní vlásenky
OligoAnalyzer
q 
http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/
default.aspx
Vložení oligonukleotidové
sekvence
Charakterizace
primerů
OligoAnalyzer
důležité parametry
OligoAnalyzer
Tm vlásenky by měla být co nejnižší,
případně nesmí přesáhnout Tm primeru
OligoAnalyzer
Hodnota deltaG by měla být co největší (čím vyšší hodnota, tím
nižší stabilita vzniklého dimeru) – stabilita dimeru závisí na počtu
vzniklých párů basí
OligoAnalyzer
Vložení sekvence
druhého primeru
Pro získané parametry platí
stejná pravidla jako u
homodimerů
Klonovací vektory
vektor – DNA využívaná pro přenos cizího genetického
materiálu dovnitř buněk, jeho namnožení a případně i expresi
q  jako vektory se používají např. plasmidy, bakteriofágy, ...
q  každý vektor musí obsahovat:
q 
ori (počátek replikace) – nutný pro replikaci vektoru v buňce
q  selekční marker – pro odlišení buněk, které obsahují vektor, selekční
marker uděluje buňkám např.rezistenci k určitému antibiotiku
q 
q 
q 
multiklonovací místo (MCS, polylinker) – segment DNA, který
obsahuje až 20 unikátních cílových míst, které se jinde ve vektoru
nenacházejí a které jsou rozpoznávány restrikčními endonukleasami;
místo, kam se vkládá cílová sekvence DNA (tzv. inzert)
expresní vektory obsahují navíc
q 
oblasti důležité pro expresi proteinu (promotor, operátor, rbs,
terminátor)
multiklonovací
místo
Plasmidový vektor
vektorová mapa:
plasmid – kruhová molekula DNA schopná samostatné
replikace nezávisle na chromozomové DNA, nachází
se především u bakterií - není pro ně nezbytná, ale
uděluje jim oproti jiným bakteriím určitou výhodu
(rezistence proti antibiotikům, těžkým kovům, ...)
selekční
marker
sekvence uvedena od 5´konce po 3´konec (po záměně T
za U odpovídá sekvenci mRNA vznikající přepisem 3´ 5
´řetězce)
promotor a operátor –
řídí transkripci
komerční vektor
od firmy Novagen
oligohistidinová kotva –
usnadňuje purifikaci proteinu,
jehož je součástí, z buněčného
lyzátu, který obsahuje
desetitisíce různých proteinů
(ale není nezbytně nutná)
počátek replikace
5´
vazebné místo pro
ribozom - translace probíhá
od prvního následujícího
iniciačního kodonu
N
C
3´
terminátor – ukončení
transkripce