t mplexni N-oligosacharidy

Obsah
MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST .................................................... 4
Úvod do problematiky projektu ..................................................... 4
Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec,
komplementarita bází, GMO) .................................................... 6
E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA ..... 13
Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních
proteinů ........................................................................................ 17
Bakteriální expresní systémy ................................................... 19
Kvasinkové expresní systémy ................................................... 24
Hmyzí expresní systémy ........................................................... 29
Savčí expresní systémy ............................................................. 31
Výběr genu a jeho izolace ............................................................ 35
Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní
protein ...................................................................................... 35
Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní
protein ...................................................................................... 36
Techniky izolace známého genu a cDNA (PCR, RT-PCR, RACE) 39
Práce s genovými a proteinovými databázemi ........................ 45
Klonovací a expresní plasmidy ................................................. 46
Základní technika klonování (restrikce – ligace) ...................... 49
Minipreparace a maxipreparace DNA ..................................... 50
Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu. ................. 51
Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální,
rekombinace do genomu ............................................................. 54
2
Vnesení plasmidů do buněk – transformace............................... 54
Chemická transformace – principy, příprava kompetentních
buněk ........................................................................................ 54
Elektroporace – princip, příprava kompetentních buněk,
podmínky .................................................................................. 55
Stabilita plasmidů v buňkách ....................................................... 57
Episomální DNA ........................................................................ 57
Antibiotická selekce ................................................................. 57
Homologní rekombinace .......................................................... 59
Ověření exprese genů na laboratorní úrovni .............................. 59
Fenotypová analýza, PCR analýza ............................................ 59
Skríning produkce rekombinantních proteinů ........................ 60
ORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE ............................. 62
Historie ......................................................................................... 62
Výměna genetické informace ...................................................... 63
Bakterie .................................................................................... 63
Eukaryota .................................................................................. 64
Vznik imunity jako obrany integrity ............................................. 66
Genom člověka ............................................................................. 67
Pangenom..................................................................................... 69
Závěy ............................................................................................. 70
Doporučená literatura .................................................................. 71
Internetové zdroje ........................................................................ 71
3
MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST
Úvod do problematiky projektu
Základním cílem projektu je demonstrace a praktické provedení dílčích experimentů
vedoucích k biotechnologické produkci hyaluronové kyseliny (HA), použitelné pro
farmakologické účely. U člověka se HA tvoří jako součást chrupavky kloubů, synoviální
tekutiny kloubů, ale i kůže, kde významnou měrou přispívá k hojení ran. Na HA, jako
součást mimobuněčné hmoty (extracelulární matrix), se prostřednictvím receptoru
(CD44) vážou buňky imunitní, aby zde mohly zahájit svou obrannou funkci. HA je dále
zapojena například do vývoje nervové soustavy. V neposlední řadě se HA uplatňuje při
nádorovém bujení a rozvoji metastáz.
Z chemického hlediska je ha lineární polymer tvořený opakující se sekvencí dvou
jednotek: D-glukuronové kyseliny a D-N-acetyglukosaminu spojených střídavými
glykosidickými vazbami β-1,4 a β-1,3 (Obr. 2.1).
4
Obrázek 2.1. Struktura kyseliny hyaluronové
Je známo, že některé bakterie z řádu Lactobacillales tvoří HA jako součást
bakteriálního pouzdra chránícího bakterii před působením imunitního systému hostitele.
Její struktura je identická s ha lidskou. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus
představuje jednu z bakterií používaných k biotechnologické přípravě HA. Bakterie
produkuje mimo jiné enzym -glukuronidasu, odštěpující z neredukujícího konce HA
glukuronovou kyselinu (GK) viz. Obrázek. 2.2, která je dále metabolizována jako zdroj
energie. Geny podílející se na metabolismu GK jsou sdruženy v jednom operonu (βglucuronic-acid-utilizing operon), jehož exprese je přítomností volné GK aktivována.
Aktivace operonu, ač finálně vedoucí k zisku energie z GK, představuje pro bakterii
významnou metabolickou zátěž spojenou se zpomalením rychlosti dělení buněk.
Obrázek 2.2. -glukuronidasa štěpí glukuronosid na glukuronát
5
V této kapitole bude probrána základní terminologie a molekulárně biologické
techniky umožňující pochopení veškerých dílčích metodických postupů vedoucích k
přípravě mutantního kmene Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který neexprimuje
enzym β-glukuronidasu v důsledku navozené ztrátové (deleční) mutace příslušného genu
(gusA).
Principiální výhodou biotechnologického použití bakteriálního kmene, který
netvoří β-glukuronidasu, je zvýšení rychlosti růstu mutantních bakterií a následné zvýšení
výtěžku ha z jednotkového objemu bakteriální kultury v důsledku energetické
úspory inaktivací β-glucuronic-acid-utilizing operonu.
Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO)
Jelikož v následujících kapitolách budou používány některé pojmy, které usnadňují
popis metod molekulárního klonování, nejdříve uvedeme jejich definice, případně
vysvětlení souvislostí.
Operon – skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční
jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou
transkribovány do polycistronické mRNA.
Gen – základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti.
Strukturní gen – úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje
strukturu proteinu a RNA molekuly, ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich
exprese.
6
Operátor – oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor) bránící iniciaci
transkripce z přilehlého promotoru.
Promotor – oblast DNA, na kterou se váže RNA polymerasa a transkripční faktory,
zahajující transkripci mRNA.
Cis-trans komplementační test – párovací test, sloužící k určení toho, zda dvě různé
recesivní mutace na opačných chromozomech diploidního organismu (pozice in trans) se
vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne,
postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako „test alelismu“ (Obr. 2.3).
Cistron – nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci ve výše
zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliže tytéž mutace
jsou na jednom chromozomu (v poloze in cis). Cistron je tedy slučitelný s pojmem
kódující částí jednoho genu.
Cis regulace – odpovídající cis poloze v cis-trans testu.
Polycistronická mRNA – mRNA kódující více než jeden protein.
Vnitřní místo nasedání ribozomů – vzhledem k tomu, že z polycistronické mRNA se
přepisují různé proteiny, musí docházet k nasedání a sestavení ribozomu i mezi úseky
mRNA kódující jednotlivé proteiny.
Obrázek 2.3. Princip segregačního cis-trans testu
7
Čtecí rámec – transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA a přinášejí nově
syntetizovanému peptidu další aminokyseliny k jeho prodlužování. Jednotlivé tRNA
rozlišují podle principu komplementarity příslušnou trojici nukleotidů na mRNA.
Z takovýchto trojic je souvisle vytvořena kódující část mRNA. Při návrhu klonovacích
postupů spojujících dvě oblasti genů kódujících budoucí fúzní protein je třeba bedlivě
dbát, aby při spojování dvou DNA vznikl opět souvislý sled tripletů bez vmezeření či
výpadku báze DNA, neboť jinak by došlo k posunutí čtení tripletů a k přepisu
nesmyslného proteinu.
Komplementarita bází – báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné
dodržet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování.
Kohezivní konce dvouvláknové DNA – jednovláknový úsek DNA molekuly přesahující
buď na 5’ nebo 3’ konci dvouvláknovou DNA, který v rámci komplementarity bází může
vázat komplementární úsek jiné DNA molekuly. Pokud na obou koncích DNA molekuly
„A1“ jsou přesahující konce odlišné sekvence (vzájemně nekomplementární) a DNA
„B2“ je ukončena konci komplementárními k úsekům molekuly „A1“, můžeme tyto dvě
molekuly spojit (ligovat) tak, že je předem zajištěna správná orientace obou úseků DNA
vůči sobě (Obr. 2.4). Kohezivní konce můžeme připravit štěpením DNA dvojšroubovice
DNA endonukleázou. Pokud použijeme dvě odlišně štěpící endonukleasy, vznikne DNA
8
úsek se dvěma různými kohezivními konci. Stejným ošetřením jiné molekuly vytvoříme
pár dvou DNA fragmentů, které je možno následně stranově specificky spojit (Obr. 2.4).
Použitím restrikčních endonukleáz, které po rozštěpení DNA vytvoří přesahující konec
ve formě palindromu, je zajištěna komplementarita všech konců vzniklých štěpením
jednou endonukleázou.
Palindrom – sekvence DNA, která je vzájemně „komplementární“ podle svého středu
(AGCCT nebo ACTGCAGT).
Obrázek 2.4. Využití kohezivních konců pro jednosměrné klonování
Pro snadnější pochopení některých výše uvedených pojmů popišme stručně Lac
operon E. coli. Představuje jeden z prvních popsaných operonů. Je tvořen skupinou
přilehlých společně regulovaných genů zapojených do metabolismu laktózy lacZ, lacY a
lacA. Pokud buňky rostou v médiu bohatém na glukózu, exprese genů lac operonu je
blokována lac represorem (produkt přilehlého lacI genu), který se váže na operátor a
brání tak nasedání RNA polymerasy. Pokud však buňky rostou v médiu obsahujícím
laktózu nebo její nemetabolizovatelné analogy jako isopropyl-1-thio-β-D-galaktosid
(IPTG), represor je vazbou β-galaktosidů uvolněn z vazby na operátoru a RNA
polymerasa může nasedat a zahájit transkripci polycistronické mRNA lac operonu. Gen
9
lacZ kóduje β-galaktosidasu, gen lacY kóduje permeasu pro β-galaktosidy a gen lacA
kóduje galaktosid-acetyltransferasu, enzymy nezbytné pro metabolické využití laktózy.
Plasmid – extrachromozomální DNA, která se replikuje a může se přenášet z generace na
generaci, pokud je to pro hostitelskou bakterii výhodné. Příkladem výhodnosti je, že
plasmid kóduje protein zajišťující rezistenci na určité antibiotikum. Jiný příklad je, že
plasmid kóduje proteiny nezbytné pro vazbu bakterií na hostitelské tkáně v průběhu
infekce nebo umožňuje bakterii lépe se bránit imunitnímu dozoru hostitele (například
povrchové antigeny borelií). Plasmid může být cirkulární (většina) nebo lineární (znám u
laktobacillů, borelií, streptomycet). Aby mohl být plasmid replikován, musí obsahovat
místo, kde je replikace zahájena. Nejčastěji používané plasmidy jsou deriváty dvou
E. coli plasmidů ColE1 a pMB1. Oba plasmidy se vyskytují v hostitelské buňce v počtu
15–25 kopií. Toto číslo je kontrolováno plasmidovým replikátorem, což je úsek plasmidu
nesoucí začátek replikace ori a další regulační sekvence či geny kódující regulační
proteiny, nikoliv však polymerasy a endonukleasy. Replikátory ColE1 a pMB1 jsou
podobné. Replikátor ColE1 je dlouhý 600 párů bází, kóduje ori místo zahájení replikace
hostitelskou DNA polymerázou, RNA primer a dva negativní regulátory RNAI a protein
Rop. Všechny enzymy účastnící se procesu replikace pochází z hostitelské bakterie.
Kritickým bodem zahájení replikace je vytvoření správné sekundární struktury dočasně
vytvořeného RNAII transkriptu, syntetizovaného hostitelskou RNA polymerázou, která
spouští jeho rozštěpení hostitelskou RNázouH, a následné zahájení replikace hostitelskou
DNA polymerázou. Regulace replikace spočívá v narušení sekundární struktury RNAII
transkriptu vazbou regulační RNAI a stabilizací této vazby proteinem Rop, což znemožní
zahájení replikace (Obr. 2.5). Mutací sekvencí RNAI či rop genů je možné značně zvýšit
počet kopií plasmidu na jednu buňku. Některé mutace replikátoru vedou k počtu kopií na
jednu buňku až 3000. Na druhou stranu plasmidy s velmi nízkým počtem kopií se
replikují synchronně s buněčným cyklem hostitelské bakterie, neboť pro zahájení své
replikace vyžadují některé hostitelské proteiny, jejich exprese je spojena se zahájením
buněčného dělení. Tyto plasmidy většinou nesou geny zajišťující regulovanou segregaci
plasmidů mezi dceřiné buňky. Přehled replikátorů používaných v molekulárním klonování
je uveden v Tab. 2.1.
Tabulka 2.1. Nejčastěji používané replikátory
Název
Příklad
Délka (bp)
Selekční znak
prototypu
Pmb1
Pbr322
4, 362
Apr, Tetr
10
Počet kopií
a
Vysoký; 100 ÷ 300
Reference
Bolivar et al., 1977
Kanr, Tetr,
Cole1
Pmk16
~ 4,500
Vysoký; > 15
Kahn et al., 1979
P15a
Pacyc184
~ 4,000
Emlr, Tetr
Psc101
Plg338
Vysoký; ~ 15
Chang et al., 1978
~ 7,300
Kanr, Tetr
Nízký; ~ 6
F
Stoker et al., 1982
Pdf41
~ 12,800
Trpe
Nízký; 1 ÷ 2
Kahn et al., 1979
R6k
Prk353
~ 11,100
Trpe
Nízký; < 15
Kahn et al., 1979
Cole1imm
R1
r1drd-17
Pbeu50
~ 10,000
Ap r, Tetr
Rk2
Prk2501
~ 11,100
Kanr, Tetr
Nízký – pod 30°C
Vysoký – nad 35°Cb
Nízký; 2 ÷ 4
Uhlin et al., 1983
Kahn et al., 1979
a
počet kopií odpovídá prototypovému plasmidu. Mutace v replikátoru může značně
ovlivnit počet kopií. Například u pUC řady (pMB1) mutace replikátorů vedou až k 1000
÷ 3000 kopiím na jednu buňku. Převzato z Current Protocols in molecular biology,
Wiley, New York.
b
citlivé na teplotu kultivace.
Inkompatibilita plasmidů – je stav, kdy dva neidentické plasmidy nemohou společně
koexistovat v jedné buňce dlouhou dobu, pokud nejsou oba udržovány pomocí rozdílných
selekčních znaků, například antibiotik. K inkompatibilitě dochází zejména, pokud dva
plasmidy sdílejí podobné regulační mechanismy replikace. Inkompatibilita je důsledkem
neschopnosti korigovat fluktuace vyplývající z náhodné selekce jednotlivých kopií
k iniciaci replikace a následnému rozdělení plasmidů do dceřiných buněk. Jelikož ColE1
a pMB1 mají podobné replikátory, a jsou tedy podobně regulovány RNAI, jsou ve stejné
skupině inkompatibility a nemohou dlouhodobě koexistovat v jedné buňce. Pozor, dva
plasmidy vzniklé rekombinací (například vnesením dvou velmi podobných inzertů) se liší
pouze svou velikostí a jsou rovněž inkompatibilní .
Episom – DNA element, který se může replikovat nezávisle na replikaci chromozomu
(stejně jako plasmid) nebo se může integrovat do chromozomu a zde se replikovat
společně s chromozomální DNA. Po opětném vystřižení z chromozomu existuje jako
cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu.
Obrázek 2.5. Regulace replikace ColE1 a pMB1 plasmidu pomocí RNAII a Rop
11
MCS – místo v klonovacím plasmidu určené pro vnášení cizorodé DNA. Je tvořeno
úsekem DNA složeným z krátkých sekvencí rozlišovaných různými restrikčními
endonukleasami. Pro smysluplnost postupu tato restrikční místa nesmí být umístěna
v jiných oblastech plasmidu. V mnoha plasmidech je MCS umístěno uvnitř genu lacZ
jako součást lac operonu.
GMO – geneticky modifikovaný organismus. V průběhu molekulárního klonování
vnášíme různé DNA úseky do plasmidů a tyto vnášíme do hostitelských bakterií za
účelem selekce a amplifikace plasmidů. Vnesením cizorodé DNA jinou než přirozenou
cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugace přirozených plasmidů atd.).
Vzniká buňka, která obsahuje laboratorně manipulovanou DNA a podle definice se jedná
o geneticky modifikovaný organismus. Pro manipulace vedoucí ke vzniku GMO je nutné,
aby měla laboratoř povolení k této manipulaci od Ministerstva životního prostředí – MŽP
(v kategorii rizika i stačí podat oznámení MŽP) – a aby pravidelně, jednou za rok,
oznámila MŽP formou ročního hlášení (vždy k 15. únoru následujícího roku), jak
nakládala s GMO. Legislativa související s manipulací s GMO, jednotlivé kategorie a
způsoby nakládání jsou definovány zákony a vyhláškami České republiky (zákon
12
178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a
nařízeními Evropského parlamentu a rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). V ročním
hlášení je kladen důraz na dodržení podmínek deklarovaných v oznámení o nakládání.
Toto roční hlášení musí schválit odborný poradce pro GMO, který je u každé instituce
jmenován statutárním zástupcem. Pracovníci nakládající s GMO musí být pravidelně
školeni. Příklad obsahu pravidelné roční zprávy je uveden v Tab. 2.2.
Tabulka 2.2. Formulář ročního hlášení pro uzavřené nakládání s GMO
Uživatel
Datum a číslo rozhodnutí o zápisu do seznamu uživatelů
Používané GMO (podle zápisu GMO v seznamu uživatelů)
Odborný poradce
Účel nakládání s GMO
Pracoviště
Kontaktní osoba na pracovišti
Kategorie rizika
Přibližné množství použitých GMO
Veškeré změny v nakládání proti údajům uvedeným v žádosti o zápis do seznamu uživatelů
(např. Pokud nebyly některé GMO v uplynulém roce používány)
Likvidace GMO
Mimořádné události v průběhu nakládání s GMO a přijatá opatření
Kontroly výskytu GMO mimo uzavřený prostor
Jakákoliv pozorovaná souvislost s přímým či nepřímým ohrožením lidského zdraví
Další poznatky získané při nakládání s GMO, které mají vliv na hodnocení rizika
Bude uzavřené nakládání s GMO pokračovat v dalším roce? Pokud ne, uvést důvod ukončení.
Pokud ano, jsou plánovány nějaké změny?
Shrnutí (porovnání skutečného průběhu nakládání s GMO s údaji uvedenými v žádosti o
zapsání do seznamu uživatelů)
E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA
V průběhu molekulárního klonování se téměř každý experimentátor setká s nutností
využít nějaký klonovací či expresní plasmid. Jejich konstrukce a amplifikace se,
13
s výhodou danou jejich původem, provádí s pomocí hostitelského mikroorganismu,
jakým je nejčastěji E. coli. Tato jedna z nejlépe prostudovaných bakterií umožňuje velmi
přesně amplifikovat plasmidovou DNA, selektovat připravené rekombinantní varianty
plasmidu a v mnoha případech získat s vysokým výtěžkem i rekombinantní proteiny
plasmidem kódované.
E. coli je Gram negativní tyčka s cirkulárním chromozomem o velikosti zhruba 3.106
párů bází. Je schopna růstu na minimálním médiu obsahujícím zdroj uhlíku jako je
glukóza a soli, které jsou zdrojem dusíku, fosforu a stopových kovů. Na médiích
obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. však roste mnohem
rychleji. Po naočkování malého množství bakterií (inokula) do obohacených médií se
bakterie po úvodní fázi lag dělí exponenciálně se zdvojovacím časem 20–30 minut. Tato
exponenciální fáze se nazývá log fáze. V log fázi růstu setrvává bakterie, dokud
nespotřebuje veškeré živiny či kyslík, nebo pokud množství zplodin metabolismu, jako
jsou například kyseliny, nepřesáhne hranici inhibice růstu. Většina kmenů E. coli
používaných při rekombinaci DNA je derivována z nepatogenní linie E. coli K-12,
izolované v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v
Kalifornii.
F faktor – fertility (nebo sex) faktor umožňuje přenos genetického materiálu z jedné
E. coli, která F faktor obsahuje (F+, samčí, dárcovská) do druhé, která F faktor
neobsahuje (f-, samičí, příjemcovská) při procesu zvaném konjugace. F faktor může být
v buňce ve formě plasmidu, episomu, nebo jako součást bakteriálního chromozomu (Hfr
– high frequency of recombination). F plasmid tak, jak byl původně popsán, má délku
téměř 105 párů bází. Pro molekulárně biologické aplikace se používá minimalizovaná
verze, která kromě genů záměrně vnesených do f plasmidu (nebo f episomu) obsahuje ori
místo pro zahájení replikace, rep gen kódující replikasu, případně par segregační geny
kódující jednotlivé podjednotky topoizomerasy IV a ccd (ccd stands for coupled cell
division) geny. S výhodou jsou do F plasmidu vnášeny geny rezistence na antibiotikum,
pomocí kterého je plasmid udržován v následujících generacích a dále například gen
kódující ω fragment -galaktosidasy umožňující α komplementaci.
Příkladem je F episom v bakterii XL-1 Blue F’[::tn10 proAB+ lacIq δ(lacZ)M15]. F’
označuje, že se jedná o bakterii, která je potomkem kmene, v němž se F faktor
integrovaný do chromozomu uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále setrvává
ve formě episomu. Geny získané z chromozomální DNA jsou uvnitř hranatých závorek.
Zde se jedná o část transpozonu Tn10 nesoucího gen rezistence na tetracyklin, geny
proAB kódující γ-glutamyl fosfát reduktasu a kinasu, účastnící se metabolismu prolinu,
dále represor laktózového operonu lacI, který je z tohoto episomu nadprodukován, a gen
kódující ω fragment -galaktosidasy δ(lacZ)M15.
14
α komplementace – je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichž jeden kóduje N’
terminální úsek
-galaktosidasy (α fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek
galaktosidasy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou
polypeptidových podjednotek po jejich translaci. To umožňuje prokázat přítomnost obou
genů při kultivaci buněk v přítomnosti substrátu -galaktosidasy [X-Gal, (5-bromo-4chloro-3-indolyl- d-galaktosid)], vedoucí k modrému zabarvení buněk. Příkladem
využití tohoto fenoménu je rychlé monitorování úspěšnosti vnášení DNA fragmentů do
klonovacích plasmidů. -galaktosidasa zde slouží jako reporterový gen. Plasmidy vhodné
pro tyto aplikace mají MCS umístěné uvnitř genu lacZ, kódujícího
fragment
galaktosidasy, jako součást modifikovaného lac operonu. Hostitelské E. coli exprimují ω
fragment -galaktosidasy nejčastěji z F’ episomu. Při vnesení DNA inzertu do MCS
dojde při translaci lacZ genu k porušení aminokyselinové sekvence
fragmentu galaktosidasy, která nemůže
komplementací vytvořit funkční protein -galaktosidasu,
což je viditelné po naočkování bakterií na pevnou agarovou půdu s X-Gal a IPTG.
Kolonie bakterií nesoucích nerekombinovaný plasmid (bez DNA sekvence vnesené
dovnitř genu pro
fragment) jsou modré, kdežto kolonie s vneseným DNA inzertem
modré nejsou (Obr. 2.6).
Obrázek 2.6. Modrá-bílá selekce transformovaných bakterií
15
Antibiotika – antibiotika představují neodmyslitelný nástroj v molekulárním klonování.
Umožňují selektovat bakteriální linie, do nichž byl úspěšně vpraven plasmid kódující
protein inaktivující použité antibiotikum. Gen pro tento protein (antibiotickou rezistenci)
se nachází mimo klonovací místo (oblast vnášení cizorodé DNA). Pomocí dalšího
antibiotika, nebo antibiotik, je dále možné udržovat v bakterii pomocné plasmidy či
episomy, pokud nesou příslušné geny rezistence. Takové plasmidy a episomy zajišťují
potřebné fenotypové vlastnosti konkrétního bakteriálního kmene.
Antibiotika jsou použitelná i pro selekci transfekovaných savčích buněčných linií.
Selekční tlak antibiotik umožňuje mimo jiné selektovat buněčný klon, u nějž se plasmid
integroval do genomické DNA, se kterou se přenáší na následující dceřiné generace.
Vzniká tak stabilně transfekovaná buněčná linie. Pokud byl integrován plasmid nesoucí
nejen gen rezistence na antibiotikum, ale i gen kódující rekombinantní protein, můžeme
selekcí získat klon s dostatečně vysokou produkcí daného rekombinantního proteinu.
Nejčastěji používaná antibiotika při selekci bakterií jsou uvedena v Tab. 2.3.
Tabulka 2.3. Antibiotika používaná v molekulárním klonování
Název
Pracovní
Mechanismus působení
Mechanismus rezistence
(mg/ml)
Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, -laktamasa hydrolyzuje ampicilin dříve,
inhibuje syntézu stěny potlačením než se dostane do buňky
tvorby
příčných
vazeb
mezi
peptidoglykany
20
Bakteriostatický;
inhibuje Chloramfenikol
acetyltransferasa
proteosyntézu
interakcí s 50s inaktivuje chloramfenikol
podjednotkou ribozomu a inhibuje
reakci peptidyltransferasy
15
Baktericidní;
inhibuje Aminoglykozid
acetyltransferasa
a
proteosyntézu
interakcí
s l6 aminoglykozid
nukleotidyl
transferasa
proteinem
50s
podjednotky inaktivuje gentamicin; mutace v rplF
ribozomu
brání vazbě gentamicinu
30
Baktericidní;
inhibuje Aminoglykozid
(neomycin)
proteosyntézu, inhibuje translokaci fosfotransferasa,
aminoglykozid
a vyvolává poruchy čtení tripletů
acetyltransferasa
a
aminoglykozid
nukleotidyl
transferasa
inaktivuje
gentamicin a kanamycin
Kanamycin
Gentamici
n
Chloramfenikol v
metanolu
Ampicilin
50–100
16
v
Tetracyklin
70% etanolu
12
Bakteriostatický;
inhibuje Aktivní eflux tetracyklinu z buňky
proteosyntézu bránění ve vazbě
aminoacyl tRNA na místo a
ribozomu
Nonsense suppression – potlačení efektu stop kodonů v důsledku přítomnosti
abnormálních tRNA, které se vážou na stop triplet, přinášejí aminokyselinu a umožňují
další průběh translace. Na možnou přítomnost abnormálních tRNA je nutno myslet při
výběru E. coli pro zamýšlený experiment. Supresorové geny jsou uvedeny v genotypu
bakterie. Příklady supresorových genů jsou supD, supE atd. Většina supresorových tRNA
nasedá na stop kodony Amber (UAG) nebo Orche (UAA).
Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a
rekombinantních proteinů
Při práci s mikroorganismy i tkáňovými kulturami je třeba dodržovat zásady sterilní
práce, zejména při přípravě bakteriálního inokula. Ač je často komplikované kultivovat
zvolenou populaci buněk, kontaminace se může objevit, aniž bychom jí to jakkoliv
usnadňovali. Nicméně zásady sterilní práce umožňují minimalizovat toto riziko.
Pro přípravu sterilních kultivačních médií pro kultivaci bakterií, pufrů a vody se
nejčastěji používá sterilizace autoklávováním. Při autoklávování se mikroorganismy ničí
nasycenou vodní parou při teplotě nejčastěji 121°C, po dobu minimálně 25–60 minut
a zvýšeném tlaku. Autoklávování je možné opakovat za 24–48 hodin, což je čas nezbytný
pro vyklíčení eventuálně přítomných spór, které jsou jinak k autoklávování rezistentní.
Sklo, plast a nástroje se autoklávují za teploty 134°C po dobu 20–45 minut. Autoklávovat
lze i citlivější materiály, jako jsou plasty (polyetylen, polykarbonát, silikon; nevhodný k
autoklávování je polystyren, částečně se může poškodit polypropylen). Doporučení je
vždy otestovat vhodnost konkrétního plastu pro autoklávování. Autoklávování se
nepoužívá pro sterilizaci médií pro tkáňové kultury.
Nástroje a sklo je možné dále sterilizovat horkovzdušnou sterilizací za teploty 180°C
po dobu 1–2 hodiny. Horkovzdušná sterilizace se kromě vlastní sterilizace používá i
k inaktivaci RNA pro účely přípravy materiálu na izolaci RNA. Zde je však nutné
použít mnohem drastičtější podmínky, a to 180°C po dobu 8 hodin. Horkovzdušná
sterilizace je vhodná zejména pro sterilizaci skla a nástrojů z nerez oceli. Není vhodná
pro sterilizaci ostrých nástrojů, neboť ostří se při opakovaném vystavení vysoké teplotě
vzduchu rychle tupí.
17
Komerčně dodávaný plast a pomůcky pro sterilní manipulaci se průmyslově sterilizují
zářením. Sterilizace etylenoxidem nebo formaldehydem není vhodná zejména pro
materiály přicházející do kontaktu s tkáňovými kulturami, neboť i nepatrné zbytky těchto
látek mohou působit toxicky na kultivované buňky.
Izolace rekombinantního proteinu je procedura, která sestává z několika klíčových
kroků. V první řadě je nutné zvážit, jaký expresní systém bude vhodný pro produkci
rekombinantního proteinu. Tomu je nutné přizpůsobit následující klonovací postup. Volba
expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinovaného proteinu, potřebou zachovat
nezbytné posttranslační modifikace, rozpustnost proteinu a požadované množství (Tab. 2.4,
2.5).
Následuje izolace cDNA kódující daný protein. V dalším kroku je třeba navrhnout,
sestavit, izolovat a namnožit plasmid, který umožní expresi rekombinantního proteinu.
Na závěr je tento plasmid vnesen do vhodného hostitele, který podle něj vytváří
rekombinantní protein. E. coli zde slouží jako vysoce přesný nástroj umožňující selekci a
amplifikaci rekombinovaných plasmidů vzniklých molekulárním klonováním a
vnesených do E. coli některou z takzvaných transformačních metod. Transformované
bakterie jsou naočkovány na tuhé agarové kultivační půdy tak, aby kolonie, které zde
vyrostou, byly od sebe dostatečně prostorově separovány. Díky fenoménu
inkompatibility plasmidů nesou kolonie, které vyrostou z bakterií naočkovaných na tuhou
půdu, jen jednu variantu rekombinovaného plasmidu. Aby na tuhé půdě narostly pouze
E. coli, které nesou rekombinovaný plasmid, obsahuje kultivační půda antibiotikum, ke
kterému jsou odolné pouze bakterie obsahující plasmid (plasmidem transformované
bakterie, rekombinované bakterie), neboť plasmid kóduje znak rezistence na příslušné
antibiotikum. Selekce jednotlivých kolonií nesoucích plasmid je nezbytná proto, že
rekombinované plasmidy vzniklé molekulárním klonováním nejsou vždy správně
sestavené, mohou obsahovat kontaminující DNA, mohou nést různé mutace, nemusí
obsahovat žádnou vnesenou cDNA, či mohou obsahovat vnesenou cDNA v nesprávné
orientaci atd..
Jiná situace nastává při produkci polysacharidu jako ha. Zde vycházíme ze spontánní
tvorby dané makromolekuly (HA), molekulární klonování a manipulace s expresní
bakteriální linií slouží pouze ke zvýšení výtěžku makromolekuly produkované vybraným
kmenem bakterií přirozeně se vyskytujícím v přírodě.
Tabulka 3.4. Velikost rekombinantního proteinu a expresní systémy
Velikost proteinu
E. coli
Kvasinky
Povaha proteinu
18
Hmyzí buňky
Savčí buňky
< 8 kDa
+++
Fúzní
> 8 kDa
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
Intracelulární
8–50 kDa
Sekretované
> 50 kDa
+++
Sekretované a povrchové
Bakteriální expresní systémy
Bakteriální systémy jsou používány pro klonování DNA i pro expresi
rekombinantních proteinů. Výhodou bakteriálního systému, zejména E. coli, je dobrá
znalost jejich chování a kultivačních podmínek, krátký zdvojovací čas E. coli, dostupnost
efektivních metod pro transformaci, izolaci DNA i rekombinantních proteinů atd. Vhodné
linie E. coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy, ale i obří plasmidy bacmidy, které
mají velikost několika stovek párů bází.
E. coli rostou jak v tekutých, tak na tuhých plotnách v normální atmosféře při
teplotách od 23°C do 37°C. Při klonování DNA se používá standardně 37°C. Pro expresi
rekombinantních proteinů je možno použít teplotu 37°C, nebo teplotu snížit, čímž se
může snížit i potenciální toxicita rekombinantního proteinu.
Při produkci rekombinantního proteinu v E. coli dosahujeme obecně nejvyšších
výtěžků dosahujících až 5 gramů proteinu na 1 litr biomasy (Tab. 2.5). Rekombinantní
proteiny produkované v E. coli však nejsou dostatečně posttranslačně modifikovány
(chybí obecně: N-glykozylace, C-glykozylace, tvorba disulfidických můstků, štěpení
prekurzorových proteinů specifickými proteasami, skládání proteinu). Jelikož jejich
intracelulární transport je většinou odlišný od situace při jejich přirozené produkci a
asistenční proteiny, jako proteiny tepelného šoku (hsp), mohou mít poněkud odlišné
funkce v bakteriálním hostiteli, mohou se rekombinantní proteiny exprimované v E. coli
shlukovat
do
inkluzních
tělísek
lokalizovaných
v cytoplasmatickém
nebo
periplasmatickém prostoru.
Tabulka 2.5. Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi
19
Kvasinky
Protein
E. coli
Hmyzí buňky
Savčí buňky
0,001 ÷ 0,5
0,001 ÷ 0,1
P. pastoris, S.cerevisiae
Sekretovaný
< 0,5
0,2 ÷ 4
≤ 0,25
0,5 ÷ 5
0,2 ÷ 12
1÷4
[g/l biomasy]
Intracelulární rozpustný
0,001
[g/l biomasy]
Intracelulární inkluze
0,5 ÷ 5
1÷4
[g/l biomasy]
E. coli vytváří inkluzní tělíska přirozeně za účelem ukládání zásob. U savčích buněk
vznikají inkluzní tělíska nejčastěji z virových kapsidových proteinů. Nejsou ohraničena
membránou. Inkluzní tělíska z rekombinantních proteinů jsou tvořena nerozpustnými
agregáty nesprávně složeného proteinu bez biologické aktivity. Velikost inkluzních
tělísek se pohybuje od 0,2 do 0,6 m. Jsou pozorovatelná ve fázovém kontrastu jako
temná intracelulární tělíska. Sekrece rekombinantního proteinu je jednou z cest
minimalizace tvorby inkluzí. Sekrece proteinů přes dvojitou buněčnou membránu E. coli
je však velmi málo efektivní a pro velké rekombinantní proteiny většinou dosud
technologicky nezvládnutá. Nicméně jsou popsány mechanismy, které zřejmě
v budoucnu umožní modifikaci rekombinantních proteinů k efektivní sekreci. Sekrece se
děje prostřednictvím transportních drah, kterých bylo u E. coli popsáno šest.
Sekrece typu I je závislá na ABC transporterech (ATP-binding cassette) a proteiny
prochází periplasmatickým prostorem pomocí kanálu, který je od něj do jisté míry
izoluje. Využití sekrečního mechanismu typu i je limitováno velikostí efektivně
sekretovaných proteinů. Její hodnota je pod 200 aminokyselin. Sekrece je navozena
připojením sekretorního signálu (HlyA) k C’ konci rekombinantního proteinu, který je
možné po izolaci proteinu odstranit enzymaticky.
Sekrece typu II je závislá na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle) nebo TAT
(twin-arginin translocation) drahách. Tyto dráhy jsou zodpovědné za první krok
sekrečního mechanismu typu II – transport do periplasmatického prostoru. 1) SEC
sekrece je zodpovědná za sekreci většiny rekombinantních proteinů do periplasmatického
prostoru. U proteinu je před transportem přes sec nejdříve rozvolněna vyšší konformační
struktura a po vstupu do periplasmatického prostoru je protein opět složen do vyšší
konformace. Na této dráze je zapojeno minimálně 9 proteinů (Trigger Factor, SecA,
SecB, SecY, SecE, SecG, SecD, SecF a YajC). 2) SRP závislá sekrece probíhá jako
20
jediná kotranslačním mechanismem, což znamená, že protein je translokován do
periplasmatického prostoru dříve, než se poprvé složí. Tato dráha je biotechnologicky
využitelná pro rychle se skládající proteiny, jako jsou DARP proteiny (designed ankyrin
repeat proteins). 3) dráha TAT je jediná, která translokuje plně složené proteiny přes
vnitřní membránu buňky. Signální sekvence využitelné pro transport rekombinantních
proteinů jsou známy. Ne každý rekombinantní protein však může být transportován
uvedenými drahami a je nutné laboratorně ověřit jejich vhodnost. Následující sekrece
proteinu mimo buňku je realizována zřejmě společným transportním mechanismem, který
je zprostředkován komplexem 12–16 proteinů, které jsou doposud málo popsány a které
nejsou efektivně exprimovány za laboratorních podmínek. Sekrece typu II je
mechanismus
zodpovědný
za
kumulaci
mnoha
rekombinantních
proteinů
v periplasmatickém prostoru, kde mohou vytvářet inkluzní tělíska. Výhoda sekrece
rekombinantního proteinu v E. coli spočívá v tom, že proteiny prochází periplasmatickým
prostorem, kde jsou vystaveny lokálním disulfid-izomerasam a foldasam, které přispívají
ke správnému složení proteinu. V periplasmatickém prostoru je navíc méně proteas než
v cytoplasmě (Obr. 2.7).
Obrázek 2.7. Sekretorní dráha typu II v E. coli
21
Tvorba inkluzních tělísek může být potlačena snížením teploty kultivace E. coli,
použitím slabšího promotoru nebo snížením koncentrace induktoru exprese (například
IPTG u proteinů exprimovaných z laktózového operonu). Vznik inkluzních tělísek
komplikuje izolaci proteinu a často vyžaduje použití denaturačních činidel k jejich
rozpuštění. Na druhou stranu je možné inkluzní tělíska nejdříve separovat centrifugací,
potom rozpustit a protein následně renaturovat takzvaným refoldováním proteinu do jeho
správné vyšší konformace, což může vést k dosažení vyšší finální čistoty
rekombinantního proteinu.
Problémem produkce proteinů v E. coli se může stát kontaminace lipopolysacharidem
– lipofilní složkou buněčné stěny Gram negativních bakterií, která v savčím organismu
vyvolává reakci imunitního systému spojenou se zvýšenou teplotou a vyplavením
prozánětlivých cytokinů (Obr. 2.8). Působí tedy jako tzv. pyrogen. Pokud je
lipopolysacharidu, taky zvaného endotoxin, aplikováno větší množství aplikováno do
krevního oběhu, může vyvolat až šokový stav ohrožující jedince na životě. Přítomnost
endotoxinu může být tolerovatelná při aplikacích produktu in vitro, ale pro aplikace in
vivo je vždy nutná depyrogenace. Ta se dá provádět metodami chromatografickými, ať už
jde o iontoměničovou chromatografii, gelovou permeační chromatografii či
chromatografii afinitní (např. Za využití imobilizovaného polymyxinu, polylyzinu nebo
proteinu vážícího lipopolysacharid - LBP). Je také možno využít extrakci endotoxinu do
organické fáze tvořené detergentem, např. Tritonem-X114. Tyto metody však často
snižují finální výtěžek produktu a mohou ovlivnit stabilitu a nativní konfiguraci proteinu.
Náročné je také testování obsahu endotoxinu . Pro velkou biologickou aktivitu již malého
množství je nutno provádět bilogický test založení na lyzátu amebocytů hrotnatce druhu
Limulus polyphemus (LAL – limulus amebocyte lysate).
22
Obrázek 2.8. Struktura molekuly lipopolysacharidu
E. coli je možné kultivovat v různých
obohacených kultivačních médií (bujónů).
modifikacích
minimálních
nebo
Minimální médium: A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g
KH2PO4; 10,5 g K2HPO4; 0,5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4 x 7H2O; 0,2% glycerol
(nebo cukr).
Bohatá média: Luria-Bertani nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g
tryptonu; 5 g kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH). H medium: obsahuje v 1
litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl. Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g
tryptonu; 2,5 g NaCl.
E. coli přes uvedené limitace představují jeden z nejvíce používaných expresních
systémů. V případě nutnosti zachovat nezbytné posttranslační modifikace se používá
evolučně vyšší, ale finančně náročnější expresní systém – nejčastěji kvasinkový nebo
savčí. Srovnání zastoupení jednotlivých expresních systémů pro komerční produkci
rekombinantních proteinů je uvedeno v Tab. 2.6.
23
Tabulka 2.6. Posttranslační modifikace rekombinantních proteinů
Posttranslační modifikace
Expresní
systém
N-glykozylace
O-glykozylace
Fosforylace
E. coli
Chybí
-
-
-
-
-
+
+
+
+
-
Kvasinky
Vysoce
manosilované
glykany
Hmyzí buňky
Jednoduchá, bez
sializace
+
+
+
+
-
Savčí buňky
Komplexní
+
+
+
+
+
Acetylace Acylace γ-karboxylace
Kvasinkové expresní systémy
Kvasinky představují eukaryontní expresní systém, který obecně mnohem vhodněji
posttranslačně modifikuje rekombinantní proteiny eukaryontního původu. Rovněž
sekrece proteinu je dobře realizovatelná připojením sekretorních signálů. Příprava
expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a
charakterizovat několik expresních kvasinkových klonů, neboť obvykle se intenzita
tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu. Nicméně produkce
rekombinantních proteinů v kvasinkách je oproti savčím expresním systémům levná.
Kvasinky je možné kultivovat do vysokých koncentrací buněčné suspenze a zdvojovací
čas kvasinek je oproti savčím buňkám mnohem kratší. Nejčastěji se používají
Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Obě kvasinky se zásadně liší zejména
v dosažitelné sekreci rekombinantního proteinu a podílu sekretovaného proteinu z
celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou, které pro S. serevisiae dosahuje
maximálně 1 % kdežto u P. pastoris až 10 % (Tab. 2.7).
Tabulka 2.7. Srovnání četnosti komerčního využití jednotlivých expresních systémů
Společnost
Produkt
Koagulační faktory (VII, VIII, IX)
Systém
Novo-Nordisk/Bayer/Centeon
BHK buňky
Genetics Baxter/Centeon/Wyeth
CHO buňky
Calcitonin
Unigene
E. coli
CHO buňky
24
DNasa (cystická fobróza)
Erythropoetin
Roche
CHO buňky
Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer
CHO buňky
Darbepoetin
Folikuly stimulující hormon
Luteinizační hormon
Gonadotropin
Glukagon
Glukocerebrosidasa (Gaucherova nemoc)
Růstové hormony (somatotropiny)
CHO buňky
CHO buňky
Serono
CHO buňky
Serono
CHO buňky
Novo-Nordisk
S. cerevisiae
Genzyme
CHO buňky
Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring
E. coli Myší
Serono
linie CHO
Serono/Bio-Technology Gener. Corp
buňky
Lg Chemical
S. cerevisiae
Novartis/Essex/Amgen/Roche
E. coli
Eutropin
Growth factors (GCSF, GMCSF)
Amgen
Serono/Organon
Chugai Pharmaceuticals
CHO buňky
Platelet derived growth factor (PDGF)
Janssen-Cilag
S. cerevisiae
PDGF-agonista
Zymogenetics
S. cerevisiae
Hepatitis B vakcína
Hirudin
Glaxosmithkline
S. cerevisiae
Rhein-Biotech
H. polymorpha
Aventis/Novartis
S. cerevisiae
Insulin a muteiny
Aventis/Lilly/Berlin-Chemie
E. coli
Insulin
Bio-Technology General Corp
E. coli
Interferon alpha a muteins
Novo-Nordisk
S. cerevisiae
Roche/Essex/Yamanouchi
E. coli
Schering
E. coli
Biogen/Serono
CHO buňky
Amgen/Boehringer
E. coli
Interferon beta
Interferon gamma (mutein)
Interleukin 2
Chiron
E. coli
Oprelvekin (agonista IL-11)
Wyeth
Romi 8866
Curis/Striker
E. coli
Tkáňový aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
CHO buňky
Aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
E. coli
Amgen
CHO buňky
Op-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt)
Faktor kmenových buněk (SCF)
25
Tumor nekrosis faktor (TNF)
Boehringer
E. coli
Modifikováno podle Schmidt, 2004
Kvasinky, na rozdíl od savčích buněk, tvoří jiné struktury N-glykanů (převážně
vysoce manosilované, high mannose), které připomínají savčí prekurzory nacházející se
v endoplasmatickém retikulu. Tyto jsou savčími buňkami většinou dále modifikovány na
kratší řetězce, v nichž terminální manosa je nahrazována N-acetylglukozaminem,
galaktózou, fukózou a sialovou kyselinou za vzniku hybridních a komplexních noligosacharidů. Kvasinkové buňky je možné modifikovat vnesením vektorů kódujících
nezbytné manosidasy (MI a MIIx) a glykozidasy (Obr. 2.9, 2.10). U rekombinantního
glykoproteinu musí být tedy předem podrobně analyzována glykozylace. Exprese
glykozyltransferáz musí být pak upravena výměnou odpovídajících promotorů za silnější
či slabší, nebo musí být použita rekombinovaná hostitelská linie, která produkuje
potřebné glykozyltransferasy a podobně. To samozřejmě komplikuje proces přípravy
vhodného kvasinkového klonu pro expresi rekombinantního proteinu.
Obrázek 2.9. Struktura N- a O-oligosacharidů u savčích glykoproteinů
26
Vysoce-manosylovane N-oligosacharidy
Hybridni N-oligosacharidy"'
v
,_
_' ...-{
...
•
,J
l
t mplexni N-oligosacharidy
·
t.
• • •v;:+-a........-'""
:=)
,.('\')
.........-d
······
··'·=
Zakladni jadrove stru ktury 0-oligosacharidu
JJ--'c.
......,.
Corell
Core I
._._.)
L,J
\,../
1-€
CoreiV
Core Ill
• •• "'..-..... £
]'€
• •• ill .Jij€
0-man6za
•Glc • Manosa •Gc
l NAc
O-fuk6za
0 GaiNAc
••• x
O-gluk6za
•Gal
.A Fuc
•NeuAc • Xyl6za
Fukozylace je proces pi'ipojovani fuk6zy na ruzne pozice zejmena 0oligosacharidu. K vasink y normalne nepripoj uji f uk6zu k oli gosacharidt'tm na tvofenych
glykoproteinech. Proto expresi fukozylovanych proteint't je tedy nezbytne pouzit
27
geneticky modifikované kvasinky, nebo přejít na evolučně vyšší expresní systém.
Genetická modifikace kvasinek k produkci fukozylovaných proteinů byla publikována
poprvé v roce 2008 .
Obrázek 2.10. Syntéza
1,6 GlcNAc rozvětvených N-oligosacharidů
O-glykozylace představuje další rozdíl v posttranslační modifikaci mezi savčími a
kvasinkovými expresními systémy. U kvasinek a jiných houbových mikroorganismů je oglykozylace zahájena v endoplasmatickém retikulu přenosem manosových zbytků
z dolichyl fosfát D-manosy na specifický serin nebo treonin aminokyselinové páteře
proteinu . V této chvíli je již protein složen a lokální poměry rozhodují o průběhu Oglykozylace. To, který z uvedených serinů a treoninů bude O-glykozylován, je velmi
těžké předpovědět a prakticky se to dá s jistotou říci jedině až na základě analýzy
glykozylace vytvořeného proteinu. Experimentální průkaz O-glykozylace IGF (insulinu
podobný růstový faktor) a IL-2 produkovaných v kvasinkách a v savčích buňkách ukázal
zásadní rozdíly mezi oběma systémy. Jiné proteiny jsou glykozylovány v obou systémech
identicky (hGM-CSF) . Odhadnout glykozylaci proteinu je možné pomocí některých
predikčních programů pracujících na principu neuronálních sítí. Tyto programy pracují
většinou tak, že hledají strukturní podobnosti s jinými proteiny, u nichž byla glykozylace
experimentálně popsána. Příkladem je server dánského technického institutu
(http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc), který předpovídá pravděpodobnost připojení
28
O-vázaných oligosacharidů v savčích buňkách. Prostřednictvím serveru je možné
provádět
odhad
i
mnoha
dalších
posttranslačních
modifikací
(http://www.cbs.dtu.dk/services/). Pro kvasinkové expresní systémy však specifický
predikční nástroj zatím není vyvinut.
Hmyzí expresní systémy
Jedním ze systémů majících výhody jak eukaryontních, tak částečně i
prokaryontních expresních systémů jsou systémy hmyzí – bakulovirové, označované
podle hlavního nástroje vnášení DNA do hostitelských buněk – bakuloviru, velkého
hmyzího dvouvláknového DNA viru Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) nevirulentního pro savce. Tento expresní systém na rozdíl
od ostatních pracuje v standardním uspořádání tak, že exprese proteinu se neděje
z buněčných linií stabilně transfekovaných, jako je tomu u savčího systému a v podstatě i
u bakteriálního systému, ale DNA kódující rekombinantní protein je vnášena do kultury
hmyzích buněk formou infekce rekombinovaným bakulovirem. Příprava, ověření a
udržování dostatečného množství infekčních virových partikulí (viral stock) představuje
nejnáročnější krok celé bakulovirové technologie. Jako hostitelské buňky slouží larvální
kultura buněk můry autographa californica nebo Spodoptera frugiperda (Sf9) (Obr.
2.11).
V současnosti jsou komerčně dostupné i vektory pro přípravu stabilně
transfekovaných linií hmyzích buněk umožňující vynechat náročné udržování a kontrolu
suspenze rekombinovaných virů.
Obrázek 2.11. Postup přípravy rekombinovaného bakuloviru
29
Výhody bakulovirového expresního systému spočívají zejména ve vysoké
výtěžnosti a nepřítomnosti endotoxinu, v podobnosti posttranslační modifikace proteinu
s modifikací probíhající v savčích buňkách, v efektivní efektivní sekreci proteinů
a v dostupnosti bezsérových médií usnadňující purifikaci sekretovaných rekombinantních
proteinů.
N-glykozylace rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách je převážně typu
vysoce manosylovaných oligosacharidů (high mannose). O-glykozylace je podobná savčí
glykozylaci, nicméně místa připojení cukrů Ser, Thr jsou opět dána specifickým
rozlišením glykozylačních motivů, které nemusí být vždy identické se savčími.
V současnosti je dostupná hmyzí linie „Mimic™ Sf9“, která stabilně exprimuje několik
savčích glykozyltransferas umožňujících tvořit rekombinantní proteiny s dvojitě
větvenými N-vázanými oligosacharidy (nesou dva N-acetylglukosaminy na první
větvičce manosy), které jsou terminálně sialylované, čímž se více podobají savčím
proteinům.
30
Savčí expresní systémy
Vlastnosti jednotlivých buněčných populací v následujících kapitolách budou
uvedeny zejména ve vztahu k biotechnologickým potřebám produkce rekombinantních
proteinů a glykoproteinů.
V závislosti na původu proteinu či glykoproteinu, který chceme připravit
rekombinantní technologií a v závislosti na vlastnostech, které od něj požadujeme, je
nutné volit expresní systém. Pro savčí proteiny je nejvhodnější použít příslušný savčí
systém. Tím je zajištěna adekvátní posttranslační modifikace, jako je acylace,
fosforylace, lipidizace, glykozylace, citrulinace, tvorba disulfidických můstků a mnoho
dalších, které evolučně nižší systémy většinou realizují jen částečně.
Problém exprese rekombinantních proteinů v savčích liniích spočívá ve vysoké
finanční náročnosti a relativně nízkém výtěžku. Z našich zkušeností vyplývá, že
očekávaný výtěžek z kultury adherentních buněk kultivovaných na ploše 1 m2 je řádově
ve stovkách mikrogramů až jednotkách miligramů. Významným faktorem je zde buněčná
linie použitá k expresi glykoproteinu. Nejvyšší výtěžnost dosahují linie lidských
embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského
(CHO). I zde se však ukazuje, že buněčné linie pocházející z tkání téhož organismu
produkují proteiny lišící se v posttranslační modifikaci, což může představovat překážku
následného použití glykoproteinu například pro imunizaci, jejímž cílem je navození
protilátek proti cukerné komponentě antigenu.
Pro dosažení vysokého výtěžku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii
buněk, což znamená, že vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí
integrovat do genomu buněk a potom se množí společně s množícími se buňkami.
Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo
dominantní selekce. Dominantní selekce znamená použití chemikálie normálně toxické
pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenž se produkuje z genu
lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Nejdříve tedy v plasmidu,
který vneseme do buňky, a posléze v genomu, kam se plasmid integroval. Selekce
stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyžaduje průběžné monitorování míry
exprese proteinu, neboť se může stát, že jinak dojde k selektování klonu rezistentního na
selekční marker, ale neprodukujícího dostatečné množství rekombinantního proteinu.
Příčinou je to, že v genomu hostitelské buňky je integrována jen část plasmidu kódujícího
rezistenci na selekční marker nebo že exprese rekombinantního proteinu, která zatěžuje
metabolicky buňku, je potlačena.
Produkci rekombinantního proteinu je možné zvýšit procesem amplifikace genu
kódujícího rekombinantní protein po genomu buňky dlouhodobou kultivací (několik
týdnů) buněk za selekčních podmínek (Tab. 2.8).
31
Tabulka 2.8. Amplikační markery pro savčí buňky
Selekce
Gen
Adenosin, alanosin a 2’-deoxycoformycin
Adenosin deaminasa
Adenin, azaserin a coformycin
Adenyláte deaminasa
Asparagin syntetasa
-aspartyl hydroxamát nebo albizzin
Pala
Aspartát transcarbamoylasa
Metotrexát
Dihydrofolát reduktasa
Methionin sulfoximin
Glutamine syntetasa
Cadmium
Metalotionein
Ornithin dekarboxylasa
-difluorometylornithin
6-azauridine nebo pyrazofuran
Ump syntetasa
Mykofenolová kyselina
Xantin-guanin phosphoribosyltransferasa
Příkladem je selekce buněk metotrexátem, kdy dochází k amplifikaci genu
kódujícího dihydrofolát reduktasu (DHFR), který byl vnesen prostřednictvím
rekombinantního plasmidu do buňky s deleční mutací obou alel genu kódujícího DHFR
(například linie CHO DG44, Invitrogen). To by samo o sobě nemělo smysl pro produkci
zvoleného rekombinantního proteinu. Pokud však plasmid konstruujeme tak, že dhfr gen
je umístěn za gen kódující rekombinantní protein a oddělen je místem umožňující
nasedání ribozomu, transkribovaná mRNA je bicistronická a oba proteiny jsou
translatovány z jedné mRNA molekuly. Toto uspořádání vylučuje, že by se do genomu
integroval pouze úsek mRNA kódující DHFR, neboť by gen ztratil promotor, a byl by
nefunkční. Vnitřní místo pro nasedání ribozomu (internal ribosome entry sites; IRES)
bývá v komerčně dostupných plasmidech pro laboratorní aplikace odvozeno například od
funkční jednotky popsané u polioviru a viru encefalomyokarditidy. Příkladem je plasmid
pOptiVEC (Invitrogen), který obsahuje klonovací místo pro vnášení DNA konstruktu, za
kterým následuje IRES odvozené z viru encefalomyokarditidy, z nějž je zahájena
translace následujícího cDNA úseku kódující DHFR. Tento plasmid mimo jiné umožňuje
rychlé vnášení cDNA amplifikované pomocí PCR s použitím polymerasy přidávající na
oba 3’ konce PCR amplikonu netemplátový dA (standardní Taq polymerasa). Efektivita
klonování je zvýšena tím, že plasmid se dodává již otevřený a na oba konce
linearizovaného plasmidu je kovalentně připojena topoizomerasa i viru vakcinie. Ligační
reakce pak může probíhat pouhých 5 minut za pokojové teploty (Obr. 2.12).
32
Při produkci virových proteinů v savčím expresním systému se můžeme setkat
s nečekaně nízkou výtěžností. To může být způsobeno tím, že virem kódovaná mRNA
má jiné zastoupení tripletů (kodonů) než běžná zdravá savčí buňka. Důsledkem je, že
buňka nemá dostatek některých tRNA pro translaci proteinu. Řešení nabízí takzvaná
procedura optimalizace kodonů (codon optimisation), kterou je možné dnes provést
pomocí různých webovských aplikací in silico. Princip spočívá v tom, že cDNA daného
proteinu se přepíše do sekvence aminokyselin a zpětně se přiřadí nová cDNA tak, aby
poměrné zastoupení tRNA v hostitelské buňce odpovídalo poměrnému zastoupení
příslušných tripletů. Nově navrženou cDNA pak musíme připravit buď cílenou
mutagenzou, pokud množství záměn nukleotidů není velké, nebo je možné syntetizovat
úseky cDNA lišící se od původní cDNA a těmito nahradit původní nebo syntetizovat
celou cDNA. Výtěžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho
řádu, ale i to je významné zlepšení. Kodonová optimalizace může významnou měrou
zefektivnit například i DNA vakcinaci, zejména pokud antigen kódovaný DNA vakcínou
pochází z evolučně vzdáleného organismu, jako jsou houby, bakterie anebo již zmíněné
viry. Před přistoupením ke kodonové optimalizaci in vitro je nejdříve nutno zvážit její
potenciální přínos, nejlépe pilotním laboratorním experimentem.
Obrázek 2.12. Bicistronický plasmid při amplifikaci genu pomocí DHFR
33
Tkáňové kultury savčích buněk jsou z hlediska požadavků na zkušenosti
experimentátora nejnáročnější. Jak již bylo uvedeno na začátku kapitoly, je nezbytné
zachovat aseptičnost veškeré manipulace s buňkami. Jako pojistka se do tkáňových kultur
přidávají antibiotika, bránící růstu eventuální kontaminace. V některých situacích však
jejich přítomnost může snižovat efektivitu některých nezbytných kroků, jako je vnášení
rekombinovaných expresních plasmidů (transfekce) do buněk. Nejčastěji používaná
antibiotika a jejich pracovní koncentrace jsou uvedena v Tab. 2.9. Obvykle se používá
trvale kombinace penicilinu a streptomycinu.
Tabulka 2.9. Antibiotika používaná standardně pro tkáňové kultury
34
Antibiotikum
Finální koncentrace
Penicilin
50–100 u/ml
Streptomycin sulfát
50–100
g/ml
Kanamycin
100 g/ml
Gentamicin
50 g/ml
Mykostatin
20 g/ml
Amfotericin b
0,25 g/ml
Pro kultivaci savčích buněk se většinou používají komerčně dodávaná média,
která se doplňují L-glutaminem, bovinním fetálním sérem jako zdrojem nutrientů a
růstových faktorů a antibiotiky. Základní média jsou:
BME (basal medium Eagle’s): originální Eaglovo médium pro HeLa buňky v kultuře
obsahuje Earleyho balancovaný solný roztok.
MEM, E-MEM (minimum essential medium): Eaglem modifikované BME. Vyšší
koncentrace aminokyseli. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok nebo Hankův
solný roztok, obohacena o neesenciální aminokyseliny. Obsahuje 2 mm L-glutamin.
DMEM (Dulbeccos modified Eagle’s medium): Dulbekova modifikace bazálního
Eaglova média. Obsahuje 4x vyšší koncentraci aminokyselin a vitamínů. Dvě
modifikace: high (4,5 g/l glukózy) a low (1,0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4 mm Lglutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného.
RPMI 1640 (Rosswell park memorial institute): 1966 Moor, je modifikací McCoyova
basálního 5A média. Při pH > 8 růžová barva a zákal – obsahuje fenolovou červeň. Je to
způsobeno volnými bazickými amonokyselinami, které jsou méně rozpustné při
bazickém pH. Při neutrálním pH je čiré a má růžovou barvu, jako ostatní média.
Obsahuje 2 mm L-glutamin.
Výběr genu a jeho izolace
Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Prokaryontní geny jsou bez intronu. Pro klonování tedy
s mRNA tak, jak je tomu v případě eukaryontních genů. Možnosti
izolaci cDNA umožňující přípravu rekombinantního proteinu jsou
jako u eukaryot. Pokud je známa sekvence požadovaného genu,
použít PCR amplifikaci s pomocí specifických primerů.
35
není nutné pracovat
identifikace genu pro
principiálně podobné
je možné s výhodou
Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Eukaryontní geny jsou mnohem složitější. Genomická DNA obsahuje nejen
oblasti, které kódují strukturu proteinu, ale i introny a dlouhé 5’ a 3’ nepřekládané
oblasti. Proto při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cDNA připravenou reverzní
transkripcí mRNA izolované z buněk. Odpadá tím komplikovaná a ne vždy přímá cesta
eliminace intronů, respektive identifikace rozhraní mezi jednotlivými exony a introny.
Příkladem webovské aplikace vyhledávání intron-exon rozhraní je například NetGene2
server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). Výhodné je použít genové databáze,
ve kterých jsou uloženy sekvence značného množství proteinů, cDNA nebo mRNA.
Porovnáním sekvence izolovaného genu je tak možno odhadnout strukturu mRNA.
Jednodušší cesta přípravy cDNA reverzní transkripcí mRNA je usnadněna tím, že
eukaryontní mRNA má specifické struktury na obou koncích. Na 5’ konci mRNA se
nachází metylační čepička, kterou je možné použít při izolaci mRNA v plné délce
například metodou GeneRacer (Invitrogen), kdy je metylační čepička na 5’ konci mRNA
odstraněna kyselou pyrofosfatasou (TAP) a k uvolněnému terminálnímu fosfátu je
připojen syntetický RNA oligonukleotid (budoucí místo nasedání PCR primeru) pomocí
T4 RNA ligasy. Aby nebyly tytéž RNA oligonukleotidy připojeny i k fragmentům RNA,
které byly izolovány společně s mRNA, provádí se před odstraněním čepičky
defosforylace volných konců izolované RNA pomocí alkalické fosfatasy (CIP). Po
připojení RNA primeru na 5’ konec mRNA se provede standardní reverzní transkripce
pomocí reverzní transkriptasy a oligo dT primeru a získaná cDNA je použitelná k
amplifikaci 5’ a 3’ úseků cDNA pomocí PCR s kombinací primerů genově specifického
(GSP) a komplementárního k výše připojenému RNA primeru (pro 5’ oblast cDNA) nebo
genově specifického a oligo da (pro 3’ oblast cDNA). Spojením obou PCR produktů je
možné připravit cDNA kódující kompletní rekombinantní protein a identifikovat
kompletní 5’ a 3’ nepřekládané oblasti mRNA (Obr. 2.13). Pro dosažení maximální
přesnosti je nutné použít přesnou DNA polymerasu s opravnou funkcí, takzvanou
proofreading. Tato metoda vyžaduje znalost aspoň krátkého úseku cDNA umožňujícího
navrhnout vnitřní primery.
Alternativně je možné získat 5’ koncovou oblast mRNA pomocí reverzní
transkripce mRNA s použitím sekvenčně specifického primeru, po níž je k 3’ konci
vzniklé cDNA připojen netemplátový oligo dC pomocí terminální deoxyribonukleotidyl
transferasy (TdT). Tento oligo dC společně se sekvenčně specifickým primerem
umožňuje namnožit DNA fragment odpovídající 5’ oblasti mRNA. Metoda je vhodná pro
identifikaci 5’ konců i minoritních mRNA.
V úvodní kapitole byla zmíněna kodonová optimalizace (CUO) cDNA za účelem
dosažení vyšší produkce proteinu přizpůsobením četnosti tripletů organismu, v němž
bude rekombinantní gen syntetizován. Níže je uvedený příklad provedené optimalizace
DNA kódující cystein dioxygenasu houby Trichophyton mentagrophytes pro expresi
36
v lidských
CHO
buňkách.
K analýze
byl
použit
server
http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/
a databáze používaných kodonů
http://www.kazusa.or.jp/codon/. Výsledek naznačuje, že pokud bychom chtěli
exprimovat s maximální účinností tento protein v CHO, museli bychom připravit cDNA
synteticky. První část ukazuje přehled nutných záměn tripletů mezi T. mentagrophytes a
lidskými CHO buňkami. V druhé části je ukázán příklad situace na úrovni cDNA
nukleotidů (Tab. 2.10).
Obrázek 2.13. Příprava mRNA plné délky pomocí GeneRacer (Invitrogen)
37
Tabulka 2.10. CUO T. mentagrophytes (query) a lidské (optimized) cDNA
38
Techniky izolace známého genu a cDNA (PCR, RT-PCR, RACE)
Nukleové kyseliny jsou přítomny v různých buněčných kompartmentech – jádro,
mitochondrie, cytoplasma. Postupy izolace DNA a RNA mohou respektovat tuto
kompartmentaci a izolovat nukleovou kyselinu specificky obsaženou v některém z nich,
nebo umožňují izolovat DNA nebo RNA obsaženou v celé buňce. Zde se budeme
věnovat izolaci celkové genomické DNA, celkové RNA a mRNA.
Při izolaci jakékoliv nukleové kyseliny je třeba volit metodu v závislosti na
požadované čistotě a množství finální NK a na typu buněk, z nichž má být NK izolována.
Pro naprostou většinu následných aplikací (zejména enzymatických) je výhodnější
dosáhnout vyšší kvality třeba i na úkor celkového množství NK, neboť pro metody jako
39
je PCR, reverzní transkripce a ligace jsou i submikro- a subnanogramová množství
vysoce kvalitní NK dostačující.
První krok při izolaci NK spočívá v uvolnění NK z buňky pomocí vhodného
pufru a následné selektivní izolaci NK, respektive selektivním odstraněním ostatních
buněčných komponent. Uvolnění NK z buňky znamená prakticky dezintegraci buněčné
membrány, případně buněčné stěny, případně dalších buněčných obalů. Toto může být
realizováno pomocí detergentů a jiných fyzikálně-chemických postupů. Jiný přístup
k dezintegraci zejména tkání a buněčné stěny jsou fyzikálně-chemické neenzymatické
postupy. Zejména pro organismy se silnou polysacharidovou stěnou je vhodné použít
v úvodu izolace fyzikální postupy dezintegrace této stěny založené na působení tření
(tření v třecí misce, Potter-Elvehjem homogenizátor, mlýny), na působení nárazu buňky
na pevnou stěnu společně s vysokou turbulencí prostředí (odstředivé dezintegrátory) a na
rychlých změnách tlaku a působení varu. Fyzikální metody se aplikují na buňky umístěné
v pufrech obsahujících kombinaci detergentů (Triton X100, NP-40), které rozpouštějí
buněčné membrány, zásad (NaOH – denaturuje DNA, z níž kovalentně uzavřená
plasmidová DNA může být snadno renaturována při neutrálním pH) a činidel
denaturujících proteiny (SDS, guanidin thiokyanát). Z detergentů, například neionogenní
NP-40, je možné použít k rozpuštění buněčné membrány při zachování jaderné
membrány, což umožní separovat jadernou NK od cytoplasmatické NK. Metody izolace
DNA se často doplňují o krok, který specificky eliminuje kontaminující RNA (jež se při
purifikaci chová podobně jako DNA) přidáním ribonukleasy A do startovního pufru.
RNasaA jako většina RNas je značně odolný enzym a alkalické lyzační prostředí pro ni
není nebezpečné.
Aplikací kombinace jednotlivých výše uvedených činidel je možné získat NK
v rozpustné formě spolu s dalšími buněčnými složkami, které je ovšem pro optimální
fungování naprosté většiny následných, zejména enzymatických, reakcí a pro požadavek
dostatečné stability NK v průběhu času nutné odstranit. V tomto kroku je možné použít
několik přístupů. Jeden z nejstarších, ale stále široce používaných postupů je extrakce
proteinové složky hrubého lyzátu fenolem. Jedná se o extrakci ze suspenze vodného
pufru a fenolu (případně s chloroformem nebo moderněji s bromochloropropanem).
Centrifugací se tato suspenze rozdělí na vodnou fázi obsahující NK, rozhraní obsahující
část denaturovaných proteinů a fenolickou část obsahující další proteinové molekuly.
Fenolová extrakce navíc umožňuje cílenou izolaci RNA zbavené DNA tak, že při použití
pufru a fenolu s nízkým pH (< 4) a při nízké objemové koncentraci chloroformu (do 20 %
použitého objemu fenolu) je DNA nerozpustná ve vodě a pouze RNA zůstává ve vodní
fázi. Další výhoda této metody spočívá v tom, že při použití silného deteregentu, jakým je
například guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid, je buněčný obsah včetně NK
v počáteční bifázické suspenzi (před přidáním chloroformu) stabilní po velmi dlouhou
dobu, jestliže je uchován při –80 °C, což je zejména vhodné pro snadné prvotní
zpracování velkého množství v čase se průběžně kumulujících vzorků, jejichž finální
40
analýza je provedena až po relativně dlouhé době. Další výhoda spočívá v možnosti
izolovat z jednoho takto uskladněného vzorku, zvlášť DNA, RNA nebo proteiny.
Komerčně jsou dostupné kity obsahující pouze jeden roztok složený ze směsi
denaturačního pufru a stabilizovaného fenolu, jež jsou přímo použitelné k uchování a
následné izolaci NK bez nutnosti míchat jednotlivé reagencie dohromady (IzogenNippon Gene, RNA-Stat 60 – Tel-Test, RNAzol B – Cinna Scientific, Tri-Pure Isolation
Reagent – Boehringer Mannheim, TRI Reagent – Molecular Research Center, TRIzol
Reagent – Life Technologies apod.).
DNA nebo RNA obsažená ve vodní fázi izolované výše uvedenými metodami je
následně purifikována od kontaminujících solí precipitací DNA pomocí isopropanolu
nebo etanolu. NK vypadává z roztoku. Soli zůstávají rozpuštěné v pufru a je možné je
oddělit od pelety. Precipitovaná NK se opakovaně promývá v 70% etanolu a poté se
vysuší a rozpustí buď ve vodě, nebo pufru s pH mezi 7–8 pro DNA nebo ve vodě pro
RNA. Alternativní postup závěrečného přečištění NK spočívá ve využití
chromatografických kolon, kterých je v současnosti na trhu obrovské množství. Základní
výhoda kolon spočívá v možnosti selektivní eluce NK o určité velikosti, což je dáno
použitým pH a iontovou silou promývacích a elučních pufrů. Vzhledem k tomu, že při
eluci NK se používá poměrně vysoká koncentrace solí, následuje po eluci NK opět
precipitace výše uvedeným EtOH nebo isopropanolem. Precipitace se vypouští v případě
tzv. minipreparací, které slouží k izolaci malého množství NK, kde je účinnost
precipitace příliš nízká.
Podobně jako ionexy umožňují separovat jednotlivé typy NK, separace
genomické DNA, plasmidové DNA a RNA je možná i pomocí ultracentrifugace
v gradientu CsCl (Obr. 2.14). Pro zvýšení efektivity separace se před centrifugací
přidává do roztoku interkalační činidlo etidium bromid, který je nutné po centrifugaci
odstranit odmýváním například n-butanolem nebo pomocí chromatografické kolony.
Horní fáze odpovídá genomické DNA, prostřední fáze, kam míří jehla, odpovídá
plasmidové DNA a peleta je tvořena RNA.
Obrázek 2.14. Ultracentrifugační frakcionace plasmidové a genomické DNA
41
Izolace genomické DNA. Zvláštnosti izolace genomické DNA spočívají zejména
v její obrovské molekulové hmotnosti, délce DNA vláken, a tedy křehkosti izolované
molekuly. Pro většinu aplikací (s výjimkou přípravy genomických knihoven) však zlomy
DNA vlákna neovlivní efektivitu následných metod, neboť zlomy jsou lokalizovány na
DNA vláknu náhodně a vždy jsou po izolaci získány i fragmenty, na nichž je kontinuální
úsek, který obsahuje sekvenci, jež je cílem našeho zájmu. Obecně však lze říci, že čím je
metoda jednodušší z pohledu mechanické manipulace s DNA, tím je výsledná délka
DNA vláken větší. Při izolaci genomické DNA se nejčastěji využívá úvodní dezintegrace
materiálu v třecí misce za nízkých teplot (v tekutém dusíku je teplota –196°C) nebo lze
použít enzymatické štěpení mezibuněčné pojivové hmoty pomocí enzymatického štěpení.
Následuje rozpuštění buněčných membrán a denaturace proteinů pomocí ionogenního
detergentu (SDS, sarcosyl) a štěpení proteinů proteinasou K, která se nechává působit
přes noc při 37–50°C. Pro ochranu DNA se přidává do lyzačního pufru EDTA, která váže
ionty, jež jsou nezbytnými kofaktory DNas. Druhý den se DNA extrahuje opět fenolovou
metodou nebo je možné použít solnou extrakci proteinů pomocí NaCl ve výsledné
koncentraci 2,2 M. Následuje precipitace etanolem, nebo isopropanolem, umožňující
koncentrovat DNA a odstranit většinu solí. Při izolaci genomické DNA z materiálu
s vysokým obsahem polysacharidů (rostliny, houby) je možné selektivně precipitovat
DNA pomocí CTAB.
Izolace RNA. Samostatnou kapitolu tvoří metody pro izolaci RNA. Jako každou
jinou NK je možné i RNA izolovat výše uvedenými metodami. Hlavní rozdíl však
spočívá v nutnosti postupovat tak, aby nedošlo k degradaci RNA všudypřítomnými
RNasami, které jsou značně odolné vůči teplotě, detergentům a nevyžadují pro svou
aktivitu žádné kofaktory. Hlavním zdrojem RNas je samozřejmě izolovaný vzorek. Zde
však je degradaci možné předejít použitím nízké teploty během zpracování vzorku před
42
umístěním do lyzačního pufru. Lyzační pufry jsou většinou složeny z chaotropních
činidel (guanidium chlorid, guanidium isothyokyanát), která RNasy inaktivují. Další
nebezpečí degradace RNA tedy následuje až po odstranění těchto pufrů, tedy ve fázi
precipitace RNA etanolem nebo isopropanolem. Po precipitaci je RNA peleta rozpuštěna
ve vhodném pufru nebo v deionizované vodě a tyto musí být prosté RNas, neboť jinak
hrozí nebezpečí degradace finálního produktu a znehodnocení celého izolačního postupu.
Během další manipulace s izolovanou RNA je nutné zabránit možné kontaminaci vzorku
RNasami, jejichž zdrojem jsou ruce experimentátora, bakteriální kontaminace roztoků a
laboratorního materiálu. Ošetření laboratorního materiálu umožňujícího degradovat
RNasy spočívá v žíhání skleněných pomůcek za vysoké teploty (180°C po 8 hod), nebo
ošetření pomůcek chloroformem. Odstranění RNas z vody je možné přidáním
dietylpyrokarbonátu, jenž musí působit přes noc a poté se degraduje autoklávováním.
Povrchy laboratorních přístrojů a pracovních ploch je možné ošetřit speciálními
detergenty ničícími RNas (RNseZAP Sigma). Samozřejmostí je nošení ochranných
rukavic, dodržování čistoty, minimalizace času při zpracování vzorku a hlavně využívání
plastu na jedno použití, který je certifikován jako RNas prostý.
Reverzní transkripce umožňuje přepis RNA do podoby komplementární DNA
(cDNA). Při izolaci genu pro produkci rekombinantních proteinů se provádí reverzní
transkripce mRNA pomocí oligo dT primeru, který umožní selektivní přepis pouze
mRNA a enzymu reverzní transkriptasy. V současnosti jsou k dispozici různé modifikace
reverzní transkriptasy nejčastěji odvozené z moloneyového viru myší leukémie (MMLV)
nebo viru ptačí myeloblastózy (AMV), připravených rekombinantní technologií.
Modifikace se týkají a) zvýšení stability enzymu při vyšších teplotách, vedoucí k vyšší
specificitě a rychlosti reakce, b) eliminace aktivity RNasyH, která štípe RNA ve
vznikajícím heteroduplexu RNA/cDNA a omezuje maximální délku cDNA. Vzniklá
cDNA je potom templátem pro amplifikaci genu například pomocí PCR. cDNA můžeme
skladovat dlouhodobě, neboť je mnohem stabilnější než RNA. Další možnost je vnesení
cDNA do klonovacího plasmidu a uchování v podobě transformovaných
rekombinovaných E. coli.
PCR se většinou provádí bezprostředně po reverzní transkripci. K dosažení
maximální přesnosti se používá polymerasa s proofreading aktivitou, což znamená, že
kromě vlastní DNA polymerázové reakce enzym provádí i exonuklasovou 3’ → 5’
opravnou kontrolu správnosti párování nukleotidů. Tím je dosaženo poklesu chyb o
několik řádů, což je významné pro izolaci bezchybné cDNA. S 3’ → 5’ exonukleázovou
aktivitou souvisí i to, zda DNA polymerasa vytváří jako produkt amplifikace
dvouvláknovou DNA končící tupě (proofreading polymerasy), nebo s přesahující dA na
3’ konci (Taq polymerasa). To je rozhodující pro volbu klonovacího plasmidu, do kterého
bude PCR produkt vnesen v případě, že použijeme plasmid pro přímé vnášení PCR
produktů. Dostupné jsou obě varianty, ale je nutné ověřit, jakou pro klonování
potřebujeme. Druhý významný faktor použité DNA polymerasy je její procesivita, tedy
43
schopnost číst templátovou DNA určité délky. Čím je větší procesivita polymerasy, tím je
možné amplifikovat delší úseky cDNA. Poslední významný faktor je, zda je polymerasa
schopná amplifikovat templáty s vysokým obsahem g/c nukleotidů. Jedná se do značné
míry o kompatibilitu polymerasy s pufrem modifikovaným pro g/c templáty. Jednotlivé
parametry ovšem vylučují jiné, a proto je nutné vždy volit na základě zvolené priority.
Příkladem je nabídka firmy New England Biolabs (Obr. 2.15)
Obrázek 2.15. Souvislost různých parametrů polymeras pro PCR
44
Práce s genovými a proteinovými databázemi
Současný mohutný rozvoj informačních technologií umožnil vytvoření genových
a proteinových databází, které jsou vzájemně propojeny, takže vyhledávání a srovnávání
popsaných genů a proteinů je relativně velmi snadné. Do databází jsou většinou vkládány
výsledky sekvenace genomické DNA nebo cDNA získané reverzní transkripcí mRNA.
Proteinové sekvence jsou naopak velmi často výsledkem nikoliv přímého sekvenování
izolovaných proteinů, ale výsledkem přepisu cDNA sekvence do aminokyselinové
sekvence in silico, tedy pomocí počítače. Dále jsou dostupné databáze fragmentů
exprimovaných sekvencí (database of expressed sequence Tags – dbEST), které
usnadňují lokalizaci exonů na genomické DNA úrovni. Propojení různých databází je
možné demonstrovat na schématu sekcí národního centra pro biotechnologické informace
(NCBI) Národního institutu zdraví USA (NIH) (Obr. 2.16).
Obrázek 2.16. Schéma vzájemného provázání databází NCBI NIH
45
Klonovací a expresní plasmidy
Vnášení DNA do plasmidu je možné několika způsoby. Klasický způsob spočívá
v ligaci DNA do plasmidu pomocí DNA ligasy (Obr. 2.17). Jinou možností je vnášení
PCR produktů buď běžnou ligační reakcí, nebo přímým klonováním PCR produktů do
linearizovaných plasmidů aktivovaných topoizomerasou I (Obr. 2.18). Jiná možnost je
přenos DNA fragmentu z jednoho plasmidu do druhého místně specifickou rekombinací,
jako je tomu například u systému Gateway od firmy Invitrogen (Obr. 2.19).
Obrázek 2.17. Plasmid s MCS pro ligaci DNA insertu DNA ligasovou reakcí
46
Obrázek 2.18. Plasmid pro jednosměrné PCR klonování
47
Místně specifická rekombinace u systému Gateway je odvozená od místně
specifické rekombinace probíhající u lambda fága. Rekombinace je katalyzována
enzymovou směsí označovanou jako klonasa II, která rozlišuje signální sekvence attL1 a
attL2 v donorovém plasmidu, vyštípne úsek DNA mezi nimi a liguje jej mezi signální
sekvence attR1 a attR2 akceptorového plasmidu.
Obrázek 2.19. Gateway pro místně specifickou rekombinaci (Invitrogen)
48
Základní technika klonování (restrikce – ligace)
Restrikce DNA. Analýza DNA pomocí restrikčních endonukleas. Restrikční
endonukleasy byly poprvé popsány u bakterií v souvislosti se schopností bakterií
odolávat infekci DNA viry. Restrikční endonukleasy tvoří velmi širokou rodinu proteinů,
jež svou velikostí variují od 157 aa (PvuII) až do 1250 (CjeI) a více. Z hlediska
praktického využití, zejména při analýze DNA a rovněž při klonování, je třeba
připomenout několik základních pojmů. Izoschisomery se označují všechny restriktasy,
které rozlišují stejnou sekvenci DNA. Rozlišovaná DNA sekvence vykazuje často
symetrii. Palindrom je úsek dvouřetězcové DNA, jehož pořadí bází je v obou vláknech
totožné při protisměrném čtení. Mnoho restrikčních endonukleas štěpí DNA sekvenci,
která má vlastnosti palindromu. Jiné restriktasy naopak štípou sekvenci, která není
palindromem. Mnohé z takových restriktas štípou mimo rozlišovanou sekvenci
(definovaný počet nukleotidů dále), což je možné s výhodou využít při klonování DNA.
Restrikční místo přidáme k izolované sekvenci například prostřednictvím PCR primerů
na jejich 5’konec, a tedy vně klonované sekvence. Produkt PCR klonujeme k další DNA
po restrikci enzymem (např. BbsI), jež rozliší příslušnou sekvenci, ale štípe mimo ni, a to
směrem do amplifikované DNA (Tab. 2.11).
49
Tabulka 2.11. Klonování bez vnesení restrikčního místa do cílové sekvence
GAAGACTT
CTTCTGAAGCCG
CGGCGCC TGG TTC CCC CTT TTC
GAAGACCC
CGG ACC AAG GGG GAA AAG
CTTCTGGGCGGC
upstream primer 5’ klonované sekvence
GCC GAG AAG CTG T
TC TTC GAC A
downstream primer 3’ klonované sekvence
NNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAGGGGGAACCAGGCGCCGAAGTCTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTTCCCCCTTGGTCCGCGGCTTCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
spojení mezi 5’DNA úsekem a 3’DNA úsekem
Sekvence rozlišovaná restriktasou BbsI, sekvence oddělující místo rozlišované
BbsI a štípané BbsI, 3’konec DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5’konci
(odpovídá například N’ terminální části fúzního proteinu), sekvence 5’konce DNA
fragmentu lokalizovaného směrem k 5’konci (odpovídá například C’terminální části
fúzního proteinu).
Kromě výše uvedených restrikčních endonukleas se využívají specifické
exonukleasy a restriktasy, které štípou specificky jednovláknovou DNA, jednovláknovou
RNA nebo RNA v hybridu s DNA atd.
Minipreparace a maxipreparace DNA
Preparace plasmidové DNA. V jednotlivých krocích klonování je nutné získat
čistou plasmidovou DNA pro další postupy. Prvním krokem je tedy izolace plasmidové
DNA, která může být provedena jako mikropreparační metoda (množství získané DNA
dosahuje 20 g), například pro následnou PCR analýzu nebo následné PCR klonování,
midipreparační metoda (množství získané DNA dosahuje 500 g) použitelná pro všechny
standardní postupy, zejména ligaci fragmentů DNA získaných restrikcí specifickými
endonukleasami. Maxi a mega preparativní postupy (množství získané DNA dosahuje 5 ÷
10 mg) umožňují připravit DNA například pro DNA vakcinaci, kde dávky na jednu
experimentální imunizaci dosahují 10 ÷ 100 g pro malá laboratorní zvířata a až 8 mg
pro člověka.
Pro izolaci plasmidové DNA je možné, podobně jako při izolaci genomické DNA,
použit 1) ultracentrifugační frakcionaci celkové nukleové kyseliny na genomickou DNA,
plasmidovou DNA a RNA, 2) purifikaci plasmidové DNA od níž je genomická DNA
odseparována pomocí inotoměniče, nebo 3) separaci plasmidové DNA od genomické
50
DNA po precipitaci celkové DNA pomocí rozdílné rozpustnosti plasmidové a genomické
DNA.
Většina procedur pro purifikaci plasmidové DNA je založena na metodě alkalické
hydrolýzy. Spočívá v separaci buněk od kultivačního média, resuspendování buněčné
pelety v Tris-Cl pufru s glukózou a EDTA a následné alkalické lýze, kdy je buňka
lyzována a proteiny s DNA jsou denaturovány pomocí SDS a NaOH. Následuje
vysrážení SDS s vysokomolekulární DNA a denaturovanými proteiny prostřednictvím
octanu draselného. Kovalentně uzavřené plasmidy renaturují a zůstávají rozpuštěny v
pufru. Precipitát je následně odstraněn centrifugací nebo filtrací a izolovaná plasmidová
DNA (rozpuštěná v supernatantu) je precipitována isopropanolem nebo purifikována na
iontoměničové koloně. Po eluci je DNA rozpuštěna v pufru s optimálním pH 8 (například
Tris-Cl). Do pufru je možné přidat EDTA, která odebráním iontů kovů inaktivuje DNA.
Purifikace pomocí iontově výměnné chromatografie umožňuje volbou vhodné
koncentrace NaCl během promývání a eluce separovat jednotlivé druhy nukleových
kyselin (Obr. 2.20).
Obrázek 2.20. Eluce jednotlivých NK podle koncentrace NaCl
Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu.
Agarosový gel umožňuje separovat nukleové kyseliny o délce od 50 nukleotidů
do 2.106 nukleotidů. Standardní agarosová elektroforéza separuje optimálně fragmenty
dvouvláknové DNA o velikosti 50 až 25 000 párů bází. Optimální rozlišení v určitém
51
rozsahu velikostí DNA a RNA je možné dosáhnout volbou koncentrace agarosy
v připraveném separačním gelu (Tab. 2.12, Tab. 2.13, Obr. 2.21).
Tabulka 2.12. Optimální dělící podmínky pro agarosovou elektroforézu
Délka fragmentů DNA [kb]
1–30
0,8–12
0,5–10
0,4–7
0,2–3
Optimální koncentrace agarosy [%]
0,5
0,7
1,0
1,2
1,5
Pro separaci se používá acetátový nebo borátový pufr. DNA se v elektrickém poli
při pH 8 pohybuje jako záporně nabitá molekula ke kladně nabité elektrodě – anodě.
Intenzita separačního napětí bývá 1–5 V/cm vzdálenosti připojených elektrod. Rozdíly ve
struktuře DNA molekuly ovlivňují významně pohyblivost DNA. Pro vizualizaci DNA se
používá interkalační činidlo ethidium bromid (EtBr), který je aktivován pomocí
ultrafialového světla a emituje světlo v oblasti oranžové barvy (610 nm). Ethidium
bromid je silný mutagen a suspektní karcinogen. Detekční mez při použití EtBr je dána
velikostí DNA fragmentů a nemá lineární závislost. V průměru dosahuje asi 2 ÷ 5 ng
DNA na jeden diskrétní 5 mm dlouhý proužek. Při analýze genomické DNA je tedy
nutné použít mnohonásobně vyšší množství DNA 20 ÷ 30 g na 5mm dlouhou jamku.
EtBr ovlivňuje i pohyblivost jednotlivých forem DNA šroubovice. Ethidium bromid svou
interkalací do DNA ruší negativní suprahelikální strukturu formy I DNA a po překročení
kritické hodnoty koncentrace volného EtBr „free-dye concentration“ (0,1 ÷ 0,5 g/ml)
dochází k tvorbě kladné suprahelikální struktury u formy I DNA. Tak pohyblivost od
negativního superhelixu přes prostou cirkulární DNA k pozitivnímu superhelixu nejdříve
klesá a potom opět roste. U forem II a III interkalace EtBr do struktury způsobuje
prodloužení DNA molekuly a vzrůst rigidity, čímž může pohyblivost pouze klesat, a to až
o 15 %.
Tabulka 2.13. Morfologie a pohyblivost DNA na agarosovém gelu
Forma
Morfologie
Pohyblivost
I
Suprahelix. Negativní → relaxovaná → pozitiv.
Nejvyšší → nízká → nejvyšší
II
Prostá (zářezy) cirkulární
Nízká
III
Lineární dvojvlákno
Vysoká
52
Obrázek 2.21. Závislost pohyblivosti DNA na její morfologii
Pro separaci vysokomolekulární DNA je nutné použít PFE (elektroforéza v
pulsním elektrickém poli) nebo chef (contour clamped homogenous electric field =
homogenní elektrické pole založené na řízené rotaci polarit přilehlých elektrod).
Malé DNA fragmenty a malé rozdíly délky DNA molekuly je možné analyzovat
v polyakrylamidovém gelu s borátovým pufrem. Tyto gely se používají jednak pro
separaci oligonukleotidů, jednak pro sekvenační účely. Na rozdíl od standardního
agarosového gelu probíhá separace DNA v akrylamidovém gelu velmi pomalu.
Standardní agarosová elektroforéza není vhodná ani pro separaci RNA. Tuto je
nutné dělit v agarosovém gelu za denaturačních podmínek, tedy v pufru obsahujícím
nejčastěji 7 % formamidu. RNA vzorek v nanášecím pufru obsahujícím ústoj,
formaldehyd a formamid je nutné před nasazením do gelu denaturovat 15 min při 55°C.
Po separaci RNA je nutné před vizualizací ethidium bromidem odmýt nejdříve
53
formaldehyd z agarosového gelu pomocí 0,5M octanu amonného. Typickým znakem
kvalitní celkové RNA je přítomnost dvou proužků odpovídajících ribozomální RNA.
Naopak typickým znakem kvalitní izolace mRNA z celkové RNA je úbytek intenzity
obou proužků na úkor zvýšeného smíru mRNA pokrývajícího oblast 500 až 4 000
nukleotidů.
Lokalizace transgenu v buňce extrachromosomální, rekombinace do genomu
Zajištění trvalé přítomnosti plasmidu v hostitelské buňce je většinou realizováno
pomocí selekčního tlaku antibiotik. Tato metoda je efektivní a také nejsnadnější. Expresi
vneseného genu kódujícího rekombinantní protein či fenotypový znak buňky vázaný na
expresi či naopak blokování exprese určitého proteinu je možné zajistit stabilní integrací
do odpovídajícího místa chromozomu hostitelské buňky. Inaktivace určitého buněčného
genu je nejlépe realizovatelná homologní rekombinací STOP kazety do oblasti genu.
V případě izolace kyseliny hyaluronové z kmene Streptococcus equi subsp.
zooepidemicus, použité jako modelový problém praktické části kurzu, byla použita
homologní rekombinace kazety nesoucí gen rezistence k inaktivaci genu pro glukuronidasu.
Vnesení plasmidů do buněk – transformace
V průběhu buněčného klonování je nutné dopravit DNA konstrukt (plasmid) do
buňky, kde je následně replikován a v případě expresního plasmidu dochází k regulované
expresi rekombinantního proteinu. Vnesení DNA do prokaryontní buňky se označuje
transformace, vnesení DNA do eukaryontní buňky se nazývá transfekce. Pro vnášení
DNA do buňky jsou k dispozici různé metody, a to fyzikální, chemické nebo biologické.
Chemická transformace – principy, příprava kompetentních buněk
Chemická transformace E. coli je metoda velmi efektivní, a proto se standardně
používá v mnoha laboratořích. Její výhoda mimo jiné spočívá v nízkých nákladech na
provedení vlastní transformace, neboť kromě vyhřívané lázně nebo aspoň kádinky
s vodou o teplotě 42°C není nutný žádný zvláštní přístroj. Metody se nazývají podle
způsobu přípravy takzvaně kompetentních buněk, tedy bakterií připravených k následné
transformaci, která se provádí tak, že se přidá DNA k chemicky kompetentím buňkám a
po krátké inkubaci, kdy dochází k adhezi DNA na povrch buněk, je proveden tepelný šok
(42°C, 30 – 90 s), během něhož DNA vstupuje do buňky. Následuje preinkubace buněk
54
v SOC médiu (37°C, 1 hod.) a vyočkování na tuhé (agarové) selekční půdy. Podobným
způsobem probíhá druhý typ chemické transformace, kdy jsou kompetentní buňky
připraveny inkubací v roztoku chloridu rubidného. Obě metody umožňují připravit
kompetentní bakterie do zásoby předem a uchovat je dlouhodobě v -80°C.
Pro transfekci DNA do savčích buněk je možno použít metody s DEAE
dextranem nebo transfekci za tvorby komplexu DNA a fosforečnanu vápenatého .
V současnosti se stále více využívají kationické liposomy a kationické polymery, jako
například polyethylenimin. Tyto jsou dodávány komerčně pod různými názvy a efektivita
transfekce závisí zejména na použité buněčné linii a kvalitě kultury v době transfekce
(životnost buněk, stáří).
Elektroporace – princip, příprava kompetentních buněk, podmínky
Elektroporace je metodou volby v případech, kdy chemické metody transformace
bakterií či transfekce eukaryontních buněk nedosahují dostatečné efektivity. Princip
elektroporace spočívá v dočasné destabilizaci buněčné membrány, navozené elektrickým
pulsem. V případě bakterií se i zde využívá možnost připravit kompetentní bakterie
předem, a to promýváním bakteriální suspenze ve sterilní vodě při teplotě tání ledu.
Uchování kompetentních bakterií se provádí v 10% vodném roztoku glycerolu při –80°C.
Podmínky elektroporace jsou optimalizované pro různé bakteriální druhy a spočívají
v elektrickém pulsu provedeném přes elektroporační kyvetu, v níž jsou kompetentní
buňky s DNA umístěny. Volitelné podmínky elektroporace jsou: koncentrace buněk,
množství DNA, druh elektroporační kyvety, elektrické napětí, kapacita, případně odpor a
průběh pulsu. Pro E. coli je možné použít tyto podmínky – peleta z 25 ml bakteriální
kultury O.D.600 = 0,3; 10 pg DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,1 cm štěrbina;
25 F; 1800 V; 200 Ω. Transfekční účinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli
na 1 g DNA. K elektroporaci je nutné použít elektroporátor, což je zařízení, jehož
pořizovací náklady jsou ve stovkách tisíců korun. Příklad elektroporátoru od firmy Bio
Rrad je uveden na Obr. 2.22.
Obrázek 2.22. Elektroporátor pro vnášení DNA do bakterií i savčích buněk
55
Pro elektroporaci eukaryontních buněk jsou rovněž dostupné protokoly nastavení
elektrických vlastností pulsu. Buňky se k elktroporaci připravují těsně před vlastním
pulsem. Buňky nejsou promývány vodou jako u E. coli, ale pomocí vhodného pufru nebo
kultivačním médiem. Příklady používaných pufrů pro přípravu savčích buněk
k elektroporaci jsou následující: RPMI 1640; RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM
dithiothreitol; 1 x PBS; 15 mM HEPES pufr; elektroporační pufr 272 mM sacharóza,
7 mM fosfát sodný, pH 7,4, 1 mM MgCl2; pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM
CH3CO2K, 20 mM KOH, pH 7,4; hypoosmolární elektroporační pufr (Eppendorf).
Elektrické parametry pulsu závisí na použité buněčné linii a i pro jednu linii je
publikováno poměrně velké rozpětí hodnot, které jednotlivé laboratoře experimentálně
ověřily jako optimální. Jako příklad uveďme elektroporaci monocytární linie U937 – 0,3
ml buněčné suspenze 1,3x107/ml živých buněk 10 g DNA; předchlazené elektroporační
kyvety 0,4cm štěrbina; elektrické podmínky viz Obr. 2.23. K elektroporaci bylo použito
10 g plasmidu pSIV LTR/CAT kódujícího bakteriální chloramfenikolacetyltranferázu
(CAT) pod kontrolou LTR promotoru (CAT byla použita k monitorování transfekční
účinnosti) a 15 g pSV/tat plasmidu kódujícího Tat protein, který aktivuje transkripci
genu kontrolovaných LTR. Aktivita CAT byla měřena radioaktivní metodou stanovující
radioaktivitu reakčního produktu po inkubaci s buněčným lyzátem (obsahujícím
syntetizovanou CAT).
Obrázek 2.23. Podmínky elektroporace lidské monocytární linie U937
56
Stabilita plasmidů v buňkách
Po vnesení plasmidu do bakterie je nutno udržovat selekční tlak, který zabrání
bakterii, aby plasmid vyloučila z buňky. Nejvhodnější je použití antibiotik, jejichž
eliminace je zajištěna proteinem kódovaným pomocným genem v klonovacím nebo
expresním plasmidu.
Jinou možností je integrace plasmidové DNA do genomu hostitelské buňky, a to buď
náhodně (používáno při selekci stabilně transferovaných klonů savčích buněčných linií),
nebo homologní rekombinací (používáno i u prokaryot). Homologní rekombinace vždy
nahradí určitý, přesně vymezený úsek genomické DNA. Vnesený gen může kódovat buď
jen selekční marker (rezistence na antibiotikum), nebo jiný protein zajišťující novou
fenotypovou vlastnost buňky, nebo může být cílem pouze inaktivace nahrazeného úseku
genomické DNA, což bude v praktické části projektu použito k inaktivaci genu
kódujícího -glukuronidasu v linii Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.
Episomální DNA
Episomální DNA se používá zejména pro zajištění nového fenotypového znaku
hostitelské bakteriální linie. Detaily byly diskutovány výše.
Antibiotická selekce
Antibiotika jsou stále nejčastěji používaným selekčním markerem při
molekulárním klonování. Některé obecné aspekty byly již zmíněny v předcházejících
kapitolách. Zde jen několik praktických poznámek. Použití antibiotika jako ampicilin je
57
spojeno s fenoménem satelitních kolonií. Jedná se o to, že po naočkování bakterií na
pevné selekční půdy s ampicilinem začnou nejdříve růst pouze bakterie, které nesou
plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin (Obr. 2.24).
Obrázek 2.24. Satelitní kolonie při kultivaci na tuhých půdách s ampicilinem
Po několika hodinách se však v okolí kolonií objeví další malé „satelitní“ kolonie
bakterií, které však nenesou plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin. Na obrázku jsou
šipkami označeny centrální kolonie, kolem kterých se satelitní kolonie vytvářejí.
Ampicilin je totiž v okolí velké kolonie rychle hydrolyzován, a satelitní kolonie jsou tedy
projevem růstu bakterií na neselekční půdě. Proto je třeba klást důraz na použití čerstvých
antibiotik. V případě ampicilinu je možno redukovat kontaminaci vybraného klonu
satelitně rostoucími bakteriemi rozočkováním klonu kličkou na čerstvou selekční půdu.
58
Homologní rekombinace
Homologní rekombinace je postup cíleného nahrazení úseku genomické DNA
nejlépe pomocí lineární DNA, jejíž okrajové části mají vysokou sekvenční homologii s
okrajem nahrazeného úseku. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat
či odstranit (gene knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene
knock-in). U bakterií dochází k homologní rekombinaci v důsledku aktivity RecA
systému. V savčích buňkách a u kvasinek dochází k homologní rekombinaci v důsledku
aktivity mis-match repair systému. U savčích buněk se však většina vložené DNA začlení
náhodně (nikoliv sekvenčně specificky). Homologní rekombinace nastává v 1 – 0,01 %
případů z celkového počtu prokázaných rekombinací. Tím je využití homologní
rekombinace u savčích buněk značně omezeno. Užitečným pomocníkem může být
například reporterový gen, který správnou rekombinací umožní detekovat a klon následně
izolovat. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat či odstranit (gene
knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene knock-in).
Ověření exprese genů na laboratorní úrovni
Fenotypová analýza, PCR analýza
Přípravou rekombinovaného expresního plasmidu a jeho vnesením do hostitelské
buňky začíná další významný krok přípravy rekombinantního proteinu, ověření produkce
a optimalizace podmínek exprese a purifikace. První skríning je možné provést analýzou
buněčného lyzátu, například pomocí western blot analýzy. Zde je možné s výhodou
použít protilátky proti různým tagům neboli krátkým peptidům, s nimiž je rekombinantní
protein fúzován po vnesení do expresního plasmidu. Tyto krátké sekvence jsou součástí
většiny komerčně dodávaných plasmidů a nacházejí se bezprostředně před nebo za
klonovacím místem (MCS) nebo místem pro vnášení cDNA fragmentu získaného PCR
amplifikací. Aby byla tato krátká sekvence přepisována do sekvence aminokyselin, musí
být, cDNA inzert vnesen do MCS nebo odpovídajícího PCR klonovacího místa se
zachováním čtecího rámce (viz výše). Pokud se jedná o sekretované proteiny, je možné
provádět skríning přímo ze supernatantu kultury. Bližší popis biochemických
analytických metod je uveden v poslední kapitole.
V některých situacích, zejména u eukaryontních expresních systémů se můžeme
setkat s problémem nízké míry exprese rekombinantního proteinu, což znesnadňuje
detekci. Zde je možné skrínovat přítomnost rekombinantního expresního plasmidu
pomocí PCR. Tato metoda je dále vhodná pro mapování průběhu homologní
rekombinace. Pokud se jedná o náhodnou integraci do genomu hostitelské buňky, je
možné použít PCR k průkazu integrace rekombinované DNA například selektivní izolací
59
genomické DNA, která pak slouží jako templát pro PCR amplifikaci. Zde však je nutné
zahrnout kontrolu, která prokáže, že templátem nebyl zbytkový plasmid, který
genomickou DNA kontaminuje.
Skríning produkce rekombinantních proteinů
Pro skríning produkce rekombinantního proteinu byl uveden jako vhodný nástroj
western blot. Jelikož však většinou chceme docílit maximální dosažitelné exprese,
snažíme se izolovat buněčný klon s maximální mírou exprese. To je významné zejména u
eukaryontních expresních systémů kvasinkových a savčích. Navíc buňky, které exprimují
rekombinantní protein, jsou oproti ostatním buňkám v nevýhodě, protože mají delší
buněčný cyklus a ostatní buňky se dělí rychleji a postupně dochází k přerůstání stabilních
transfektantů ostatními buňkami.
Pro skríning exprese rekombinantního proteinu jsou vhodné metody jako dot blot
či ELISA. Dot blot metoda je založená na vazbě proteinu na nitrocelulózovou nebo
polyvinyliden fluoridovou membránu na zařízení dot blotter (Obr. 2.25). Výhoda metody
spočívá v jejím snadném aplikování na velké množství vzorků současně tedy pro
skrínování. Po nanesení proteinu na membránu se dále postupuje identicky jako při
imunodetekci na western blotu proteinů. Jediná nevýhoda spočívá v tom, že dot blot
neposkytuje žádné informace o velikosti proteinu. Tedy pokud by došlo k tomu, že
vybraný klon exprimuje daný rekombinantní protein, na který se váže protilátka, budeme
na dot blotu pozorovat pozitivní reakci, což je kolečko odpovídající nanesenému
proteinu. Pokud však skrínováním vybereme několik kandidátních klonů, snadno
můžeme provést následující analýzu, např. SDS-PAGE s následným western blotem, čím
získáme základní informace o proteinu. Někdy se na wester blot analýze ukáže více
proužků, které reagují se specifickou protilátkou. Může to být zapříčiněno rozpadem
proteinu, který může probíhat intracelulárně i extracelulárně. To už ale spadá do oblasti
optimalizace expresních podmínek a někdy vede k nutnosti provést modifikaci struktury
proteinu tak, aby byla zabezpečena vyšší stabilita bez ztráty potřebné funkce.
Obrázek 2.25. Zařízení pro dot blot firmy BioRad
60
61
ORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE
Historie
V roce 1867 upozornil švýcarský botanik s. Schwendener na podvojnou povahu
lišejníků a uvažoval o evolučním významu koexistence dvou rozdílných organismů
v jednom. Tuto myšlenku rozpracoval německý biolog a. De bary roku 1879. Pro různě
odstupňované vztahy mezi organismy (od relativně volného soužití primitivní
protokooperace nebo komenzalismu, při nichž mají obě strany určitý prospěch, až po
kompetici, parazitismus a predaci, kdy si vzájemně škodí) zavedl pojem symbióza. Roku
1893 vyslovuje myšlenku o symbiotickém původu buněčného jádra americký embryolog
a cytolog S. Watase a o jedenáct let později také německý cytolog T. Boveri. Ruský
biolog K. S. Merežkovskij na základě svých detailních studií chloroplastů v rostlinných
buňkách zavádí termín symbiogeneze (1905, 1909), který později (1920) podrobně
rozvíjí do teorie symbiogeneze. V téže době razí podobnou hypotézu ještě ruský anatom
a. S. Famintsyn a americký biolog I. E. Wallin. Famintsyn prokázal, že chloroplasty mají
symbiotický původ, zachovávají si svoje fotosyntetické funkce, i když jsou kultivovány
mimo rostlinnou buňku. Oběma vědcům se podařilo nalézt řadu shodností mezi funkčním
projevem bakterií a chloroplastů, z čehož vyvodili, že chloroplasty byly původně
fotosyntetizující mikroby, které byly fagocytovány, ale nebyly stráveny a uvnitř fagocytů
dále vykonávaly fotosyntézu. Zachovaly si také schopnost nezávislého rozmnožování. V
roce 1918 francouzský biolog P. Portier razil teorii, že mitochondrie jsou rovněž
endosymbiotické bakterie, což vyvolalo naprosté odmítnutí.
V roce 1927 rozpracoval wallin stejnou myšlenku. O rok později F. Griffith
provedl své známé transformační pokusy s různými mutanty pneumokoka (streptococcus
pneumoniae), které se odlišovaly některými vlastnostmi, a tudíž, že dědičnost lze cíleně
měnit. V roce 1944 prokázali američtí badatelé o. T. Avery, C. M. Macleod a M.
Mccarty, že za tuto navozenou dědičnou změnu (transformaci) je odpovědná DNA a
nikoliv bílkoviny, jak byla tehdy většina vědců přesvědčena. Byl to přímý důkaz, že geny
lze přenést i horizontálně, nejen vertikálně, tj. z rodičů na potomstvo. Rok 1944 lze bez
nadsázky považovat za datum zrodu molekulární genetiky. V šedesátých a sedmdesátých
letech 20. Století mluví L. Margulisová o horizontálním mezidruhovém přenosu
genetické informace jako o obecném biologickém fenoménu, který byl vlastní příčinou
vzniku eukaryotické buňky (teorie o symbiotickém původu jaderné buňky). Na její práce
navázal v roce 1970 n. G. Anderson (1970) a zdůrazňoval, že horizontální přenos genů
přes druhové bariéry má závažné evoluční důsledky v daleko širším kontextu. V roce
1977 přinášejí c. R. Woese a g. E. Fox důkaz: nukleové kyseliny mitochondrií a
chloroplastů jsou příbuznější bakteriální nukleové kyselině než eukaryotické.
62
Výměna genetické informace
Bakteriální i eukaryotické buňky nejenže geny přijímají a vestavují, ale i naopak,
nukleové kyseliny vylučují nebo se do prostředí dostávají z mrtvých buněk. Celé
molekuly nukleových kyselin, oligo- a mononukleotidy se ve vysokých koncentracích
vyskytují hlavně ve vodním prostředí. Fragmenty DNA mohou přetrvávat
v rozkládajících se tělech zvířat nebo v exkrementech týdny a v rostlinných zbytcích celá
léta. V teplotách nevystupujících nad bod mrazu, např. Ve věčně zmrzlé půdě, se volná
DNA uchovává po stovky let. Nukleové kyseliny jsou jako součásti buněk v trávicím
ústrojí živočichů štěpeny příslušnými enzymy a přijímány jako složky nutrice. Přes
buňky zažívacího ústrojí pak přecházejí do krevního a mízního oběhu a jsou roznášeny
po těle, kde jsou využívány pro růst a regeneraci tkání.
Horizontální přenos genetické informace přes druhové bariéry je zprostředkován
buď splýváním celých genomů dvou či více organismů, nebo vkládáním rozsáhlejších
genomových oblastí (např. Ostrovy patogenity u bakterií), nebo jen jednotlivých genů či
jejich částí (nukleotidy). V tomto případě jsou vektorem viry (fágy) a konjugační
plazmidy. např. geny pro fotosyntézu mořských bakterií byly vneseny fágy. Fágy jsou na
zemi nejpočetnější. Odhaduje se, že existuje 1030 fágových partikulí, které každou vteřinu
infikují 1025 bakteriálních buněk. Mezi mobilní genetické elementy patří také
transpozony a retrotranspozony.
Dnes je naprosto prokázáno, že všechny jednobuněčné i mnohobuněčné
organismy mající v buňkách jádro (eukaryota), vlastní přinejmenším dva vzájemně těsně
spolupracující genomy: jeden představuje jaderná DNA a druhý je DNA obsažená v
mitochondriích. Zatímco jaderný genom se dědí po obou rodičích, mitochondriální geny
jsou předávány potomstvu pouze po mateřské linii. Rostliny a řasy mají ještě třetí genom
v chloroplastech, což jsou původně fagocytované fotosyntetické bakterie. Pět i více
genomů mají jednobuněčné eukaryontní organismy ‒ prvoci, hlenky a láčkovci.
Bakterie
Bakterie rozstřihávají, přestavují a spojují geny, genové kazety i celé genomy už
po miliardy let. Horizontálním přenosem genů reorganizují své genomy, což jim
umožňuje rychle získat nové vlastnosti (patogenitu a virulenci) a nové metabolické
reakce. Mezi nepříbuznými bakteriemi byly zjištěny homologické geny, zaujímající až 25
% jejich genomu, které se tam dostaly z jiných bakterií horizontálním přenosem. Stále se
rozšiřující rezistence na antibiotika je příkladem této genetické výměny. Z člověka
léčeného antibiotiky se rezistentní bakterie dostávají do vnějšího prostředí, kde předávají
geny rezistence dalším bakteriím. Rychlost tohoto přenosu lze odvodit nepřímo ze
statistik uveřejněných v USA: koncem 90. Let mělo 80 % lidí ve svém trávicím traktu
bakterie rezistentní na tetracyclin, zatímco před rokem 1970 to bylo jen 30 %. Byly
dokonce izolovány bakterie, které byly rezistentní na 31 druhů antibiotik. Biochemici na
63
arizonské univerzitě v tusconu odhadují, že podíl genetického materiálu přejatého od
jiných bakterií dosahuje až 90 % (Tab. 7.1).
Genetická informace se mezi bakteriemi přenáší buď volnou DNA, tzv.
Transformací nebo transdukcí, jak se označuje přenos části bakteriální DNA pomocí
bakteriálních virů (fágů), anebo konjugací, speciálním parasexuálním procesem, při
kterém se musí dvě bakterie dostat do fyzického kontaktu. Cizorodá DNA se
do bakteriálního genomu včleňuje několika způsoby: rekombinací, jde-li o DNA blízce
příbuzných druhů bakterií, nebo integrací, když se jedná o DNA fágů. Jiným způsobem
se připojuje DNA mobilních genetických elementů jako plazmidů, integronů anebo
transpozonů (geny přeskakující na různá místa chromozomu), který uskutečňují enzymy
transpozasy. Přenesená DNA může být rovněž „nezákonitě“ využita při opravě zlomů
dvoušroubovice DNA anebo může uvnitř bakteriální buňky dočasně přetrvávat ve formě
epizomu.
Eukaryota
Bakterie vnášejí své geny také do buněk eukaryotických organismů, hub, rostlin i
živočichů. Vznik eukaryotické buňky byl důsledkem horizontální výměny genetické
informace, v tomto smyslu výsledkem různých typů symbiotických soužití eubakterií i
archebakterií. Nitro eukaryotické buňky se stalo vhodným prostředím i pro viry, které
přenos genetické informace a tím i vznik evolučních novinek ještě víc urychlily.
Vybaveny schopností fagocytovat dostaly eukaryotické buňky do vínku hned tři evoluční
inovace: možnost získávat větší kvanta potravy, než zabezpečovala pouhá difuze
rozpuštěných živin, možnost likvidovat potenciální parazity a patogenní nepřátele, a co
bylo patrně evolučně nejvýznamnější, možnost horizontální výměny genetické informace,
kdy už nebyly jejími vektory jenom viry nebo části genetického materiálu (transpozony,
retrotranspozony), ale endosymbioticky byly integrovány celé pohlcené organismy,
z nichž se pak adaptivně vyvinuly buněčné organely. Příklady přenosů pro geny
regulující některé metabolické reakce jsou uvedeny v Tab. 7.2.
Tabulka 7.1. Potenciální dárci genetické informace do genomů některých zástupců
bakterií
bakterie
rozsah
genomu Mb
Bacillus subtilis
4,21
Borrelia burgdorferi
0,91
počet
atypických
oblastí
51
7
64
Taxon
eubakterie
G+ bakterie
Viry
eukaryota
% zastoupení
dárců z taxonu
69
50
16
50
Campylobacter
jejunii
Chlamydia
pneumoniae
Chlamydia
trachomatis
Escherichia coli
1,64
12
1,23
13
1,04
11
4,64
84
Haemophilus
influenzae
Helicobacter pylori
1,83
13
1,67
18
Mycobacterium
tuberculosis
Rickettsia prowazekii
4,41
43
1,11
10
eubakterie
viry
eubakterie
eukaryota
eubakterie
eukaryota
eubakterie
viry
eubakterie
enterobakterie
viry
eubakterie
eukaryota
eubakterie
G+ bakterie
eubakterie
γ-proteobakterie
eubakterie
eukaryota
25
25
50
38
58
25
58
25
87
56
10
59
35
83
33
95
50
59
30
Tab. 2: příklady horizontálního přenosu kompletních chromozomálních genových
sekvencí kódujících metabolické aktivity u eukaryot
Geny pro
Vektory
Původ
Glukozofosfátovou
Isomerasu
Fe superoxidovou
Dismutasu
Aldolasu
Cytochrom c
Escherichia coli
Dvouděložné rostliny
Clarkia unguiculata (lokanka lepá)
Prokaryota
Xylanasu
Thioredoxin
Glyceraldehydovou
Dehydrogenasu
Entamoeba histolytica
Kvasinky
Arabidopsis thaliana
(huseníček thalův)
Rumonococcus
Rostliny
Escherichia coli
Anabaena (sinice)
Escherichia coli
Houby
Houby
Prokaryota
Eukaryota
Nejznámější bakterií, která přenáší své geny do rostlin, je Agrobacterium. Patří do
významného řádu, jehož zástupci vytvářejí ve spolupráci s rostlinnými pletivy hlízky
(rhizobia), symbiotická společenství mikrobů na kořenech rostlin. Agrobacterium však
vyvolává rostlinné nádory, protože je přenašečem plazmidu, jehož geny mění syntézu
růstových hormonů v buňkách rostlinných pletiv. Mechanismus plazmidového přenosu
65
u agrobakterií objevila v sedmdesátých letech minulého století m. D. Chiltonová na
Seattle university. Stala se zakladatelkou zcela nového vědního oboru
biotechnologie
rostlin. Jejím dalším významným úspěchem bylo, že se jí podařilo z agrobakterií odstranit
nádorotvorné geny, ale schopnost přenášet genetickou informaci zůstala zachována. To
otevřelo cestu k jejich praktickému využití jako vektorů genetické informace. Jejich
prostřednictvím lze konstruovat nové, tzv. Geneticky modifikované odrůdy rostlin
nesoucí požadované užitné vlastnosti.
V rhizobiální symbióze žije řada dalších půdních aerobních i anaerobních
bakterií, které přednostně váží dusík z ovzduší a syntetizují dusíkaté látky důležité pro
výživu rostlin. Odhaduje se, že ročně pohltí na 90 milionů tun atmosférického dusíku, což
je srovnatelné s množstvím dusíku pohlceným oceány, lesními porosty a ostatními
biotopy země dohromady. Tato fixační schopnost zemědělských půd závisí na vysoce
specializovaných symbiotických bakteriích rhizobium, frankia a azospirillum, které
přenášejí do rostlinných buněk plazmid vybavený genovou sekvencí řídící fixaci dusíku.
Na tomto prastarém, horizontálně získaném mechanismu bakteriální přeměny
atmosférického dusíku je lidstvo závislé nejméně od doby neolitu, kdy se začalo zabývat
pěstováním rostlin a zemědělské plodiny se staly převažujícím zdrojem potravin.
Vznik imunity jako obrany integrity
V eukaryontním živém světě se muselo objevit něco, co zabezpečilo obranu
integrity, a tím neopakovatelnou jedinečnost každé eukaryontní buňky, každého
mnohobuněčného eukaryontního jedince. Bez schopnosti udržet si vlastní jedinečnost by
nemohlo ani dojít k diverzifikaci druhů na zemi. Tato schopnost obrany integrity se u
živočichů označuje obecně jako imunita (v rostlinném světě pak jako rezistence). V 90.
letech minulého století byl získán nezvratný důkaz, že tzv. Adaptivní imunita vznikla u
čelistnatců na základě horizontálního přenosu genů. Adaptivní imunitní strategie je
založena na využití molekul imunoglobulinové nadrodiny: patří sem protilátky,
membránové receptory t a b lymfocytů a další efektorové molekuly. Předpokládá se, že
do genomu jejich předchůdců byly horizontálně vneseny transpozony bakterií, mobilní
genové sekvence Rag-1 a Rag-2 (z Angl. Recombination activation genes), kódující
přeskupování genových segmentů pro vazebné místo pro antigen na molekule
imunoglobulinů, čímž bylo zajištěno generování nezměrné rozpoznávací variability.
Počet vazebných míst může dosahovat až 1018, což zajišťuje specifickou odpověď i na
struktury, které se v přírodě nevyskytují. Na horizontální přenos rag sekvencí ukazuje
řada podobností s jinými transpozony: transesterifikace DNA u nich probíhá podobně,
rovněž se integrují jako viry hiv a jejich integrasy štěpí DNA podobně jako integrasy
HIV (Tab. 7.3).
66
Tabulka 7.3. Podobnost rag a některých transpozonů
Integrasa HIV
Rostlinné transpozony Ac Ds, Tam3
Transpozon drozofily „hobo“
Houbový transpozon (Ascobolus immersus) Ascot-1
Integrační faktory Escherichia coli
Hin invertasa salmonel
Genom člověka
V roce 1999 byl publikován seznam 19 lidských genů odvozených z transpozonů.
Podle údajů Mezinárodního konsorcia pro sekvencování lidského genomu (International
Human Genome Sequencing Consortium) z roku 2001 tvoří mobilní genetické elementy
téměř polovinu lidského genomu. V roce 2004 R. J. Britten z Kalifornského
technologického institutu uveřejnil, že mobilního původu může být až 89 % funkčních
lidských genů. Část z nich tvoří endogenní retroviry (ERV
z angl. Endogenous
RetroVirus) nebo jejich fragmenty. Pro srovnání, v myším genomu zabírají retrovirové
elementy 10 %, v genomech vyšších rostlin jsou zastoupeny ještě více (např. u kukuřice
z 50 % nebo u pšenice více jak z 90 %). Tato poměrně vysoká množství retroelementů,
nacházejících se v dnešních eukaryotických genomech, jsou relikty dávných
retrovirových infekcí. Podle posledních a stále upřesňovaných údajů zaujímají 8,3 %
genomu člověka endogenní retroviry (HERV
angl. Human Endogenous RetroVirus),
retrovirové, tzv. dlouhé opakující se terminální struktury (LTR
angl. Long Terminal
Repeat structures) a mobilní elementy obdobné retrotranspozonům. O neobvyklém zájmu
o tuto problematiku svědčí rychlost, s jakou jsou objevovány nové a nové rodiny HERV.
V roce 2000 jich bylo známo 22, dnes už jich známe na 80 a předpokládá se, že jich bude
identifikováno více jak 100 (Tab. 7.4).
Tabulka 7.4. Zařazení lidských endogenních retrovirů (HERV) v rámci čeledi
retroviridae
Jednoduché retroviry
rod
Alpharetrovirus
Betaretrovirus
Gammaretrovirus
příklad
virus ptačí leukózy
virus nádoru mléčné žlázy myší
opičí viry
virus leukémie myší
Komplexní retroviry
67
HERV
Třída II
Třída I
rod
Deltaretrovirus
Epsilonretrovirus
Lentivirus
Spumavirus
příklad
virus leukémie skotu
virus nádorů kůže ryb
opičí viry
lidské a opičí viry (HIV, SIV)
lidské a opičí viry
HERV
Třída III
HERV se v našem genomu shromažďovaly po 80 milionů let. Čas od času
propukaly mezi našimi předchůdci nemoci a epidemie vyvolané retroviry, podobně jako
dnes infikují exogenní retroviry SIV (z angl. Simian Immunodeficiency Virus) opice
anebo HIV-1 a HIV-2 (z angl. Human Immunodeficiency Virus), vyvolávající selhání
imunity u člověka (AIDS), které se od začátku 80. let minulého století stále šíří a už
nabylo charakteru pandemie. O retrovirech HIV se můžeme s vysokou pravděpodobností
domnívat, že mohou přinést evoluční inovace do genomu lidí. Je vysoce pravděpodobné,
že HERV urychlily evoluci určitých vývojových linií primátů směrem k člověku
(hominizaci). Nově integrované HERV přinášely nejen novou informaci, ale mohly
v genomu změnit pořadí exprese jiných, původních genů a poskytnout tak evoluční
výhody pro jejich nositele. Jak předpokládá R. Löwerová z Institutu Paula Ehrlicha
v Německu, takovou evoluční výhodou mohlo být přenesení rezistence proti řadě
původců jiných virových chorob. Exogenní retroviry totiž po endogenizaci ztrácejí
virulenci, ale přitom zabraňují vstupu jiných exogenních virů. To mohlo napomoci přežití
našich předků oproti jiným primátům, u nichž k retrovirové endogenizaci nedošlo.
Existují také hypotézy, že HERV byly příčinou růstu lidského mozku a nebývalého
rozvoje neokortexu (šedé kůry velkého mozku, který je sídlem inteligence). Lidský
mozek je v průměru třikrát větší než mozek pravěkých i dnes žijících opic. Fosilní nálezy
svědčí o tom, že k jeho zvětšování došlo u hominidů (v linii primátů vedoucí k člověku)
vícekrát. Začalo asi před dvěma miliony let a skončilo pravděpodobně před odštěpením
neandrtálců před 500 000 lety. A. Stengel z německého Národního centra pro životní
prostředí a zdraví nedávno zjistil v lidském mozku expresi HERV, která nebyla prozatím
v opičím mozku zjištěna. Většina HERV už není schopna se dále v genomu rozmnožovat
díky řadě mutací a jiných přeměn, přesto některé z nich kódují proteiny, které se dají
dobře detekovat. Přítomnost takových proteinů nebo jejich mRNA byla prokázána při
nádorových procesech, ale co je důležité, také v řadě lidských tkání, kde se podílejí na
zabezpečení mnoha životně důležitých funkcí, např. při zrání spermií nebo embrya
v placentě (Tab. 7.5).
Tabulka 7.5. Příklady některých rodin herv a erv a exprese jejich mRNA
rodina
počet identifikovaných kopií mRNA
specifická exprese mRNA
HERV-E
30‒50
placenta, mozek, rakovina prsu
68
HERV-H
50‒1000
teratokarcinom
HERV-W
10‒100
placenta
HTDV/HERV-K
30‒50
spermie, placenta, nádory
HERV-K/T47D
30‒50
rakovina prsu, placenta
ERV-3
1
placenta, tkáně plodu, spermie
ERV-9
30‒50
teratokarcinom, placenta
O původu a evoluční historii jednotlivých rodin HERV je známo málo. Výjimku
tvoří rodiny označované jako HERV-H, HERV-K, HERV-L, HERV-W a MSRV (z angl.
Multiple Sclerosis RetroVirus). MSRV může být exogenní retrovirus, ale je pro svoji
podobnost řazen do podrodiny Herv-w. Byl izolován z buněčných kultur nemocných s
roztroušenou sklerózou. Později byl prokázán i u sklerotiků. HERV-W rodina patří dnes
k nejprozkoumanějším endogenním retrovirům. Zdá se, že HERV-W patří k
fylogeneticky nejmladším, vstoupily do genomu primátů ještě před rozštěpením opic
Starého a Nového Světa před 25 až 40 miliony let. Jeden z členů rodiny HERV-W si
zachoval kompletní provirovou genovou sekvenci exogenních retrovirů. Tento unikátní
gen env (z ang. ENVelope, obálka, virový obal) kóduje glykoproteiny, které dalšími
enzymatickými procesy dávají vznik syncytinu 1 a 2. Oba proteiny jsou více jak z 90 %
exprimovány v placentě a v pokusech in vitro se ukázalo, že způsobují splývání buněk
(buněčné fúze). Právě na nich závisí příprava děložní sliznice (endometria) pro přijetí
oplozeného vajíčka a přeměna cytotrofoblastu na syncytiotrofoblast (nejen chránící
vyvíjející se plod, nesoucí cizorodé antigeny otce před imunitní reakcí matky, ale také
zajišťující transport živin, výměnu plynů a další metabolické a endokrinní funkce). Slabá
přítomnost syncytinu byla prokázána ještě ve varlatech, ale nikde jinde ze 23 typů
analyzovaných lidských tkání. Avšak na začátku tohoto století některé práce poukázaly
na fakt, že se při určitých zánětlivých onemocněních nervové soustavy zvyšuje množství
některých proteinů ERV, zejména geny env, a to nejen u člověka a některých opic, ale
také u hlodavců a koček. U roztroušené sklerózy, která je provázena nahromaděním
zánětlivých buněk, demyelinizací a zánikem oligodendrocytů, je nacházeno zvýšené
množství nám už známého syncytinu, který je kódován stejnými geny HERV-W. V roce
2004 byly publikovány výsledky úctyhodné spolupráce vědců z univerzit v Kanadě,
USA, Francii a Anglii, které prokázaly, že je to syncytin, který má na svědomí aktivaci
prozánětlivých molekul v nervové tkáni, je příčinou buněčné smrti nervových buněk, a co
je důležité, že některé antioxidanty těmto jeho nebezpečným účinkům zabraňují.
Pangenom
Jestliže si představíme celou biosféru jako sumu všech genů ze všech buněčných
organismů, virů a mobilních genetických elementů, dostaneme jediný gigantický soubor
genetické informace, z něhož čerpá biologická evoluce. V. V. Tetz ze Státní Pavlovovy
69
lékařské univerzity v Petrohradě nazývá tuto celoplanetární genetickou informaci
pangenom. Nejvýznamnější úlohu informačních zdrojů v něm přisuzuje prokaryotickým
mikroorganismům a virům. Jejich celková hmotnost se odhaduje na 7,5 miliard tun, což
převyšuje celkovou hmotnost rostlin (5,5krát) i živočichů (0,5krát).
V současné době známe sekvence genů v genomech 250 druhů prokaryot. To je
však jen zlomek z dosud popsaných 17 tisíc druhů bakterií, což je opět jen nepatrný díl
skutečného množství bakteriálních druhů. V půdě přírodní louky se nalézá kolem milionu
odlišných mikrobiálních genomů a jen mikrobiota lidského střeva zahrnuje přes 300 000
genů, zatímco vlastní genom člověka má asi 25 000 genů.
Tato obrovská pestrost genomů se lidskými zásahy stále snižuje. V zemědělsky
obhospodařované půdě se nachází už jen desetina genomů a v půdách znečištěných
průmyslovými spady klesne jejich počet na pouhou tisícinu. Na druhé straně, člověkem
řízený horizontální přenos genetické informace, neuvážené, masové zavádění GMO,
které některé geny upřednostňuje, může vést ke změnám v přirozeném koloběhu výměny
genetické informace a k rozkolísání ustavené rovnováhy planetárního ekosystému.
Závěy
Objev horizontálního přenosu genetické informace změnil náš pohled na živý
svět. J. Hoffmeyer z Institutu molekulární biologie kodaňské univerzity tvrdí, že příroda
podstupuje semiotizaci, tj. stále zvyšuje výměnu informace. Výměna informace je tudíž
conditio sine qua non evoluce nových druhů. Horizontální přenos genetické informace
má v evoluci živých forem proto tak závažnou úlohu, že je motorem hlavních evolučních
inovací, jako je např. výše zmíněný vznik adaptivní imunity čelistnatců.
V této souvislosti se přímo vnucují neodbytné otázky: Mohou se dnešní
nitrobuněční bakteriální parazité jako Salmonella, Shigella, Francisella, nebo dokonce
viry (viz podobnost RAG a HIV) stát přenašeči nové genetické informace, která
v konečném důsledku způsobí kvalitativní evoluční skok? Nebo to budou mobilní části
DNA jiných organismů, o jejichž působení vůbec nic nevíme? Jak dlouho bude trvat, než
se evoluční inovace projeví? Bude to sto let, tisíciletí, nebo déle?
Uvažujeme-li v tomto evolučním kontextu, je třeba si stále uvědomovat, že živé
formy se nikdy nevyvíjely v nějaké „splendid isolation”. Nebyla to evoluce, ale
koevoluce (jejíž podstatou je horizontální přenos genetické informace), která vytvořila a
jistě dosud stále vytváří všechny druhy živých organismů na Zemi.
70
Doporučená literatura
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002) Molecular biology of
the cell. Garland Science, New York, USA.
Kirkham B., Kavanaugh A., Plevy S. E., Barker J. (2008) Handbook of biological therapy.
Oxford, New York, USA.
Rosypal S. (1997) Úvod do molekulární biologie. Vydáno vlastním nákladem, Brno, CR.
Schleef M. (editors) (2001) Plasmids for therapy and vaccination. Wiley-VCH, Weinheim,
Germany.
Schleef M. (editors) (2005) DNA Pharmaceuticals. Formulation and delivery in gene therapy,
DNA vaccination and immunotherapy.
Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Sherlock R., Morrey J. D. (editors) (2002) Ethical issues in
biotechnology. Rowman &#61478; Littlefield Publishers, Maryland, USA.
Snyder L., Champness W. (2007) Molecular genetics of bakteria. ASM Press, Washington,
USA.
Trent R. J. (2005) Molecular medicine. Elsevier, London, UK.
Internetové zdroje
http://www.molgen.mpg.de/~soldatov/protocols/protocol/index.html
http://www.arabidopsis.org/Protocols_Mundy2.html
http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_index.html
http://www.aesculab.cz/Pages/Default.aspx
71