Současná strategie přípravy trojrozměrných nosičů

Současná strategie přípravy trojrozměrných nosičů

Současná strategie přípravy
trojrozměrných nosičů metodou
elektrospiningu
Sborník k workshopu
Tento sborník vznikl v rámci projektu OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a
výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů (reg. č. CZ.1.07/2.4.00/31.0245.)
Obsah
ÚVOD ........................................................................................................................................ 3
TROJROZMĚRNÉ NOSIČE ................................................................................................. 4
MATERIÁLY PRO TVORBU NOSIČŮ ........................................................................................... 5
Přírodní materiály .............................................................................................................. 6
Syntetické materiály ........................................................................................................... 8
METODY PŘÍPRAVY NOSIČŮ................................................................................................... 10
Příprava nanovláken ........................................................................................................ 14
Elektrostatické zvlákňování (Electrospinning) ............................................................ 15
4SPIN ........................................................................................................................... 19
APLIKACE NANOVLÁKENNÝCH MATERIÁLŮ V MEDICÍNĚ ....................................................... 23
SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................................ 26
SEZNAM LITERATURY ..................................................................................................... 27
Úvod
Konvenční kultivace buněk in vitro poskytují pouze dvourozměrný prostor
pro buněčnou proliferaci, migraci a diferenciaci. Takový model však neodpovídá
fyziologickému stavu. Proto se v rámci tkáňového inženýrství v současné době
rozšiřuje příprava a používání trojrozměrných nosičů. Jako materiál pro tvorbu
takovýchto nosičů slouží jak přírodní látky vyskytující se v extracelulární matrix
různých tkání, tak i uměle vytvořené polymery. Z těchto materiálů jsou formovány
různě strukturované konstrukce - „lešení“, které mohou být dále obsazovány buňkami
a použity k transplantacím v rámci regenerativní medicíny. Současně s přípravou
takovéhoto nosiče je pak možné přímo do materiálu či na jeho povrch nanést aktivní
látky, které mohou ovlivnit cytokinetické děje.
V přípravě
trojrozměrného
nosiče
hraje
významnou
úlohu
metoda
„elektrospining“, která umožňuje vrstvit nanovlákenný materiál dle specifických
požadavků.
V tomto sborníku naleznete informace o materiálech, které se používají
pro tvorbu 3D nosičů a také o metodách, kterými se tyto nosiče připravují. Podrobněji
je pak popsána právě metoda „elektrospiningu“. V závěru textu jsou shrnuty možnosti
využití takto vytvořených nosičů.
3
Trojrozměrné nosiče
Výběr vhodného nosiče, který mimikuje prostředí buněk in vivo, je základním
předpokladem pro tvorbu trojrozměrného modelu tkáně. V takovémto modelu mohou
buňky vrůstat do porézního biokompatibilního trojrozměrného prostředí, kde je téměř
celý povrch buňky vystaven buď povrchu ostatních buněk nebo povrchu nosiče
(Haycock, 2011). Kromě mechanické opory a možnosti adhezivních kontaktů,
poskytují 3D nosiče buňkám přirozené mikroprostředí včetně dostatečného přísunu
živin a růstových faktorů. Takovýto model pak umožňuje buňkám vyšší stupeň
organizace včetně vytváření prostorových komunikačních sítí (Page et al., 2013).
Zvolený design nosiče ovlivňuje vlastnosti 3D modelu v makro-, mikro- a nanoměřítku. V Makro-měřítku hraje roli celková velikost a tvar podpůrné struktury, což
může být kritérium výběru pro konkrétní použití. Např. v regenerativní medicíně
se pro náhradu kloubní chrupavky více hodí nosič ve tvaru ploténky než třeba
trubičky. Správná mikrostruktura nosiče zase umožňuje efektivní transport signálních
molekul, přísun živin a odvod odpadních produktů a vytváří prostor pro snadnou
migraci či proliferaci buněk. Nanostruktura je pak rozhodující při přímé interakci
buněk s nosičem a ovlivňuje tak děje na molekulární úrovni (Haycock, 2011)
4
Materiály pro tvorbu nosičů
Podle původu lze materiály nosičů dělit na přírodní a syntetické. Výhodou
přírodních materiálů je jejich přirozený výskyt v organizmu a možnost degradace
přirozenou cestou. Naopak předností syntetických materiálů je přesně definované
složení a možnost eliminace rizika přenosu zvířecích patogenů.
Materiály, ze kterých jsou 3D nosiče vytvořené je možné obecně
charakterizovat podle několika kriterií. Nejdůležitějšími z nich jsou biokompatibilita,
biodegradabilita,
porozita,
elasticita
a
úroveň
síťování
(následující
vychází
z Wintermantel et al., 1996).
Biokompatibilní materiál je pro tělo netoxický, nealergenní a nemutagenní,
neovlivňuje plodnost a nezpůsobuje vznik nádorů. Nejlepší je neimunogenní materiál
podobný extracelulární matrix (ECM).
Biodegradabilita
popisuje
možnost
rozkladu
materiálu
v
organizmu.
Pro terapeutické účely jsou vhodné takové materiály, které buňkám poskytnou
podporu při přenosu do organizmu a začleňování do tkání, ale po určité době,
ve které dojde k uchycení buněk v organizmu, se degradují a mohou být nahrazeny
ECM.
Porozita materiálu poskytuje buňkám prostor k uchycení, proliferaci a migraci.
Velikost pórů v biomateriálech se pohybuje v rozmezí desítek až stovek mikrometrů.
Elasticita popisuje schopnost materiálu vrátit se po stlačení nebo natažení
do původního stavu. Elasticita materiálu má vliv na uchycení, dělení i diferenciaci
buněk, měla by se podobat elasticitě konkrétní tkáně tkáně.
Síťováním dochází ke spojení jednotlivých molekul tvořících 3D materiál
kovalentními nebo iontovými vazbami. Síťování je obvykle dosaženo pomocí UV
záření nebo chemicky. Síťováním, stejně jako koncentrací použitého materiálu lze
regulovat degradabilitu, porozitu a elasticitu materiálu.
5
Přírodní materiály
In vivo je přirozeným prostředím buněk ECM. ECM se v různých tkání liší, jak
po strukturní, tak po funkční stránce. Proto jsou jako přírodní nosiče využívány
organizované 3D struktury složek ECM, jako jsou např. kolagen, laminin, fibronektin
a zejména kyselina hyaluronová a její deriváty (Tanzer, 2006).
Buňky s ECM vytváří adhezní spojení, které neslouží pouze k jejich ukotvení,
ale často znamená i přenos informací v podobě buněčné signalizace. Mikroprostředí
ECM tak může mít přímý vliv na směr diferenciace a výsledný fenotyp buněk (Lin
et al., 2010).
Kromě materiálu nosiče mohou na buňky působit i aktivní látky, nejčastěji
proteiny, které je možné navázat na povrch materiálu. Kromě proteinů lze materiály
pokrývat krátkou sekvencí aminokyselin, která slouží v daném proteinu jako signální
doména pro buněčné receptory (Patel et al., 2007).
Kolagen je nejčastěji zastoupený protein v lidském těle, tvoří asi 30 % všech
proteinů v organismu. Vyskytuje se hojně v mezibuněčné hmotě pojivových tkání a to
nejčastěji ve vláknité formě. V současnosti je známo nejméně 27 různých typů
kolagenů, ale jen některé, jako např.: kolagen I, II, III, V, XI, XXIV a XXVII, vytváří
vláknitou strukturu. Naopak nevláknitý kolagen typu IV je obsažen v bazální lamině.
Vzhledem k hojnému zastoupení kolagenu v těle, biodegradabilitě, biokompatibilitě
a poměrně nenáročné přípravě je kolagen ideálním materiálem pro tvorbu 3D
systémů (Ricard-Blum, 2011).
Glykoprotein laminin tvoří základní složku bazální laminy. Molekula lamininu
se skládá ze tří původně samostatných řetězců, které se propojují disulfidickými
můstky a vytváří spolu komplex křížovitého tvaru. Lamininy jsou označované čísly
(1–5) a obvykle řídí buněčnou adhezi a migraci během embryonálního vývoje (Sasaki
et al., 2004).
6
Fibronektin je glykoprotein s vysokou molekulovou hmotností (~440kDa). Rozpustný
plazmatický fibronektin je produkován hepatocyty a je jednou z hlavních komponent
plazmy (300 μg/ml). Nerozpustný fibronektin je důležitou komponentou ECM. Je
produkován různými typy buněk především fibrocyty ve formě rozpustného dimeru
a poté je seskládán do nerozpustné hmoty. V rámci ECM se jednak váže
k membránovým receptorům buněk, tzv. integrinům, a jednak ke komponentám ECM
jako jsou kolagen, fibrin a heparan sulfát. Fibronektin tak má důležitou úlohu
v buněčné adhezi, migraci, proliferaci a diferenciaci (Pankov and Yamada, 2002).
Kyselina hyaluronová (HA) je přírodní glykosaminoglykan, který nese záporný
náboj. HA se přirozeně vyskytuje v ECM tkání, jako součást základní hmoty amorfní.
Chemicky se řadí mezi nesulfatované glykosaminoglykany o molekulové hmotnosti
od 100 do 8000 kDa. Glykosaminoglykany jsou tvořeny lineárními polysacharidy,
které
obsahují
deriváty
uronových
kyselin
a
zbytky
hexóz.
Vazbou
glykosaminoglykanů s proteiny vznikají takzvané proteoglykany. Jedinečnou
vlastností HA je vysoká schopnost hydratace. Na jednu molekulu HA se může vázat
až 6000 molekul vody. Tímto HA zastává hlavní roli v regulaci rovnováhy tekutin
v intersticiu. Další funkcí HA je adheze buněk a vláken, a mnoho dalších biologických
funkcí včetně transportu rozpuštěných látek a jejich výměny. V extracelulárním
prostředí vytváří molekuly HA síť s různě velkými póry. Tato síť vytváří stavební
oporný prvek tělních tkání a udržuje viskozitu tělních tekutin. Je také významnou
signální molekulou, která ovlivňuje buněčný cyklus, mobilitu, diferenciaci i maturaci.
HA se liší biologickými účinky v závislosti na své molekulové hmotnosti (Chen and
Abatangelo, 1999; Noble, 2002; Reitinger and Lepperdinger, 2013).
Chitosan je netoxický biodegradovatelný přírodní polymer. Může být formován
ve vlákna, která jsou používána pro přípravu „lešení“, které kombinuje odpovídající
porézní strukturu s dostatečnou mechanickou odolností (Raftery et al.).
Algináty jsou sodné, draselné nebo trietanolaminové soli kyseliny algové, která je
obsažena v mořských řasách. V přítomnosti dvoumocných iontů mají schopnost tvořit
gel. Vytvořený gel je stabilní a pouze pomocí chelatačních činidel se může znovu
změnit v sol (Bogun et al., 2013).
7
Matrigel je komerčně vyráběný rozpustný extrakt z proteinů bazální membrány
získaných z myšího sarkomu (EHS - Engelbreth–Holm–Swarm sarcom). Matrigel se
uchovává zmražený a při teplotě 37 C tvoří gel, který podporuje buněčnou proliferaci
a diferenciaci (Hughes et al., 2010). Buňky mohou být naneseny na povrch gelu
nebo mohou být vmíchány do roztoku Matrigelu, , čímž je po ztuhnutí dosaženo
rovnoměrného rozložení buněk v celém objemu gelu.
Syntetické materiály
Mezi materiály používané k výrobě „lešení“ řadíme i kovy, sklo, keramiku,
ale především polymery. Polymery jsou používány hlavně proto, že známe jejich
chemické a strukturní vlastnosti a je možné je snadno vyrobit. Jde o zcela syntetické
látky nebo o syntetické deriváty přírodních látek jako např. polymery kyseliny
glykolové (PGA, poly glycolic acid) a kyseliny mléčné (PLA, poly lactic acid) nebo
jejich kopolymery. Hlavní předností polymerních kompozitních materiálů je možnost
volby jednotlivých složek z pohledu jejich skladby a orientace, materiálových,
fyzikálních a chemických charakteristik, kterými je možno dosáhnout širokého
rozsahu mechanických a biologických vlastností (Haycock, 2011).
PGA
byl
jeden
z
prvních
vyrobených
syntetických
polymerů
využitých
pro biomedicínské aplikace. Vykazuje vysokou pevnost v tahu a nízkou rozpustnost
v organických rozpouštědlech. I přes jeho nízkou rozpustnost, může být vyroben
v různých formách a strukturách. Pro svou schopnost tvořit vlákna a pro svou
biologickou rozložitelnost, začal být využíván při výrobě vstřebatelných stehů. V těle
se rozkládá za vzniku glycinu, který je dále přes Krebsův cyklus kompletně biologicky
odbourán (Nair and Laurencin, 2007).
PLA je ve srovnání s PGA pomalu rozložitelný polymer s dobrou pevností v tahu
a přitom vysokou pružností. Proto se stal ideálním biomateriálem pro nosné aplikace,
jako jsou například fixace ortopedických náhrad (Nair and Laurencin, 2007).
8
Obr. 1: Trojrozměrné porézní struktury vytvořené z PLGA (Nair and Laurencin, 2007)
Kopolymer kyseliny glykolové s kyselinou mléčnou (PLGA) je syntetický
materiál, který se v organizmu rozkládá na kyselinu mléčnou a glykolovou, které jsou
fyziologickými meziprodukty metabolismu (Nair and Laurencin, 2007).
Polykaprolakton (PCL) je biokompatibilní a zároveň biodegradabilní polymer,
využitelný v medicíně. Polykaprolakton (PCL) se vyrábí polymerací ε-kaprolaktonu
(CL). Tento polyester je biologicky odbouratelný, může tvořit kopolymery se škroby
či jinými látkami, a to z něj činí velmi zajímavý materiál. Vyrábí se z něj chirurgické
nitě pro vnitřní stehy, nebo nosiče léků, u kterých je potřeba postupné uvolňování
do těla. Také se používá jako kostní náhrada, která se vytiskne 3D tiskárnou na míru
a pokryje vhodnými buňkami. PCL se zvolna odbourává a nová kost roste.
Mechanismus rozkladu in vitro se může lišit od mechanismu rozkladu ve tkáních
(Bogun et al., 2013).
PLA, PGA, PCL a jejich kopolymery jsou často používány pro přípravu nosné
konstrukce „lešení“. Nicméně, jejich hydrofóbnost, kyselost produktů jejich rozkladu,
a rychlá degradace představují možné komplikace při použití zejména při náhradách
namáhaných tkání (Bogun et al., 2013; Nair and Laurencin, 2007).
Polyuretan - je elastický polymer, který je pružný, pevný a odolný. Většina z těchto
polymerů se skládá z lineárních alifatických polyesterů s vysokou molekulovou
hmotností. Tyto materiály mají mechanické vlastnosti, které lze nejlépe využít
pro náhrady tvrdé tkáně. Nicméně i v oblasti tkáňového inženýrství měkkých tkání
jsou žádoucí jako elastické „lešení“ (Guan et al., 2005).
9
Metody přípravy nosičů
Výběr metody přípravy trojrozměrných nosičů závisí na chemické struktuře
materiálu a na požadovaných chemických a fyzikálních vlastnostech. Současnou
strategií je využití nanobiotechnologie. Zde jsou uvedeny některé příklady metod
přípravy 3D nosičů (vychází z Khang, 2012; Tsang and Bhatia, 2004). Příprava
nanovláken je popsána v samostatné kapitole.
Modelování depozicí taveniny. V tomto případě se roztavený materiál vytlačuje
tryskou a ukládá ve vrstvách na povrchu podložky. Výhodou této metody je
nepřítomnost organického rozpouštědla v procesu zhotovení.
3D tisk spočívá v nanesení vrstvy prášku materiálu na povrch matrice a pomocí
tiskové hlavy je proveden přesný postřik pojivem, čímž dojde ke spojení částic.
V další vrstvě se proces opakuje.
Samosestavování je spontánní tvorba 3D struktury, založená na nekovalentních
interakcích. Takovéto schopnosti mají biopolymery jako např. peptidy nebo nukleové
kyseliny.
Lyofilizace, neboli vysoušení mrazem, je proces, při kterém se nejprve daný materiál
zmrazí, a následně snížením tlaku a zvýšením teploty dojde k sublimaci zmrzlé vody,
čímž vznikají v materiálu póry.
10
Obr. 2: Lyofilizací zhotovený nosič z kolagenu (A, B) a nosiče z želatiny (C, D) a z kolagenu (E, F),
zhotovené metodou elektrostatického zvlákňování (URL 1).
Proces loužení soli znamená, že se chemická látka, ze které bude 3D nosič
vytvořen, smísí s krystaly soli vhodné velikosti (např. NaCl). Po ztuhnutí je ponořen
do vody, kde dojde k vyluhování krystalů, což zanechá v materiálu póry. Tento
proces loužení se musí několikrát opakovat, aby byly odstraněny všechny zbytky soli.
Napěnění pomocí plynu a částečné loužení. Směs materiálu a soli se slisuje
a vzniklé disky jsou pak vystaveny vysokým tlakům plynu CO2 po dobu 48 hodin,
aby došlo k nasycení. Následným snížením tlaku plynu na tlak okolního prostředí
dojde k vytvoření termodynamické nestability. To vede k nukleaci a růstu pórů CO2.
Solné částice jsou následně odstraněny vyluhováním.
11
Fotopolymerace využívá světlo k převedení kapalného roztoku materiálu v pevný
hydrogel při fyziologické teplotě a pH. Tento způsob je výhodný pro zhotovení
hydrogelového „lešení“ se současným zapouzdřením buněk nebo biologicky
aktivních látek.
Stereolitografie je fotopolymerizační technika. Světlo z laserového paprsku je
zaměřeno na předem naprogramované oblasti určité vrstvy kapalného polymeru,
což způsobuje tuhnutí v exponovaných místech. Postup se opakuje postupně
ve všech vrstvách (Tsang and Bhatia, 2004).
Obr. 3: Stereolitografie (Tsang and Bhatia, 2004)
Výroba pěny mechanickým mícháním v kombinaci s metodou vytvrzení kapaliny.
Silný roztok chemické látky se míchá dokud nedojde k napěnění. Pak se přidá
12
vhodný roztok, který způsobí ztvrdnutí. Vzniká nosič s póry v místech bublin. Smísí-li
se látka s vodou, lze pro extrakci použít lyofilizaci a vznikají větší póry.
Další možností, jak vytvořit pórovitý materiál vhodný jako nosič pro buňky, je
použít agregace mikrokuliček (microcarrier beads). Buńky zde mohou růst přímo
na povrchu kuliček a využívají také mezer mezi kuličkami pro vytvoření 3D struktury.
Mikrokuličky jsou malé kuličky typicky 100 - 400 um, které jsou vyrobeny z různých
materiálů. Velikost a tvar mikrokuliček ovlivňuje velikost povrchu nosiče vzhledem
k jeho objemu (Clark et al., 1980).
Obr. 4: Růst epitelových buněk linie HTB-30 mezi mikrokuličkami (URL 2).
Příprava hydrogelu síťováním. Kroslinkační činidlo způsobuje, že se vytváří
kovalentní vazby mezi funkčními skupinami výchozího polymeru. Hydrogely mohou
být přírodního nebo syntetického původu, nebo hybridní (z obou typů). Z přírodních
materiálů jsou pro 3D buněčné kultury úspěšně využívány kolagen, škrob, želatina,
chondroitin sulfát, kyselina hyaluronová a kolagen-glykosaminoglykany. Hydrogely
jsou vyráběny i ze syntetických polymerů, jako je PGA, PLA a jejich směsi PLGA.
Hydrogely dokážou ve svojí struktuře držet až 99% tekutiny, např. média, a tím
vytváří vhodné prostředí pro růst buněk (Dutta and Dutta, 2009).
13
Příprava nanovláken
Nanovlákna jsou definována jako vlákna s průměrem menším než 100 nm
(Kreyling et al., 2010). Jednou z jejich důležitých vlastností je velký měrný povrch.
Existuje hned několik postupů, jak lze vyrobit nanovlákna. Mimo velmi užívanou
metodu,
tzv.
elektrostatické
zvlákňování
(anglicky
Electrospinning),
kterým
se budeme věnovat podrobněji, existuje řada dalších metod (shrnuto v Zahrádková
2012 - URL 3):
Dloužení (drawing) znamená tažení z kapek polymeru nebo širšího vlákna, kterým
se vlákna ztenčují a několikanásobně prodlužují. Podobá se procesu zvlákňování
za sucha, který se používá v textilním průmyslu. Může produkovat dlouhá
samostatná vlákna.
Podložková syntéza
(template synthesis)
používá membránu s drobnými
nanorozměrnými póry, pomocí nichž se tvoří nanovlákna nebo nanotrubičky z velké
škály rozdílných materiálů, např. kovů polovodičů, elektricky vodivých polymerů
a uhlíku. Touto metodou však nemohou vznikat samostatná nanovlákna.
Samo-organizování (self assembly) je také zdlouhavý proces, při němž se prvotní
složky samy organizují do požadovaných forem a tvarů s různými funkcemi.
.
14
Elektrostatické zvlákňování (Electrospinning)
Elektrostatické zvlákňování je velmi perspektivní a efektivní způsob přípravy
nanovláken, při kterém z polymerních roztoků nebo tavenin vznikají polymerní vlákna
s průměry od 2 nm do několika mikrometrů. Tento způsob produkce nanovláken je
velice rozšířen pro svou univerzálnost a schopnost trvale produkovat vlákna
v rozsahu nanometrů, což je obtížně dosažitelné jinými standardními technologiemi.
Proces elektrostatického zvlákňování využívá vysoké napětí k vytvoření
elektricky nabitého proudu polymerního roztoku nebo taveniny, přičemž elektroda
vysokého napětí je spojena přímo se zvlákňovanou tekutinou. Díky vysokému
elektrickému napětí mezi špičkou kapiláry a uzemněným kolektorem vzniká tzv.
Taylorův kužel na špičce zvlákňovací trysky. Taylor stanovil, že v elektrickém poli
se kapka v rovnovážném stavu deformuje do kónického tvaru, ze kterého se potom
v důsledku zvyšování elektrického napětí a snižování povrchového napětí roztoku,
tvoří proud roztoku polymeru (Garg and Bowlin, 2011). Proud nabité viskózní
kapaliny, ať už polymerního roztoku nebo taveniny, v elektrostatickém poli zrychluje
a dochází k jeho ztenčování. Cestou k uzemněné elektrodě se odpařuje rozpouštědlo
a tvoří se nabité submikronové vlákno, které se následně usazuje na povrchu
materiálu umístěného před uzemněnou elektrodou. Vznikající vlákna tuhnoucí buď
odpařením rozpouštědla nebo chladnutím taveniny se vlivem elektrostatických sil
zachycují na povrchu kolektoru a vytvoří vlákennou vrstvu. Polymerní kapaliny jsou
viskóznější a elastické síly stabilizují proud, což dovoluje formaci nabitých vláken
malého průměru, která ztuhnou a uloží se na kolektoru ve formě netkané textilie
(Růžičková, 2012; Deitzel et al., 2001).
15
Obr.5: Princip elektrostatického zvlákňování a elektrostatického rozprašování (Deitzel et al., 2001).
K elektrostatickému zvlákňování je možné použít různé polymery, jak přírodní,
např. kolagen, želatina, chitosan a kyselina hyaluronová, tak i syntetické jako PLA,
PCA, polyethylenoxid nebo PLGA. Je možné je použít pro výrobu nosiče buněk
pro regeneraci tkání nebo pro aplikaci léčiva.
Další
podobné
metody
přípravy
nanomateriálů
jsou
„electroblowing“
a „electrospraying“. „Eletroblowing“ je vzduchem asistovaný „elektrospinning“, kdy
je kolem elektrody vháněn ohřátý vzduch, což vede k překonání obtíží při vysoké
viskozitě polymeru (např. HA) (Um et al., 2004). Při „electrosprayingu“, neboli
elektrickém rozprašování, se kapalinový proud rozbije do kapiček následkem
povrchového napětí a kvůli nízké viskozitě použité kapaliny tak nevznikají vlákna,
ale jednotlivé částice (Deitzel et al., 2001; Zamani et al., 2013). „Electrospraying“ je
slibnou metodu pro přípravu mikro- a nanočástic vhodných jako nosič léků. Použití
techniky „electrospraying“ mohou být překonány nevýhody spojené s běžnými
způsoby produkce částic (Zamani et al., 2013).
16
Obr. 6: Schéma „electroblowingu“ (Um et al., 2004).
Nanovlákna mohou vykazovat jednoosé či víceosé uspořádání. Z nanovláken
1000x tenčích než lidský vlas tak mohou být tvořeny celé struktury, které mohou být
osety buňkami a sloužit jako náhrada tkáně. Podobně jako ostatní nosiče mohou
ve své struktuře nést aktivní látky. Aktivní látky mohou být do nanovláken začleněny
dvěma různými principy. Prvním z nich je elektrostatické zvlákňování polymerních
roztoků s rozpuštěnou aktivní látkou a druhým je zvlákňování polymerních roztoků
s nerozpustnými částicemi ve formě jemné disperze. Do vláken je možné
inkorporovat jak hydrofobní (např. rifampin, paclitaxel), tak hydrofilní látky (např.
tetracyklin hydrochlorid, doxorubicin hydrochlorid) a biomakromolekuly, jako jsou
proteiny a DNA (Zamani et al., 2013). Regulace uvolňování antibiotik (gentamicin,
chlorhexidin) nebo jiných antimikrobiálních látek, jako jsou stříbrné ionty, porfiríny
nebo chiniofon, je důležitá při léčbě a souvisí se způsobem začlenění aditiv
do struktury nanovláken a samozřejmě i s jejich rozpustností (Růžičková et al., 2012).
17
Obr. 7: Různé struktury nanovláken z PLA (Xie et al., 2008).
18
4SPIN
Společnost Contipro představila v rámci workshopu přístroj 4SPIN, který
umožňuje přípravu nanovláken (URL 4). Tímto zařízením je možné zjednodušit
výrobu nanovlákenných materiálů pro medicínu a výzkum. Přístroj 4SPIN je lehce
ovladatelný, je do něj snadný přístup, je bezpečný a dobře se udržuje a čistí.
Obsluhu přístroje tak s přehledem zvládnou i studenti. Díky uzavřenému dávkování
se významně spoří drahé roztoky určené pro výrobu nanovláken. Podle toho, jaký
materiál je třeba připravit, lze kombinovat různé trysky, sběrné elektrody a procesní
podmínky. Na přístroji
lze nanomateriály tvořit metodami „electrospinningu“,
„electroblowingu“ a „elektrosprayingu“. Těmito metodami je možné zpracovávat
všechny běžné syntetické polymery a také přírodní polymery využívané pro výrobu
nanovláken. Přístrojem 4SPIN je tak možné zpracovávat např. kyselinu hyaluronovou
(HA), polykaprolakton, polyethylen oxid, polylaktid, polyuretan nebo polyvinylalkohol.
Navíc lze ovlivňovat uspořádání vlákenných vrstev a vytvářet i pravidelné 3D
vlákenné struktury.
Základní sestavu pro tvorbu nanovláken tvoří zdroj vysokého napětí,
zvlákňující tryska a uzemněný kolektor. V klasickém uspořádání elektrostatického
zvlákňování, se nanovlákna ukládají na kolektor v náhodném směru. Pro některé
aplikace je však vhodnější uspořádaná struktura. Uspořádání nanovláken může být
regulováno typem kolektoru. Různé typy kolektorů mohou být použity pro generování
nanovlákenných vrstev s různým stupněm organizace. Prostřednictvím použití
různých kombinací elektrod, lze ovlivňovat výslednou morfologii a rozměry
nanovlákenné vrstvy.
Tvorbu a strukturu nanovláken ovlivňuje několik dalších parametrů týkajících
se roztoku materiálu, vlastního procesu tvorby a okolních podmínek. Co se týče
roztoku materiálu, má významný vliv jeho viskozita, koncentrace, molekulová
hmotnost, vlastnosti rozpouštědla, povrchové napětí a vodivost. Mezi procesní
parametry, které ovlivňují tvorbu nanovláken, patří přiváděné napětí, vzdálenost
elektrody od kolektoru, rychlost průtoku a kapilární geometrie. V neposlední řadě tyto
procesy ovlivňuje teplota a relativní vlhkost okolního prostředí.
19
Obr. 8: Contipro 4SPIN C4S Lab 1 je stolní laboratorní zařízení používané při výrobě nanovláken a
nanovlákenných vrstev z roztoků syntetických a přírodních polymerů. Jedná se o vysoce modulární
zařízení. Vybrané parametry procesu jsou kompletně řízeny centrálním řídícím systémem s intuitivním
ovládáním pomocí dotykového displeje (URL 4).
Funkční charakteristika 4SPIN
- Nastavení vysokého napětí do 60 kV
- Automatická konfigurace vzdálenosti kolektoru
- Automatické vybití zbytkového náboje
- Regulace rychlosti proudění a ohřívání vzduchu - "electroblowing"
20
- Monitoring stavu v průběhu procesu výroby nanovláken
- Snadné intuitivní ovládání s možností ukládání dat na PC
- Integrovaný dávkovací systém s možností vkládání stříkačky s různými objemy
roztoku (10, 20 a 30 ml)
- Přesné nastavení rotační rychlosti kolektorů ovlivňující uspořádání nanovlákenné
struktury
Funkce, jako je například elektronicky řízený zámek dveří a mechanismus
automatického
vybíjení
zbytkového
náboje
na
elektrodách,
jsou
zárukou
bezpečnosti.
Přístroj 4SPIN má čtyři odlišné typy trysek a čtyři typy kolektorových jednotek.
Trysky jsou připojeny ke zdroji vysokého napětí a k podávacímu mechanismu, který
obsahuje směs pro spřádání. Většina trysek je navíc doprovázena vzduchovody
přivádějícími vzduch s řízenou rychlostí a teplotou do oblasti těsně kolem hrdla
trysky.
Trysky 4SPIN jsou navrženy tak, aby měly čtyři základní funkce potřebné
pro výrobu nanovlákenných struktur:
- Vedení vysokého napětí
- Kontinuální dávkování zvlákňovací směsi
- Přirozené formování zvlákňovací směsi do malých kapek
- Proudění vzduchu v blízkosti kapek (electroblowing)
Obr. 9: Různé typy trysek přístroje 4SPIN (URL 4).
21
Kolektory (sběrače) jsou vodivé elektrody, na nichž se postupně ve vrstvách
ukládají tuhnoucí letící vlákna, čímž vzniká nanovlákenný materiál. Různé typy
kolektorů mohou být použity k vytváření jednak velkých plochých náhodně
strukturovaných vzorků, ale i vzorků s přesnou jednoosou nebo víceosou
uspořádanou strukturou. Díky tomu, že je zařízení modulární, mohou být tyto
elektrody použity v libovolné kombinaci, mohou být rychle vyměněny a snadno
se udržují. Jediný ústřední řídící systém je zárukou stabilních provozních podmínek,
což znamená stejných vlastností materiálu při opakované výrobě nanovláken.
Design kolektoru je vždy přizpůsoben požadavku na produkt, pokud jde
o velikost a vnitřní morfologii nanomateriálů. Další významné vlivy na materiálové
vlastnosti (průměr vláken, mechanické vlastnosti, velikost vzorku, atd.) má
vzdálenost mezi oběma elektrodami, vysoké napětí, klimatické podmínky, atd.
Systém kolektorů nabízených jako vybavení 4Spin umožňuje přípravu malých
i velkých plochých materiálů, jak náhodné tak přesně definované struktury.
Obr. 10: Různé typy kolektorů přístroje 4SPIN (URL 4).
Tyto
další
parametry
výrazně
rozšiřují
možnosti
využití
přístroje
pro experimenty a hrají významnou roli při vytváření a formování vláken, jakož
i dosažení požadovaných morfologických parametrů připravovaných materiálů.
22
Aplikace nanovlákenných materiálů v medicíně
Nanovlákna poskytují spojení mezi nano- a makrosvětem, protože jejich
průměry jsou v řádu nanometrů, zatímco jejich délky mohou být až stovky metrů.
Materiály formované do nanovláken pomocí „electrospinningu“ jsou využívány
zejména pro biomedicínské aplikace. Biomedicína představuje dvě třetiny aplikací
nanovláken, filtrace zahrnuje šestinu a zbytek je rozdělen mezi další aplikace
(ochranný oděv, optické elektroniky, atd.). Hlavní užití nanovláken v biomedicíně
se týká tkáňového inženýrství, cíleného transportu léčiv nebo aplikace hojivých
obvazů.
Ve srovnání s většinou materiálů povrch nanovláken umožňuje mnohem větší
adhezi buněk, proteinů a léků. Elektrostatické zvlákňování poskytuje příležitost
pro přímé
zapouzdření
drog
do
nanovláken.
Léčiva
inkorporovaná
do nanovlákenných fólií mohou být aplikována lokálně k hojení ran nebo jako
pooperační
implantát
s
antibiotiky,
protiplísňovými,
antimikrobiálními
a protinádorovými léčivy. Zejména cílená doprava protinádorových léčiv a jejich
řízené uvolňování pouze v nádorových buňkách, je téma, které by mohlo významně
profitovat z využití polymerních nanovlákenných struktur, a proto je v současné době
středem pozornosti mnoha vědeckých skupin.
K dnešnímu dni byla nanovlákna se začleněnými léčivy použita hlavně
k lokálním aplikacím, ačkoliv už byla nanovlákna použita i perorálně (Zamani et al.,
2013).
Nanovlákenné
materiály
z polyvinylacetátu
(PVA)
se
začleněným
ciprofloxacinem byly použity jako obvazy na rány, a bylo prokázáno, že právě
nanovlákna z PVA snížila rychlost uvolňování léčiva a prodloužila dobu jejich
působení (Zamani et al., 2013).
Nanovlákna mohou také poskytovat trojrozměrné porézní biokompatibilní
prostředí, tzv. „lešení“, či „scaffold“ pro růst buněk. Byl vytvořen in vitro model
pro studium toxicity, který využívá kultivace hepatocytů na „lešení“ z nanovláken.
Při pokusech s tímto modelem bylo dosaženo korelace s pokusy in vivo (Bierwolf et
al., 2011).
23
3D „lešení“ je možné použít pro dlouhodobé kultivace buněk epiteliálních
(Choe et al., 2006), nervových (Ma et al., 2004), hladkých svalových (Kim et al.,
1999), osteoblastů (Bancroft et al., 2002) a nebo třeba buněk kmenových (Levenberg
et al., 2003). Na konstrukci z nanovláken, vyrobené elektrostatickým zvlákňováním
PCL mohou proliferovat a diferencovat i kmenové buňky vlasového váčku (Hejazian
et al., 2012).
Obr. 11: Snímek rastrovacího elektronového mikroskopu. Kmenová buňka vlasového váčku sedící na
„lešení“ z PCL nanovláken (Hejazian et al., 2012).
3D systémy nanovlákenných materiálů jsou využitelné také pro tkáňové
terapie, kde implantovaný 3D materiál vyplní prostor vzniklý degradací poškozené
tkáně a poskytne vneseným buňkám prostředí vhodné pro jejich růst a začlenění
do tkáně. Polyestery, jako je PGA, PLA, PCL nebo polyhydroxybutyrát, a jejich
kopolymery byly použity jako nanovlákenné konstrukce pro inženýrství nervové tkáně
(Cao et al., 2009; Patel et al., 2007). Tato „lešení“ s uspořádanými nanovlákny slouží
jako vodítko pro uspořádání neuronů a orientaci jejich neuritů. Neurony kultivované
na uspořádaných nanovláknech mají dlouhé neurity, delší než když jsou kultivované
na neuspořádaných vláknech. Avšak největší prodloužení neuritů bylo pozorováno
na uspořádaných nanovláknech nesoucích ve své struktuře fibroblastový růstový
faktor 2 (FGF2) (Patel et al., 2007). Podobný systém nesoucí proteiny může
významně podpořit obnovení poraněné periferní nervové tkáně (Chew et al., 2007).
Také v oblasti regenerace kostí, chrupavky a dalších tkání se stále více používají
nosiče z nanovláken. Byl vyvinut kompozitní nanovlákenný materiál z PCL, HA
a kolagenu pro růst osteoblastů. PCL zde poskytuje mechanickou stabilitu, zatímco
24
kolagen podporuje buněčnou proliferaci a HA může zlepšit mineralizaci osteoblastů
(shrnuto v Cao et al., 2009).
Závěrem lze snad jen podotknout, že technologie nanovláken patří k jedněm
z nejrychleji se rozvíjejicích oblastí vědy s velice širokým mezioborovým uplatněním,
jak je jistě vidět z několika výše uvedených příkladů. Zdá se, že zanedlouho budou
nanovlákna ve svých různých podobách součástí běžné praxe a stanou
se každodenní oporou i pomocníkem v mnoha oblastech činností člověka.
25
Seznam zkratek
ECM
extracelulární matrix (mimobuněčná hmota)
HA
kyselina hyaluronová
PCL
polykaprolakton
PGA
polymer kyseliny glykolové (polyglykolid)
PLA
polymer kyseliny mléčné (polylaktid)
PLGA
kopolymer kyseliny glykolové a mléčné
PVA
polyvinylacetát
26
Seznam literatury
Bancroft GN, Sikavitsas VI, van den Dolder J, Sheffield TL, Ambrose CG, Jansen JA, Mikos
AG (2002) Fluid flow increases mineralized matrix deposition in 3D perfusion culture
of marrow stromal osteoblasts in a dose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S
A 99(20):12600-5.
Bierwolf J, Lutgehetmann M, Feng K, Erbes J, Deichmann S, Toronyi E, Stieglitz C, Nashan
B, Ma PX, Pollok JM (2011) Primary rat hepatocyte culture on 3D nanofibrous
polymer scaffolds for toxicology and pharmaceutical research. Biotechnol Bioeng
108(1):141-50.
Bogun M, Krucinska I, Kommisarczyk A, Mikolajczyk T, Blazewicz M, Stodolak-Zych E,
Menaszek E, Scislowska-Czarnecka A (2013) Fibrous polymeric composites based
on alginate fibres and fibres made of poly-epsilon-caprolactone and dibutyryl chitin for
use in regenerative medicine. Molecules 18(3):3118-36.
Cao H, Liu T, Chew SY (2009) The application of nanofibrous scaffolds in neural tissue
engineering. Adv Drug Deliv Rev 61(12):1055-64.
Clark J, Hirstenstein H, Gebb C (1980) Critical parameters in the microcarrier culture of
animal cells. Dev Biol Stand 46:117-24.
Deitzel JM, Kleinmeyer J, Harris Dea, Beck Tan NC (2001) The effect of processing
variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer
42(1):261-272.
Dutta RC, Dutta AK (2009) Cell-interactive 3D-scaffold; advances and applications.
Biotechnol Adv 27(4):334-9.
Garg K, Bowlin GL (2011) Electrospinning jets and nanofibrous structures. Biomicrofluidics
5(1):13403.
Guan J, Fujimoto KL, Sacks MS, Wagner WR (2005) Preparation and characterization of
highly porous, biodegradable polyurethane scaffolds for soft tissue applications.
Biomaterials 26(18):3961-71.
Haycock JW (2011) 3D cell culture: a review of current approaches and techniques, in 3D
Cell Culture, pp 1-15. Springer.
Hejazian LB, Esmaeilzade B, Moghanni Ghoroghi F, Moradi F, Hejazian MB, Aslani A,
Bakhtiari M, Soleimani M, Nobakht M (2012) The role of biodegradable engineered
nanofiber scaffolds seeded with hair follicle stem cells for tissue engineering. Iran
Biomed J 16(4):193-201.
Hughes CS, Postovit LM, Lajoie GA (2010) Matrigel: a complex protein mixture required for
optimal growth of cell culture. Proteomics 10(9):1886-1890.
Chen WY, Abatangelo G (1999) Functions of hyaluronan in wound repair. Wound Repair
Regen 7(2):79-89.
27
Chew SY, Mi R, Hoke A, Leong KW (2007) Aligned Protein-Polymer Composite Fibers
Enhance Nerve Regeneration: A Potential Tissue-Engineering Platform. Adv Funct
Mater 17(8):1288-1296.
Choe MM, Tomei AA, Swartz MA (2006) Physiological 3D tissue model of the airway wall
and mucosa. Nat Protoc 1(1):357-62.
Khang G (2012) Handbook of Intelligent Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative
Medicine. CRC Press.
Kim BS, Nikolovski J, Bonadio J, Smiley E, Mooney DJ (1999) Engineered smooth muscle
tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Exp Cell Res 251(2):318-28.
Kreyling WG, Semmler-Behnke M, Chaudhry Q (2010) A complementary definition of
nanomaterial. Nano Today 5(3):165-168.
Levenberg S, Huang NF, Lavik E, Rogers AB, Itskovitz-Eldor J, Langer R (2003)
Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer
scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A 100(22):12741-6.
Lin YM, Zhang A, Rippon HJ, Bismarck A, Bishop AE (2010) Tissue engineering of lung: the
effect of extracellular matrix on the differentiation of embryonic stem cells to
pneumocytes. Tissue Eng Part A 16(5):1515-26.
Ma W, Fitzgerald W, Liu QY, O'Shaughnessy TJ, Maric D, Lin HJ, Alkon DL, Barker JL
(2004) CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in
three-dimensional collagen gels. Exp Neurol 190(2):276-88.
Nair LS, Laurencin CT (2007) Biodegradable polymers as biomaterials. Progress in polymer
science 32(8):762-798.
Noble PW (2002) Hyaluronan and its catabolic products in tissue injury and repair. Matrix
Biol 21(1):25-9.
Page H, Flood P, Reynaud EG (2013) Three-dimensional tissue cultures: current trends and
beyond. Cell Tissue Res 352(1):123-31.
Pankov R, Yamada KM (2002) Fibronectin at a glance. J Cell Sci 115(Pt 20):3861-3.
Patel S, Kurpinski K, Quigley R, Gao H, Hsiao BS, Poo MM, Li S (2007) Bioactive
nanofibers: synergistic effects of nanotopography and chemical signaling on cell
guidance. Nano Lett 7(7):2122-8.
Raftery R, O'Brien FJ, Cryan SA (2013) Chitosan for gene delivery and orthopedic tissue
engineering applications. Molecules 18(5):5611-47.
Reitinger S, Lepperdinger G (2013) Hyaluronan, a ready choice to fuel regeneration: a minireview. Gerontology 59(1):71-6.
Ricard-Blum S (2011) The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol 3(1):a004978.
Růžičková J, Pokorný M, Suková L, Novák J, Řebíček J, Velebný V (2012)
Comparative study of needleless and multijet technologies of nanofiber production,
23. – 25. 10. 2012, Nanocon, Brno.
28
http://www.nanocon.eu/files/proceedings/04/reports/665.pdf
Sasaki T, Fassler R, Hohenester E (2004) Laminin: the crux of basement membrane
assembly. J Cell Biol 164(7):959-63.
Tanzer ML (2006) Current concepts of extracellular matrix. J Orthop Sci 11(3):326-31.
Tsang VL, Bhatia SN (2004) Three-dimensional tissue fabrication. Adv Drug Deliv Rev
56(11):1635-47.
Um IC, Fang D, Hsiao BS, Okamoto A, Chu B (2004) Electro-spinning and electro-blowing of
hyaluronic acid. Biomacromolecules 5(4):1428-36.
Wintermantel E, Mayer J, Blum J, Eckert KL, LĂĽscher P, Mathey M (1996) Tissue
engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials 17(2):83-91.
Xie J, Li X, Xia Y (2008) Putting Electrospun Nanofibers to Work for Biomedical Research.
Macromol Rapid Commun 29(22):1775-1792.
Zamani M, Prabhakaran MP, Ramakrishna S (2013) Advances in drug delivery via
electrospun and electrosprayed nanomaterials. Int J Nanomedicine 8:2997-3017.
Internetové zdroje
URL1: http://www.ecr6.ohio-state.edu/mse/faculty/powell/
URL 2 http://www.forschung3r.ch/fr/projects/pr_97_05.html
URL 3 http://www1.fs.cvut.cz/stretech/2012/sbornik/31.pdf
URL 4 http://www.4spin.info/
29