N - Sigma
Transkript
GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik GC 2 Kapilární kolony • 19. – 23.5. 1958 Sympozium v Amsterodamu • M.J.E. Golay • 2 chromatogramy dělení všech uhlovodíků C6 do 9 min., 45,7 m, ID. 0,25 µm, 50 000 teor. pater, 0,5 ml/min • McWilliam – FID detektor • D.H.Desty (BP) – první chromatograf pro kapilární kolony a FID • dříve skleněné nebo z nerezové oceli • dnes výhradně křemenné s polyimidem • kapilára (5-150m) • vnější stěna je pokryta polyimidovým filmem • na vnitřní stěnu je navázána stacionární fáze • kolona je charakterizována následujícími parametry – typem fáze – délkou kolony (5-150m) – ID (vnitřní průměr) (0.10-0.75mm) – tloušťka fáze df (0.10-7.0µm) 3 Kapacita kapilárních kolon Kategorie Vnitřní průměr Kapacita Megabore 0,53 mm 100–250 ng Wide bore 0,32 mm 50–125 ng Narrow bore 0,25 mm 50–100 ng Microbore 0,18–0,20 mm 25–50 ng Pro šířku filmu 0,25 µ Zdroj: D. Rood: A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting of Capillary Gas Chromatography Systems, 3rd Edition, Wiley, 1999 4 Rychlost GC separace Typ GC analýzy Doba separace w1/2 píku Konvenční >10 min >1 s Rychlá 1–10 min 200–1000 ms Velmi rychlá 0,1–1 min 30–200 ms Ultra-rychlá <0,1 min 5–30 ms Zdroj: K. Maštovká, S.J. Lehotay (2003) J. Chromatogr. A 1000, 153–180 5 Srovnávací tabulka Column ID Sample Capacity (ng) He flow@20cm/sec. H2 flow@40cm/sec. Theoretical Plates/m Effective Plates/m 0.10mm 0.18mm 0.25mm 0.25m 0.32mm 0.32m 0.53mm 0.53m 5-10 10-20 50-100 0.1cc/ min. 0.2cc/ min. 8600 0.3cc/ min. 0.6cc/ min. 5300 0.7cc/ min. 1.4cc/ min. 3300 m m 4001000500 2000 1.0cc/ 2.6cc/m min. in. 2.0cc/ 5.2cc/m min. in. 2700 1600 6700 3900 2500 2100 1200 6 uV 90e3 80e3 C O N V. 70e3 72 min 60e3 50e3 40e3 9 10 30e3 20e3 1112 10e3 0e3 31.40 6.7 uV 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 38.55 8.3 min 90e3 80e3 F A S T 16 min 70e3 60e3 50e3 40e3 30e3 20e3 10e3 0e3 6.65 6.7 uV 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.35 8.3 min 375000 350000 325000 300000 2.3 min 275000 250000 225000 200000 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0 1.225 1.250 1.275 1.300 1.325 1.350 1.375 1.400 1.425 min U L T R A F A S 7 T Aplikace v plynové chromatografii 1. Petrochemie – 2. Biochemie, farmacie, soudní chemie – 3. pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy Sledování ovzduší – 6. FAME, barviva a vůně, pesticidy,…. Životní prostředí – 5. FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště Potraviny a nápoje – 4. plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí Chemie – kontrola jednotlivých kroků syntéz 8 SUPELCO 9 Typy fází • nevázané • SP-... (Supelco Phase), SE-30, SE-54, DEX) • vázané SPB - Supelco Phase Bonded Equity 1, 5, 1710 SLB- 5ms- Supelco Low Bleed SUPELCOWAX 10 – Polyethyleneglykol – tepelně stabilní do 280°C • SLB-IL • • • • 10 Stacionární fáze Nepolární Chirální Polární Cyklodextrinové deriváty 100 % dimethylpolysiloxan (5 %-fenyl)methylpolysiloxan (50 %-fenyl)methylpolysiloxan Polyethylenglykol (70 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan (100 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan 11 Ox yg of a en co nt lc and ohol s ai ni ng , k l ac a ton etone nalyt es ; es s , Al i p a in t hal h oge cids, hat al d e f or m ic a and nat e n e h s d dc om ydes, rac ome a arom em p a r oun ate oma tic a ds tic min s es t es ; Lac e rs ; a to pol l i pha epo nes a a tic r xid es ; nd ar o sty m Am ren atic i no a eo x i de m i nes ac i d ; s; a Al i p min h es ; ena atic, o fura ntio le m e f eni c ns , r s and T er ar o pen ma es tic and He tero t er t i ar y cyc lic a am Xy l i ne m in ene s e s, phe s nol m ent ena s, su hols , ntio b me stitute cresol r d s ben s, sub Ac i ds, z en s a es, tituted eth er s l c oho e pox ket , halo ls, am i de one h i n y e d s s, ro terp , ene positio carbo diols , n s, t n erp al iso s, hy esters d i ne m er s r oc a , ol s r , si me lan bons, t ha es , mp het am i ne Supelco chirální kapilární GC By Chemistry CHIRALDEX TA CHIRALDEX DP CHIRALDEX PN CHIRALDEX BP CHIRALDEX DM Supelco DEX 325 Supelco DEX 225 CHIRALDEX Bonded B-PM CHIRALDEX PM Supelco DEX 120 Supelco DEX 110 CHIRALDEX DA CHIRALDEX PH By Cyclodextrin alpha-Cyclodextrin beta-Cyclodextrin gamma-Cyclodextrin X X X X X X X X X X X X X X X X 12 13 SUPELCO kolony pro analýzy životního prostředí, ovzduší • 1984 - SPB-608 • nízké koncentrace pesticidů a herbicidů, ECD (US EPA 508, 608, 8080, 8081) • 1985 - SP-2331 • polární kyanosilikonová fáze - dioxiny • 1986 – VOCOL • těkavé organické látky (US EPA 502.2, 524.2, 624, 8240, 8260, 8021) • 1987 - Sup-Herb • herbicidy dle US EPA metody 507 • 1995 SPB-624 • těkavé halogenované, nehalogenované a aromatické kontaminanty z vody – vyhovuje řadě US EPA metod • 1997 - SPB-HAP • nebezpečné látky znečišťující ovzduší • 2003 - Equity 1, 5, 1710 14 SLB- 5ms • SLB- 5ms je určena pro stopové analýzy • Vývoj byl zaměřen na • nový způsob deaktivace povrchu křemenné kapiláry • nový typ polymeru • Stabilní, nedochází k úniku stacionární fáze • čistá MS spektra • lepší poměr signál/šum • nižší kontaminace MS detektoru 15 Únik stacionární fáze Tradiční kolona - 5% fenyl Me O Si O Si Me 5% 95 % n Eliminace cyklotrisiloxanu (D3) za vysokých teplot nebo v katalytickém prostředí. Další je eliminace oktametylcyklotetrasiloxan (D4). Si O Si Si O Si O Si O O + Si O Si Si O O D3 Si Si 16 MS Spectrum - únik stacionární fáze Abundance Scan 4970 (24.623 min): 0715011.D 207 6500 6000 D3 5500 5000 4500 4000 3500 3000 D4 2500 2000 1500 73 281 1000 500 147 44 96 115 177 249 225 0 40 60 429 341 323 303 363 384 407 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 m/z--> 17 Únik stacionární fáze Silphenylene-Siloxane Copolymer O Me Me Si Si Me Me Me O Si Me x n poly{poly[oxy(dimethylsilandiyl]oxy(dimethylsilandiyl) (1,4-fenylen)(dimethylsilandiyl)} 18 SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 19 SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 20 SUPELCO kolony pro petrochemické aplikace Analýzy uhlovodíků Petrocol Petrocol Petrocol Petrocol DH 50.2 DH DH150 DH Octyl Analýzy permanentních plynů, lehkých uhlovodíků atd. SIMDIS Carboxen-1006 PLOT Petrocol 2887 Carboxen 1010 PLOT Petrocol EX2887 Mol Sieve 5A PLOT SGE HT-5 Supel-Q PLOT SPB-1 Sulfur Analýzy aromátů TCEP Misc. SCOT 21 PLOT kolony - charakteristika Carboxen 1006 Carbon Mole Sieve Carboxen 1010 (7A) Carbon Mole Sieve Mol Sieve 5A Zeolite Supel-Q Porus Polymer Alumina sulfate deaktivated Na 2SO4 Alumina Chloride deaktivated KCl 715 m2/g Sférické Permanentní plyny 675 m2/g Sférické Permanentní plyny 325 m2/g Nepravidelné Permanentní plyny 705 m2/g Sférické Těkavé a středně těkavé látky C1-C12 Uhlovodíky 250-350 m2/g Nepravidelné 250-350 m2/g Nepravidelné C1-C12 Uhlovodíky, Freony 22 PLOT Alumina Sulfate a Chloride Separace uhlovodíků C1 a C4. Kombinace upraveného povrchu a porózity umožňuje separaci methanu od C2 uhlovodíků, acetylen po n-butanu, separuje se n-penten a 1,3 butadien. PLOT Alumina Chloride je méně polární. separují se na ní např. i freony. 4 2 3 56 78 12 11 15 1314 16 17 1 0 4 2 10 20 30 Time (min) 78 3 56 9 10 11 12 13 14 1516 18 17 1 0 18 9 10 10 20 Sulfate Peak List (top) 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. n-butane 9. propadiene 10. acetylene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. 1,3-butadiene 18. propyne Chloride Peak List 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. acetylene 9. n-butane 10. propadiene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. propyne 18. 1,3-butadiene 30 Time (min) 18 analytů / 35°C (2.5 min.)-> 5°C/min.->150°C 23 Analýzy FAME • Biochemie • Analýza potravin • Bionafta 24 SUPELCO kolony pro FAME • kapilání • • • • • • 1983 - SP-2560 1987 - SP-2380 1990 - Omegawax 320 1991 - Omegawax 250 1995 - SPB-PUFA 2007 - Omegawax 100 25 GC Analysis of Plasma FAMEs on the SUPELCOWAX™ 10 10 m × 0.10 mm I.D., 0.10 µm 26 Omega 3 a 6 mastné kyseliny • Analýzy obsahu trans a Omega 3 a 6 mastných kyselin v potravinách se staly velice populární od té doby, kdy se obsah tzv. zdravých tuků musí uvádět na obalech potravin. • Rostoucí spotřeba Omega 3 mastných kyselin je spojována se snižováním nebezpečí nemoci věnčitých tepen a zároveň se vyzdvihuje jejich význam při vývoji dětského mozku. • Analýzy jsou dlány podle AOAC Metody 991.39 nebo AOCS Metody Ce 1i-07 na 30 metrové koloně Supelcowax™ 10 nebo Omegawax™ za 30 až 40 minut. • Nová kolona Omegawax™ 100 µm ID kapilární kolona tento čas významně zkracuje. 27 FAMEs • Mastné kyseliny se dělí GC, a to jako methylestery (FAME) • Je třeba je derivatizovat. • Volba vhodné kolony bude záviset na předpokládaných analytech. • Nepolární kolony se používají pro separace nasycených a nenasycených mastných kyselin. • Kolony na bázi polyethyleneglycolů zase dělí podle délky uhlíkového řetězce či podle stupně nenasycenosti kyselin. • Pokud dělíme cis/trans izomery mastných kyselin včetně jejich polohových izomerů, tak většinou používáme vysoce polární kyanosilikonovou fázi. 28 Omezení klasických metod 16:0 18:2 18:1 18:0 18:3 20 30 Tuk extrahovaný z margarinu 40 Time (min) 13t 6c 10t 6t 9t 11t 12t 7c 35.0 9c 10c 11c 50 Překryv píků 18:1 trans a cis isomerů 12c 13c 36.0 37.0 Time (min) 38.0 29 SPE Discovery Ag-Ion Supelco • Stabilní stříbrná SPE fáze • Při použití běžných organických rozpouštědel nedochází k uniku stacionární fáze • Stabilní barva • Světlo nemá vliv na Ag-ION sorbent • Dlouhá životnost • Kapacita 750mg SPE tube – až 1 mg celkových FAMEs • Předseparace je vysoce reprodukovatelná 30 Mechanismus interakce • Mastná kyselina – electron donor • Stříbro - electron akceptor O • Cis-mastné kyseliny tvoří pevnější komplex než trans • Čím větší počet dvojných vazeb, tím silnější interakce OCH3 C4H8 SPE Support SO3 Ag+ C11H23 Charge-transfer complex between Ag + and unsaturated bond 31 Discovery Ag-Ion postup 32 Cis/Trans FAME - předseparace 33 Ag-ION SPE metoda pro cis/trans FAME separace 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Kondicionace 4 ml aceton Equilibrace 4 ml hexan Vzorek1 ml (1mg/ml) FAMEs v hexanu, průtok 5mL/min Eluce - frakce 1 6 ml hexan:aceton (96:4 v/v) Eluce - frakce 2 4 ml hexan:aceton (90:10 v/v) Eluce - frakce 3 4 ml aceton Eluce - frakce 4 4 ml aceton:acetonitril (97:3) Odpaření a rozpuštění v hexanu, GC 34 GC separace na SP2560 75m x 0.18 mm ID Použití kratší GC kolony (SP2560, 75 m) a nosný plyn vodík – výrazné zkrácení času analýzy. Pec: Inj.: Det.: Nosný plyn: Nástřik: Liner: 180oC, izotermální 220oC FID, 220oC vodík, 40 cm/sec při 180 oC 0.5 µL, 100:1 split 4 mm ID, split 35 Standardní směs FAMEs Celkový obsah FAMEs je 1 mg/ml Standard Mixture 14:0 6 18:1 18:0 16:0 8 18:2 10 12 14 18:3 16 18 20 Time (min) SPE fraction1 6 18:1 t 8 10 Hexan: Aceton 96:4 12 14 16 18 20 Time (min) 18:1 c SPE fraction 2 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 Time (min) 14.0 Hexan: Aceton 90:10 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 Aceton SPE fraction 3 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) SPE fraction 4 Acetonitril 36 6 8 10 12 14 Time (min) 16 18 20 Výsledky analýzy FAMEs (% recovery) Elution 1 2 6 ml Hexan:aceton (96:4) 18:0 100 4 ml Hexan:aceton (90:10) 3 4 ml Aceton 4 4 ml Aceton:acetonitril (97:3) TOTAL 18:1t 18:1c 98.1 0.4 1.90 99.60 18:2tt 18:2 c/t 18:2cc 18:3ttt 100 50 100 100 50 100 100 100 18:3 100 100 100 40 55 100 95 Izomer 18:3ccc lze eluovat 100% ACN 37 Analýza bramborových chipsů • Rozemlít a extrahovat 4 x 4ml petroletheru • Podpařit a rozpustit v toluenu • Esterifikace 7% BF3/MeOH • Po esterifikaci se re-extrahoje do hexanu a vysuší seNa2SO4 • Předseparace Ag-ION SPE 750mg/6 ml 38 Analýza bramborových chipsů 18:1 counts Untreated extract 16:0 14:0 6 8 10 18:0 12 8 10 12 8 counts counts 16 18 20 14 16 18 20 18:1 c SPE Fraction 2 6 14 Time (min) 18:3 18:1 t SPE Fraction 1 6 18:2 10 12 Time (min) 14 16 14 16 18 20 counts SPE Fraction 3 6 8 10 12 Time (min) 18 20 39 Řepkový olej – analýza FAME Řepkový olej je typickým reprezentantem rostlinných olejů. Obsahuje nenasycené, mono a více nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Následující chromatogram ukazuje 6 minutovou analýzu nenasycených cis FAME na koloně Omegawax 100 column. 40 Řepkový olej - FAME, Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D. x 0.10 µm 4 3 1 column: oven: inj: det.: carrier gas: injection: liner: sample: 2.0 1. Myristic (C14:0) 2. Palmitic (C16:0) 3. Stearic (C18:0) 5. Linoleic (C18:2n6c) 6. Linolenic (C18:3n3) 7. Arachidic (C20:0) 8. cis-11-Eicosenoic (C20:1) 9. Behenic (C22:0) 10. Erucic (C22:1n9) 11. Lignoceric (C24:0) 6 2 1.0 5 10 7 9 11 8 3.0 Time (min) 4.0 5.0 Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D., 0.10 µm 140 °C, 40 °C/min. to 260 °C (2 min.) 250 °C FID, 260 °C H2, 55 cm/sec., constant 0.2 µL, 200:1 split 4 mm I.D., cup split Rapeseed Oil FAME Mix 6.0 41 42 EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax 43 EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax 44 45 GC kolony s fází na bázi iontových kapalin aniont CF3 O=S=O NO=S=O anion CF3 cation N + N linkage cation N + N CF3 O=S=O NO=S=O CF3 1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380°C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 46 Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita -Octyl -1 -5 -20 -1701 -35 -50 280°C 350°C 360°C 300°C 280°C 300°C 310°C NonPolar 0 Intermediate Polar 25 -225 PAG PEG 240°C 220°C 280°C -2330 -2331 -2560 250°C 275°C 250°C Polar TCEP 145°C Highly Polar 50 75 SLB-IL59 300°C SLB-IL76 SLB-IL82 270°C 270°C Extremely Polar 100 SLB-IL100 SLB-IL111 230°C 270°C 47 sigma-aldrich.com/il-gc Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). •Prof. Luigi Mondello (University of Messina, Italy) sigma-aldrich.com/il-gc 48 První publikace v 2010 49 SP-2560- 100 metrů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 50 SLB-IL111- 100 meterů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 51 Omezení konvenční 1D-GC • Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků… • Složky aroma (např. aroma kávy: 600–700 sloučenin) • Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy) • Chybná / nemožná identifikace analytů • Nadhodnocení / podhodnocení výsledků • Řešení • „Nové“ detekční techniky • Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC) 52 Kompletní dvourozměrná GC (GC×GC) Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem Injektor Modulátor Detektor Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m × 0,10 mm × 0,10 µm) 53 KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC • Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony • Kryogenicky zaostřené části jsou přeneseny na 2. kolonu • Rychlá separace na 2. koloně Modulace (kryogenní zaostření) Efluent z 1. kolony Efluent z 2. kolony 54 TVORBA GC× ×GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony) MODULACE Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE 2D chromatogramy naskládané vedle sebe VIZUALIZACE Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu 55 VÝHODY GC× ×GC vs. 1D-GC • Zvýšení kapacity píků • Zlepšení detekce • Tvorba strukturovaných chromatogramů 56 VÝHODY GC× ×GC vs. 1D-GC • Zvýšení kapacity píků (nc) • Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) → zvýšení separační účinnosti 1. Dimenze 2. Dimenze Konvenční kapilární kolona n = 1 000 nc(celk) = nc(kolona 1) × nc(kolona 2) GC× ×GC (kolona druhé dimenze: n = 25) n = 1 000 × 25 = 25 000 57 Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu 1D-GC Dichlorvos 0,01 mg/kg v přečištěném extraktu jablek Interference: m/z 109 (kvantifikace) m/z 79 (identifikace) BEZ SHODY S KNIHOVNOU SPEKTER 58 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186 Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu Dichlorvos spolehlivě identifikován a kvantifikován GC×GC → Výsledek zvýšené kapacity píků 5-hydroxymethyl2-furan-karbaldehyd H it 1 2 3 4 5 N am e P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 d ic h lo r o v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r R e v e rs e CAS 940 6 2 -7 3 -7 729 6 2 -7 3 -7 707 6 2 -7 3 -7 704 6 2 -7 3 -7 700 6 2 -7 3 -7 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186 Separovaný koextrakt 59 Strukturované chromatogramy → Separace podle polarity Specifické interakce • Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách • GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin) Systém: nepolární × polární kolony →Separace podle bodu varu Tlak par (Těkavost) 60 Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME polyethylenglycol Systém: nepolární × polární kolony 5 % fenylmethylpolysiloxan Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289 61 Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME 50 % fenylmethylpolysiloxan Systém: polární × nepolární kolony polyethylenglycol Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289 62 GC doplňky a nářadí 63 HPLC 64 Trendy v současné HPLC • Rychlá chromatografie (UHPLC) – Vysoké rozlišení – Zvýšení separační účinnosti – Snížení meze detekce – Krátký čas separace – Ekonomický provoz – Ekologický provoz 65 Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com 66 Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com 67 Ascentis HPLC kolony • Ascentis™ HPLC kolony jsou 4 generací SUPELCO HPLC kolon • Zahrnují následující typy kolon: • C18, C8, ES-CN, Si, Phenyl, RP-Amide, • Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. • Discovery ® HPLC kolony jsou 3 generací SUPELCO HPLC kolon • Zahrnují následující typy kolon: • C18, HS C18, C8, Cyano, PEG, HS F5 • Discovery® BIO Wide Pore • Discovery® Zr • Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. 68 Klasifikace podle možné chemické interakcea Bonded Hydrophobic Phase H-Bonding Dipolar π-π Stericb Ionicb C18 Very Strong Weak No No No Moderate C8 Strong Weak No No No Weak RPAmide Strong Strong Acceptor Moderate No Weak Very weak Phenyl Strong Weak Acceptor Weak Strong Donor Strong (Rigid) Weak F5 or PFP Moderate Moderate Acceptor Strong Strong Acceptor Strong (Rigid) Moderate Cyano Light to Moderate Weak Acceptor Strong Weak No Moderate a. Using Euerby2 variation of Snyder-Dolan-Carr Hydrophobic Subtraction Model3. b. Steric and Ionic probe data are not very helpful in predicting or interpreting steroid selectivity results; however, they are always underlying factors with silica bonded phases. 69 Discovery® BIO Wide Pore • dokonale sférické, porézní částice • velikost částic 3, 5, 10 µm • velikost pórů 300Å • specifický povrch 100 m2/g • velikost porů je vhodná pro HPLC analýzy proteinů, polypeptidů a oligonucleotidů • Vynikající pro analýzy hydrofobních molekul (MH > 500 Dalton) • pro oblast proteomiky jsou v nabídce kolony • křemenné kapiláry • mikrobore kolony 70 Discovery® BIO Wide Pore • Discovery® BIO C18 • fáze je vhodná pro analýzu peptidů • RP fáze s největší hydrofobicitou • Discovery® BIO C8 • středně hydrofobní fáze • není používaná tak běžně jako C18 a C4 • Discovery® BIO C5 • • • • doporučovaná pro analýzu proteinů a peptidů separační vlastnosti podobné jako u C4 ve srovnání s C4 má vyšší stabilitu vynikající pro LC/MS analýzy - nekrvácí 71 Discovery® BIO PolyMA • ionexy na bázi polymethakrylátových pryskyřic.Hydrofilní povrch eliminuje adsorpci proteinů – Discovery® BIO Poly-SCX je silný katex s chemicky vázanou sulfopropylovou skupinou – Discovery® BIO Poly-WAX je slabý anex s chemicky vázanou diethylaminoethyl skupinou Polymethakrylát, 5µm, 1000Å Iontově výměnná kapacita (oba): 0,3meq/g 72 Discovery® Zr • výhodou nosiče na bázi ZrO2 je chemická a tepelná stabilita • kolony jsou stabilní v celém rozsahu pH 1-14 a při teplotách do 200°C • retenční mechanismus je odlišný od silikagelových kolon (Lewisova teorie kyselin a zásad) • kolony jsou mechanicky stabilní a vysoce účinné • dodávají se čtyři typy fází 73 Fáze Discovery® Zr Zr-PBD Zr-PS Zr-Carbon Zr-CarbonC18 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 74 Fyzikálně chemické vlastnosti oxidu zirkoničitého • Atomy Zr ve strukturní mřížce mají charkter Lewisových kyselin. #1 Zr atomy se chovají vlivem přítomnosti prázdných elektonových orbitalů jako Lewisovy kyseliny (akceptor elektronového páru). -O #2 Lewisovy báze (např. fosforečnany) z mobilní fáze interagují s povrchem stacionární fáze. O P O- NH2+ .. R O- O O Zr O O Zr O O #3 Kladně nabité skupiny, přítomné v molekulách analytů jsou zachycovány na povrchu sorbentu na základě iontově výměnných interakcí. 75 Přehled chirálních stacionárních fází pro HPLC 76 Hamilton • www.sigmaaldrich.com/hamiltoncolumns 77 HPLC kolony vhodné pro separaci cukrů • SUPELCOGEL Ca • SUPELCOGEL C-610H • SUPELCOGEL C-611 • SUPELCOGEL Ag2 • SUPELCOSIL LC-NH2 • apHera™ NH2 • column: apHera NH2, 15 cm × 4.6 mm I.D., 5 µm • mobile phase: 20:80, water:acetonitrile • flow rate: 1.0 mL/min • temp.: 25 °C • detector: ELSD, 45 °C, 3.5 psi nitrogen • injection: 10 µL • sample: 500 µg/mL in 30:70, water: acetonitrile 78 Tosoh Corp. 79 Co je HILIC? • Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. • Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) • Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. • Mobilní fáze je složena z 60 - 95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. • Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla • Typické složení – 70-90% acetonitrilu v 10 mM octanu amonném • Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. • Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. • Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. • Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): 2437-2443). 80 Ascentis Si NP – separace v tucích rozpustných vitamínů 1 4 3 1. alpha tocopherol (100 µg/mL) (E) 2. menadione (150 µg/mL) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/mL) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/mL) (D) 0 2 2 4 6 Time (min) column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µ particles (581512-U) mobile phase: A – Hexane, B – Ethylacetate gradient: time %B 0 10 10 30 12 30 13 10 flow rate: 1.0 mL/min. temp.: 30 °C det.: UV at 290 nm 8 10 12 81 Rychlé HPLC analýzy 82 Chromatografický trojúhelník R S= 1 α −1 k' N ⋅ ⋅ 4 α 1 + k' Účinnost Selektivita Retence Rychlost tr= L (k’+1) u tr = retenční čas • L = délka kolony • k’ = retentenční factor • u = rychlost průtoku mobilní fáze Selektivita Účinnost 83 Rozlišení Účinnost Retence 3.0 Selectivita α 2.5 Faktor účinnosti a) b) c) Rychlost toku MF Délka kolony Průměr zrna, teplota, viskozita Faktor kapacity a) b) c) Množství stacionární fáze v koloně Změna stacionární fáze nebo MF Teplota Faktor selektivity a) b) c) Změna stacionární fáze Změna MF Rychlost toku MF 2.0 Rozlišení (R) N . k´ . α-1 RS= k´+1 α 4 N 1.5 1.0 k 0.5 0.0 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 0 5000 10000 15000 20000 0 5 10 15 20 Zhao, J.H. and P.W. Carr. Analytical Chemistry, 1999. 71(14): p. 2623-2632 1.25 α 25000N 25 k 84 Zkrácení doby analýzy tr = L (k’+1) u tr = retenční čas • L = délka kolony • k’ = retentenční factor • u = rychlost průtoku mobilní fáze Existují tři způsoby zkrácení retenčního času (tr) daného analytu: •Zkrácení délky kolony (L) •Zmenšení hodnoty retenčního factoru (k’), a to: –Změnou stacionární fáze –Zvýšením teploty • Zvýšení průtoku mobilní fáze 85 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 86 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 87 Vliv zkrácení kolony 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital 4 3 2 5 1 3 2 6 4 5 3 2 Discovery™ C18, 5µm particles CH3OH:H2O (45:55) 1mL/min 20°C UV, 214nm 3 2 1 Columns: Mobile Phase: Flow Rate: Temp.: Det.: 4 4 6 1 5 1 5 6 0 0 10 20 0 10 20 30 0 10 20 30 10 20 6 30 30 2cm x 4.6mm ID 5cm x 4.6mm ID 15cm x 4.6mm ID 25cm x 4.6mm ID Time (min) 88 98-0348 Vliv zkrácení kolony 3 Columns: Mobile Phase: Flow Rate: Temp.: Det.: 4 5 2 Discovery C18, 5µm CH3OH:H2O (45:55) 1mL/min 20°C UV, 214nm 6 1 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital 3 2 4 1 5 6 2cm x 4.6mm ID 1.0 2.0 25cm x 4.6mm ID 0 10 20 Time (min) 30 89 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 90 Vliv průtokové rychlosti Columns: Discovery C18 column, 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: CH3OH:H2O (45:55) Flow Rate: see figure Temp.: 25°C Det.: UV, 214nm 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital 1 2 1 1.0 2.0 3 2 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 4mL/min 4 1.0 2.0 3.0 4.0 1.0 2.0 3.0 4.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Time (min) 5.0 6.0 5 7.0 5.0 6.0 7.0 5.0 6.0 7.0 3mL/min 2mL/min 1mL/min 91 Účinnost kolony při různých průtokových rychlostech (porézní částice sorbentu) Flow Rate 1.0mL/min 2.0mL/min 3.0mL/min 4.0mL/min N (Barbital) 1766 1460 1250 997 N (Phenobarbital) 2556 1821 1461 1307 N (Butabarbital) 3169 2215 1766 1506 N (Mephobarbital) 3524 2383 1924 1569 N (Pentobarbital) 3829 2494 2029 1704 N (Secobarbital) 3947 2584 2113 1742 92 98-0357 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 93 Vliv teploty 1 1. Clonazepam 2. Chlorazepate 3. Diazepam Column: Discovery™ RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: ACN:H2O (30:70) Flow Rate: 2.0mL/min Temp.: see figure Det.: UV, 254nm 1 1 2 2 3 3 2 1 3 1.0 2.0 2 3.0 4.0 5.0 6.0 4.0 5.0 6.0 20°C 3 1.0 98-0359 2.0 1.0 2.0 1.0 2.0 3.0 3.0 3.0 Time (min) 4.0 5.0 6.0 4.0 5.0 6.0 30°C 40°C 50°C 94 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 95 Profil gradientu Column: 4 Flow Rate: Temp.: Det.: Elution: 3 1 4 Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles 1mL/min 30°C UV, 220nm 10:90 ACN, 0.1%TFA: H2O, 0.1%TFA gradient to 90:10 ACN, 0.1%TFA:H2O,0.1%TFA 2 1 5 3 1. 1-hydroxy-7-azabenzotriazole 2. 4-methoxybenzene sulfonamide 3. Methyl-3-amino-2-thiophene-carboxylate 4. 4-aminobenzophenone 4 2 1 1 4 3 3 2 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 20%/min gradient 16%/min gradient 2 1.0 1.0 2.0 2.0 10%/min gradient 3.0 4.0 Time (min) 98-0361 5.0 6.0 7.0 6.67%/min gradient 96 Možnosti zrychlení separací •Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče 97 Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com 98 Účinnost versus velikost částic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30°C Injection Vol: 5µ µL Analytes: 1. o-Xylene (0.04mg/mL 2. p-Xylene (0.01mg/mL Nave = 36,000 60 60 60 60 Nave = 18,000 Nave = 12,000 40 40 sub-2µ µm 40 40 Nave = 6,000 3-4µ µm 5µ µm 20 10µ µm 0 2.0 3.0 20 20 20 0 0 0 2.0 3.0 2.0 3.0 2.0 99 3.0 16,000 16,000 35.00 14,000 30.00 12,000 Pressure (psi) HETP (µm) Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace 25.00 20.00 15.00 6,000 5.00 2,000 3 4 5 Mobile Phase Velocity (mm/sec) 1-2 mL/min 8,000 4,000 2 UHPLC 10,000 10.00 1 1.7 µm 3 µm 2 4 6 8 10 12 Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 100 Povrchově porézní částice versus zcela porézní částice: 0.5 µ 2.7 µm Difuzní vrstva 0.75 µ 1.7 µm 101 Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp. Ascentis Express Fused-Coretm specifikace • Sorbent: vysoce čistý silikagel – 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B • • • • • • • Velikost částic: Distribuce velikosti částic: Velikost pórů: Velikost povrchu: pH rozsah: Limitní tlak: Nabídka stacionárních fází • LC-MS: 2.7 µ 2.7 +/- 0.16 µ (6% standardní odchylka*) 90 Å, 160 Å 150 m²/g (220-300 m²/g efektivní) 2 – 9 (minimálně) 600 barů (testováno na UHPLC) C18, peptide ES C18, C8, F5 (RP nebo HILIC), RP-Amide,Phenyl-Hexyl, HILIC (NP nebo HILIC), ES-CN vysoce kompatibilní * Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka. 102 Ascentis Express Fused-Coretm specifikace Ascentis Express Sterically Protected pH range endcapping C18 No 2-9 Yes 90 2.7 C8 No 2-9 Yes 90 2.7 RP-Amide No 2-9 Yes 90 2.7 Phenyl-Hexyl No 2-9 Yes 90 2.7 HILIC No 90 2.7 Peptide ES-C18 Yes 1-8 No 160 2.7 F5 No 2-8 Yes 90 2.7 ES-Cyano Yes 1-8 Yes 90 2.7 Live area for full-page graphic 2-8 No Pore size Angstroms Particle size microns 103 Předkolony • malý mrtvý objem • vhodné pro všechny přístroje • kompatibilní s vysokým tlakem 104 Distribuce částic 105 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem 106 Výhody silikagelových částic s pevným jádrem 107 Zpětný tlak & účinnost a velikost častic Effiiciency 30,000 1 N ∝ dp 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 Particle (µm) 0 bar 0 5 10 400 350 300 250 200 150 100 50 0 15 20 1 P∝ 2 dp 0 5 10 dp (µm) 15 20 psi bar N 1.8 5889 406 27,500 2.5 3089 213 20,000 3 2118 146 16,500 5 769 53 10,000 10 189 13 5,000 15 87 6 3,750 20 44 3 2,500 108 16,000 16,000 35.00 14,000 30.00 12,000 Pressure (psi) HETP (µm) Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace 25.00 20.00 15.00 1.7 µm 1-2 mL/min 10,000 8,000 2.7 µm FC 6,000 3 µm 4,000 10.00 5.00 2.7 µm Ascentis Express 1 2 3 4 5 Mobile Phase Velocity (mm/sec) 2,000 2 4 6 8 10 12 Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 109 Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit 450 400 Pressure drop (bar) 350 Limit tradičních HPLC systemů 35° 60° 300 80° 250 200 N = >30,000 150 100 50 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 Flow rate (mL/min) Experimentá Experimentální lní zavislost celkové celkového zpětn zp tné tného tlaku jako funkce průtokov pr tokové tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, ® 2.7 m Ascentis Express kolony přii různých zných teplotá teplotách. ch. MF: 30:70 voda:acetonitril 110 Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina Převod metod 111 Rychlejší, účinnější a levnější analýza *původní metoda je na koloně 4.6 x 250 mm, 5µ 4.6 x 50 mm, 2.7 µ 1 mL/min 2 µL inj N(5) = 10600 Rs = 1.8 6,9 MPa 3 x 50 mm, 2.7 µ 0.43 mL/min 0.9 µL inj N(5) = 10000 Rs = 1.8 6,6 MPa 2 Time (min) Column: Mobile Phase: Temp: Det: 19x úspora rozpouštědel 2.1 x 50 mm, 2.7 µ 0.21 mL/min 0.4 µL inj N(5) = 8360 Rs = 1.6 6,5 MPa 0 8x úspora rozpouštědel 4 Ascentis Express C18 64:36, water : acetonitrile 35 °C 250 nm Sample 1. Oxazepam 2. Alprazolam 3. Clonazepam 4. N-desmethyldiazepam 5. Diazepam 38x úspora rozpouštědel 112 Vliv zkrácení a zmenšení průměru kolony na úsporu rozpouštědel ID L (mm) (mm) Rs Doba Průtok analýzy mL/ (mL/min) (min) nástřik Kolona µ Úspora Ascentis C18 5 4.6 250 3.3 1 33 33 1x Ascentis Express C18 2.7 4.6 75 3.0 1 6.2 6.2 5x Ascentis Express C18 2.7 3 75 2.5 0.43 6.2 2.7 12x Ascentis Express C18 2.7 2.1 75 2.5 0.21 6.2 1.3 25x Ascentis Express C18 2.7 4.6 50 1.8 1 4.1 4.1 8x Ascentis Express C18 2.7 3 50 1.8 0.43 4.1 1.8 19x Ascentis Express C18 2.7 2.1 50 1.6 0.21 4.1 0.9 38x 113 Ascentis Express Fused Core™ • HPLC kolony s vysokou účinnosti a možnosti rychlé chromatografie jak na běžných systémech tak na systémech UHPLC. • Krátká difúzní dráha analytu v povrchově porézních částicích - užší a vyšší píky než lze dosáhnout na porézních částicích – větší citlivost, vyšší účinnost. • Tvar Deemterovy křivky ukazuje na možnosti měření při vyšších průtokových rychlostech s vysokou účinností. • Zpětný tlak na kolonách s povrchově porézním sorbentem je nižší něž na kolonách s porézními časticemi sub-2µ – odpovídá přibližně 3 µ sorbentům. 114 USP aplikace column: as listed mobile phase: * Phosphate buffer flow rate: 1.5 mL/min temp.: 30 °C det.: UV at 215 nm injection: 5 µL sample: 50 µg/mL in mobile H3C NH OH CH3 H3C O phase CH3 OH •*Phosphate buffer H3C Ibuprofen Pseudoephedrine • Combine 500 mL of potassium phosphate monobasic 500 mg/L in water and 500 mL of acetonitrile • Adjust to pH 3.3 with phosphoric acid 115 Ibuprofen /Pseudoefedrin Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm 1.0 2.0 Time (min) 3.0 phase length Ascentis Express ES-Cyano 10 Discovery Cyano 25 Ascentis Express C18 10 Ascentis ES-Cyano 10 2.0 Time (min) void rt (pseu) rt (ibu) resolution 0.64 0.56 1.87 28.3 2.15 2.27 3.05 6.1 0.55 0.54 3.57 41.4 0.65 0.85 3.11 25.4 2.0 Time (min) 3.0 plates plates/m (ibu) k (ibu) (ibu) 22479 1.9 224790 13066 0.4 52264 21281 5.5 212810 10460 3.8 104600 Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm 1.0 1.0 3.0 1.0 2.0 Time (min) 3.0 116 USP aplikace column: as listed mobile phase: 30:40:30, 20 mM sodium acetate (pH 4):methanol:acetonitrile flow rate: 1.5 mL/min temp.: 30 °C det.: UV at 210 nm injection: 5 µL sample: 50 µg/mL in mobile phase O OH O H3C H N NH CH3 OH Ritalin Methylphenidate Phenylephrine 117 Ritalin /Fenylefrin phase length Ascentis Express ES-Cyano 10 Discovery Cyano 25 Ascentis Express C18 10 Ascentis ES-Cyano 10 plates plates/m void rt (phen) rt (ritalin) resolution (ritalin) k (ritalin) (ritalin) 0.64 0.77 0.92 5.62 15981 0.4 159810 2.15 2.49 2.64 2.05 19007 0.2 76028 0.55 0.55 0.63 3.08 9038 0.1 90380 0.65 1.13 1.46 6.08 9096 1.3 90960 Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm 1.0 2.0 Time (min) 3.0 1.0 2.0 Time (min) 3.0 Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm 1.0 2.0 Time (min) 3.0 1.0 2.0 Time (min) 3.0 118 Problém s nečistotami v mobilní fázi 119 Nečistoty, které na HPLC nejsou detegovatelné mohou být problém na UHPLC LC-MS Ultra CHROMASOLV • Rozpouštěla a aditiva do MF Brand Product Name Description Pack size Fluka 14261 Acetonitrile LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14262 Methanol LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14263 Water LC-MS Ultra CHROMASOLV, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14264 Trifluoroacetic acid LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 99.0% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka 14265 Formic acid LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 98% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka 14266 Ammonium formate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G Fluka 14267 Ammonium acetate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G 120 LC-MS Ultra CHROMASOLV • Rozpouštědla se testují na UHPLC • Gradient UHPLC-UV, shodné vlastnosti mezi výrobními šaržemi • Nízké pozadí a minimum nečistot jako jsou ftaláty a PEG. • Testováno na UHPLC-MS TOF • Testování v obou polaritách • Obaly • Bílé borosilikátové sklo – Minimální výluh alkalických iontů 121 Identifikace nečistot v ESI+ Intens. x104 1.2 LCMS Ultra UVMSpos_RD1_07_3218.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd 1.0 New LC-MS ultra grade 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Intens. x104 Gradient Grade BASF pos_RD1_03_3255.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd 1.2 1.0 0.8 High quality gradient grade 0.6 0.4 0.2 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Time [min] Nežádoucí nečistoty v rozpouštědlech (plastifikátory, PEGy). 122 LC-MS Ultra CHROMASOLV ESI+ ESI- MS test v ESI+ a ESI-; 5ppb reserpinu a 20 ppb digoxinu; velmi nízký šum. 123 Borosilikátové skleněné láhve Intens. LCMS Ultra UVMSneg_RD1_01_3235.d: -MS, 3.0-9.1min #(270-809), -Constant Bkgrnd 800 600 LC MS Ultra (v borosilikátové láhvi) 400 200 325.1941 698.9277 197.9713 451.3073 648.9335 532.9422 792.9043 847.8578 0 800 909.8569 1014.8415 Chrom Gradient Grade UVMSneg_RD1_04_3232.d: -MS, 3.0-9.0min #(270-807), -Constant Bkgrnd 248.9723 Klastry mravenčanu sodného 600 219.9947 Gradient grade quality (v hnědé skleněné láhvi) 400 698.9393 200 384.9540 355.9741 520.9360 325.2004 648.9327 858.8914 906.8939 0 200 400 600 800 983.8583 1035.8551 1000 1200 m/z 124 • C18 • C8 • HILIC (Si) • RP-Amide • Phenyl-Hexyl • Peptide ES C18 • F5 • ES-CN Děkuji za pozornost 125
Podobné dokumenty
Sigma-Aldrich – rozšíření nabídky pro oblast moderní analytické
© 2012 Sigma-Aldrich Co. All rights reserved.
VíceInnofluor Topiramate Assay System
Neobvyklé vzorky s vyšším pozadím než MAX BKG hodnotou pro analýzu bude mít vytištěné „HI“ znamení po „BLK I“ čtení. Opakujte „HI“ slepé vzorky s ředěním popsaném pro vzorky s vysokou koncentrací „...
VíceSynopse přednášek ANC I. LS2005/06
automobilů, přes textil, potraviny až ke spotřební elektronice (např. aktuální problém – stanovení obsahu bromovaných látek, používaných ke snížení hořlavosti spotřební elektroniky) • sledování tox...
Vícedíl2-2628kB
cena Kč (bez DPH) cena Kč (s DPH) Specifikace výrobku 1017 K, 75 mm 1017, 75 mm 1018 K, 150 mm 1018, 150 mm
VíceIzolace inhibitorů P-glykoproteinu z Schisandra chinensis
2011-09-30 02 fr. 18 izolace Schisandra Anežka 1 - 10 ug v 1ml 5004etOH 2011-10-21 ADS frakce izolace Schisandra velká 2011-10-21 02 standard 8 lignanu- zbytek
Více