Příručka

PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE
TROJLÍSTEK - PODPORA VÝUKY
PŘÍRODOPISU, BIOLOGIE, FYZIKY A CHEMIE
ŽÁKŮ VE VĚKU 11 AŽ 15 LET
reg. č.: CZ.1.07/1.1.00/26.0044
PROJEKT JE REALIZOVÁN V RÁMCI OPERAČNÍHO PROGRAMU VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST
A SPOLUFINANCOVÁN Z PROSTŘEDKŮ EVROPSKÉHO SOCIÁLNÍHO FONDU A STÁTNÍHO ROZPOČTU ČR
Obsah
1 Základy optiky ___________________________________________________________ 3
1.1
Optické soustavy _____________________________________________________________ 3
1.1.1
1.1.2
1.2
Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků _____________________________ 3
Lom paprsků ______________________________________________________________________ 5
Zobrazování čočkou a rozptylkou ________________________________________________ 6
1.2.1
1.2.2
1.2.3
Čočka ____________________________________________________________________________ 6
Rozptylka _________________________________________________________________________ 9
Vady optických členů________________________________________________________________ 9
1.3
Lupa ______________________________________________________________________ 10
1.4
Mikroskop _________________________________________________________________ 11
1.4.1
1.4.2
1.4.3
Jak vzniká v mikroskopu obraz _______________________________________________________ 15
Neobvyklé způsoby mikroskopování __________________________________________________ 19
Mikrofotografie ___________________________________________________________________ 20
2 Terénní odběry mikroorganismů ___________________________________________ 26
2.1
Pomůcky ke sběru ___________________________________________________________ 26
2.2
Měření v terénu ____________________________________________________________ 27
2.3
Záznamy o sběru a vzorcích ___________________________________________________ 27
3 Laboratoř______________________________________________________________ 28
3.1
Preparační nástroje a pomůcky ________________________________________________ 28
3.2
Zdroj pokusných organismů ___________________________________________________ 30
3.3
Kultivace __________________________________________________________________ 32
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.4
Metody preparace __________________________________________________________ 34
3.4.1
3.5
Fixovaný materiál, cytologie _________________________________________________________ 34
Studium na živých organismech ________________________________________________ 34
3.5.1
3.5.2
3.5.3
3.6
Okenní kultivace, krátkodobá kultura pro orientační pohled _______________________________ 32
Kultivace na pevných půdách, růst kolonií, výběr kolonií, převod do sbírky ___________________ 32
Experimentální kultivace, jak nasadit pokus, jak zajistit stálou teplotu a intenzitu světla _________ 32
Stanovení životního cyklu ___________________________________________________________ 34
Určení generační doby a růstové křivky ________________________________________________ 35
Studium pohybu __________________________________________________________________ 35
Živná media ________________________________________________________________ 35
3.6.1
3.6.2
Jednoduchá živná media s půdním odvarem ____________________________________________ 35
Jednoduchá plně definovaná kultivační media __________________________________________ 37
4 Závěr _________________________________________________________________ 39
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
1
Příručka pro biologii
Příručka vznikla na základě projektu „Trojlístek – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a
chemie žáků ve věku 11 až 15 let“. Je zaměřena na zvládnutí základů optické mikroskopie a technik
studia mikroorganismů získaných z lokálních zdrojů (řas, sinic, kvasinek, probiotických organismů).
Naše publikace je metodický doplněk k laboratorní výuce. V první části představuje základy optických
soustav a základy mikroskopie. Ve druhé se věnuje práci v laboratoři a popisuje základní techniky
experimentální biologie. Nezapomíná ani na improvizace, které je nutno v minimálních pracovních
podmínkách učinit.
Doufáme, že příručka pro biologii bude platnou pomůckou pro učitele a žákům poodhalí krásu
a tajemno mikroskopie.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
2
1
Základy optiky
Optické pomůcky a přístroje se ve studiu biologie využívají v terénu i při práci v laboratoři. Je jich celá
řada od nejjednodušší lupy až ke složitému přístroji - mikroskopu. Ačkoliv se to na první pohled
nemusí zdát, lupa i mikroskop mají společné optické členy. Pracují totiž na základě zákonů lomu a
odrazu paprsků v prostředí o různých optických vlastnostech. Kdo se specializuje na mikroskopickou
biologii, musí tyto zákony velmi důkladně znát. Stejně tak by měl vědět, jak ošetřovat světelný
mikroskop, jak ho správně seřídit, a poznat jeho rozlišovací meze.
1.1
Optické soustavy
Mikroskop je složité zařízení, které obsahuje několik optických soustav. Optická soustava je složena
alespoň ze dvou optických členů, například spojné čočky a zrcadla. Právě na ty se v této části
zaměříme.
1.1.1
Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků
Odraz paprsků známe například ze zrcadla. U rovinného zrcadla je odraz úplný. To znamená, že
všechny paprsky přicházející na plochu zrcadla se odrážejí ve stejném úhlu, v jakém na něj dopadly.
Známe ale i polopropustná zrcadla. U těch je na základní skleněné desce napařena slabá odrazná
vrstva, od které se část dopadajících paprsků odrazí a část prochází. O tom, v jakém poměru jsou
odražené a procházející paprsky, rozhoduje hustota napařené vrstvičky. Základní schéma variant
odrazu je uvedeno na obrázku 01 a obrázku 02.
zrcadlo
propustné zrcadlo
propustný hranol
Obrázek 01: Odraz paprsků - jak se paprsky odrážejí a jsou propouštěny optickými soustavami.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
3
Paprsek dopadající na zrcadlo v úhlu 45° je odrážen ve stejném úhlu 45°, takže dohromady 90°, což
nám v konkrétním případě umožňuje vidět „za roh“. Totéž platí i o složeném optickém hranolu.
Prakticky se tohoto jevu využívá například při vytyčování pravých úhlů v terénu.
ZDROJ SVĚTLA
výstup 3. hranolu
2. hranol
optická osa
1. hranol
výstup 1. hranolu
3. hranol
výstup 2. hranolu
Obrázek 02: Odrazy a propustnosti možné v optických hranolech.
V mikroskopové technice je někdy užíváno zrcadlo při tak zvaném kritickém způsobu osvětlení,
tedy když není možné použití světelného zdroje. Hranoly jsou užívány zejména v binokulárním
tubusu, popřípadě jako pomocný optický člen při fotografování.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
4
1.1.2
Lom paprsků
Lom paprsků známe například z pohledu do vody, v níž je částečně ponořen pokusný objekt. Zkuste
to. Uvidíte, že se bude zdát kratší, než skutečně je. Lom paprsků je závislý na optické hustotě
prostředí, kterým paprsek prochází. Optická hustota udává množství absorbovaného světla
pohlceného v měřeném vzorku. Vzduch má optickou hustotu jedna, voda ji má vyšší. Při průchodu z
prostředí opticky řidšího do prostředí opticky hustějšího se paprsky lámou v úhlu, který je závislý na
optické hustotě nového prostředí. Schéma je na dalším obrázku 03. Lomu paprsků se běžně využívá v
mikroskopii, kdy pomocí imersní (ponořené) optiky zvyšujeme rozlišovací schopnost optického
systému.
Bílý paprsek, který je složen z barev celého spektra, se lomí tak, že se rozkládá na jednotlivé barevné
složky. Dopadá-li paprsek bílého světla z hustšího prostředí do řidšího, po lomu se rozkládá. Nejméně
se odchyluje od původního směru paprsek červený, nejvíce modrý.
MEZNÍ ÚHEL
ÚPLNÝ ODRAZ
Sklo
Vzduch
LOM
Sklo
Vzduch
Obrázek 03: Lom paprsků – jak se světlo láme při průchodu z opticky hustějšího prostředí do
prostředí opticky řidšího.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
5
1.2
Zobrazování čočkou a rozptylkou
Čočka je optický člen s kladnou optickou mohutností, naopak rozptylka má optickou mohutnost
zápornou. Optická mohutnost je veličina ukazující zakřivení čočky. Rozptylce se lidově říká také
zmenšovací sklíčko a jako optický člen má mnoho funkcí při korekcích optických vad. Nás však budou
více zajímat čočky.
1.2.1
Čočka
Na počátku všeho je osa, tedy optická osa. Můžeme si ji představit jako paprsek běžící z
nekonečna do nekonečna. Kdyby běžela jen tak, neměla by valného smyslu. Takových přímek může
být nekonečně mnoho a velmi chaotických. Jiná situace nastane, když umístíme do prostoru čočku.
Ta totiž ihned určí, kudy má optická osa běžet a umístí ji do svého optického středu (obrázek 04).
Jakmile kolem běžící paprsky uvidí, že se vyskytlo něco, co jim dává řád, po průchodu čočkou se
seřadí podle zajímavých pravidel.
a
b
F
f
O
f´
F´
c
Obrázek 04: Průchod paprsků spojnou čočkou.
Paprsek „a“, rovnoběžný s optickou osou, se láme do ohniska. Paprsek „b“, procházející optickým
středem, pokračuje nezměněným směrem. Paprsek „c“, procházející ohniskem, pokračuje po
průchodu spojnou čočkou rovnoběžně s optickou osou.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
6
Nás teď zajímají paprsky, které jdou rovnoběžně s optickou osou, tedy kolmé na rovinu optického
členu – v tzv. optické rovině. Ty se po průchodu čočkou soustřeďují do ohniska (obr. 05), ležícího na
optické ose označeného písmenem F. Jistě namítnete, že v tom případě musí existovat ještě jedno
ohnisko pro paprsky letící opačným směrem. Máte pravdu. Druhé ohnisko také existuje a označujeme
je písmenem F‘. Vzdálenost mezi optickým středem čočky a ohniskem je nazvána „ohnisková
vzdálenost“ a značíme ji symbolem f, pro opačný směr opět s apostrofem f‘. Jestli ohnisko skutečně
existuje, se můžete jednoduše přesvědčit. Jakoukoli spojnou čočku postavte plochou ke slunci a tam,
kde je ohnisko, uvidíte zářivý bod. Promítnete-li ohnisko na ruku, popálí Vás. Tímto způsobem se
v Řecku tradičně zapaluje olympijský oheň.
Jak je to s paprsky, které neběží rovnoběžně s osou, ale přesto čočkou projdou? Z hlediska zobrazení
nás zajímají paprsky, které procházejí ohniskem. Ty po průchodu čočkou změní směr a dále jdou
rovnoběžně s optickou osou (také obrázek 05). Paprsky, které projdou středem optického členu, se
nezmění a pokračují dále svým původním směrem (také obrázek 05).
Něco jsme se dozvěděli o třech základních směrech průchodu paprsků (tzv. konstrukčních paprsků),
které budeme potřebovat pro vysvětlení, jak se zobrazí předmět. Věnujme se tedy zobrazování
předmětu spojnou čočkou. Tu si pro zjednodušení nějak označíme v průmětu optické roviny. Pro náš
výklad potřebujeme definovat ještě dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost (2F, resp. 2F‘) a určit si
rovinu předmětovou a obrazovou. Tím si určíme směr paprsků, aby nás to nemýlilo (viz obr. 05).
Předmět si označíme jako tradičně šipkou, ale může to být třeba slon, anebo bacil.
Teď se ještě podíváme na obrázek 05, kdy je předmět umístěn v dvojnásobné ohniskové vzdálenosti.
Jak vidíte, jeho skutečný obraz existuje v obrazové rovině také ve dvojnásobné ohniskové vzdálenosti.
Je skutečný, převrácený a má stejnou velikost jako zobrazovaný předmět.
PŘED
MĚT
Obrazová
rovina
f´
2F
Předmětová
rovina
F
f
O
F´
2F
´
OBRAZ
Obrázek 05: Konstrukční paprsky – jak je předmět zobrazován spojnou čočkou.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
7
Obrázek 06 ukazuje předmět za dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností (směrem k nekonečnu). Jeho
obraz existuje v obrazové rovině mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a ohniskovou
vzdáleností. Je skutečný, převrácený a zmenšený (to je případ běžné fotografie, kdy tento skutečný,
převrácený a zmenšený obraz zachytíme na film nebo čip).
PŘEDMĚT
Obrazová rovina
f´
2F
F
f
F´
2F´
O
Předmětová rovina
OBRAZ
Obrázek 6: Jak je předmět obrazově zmenšen (případ fotografie krajiny).
Obrázek 07 znázorňuje stejnou situaci, je-li předmět mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a
ohniskovou vzdáleností. Obraz předmětu je v tomto případě v obrazové rovině za dvojnásobnou
ohniskovou vzdáleností směrem k nekonečnu. Obraz je skutečný, převrácený a zvětšený. To je pro
změnu případ makrofotografie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz zachytíme na film
nebo čip. A je to i případ mikroskopie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz pozorujeme
okulárem jako lupou.
2f
f´ F´
2F
F
Předmětová
rovina
f
Obrazová
2F´ rovina
O
2f´
Obrázek 07: Jak je předmět obrazově zvětšen (případ makrofotografie).
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
8
1.2.2
Rozptylka
Zobrazování rozptylkou není pro nás jako uživatele tak důležité. Přesto si je ukážeme, abychom si
alespoň zopakovali to, co zde již bylo řečeno o zobrazování čočkou. Obrázek 08 schematicky ukazuje
zobrazení rozptylkou. Nyní je na vás, abyste si je zdůvodnili.
f
F
optická osa
Obrázek 08: Čočka rozptylná.
1.2.3
Vady optických členů
Vady optických členů jsou pro zobrazování velmi důležité. Teorií optických vad a jejich odstraňováním
se zabývá věda zvaná optika. Výklad optických vad a jejich odstranění je velmi rozsáhlý a odchyloval
by se od tématu této příručky. Zájemce odkážeme na specializovanou literaturu.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
9
1.3
Lupa
Lupa – tak se nazývá nejjednodušší, tolik potřebný, optický nástroj pro biologa. Můžete namítnout, že
lupa je také spojná čočka a musí tedy zobrazovat stejně. To je sice pravda, rozdíl je ale v tom, že
pozorovaný předmět je umístěn mezi ohniskovou vzdáleností a optickou rovinou spojné čočky, které
teď říkáme lupa. V tomto uspořádání se reálný obraz nevytvoří. Obraz vznikne v naší mysli. Představa
zobrazování lupou (tedy představa o vytvoření neskutečného, zvětšeného a nepřevráceného obrazu)
je schematicky uvedena na obrázku 09.
Lupa je tedy ono „zvětšovací sklo“, které umožní pozorovat předměty velikosti špendlíkové hlavičky,
anebo nám zvětší písmenka, která jsou tak malá, že je bez lupy nepřečteme. Existují například knižní
miniatury, které se prodávají i s příslušnou lupou. Je to ale i případ mikroskopu, kdy skutečný,
převrácený a zvětšený obraz pozorujeme okulárem (což je vlastně lupa). V naší mysli ho pozorujeme
jako neskutečný, přímý a zvětšený odraz.
zdánlivý obraz
POZOROVATEL
předmět
O
F
f´
F´
f
Obrázek 09: Zobrazení lupou – předmět je umístěn do prostoru ohniskové vzdálenosti.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
10
1.4
Mikroskop
Se znalostí zobrazování spojné čočky v obou variantách, tedy i lupy, a se znalostí lomu a odrazu si
nyní můžeme rozebrat i chod paprsků v mikroskopu. Nejprve jeho hlavní prvky. Jak jsou umístěny,
ukazuje obrázek mikroskopu s popisem (obr. 10).
Obrázek 10: Kde najít jednotlivé části mikroskopu – kritické osvětlení.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
11
Stativ – dříve se říkalo noha mikroskopu, ale můj učitel říkával:
„Pokud má mikroskop nohu, pak pouze proto, aby tě kopl, že mu
ubližuješ“. A měl pravdu. Hlavní mechanickou částí mikroskopu je
stativ. Je to ono „železo“, na němž jsou vázány všechny ostatní části,
ať již optické nebo mechanické.
Světelný zdroj – zajišťuje dobré osvětlení zorného pole mikroskopu,
tedy té části preparátu, kterou právě zkoumáme. Může být pevně
spojen se stativem mikroskopu, může být odnímatelný a znovu
pevně nastavitelný ve stejné poloze, anebo u starších a starých typů
nespojený pevně s mechanikou mikroskopu. V posledním případě je
nutno světlo před prací nastavit a seřídit podle toho, co nám
příslušný zdroj, např. slunce, dovolí. Součástí mechaniky světelného
zdroje bývá tzv. polní clona. Ta vymezuje optimální svazek paprsků
Stativ
přicházejících ke kondenzoru (viz níže). Všechny nadbytečné paprsky
odstraňuje, protože by svými odrazy dělaly obraz méně kvalitní.
Zrcadlo – zajišťuje odraz světelného zdroje (např. vlákna žárovky) k další optické soustavě, kterou je
obvykle kondenzor (viz níže). Pochopitelně v mikroskopu může být zrcadel více. Obvykle jsou ve
formě hranolů, polopropustných hranolů, polopropustných destiček - to záleží na výbavě
mikroskopu. Protože se zabýváme pouze základy, mějme za zrcadlo pouze to, co nám vede cestu
paprsků od světelného zdroje ke kondenzoru. Není-li světelný zdroj pevně spojen s mechanikou
mikroskopu, pak zrcadlo vidíme obvykle jako kulaté a otáčivé v
obou potřebných rovinách. Otáčení je nutné, hledáme-li vhodné
světlo z cizího světelného zdroje. (Pochopitelně nemusíme hledat
jenom světelný zdroj. Velmi brzy jsme ve škole dokázali „seřídit“
mikroskop tak, že jsme pozorovali, jak pracují naše spolužačky
(spolužáci)).
Kondenzor – je velmi důležitou optickou částí a říká se, že je
tvůrcem dobrého obrazu s optimálním osvětlením a rozlišením.
Jeho úkolem je promítnout obraz světelného zdroje do roviny
preparátu a to v patřičné síle a bez zbytečných paprsků. Součástí
kondenzoru bývá i aperturní clona, o které se zmíníme později.
Existuje celá řada kondenzorů. Dělí se podle užití. My se
pravidelně setkáváme s kondenzorem pro procházející světlo,
Kondenzor
někdy s kondenzorem pro fázový kontrast. To je již specielní
zobrazování, pro nás však důležité, neboť nám umožňuje
pozorovat organismy za živa, bez nutného barvení. Vidět řasy za
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
12
živa, sledovat jejich životní projevy a zaznamenávat změny během jejich životního cyklu, to je na
laboratorní práci algologa to nekrásnější. Tím nechci podceňovat barvící techniky, ke kterým se také
dostaneme.
Stolek – Stolek mikroskopu je ta část, na kterou klademe objekt ve
formě preparátu. Musí zajistit rovinu a kolmost vzhledem k optické
ose mikroskopu. To je jeho hlavní úkol. Tak byl také v minulosti
chápán. Preparát byl držen svorkami a pohyb preparátem
zajišťovaly ruce pozorovatele. Později přišly křížové stolky, které
umožňují jemný pohyb preparátu ve
směru podélném i příčném. A tak je
známe dodnes.
Preparát – tak a teď budete v
rozpacích. Copak je preparát
optickým členem mikroskopu? Vidíte
a je! Jen s tím rozdílem, že jeho
Stolek
optickou kvalitu určujeme sami svou
šikovností při jeho přípravě. U
ostatních optických členů nastavil optickou kvalitu někdo již při výrobě.
Jak udělat kvalitní preparát si povíme v dalších kapitolách.
Objektiv – má výhradní postavení. Čím je kvalitnější, tím je naše
pozorování přesnější. Musíme brát v úvahu, že jeho kvalita se musí
shodovat s kvalitou ostatních
optických systémů mikroskopu. Vždyť
Objektiv
nač by nám byl kvalitní objektiv bez kvalitního kondenzoru nebo
s chybně nastaveným osvětlením? A to
nemluvím o kvalitně zhotoveném preparátu,
co nejtenčím a bez zbytečných přebytků
zalévacího media, s čistým podložním i
krycím sklem.
Okulár – je vlastně optický výstup
mikroskopu, pomocí okulárů pozorujeme
předmět na preparátu.
Okulár
Tubus – je vzdálenost mezi objektivem a
okulárem. U mikroskopu monokulárního je to
Tubus
jen trubka a pozorujeme pouze jedním okem.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
13
Tubus u binokulárního mikroskopu je dán hranolovým systémem, který paprsky dělí do dvou okulárů.
My potom pozorujeme oběma očima. Existuje ještě mikroskop trinokulární, kde je třetí výstup určen
pro kameru.
Obrázek 10a: Kde najít jednotlivé části mikroskopu – osvětlení dle Köhlera.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
14
1.4.1
Jak vzniká v mikroskopu obraz
V předchozím textu jsme si vysvětlili úlohu optických členů pro konstrukci obrazu na základě pravidel
geometrické optiky. To nám postačí pro pochopení vzniku obrazu v mikroskopu a k tomu, abychom
uměli mikroskop dobře seřídit. Schéma chodu konstrukčních paprsků je na obr. 11.
okulár
objektiv
předmět
F´
F´ok
O
F
POZORUJEME
Fok
POZOROVATEL
skutečný
obrácený
zvětšený
obraz
f´
zdánlivý
obrácený
zvětšený
obraz
Obrázek 11: Zobrazení mikroskopem – jak pozorujeme obraz předmětu okulárem mikroskopu.
1.4.1.1. Zvětšení mikroskopu
S pojmem rozlišovací schopnost a pojmem celkové zvětšení mikroskopu se setkáme velmi často. Je
všeobecným omylem, že kvalita mikroskopu se pozná podle celkového zvětšení. To se určí snadno.
Hodnota zvětšení uvedená na objektivu se vynásobí hodnotou zvětšení okuláru, popřípadě dalším
faktorem uvedeným na binokulárním tubusu, a máme zvětšení daného optického páru. To nám
ovšem nic neřekne o tom, jaké nejmenší detaily můžeme ještě rozlišit a jaké detaily už nerozlišíme.
Z předchozího můžeme vyvodit, že velká zvětšení vyžadují, aby okulár i objektiv měly krátké
ohniskové vzdálenosti.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
15
1.4.1.2. Rozlišovací schopnost
Rozlišovací schopnost závisí na rozlišovací schopnosti objektivu. Tu si můžeme přečíst na každém
objektivu. Je to číslo uvedené pod zvětšením objektivu. Kvalitu mikroskopu (použitého zvětšení)
charakterizuje tzv. rozlišovací mez. To je nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě od sebe při
pozorování rozlišíme. Na maličkých částicích mikroskopového preparátu se totiž světlo ohýbá, a tak
se bod nezobrazuje jako bod, ale jako světelný kroužek. Z teorie ohybu vyvodil pan Abbe, že
vzdálenost d mezi dvěma rozlišitelnými body je závislá na délce vlny záření, které dopadá na preparát
kolmo a vyvodil vztah:
d = vlnová délka / A,
kde A je tzv. numerická apertura, daná dalším vztahem
A= n * sin u,
kde n je relativní index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem, u je úhel mezi osou objektivu a
krajním paprskem, který vystupuje z preparátu a je ještě zachycen objektivem.
Z toho je zřejmé, že mikroskop rozliší blízké body tím lépe, čím užíváme kratší vlnové délky a čím
větší je numerická apertura vyjadřující světelnou účinnost objektivu. To vysvětluje, proč se pro velká
zvětšení klade mezi preparát a přední čočku objektivu kapalina o větším indexu lomu světla – tzv.
olejová imerze.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
16
1.4.1.3. Dobré osvětlení a jeho nastavení
Princip chodu paprsků v mikroskopu je uveden na obrázku 11. Ten ukazuje, že zrakem (pomocí
okuláru) pozorujeme obrázek zdánlivý, obrácený a zvětšený. Plyne to z minulých zobrazení, kdy
vlastně pozorujeme obraz skutečný, převrácený a zvětšený lupou, jejímž výsledkem je obraz zvětšený
a zdánlivě přímý.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
17
Praktické nastavení osvětlení a tím celého mikroskopu je poněkud komplikovanější. Rozeznáváme
dva druhy osvětlení. Kritické a osvětlení podle Köhlera. Kritické osvětlení zobrazuje obrázek 12.
zdroj světla
aperturní clonka
preparát
objektiv
ZRCADLO
kondenzor
Obrázek 12: Kritický způsob osvětlení – aperturní clona kondenzoru slouží zároveň jako polní clona,
omezující krajní paprsky.
Osvětlovací systém je složen ze zrcátka, aperturní clony a kondenzoru. Zrcátko poskytuje pomocí
odrazu rovnoběžný svazek paprsků, který je omezen aperturní clonou a kondensorem soustředěn do
místa předmětu. Někdy je užíváno zrcátko vyduté, působící jako čočka, která soustřeďuje svazek
paprsků ke kondenzoru. Nastavení je jednoduché. Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem
hrubého ostření zaostříme na nějakou strukturu při menším zvětšení. Poté pohybem zrcátka
nastavíme maximální osvětlení, které optimalizujeme pohybem kondenzoru. Poté vyjmeme okulár a
ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu. Pohneme-li aperturní
clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby otevřela alespoň 9/10
zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme, měníme zvětšení a světlo dále upravujeme.
Osvětlení podle Köhlera (obr. 13) je dokonalý způsob, který zajišťuje při dobrém seřízení optimální
osvětlení co do kvality i kvantity. Osvětlovací systém je složen ze světelného zdroje (obvykle speciální
žárovka), sběrné čočky světelného zdroje, polní clony, aperturní clony a kondenzoru.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
18
polní clonka
aperturní clonka
preparát
objektiv
zdroj světla
sběrná čočka
světelného zdroje
obraz zdroje kondenzor
světla
Obrázek 13: Köhlerův princip osvětlení.
Nastavení předpokládá několik kroků.
Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem hrubého ostření zaostříme na nějakou
strukturu při menším zvětšení.
Pohybem sběrné čočky světelného zdroje promítneme obraz vlákna žárovky do roviny polní
clony, přitom si pomáháme průsvitkou.
Díváme se do okuláru (POZOR světlo může být příliš silné, je nutno je tlumit šedým filtrem)
a posunem kondenzoru zaostříme obraz polní clonky v zorném poli. Je-li její obraz mimo střed
zorného pole, provedeme její vycentrování justičními prvky na kondenzoru.
Rozevřeme polní clonku tak, aby její okraj právě opustil zorné pole.
Vyjmeme okulár a ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu.
Pohneme-li aperturní clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby
otevřela alespoň 9/10 zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme.
Pro každé zvětšení je nutno tento postup korigovat v případě, že je naší snahou vidět všechny
detaily, které nám užitá optika umožňuje svou rozlišovací schopností. Zvláště významné je to při
pořizování fotozáznamů.
1.4.2
Neobvyklé způsoby mikroskopování
Optická mikroskopie zaznamenala velký rozvoj, což je dáno rozvojem věd obecně. Pro naše skromné
účely zatím postačí popsaná mikroskopie v procházejícím světle, která je pro algologa
experimentátora v oblasti fyziologie řas nejdůležitější. Pozorujeme-li živé mikroorganismy, je užitečná
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
19
technika fázového kontrastu. Ta umožní pozorovat struktury buňky bez obarvení, a to během celého
životního cyklu. Vyžaduje zvláštní optiku, kterou nahrazujeme optiku běžně užívanou. Podrobnostmi
o této technice se nebudeme zabývat, jsou běžně k nalezení v literatuře.
1.4.3
Mikrofotografie
Dokumentovat pozorované je součástí práce každého výzkumníka. Vedle kreslení, což je velmi
důležitá technika, dnes poněkud podceňovaná, je mikrofotografie technikou nejobvyklejší. Schéma
toho, jaký obraz pozorujeme (zdánlivý) a jaký obraz fotografujeme (skutečný) je uveden na obr. 14.
Jistě si všechna pravidla na tomto obrázku zopakujete a uvědomíte si, co je k pořízení snímku
potřeba. Asi si také vyvodíte, že máte-li fotoaparát zaostřen na nekonečno a výstupní pupila okuláru
je přibližně stejných rozměrů jako vstupní pupila objektivu fotoaparátu (obvykle jako co největší
ohnisková vzdálenost-teleobjektiv), můžeme pořídit snímek, sice nepříliš kvalitní, ale sloužící k hrubé
orientaci a předloze pro kresbu.
okulár
skutečný
obrácený
zvětšený
obraz
objektiv
předmět
F´
SNÍMÁME
KAMEROU
projektiv
F´ok
Fok 2F proj
2F´ projektivu
F
zdánlivý
obrácený
zvětšený
obraz
F´projektivu
POZORUJEME
OKULÁREM
Obrázek 14: Konstrukce reálného obrazu pro mikrofotografii – co pozorujeme a co fotografujeme.
Kvalitní fotografickou dokumentaci ovšem pořídíme pouze tehdy, jestliže jsme si vědomi, že snímáme
reálný obraz v reálné vzdálenosti a reálným rozlišením. Dnes je možno pořídit pro fotografii nástavce
na běžné digitální fotoaparáty, které zachytí obraz ve výborné kvalitě. Nástavec obvykle obsahuje
optickou soustavu, která všechny požadavky na kvalitní záznam rozřeší.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
20
Jinou oblastí je pořízení kinematografického záznamu technikou, které se říká mikrokinematografie.
Jak název vypovídá, jde o techniku záznamu pohybu. Vědecká kinematografie se vyvíjela paralelně
s vývojem technik filmu a její význam tkví zejména v popularizaci výsledků získaných v jiných
vědeckých odvětvích. Na druhé straně je faktem, že celá řada buněčných mechanismů, zejména jejich
dynamiky a kinetiky, byla objevena právě za pomoci mikrokinematografie.
Můžeme se zařadit mezi výzkumníky, kteří budou navazovat na bohatou tradici a skvělé výsledky
svých předchůdců? Jednoznačně můžeme konstatovat, že ano. Chce to pouze trpělivost, vůli stále se
vzdělávat a sledovat literaturu oboru, který jsme si zvolili. Pochopitelně, že je nutné mít k disposici
zařízení, které nám umožní pořizovat kontinuální záznam.
Dále popíšeme postup a metodiky potřebné k pořízení časosběrného záznamu růstu mikroorganismů
(např. řas, sinic, kvasinek, probiotických kultur).
Pomůcky: (o vlastní laboratorní technice je pojednáno dále)
mikroskop vybavený záznamem obrazu (fotoaparát ukládající snímky ve formátu JPG, či TIFF),
pořizujeme-li záznam přesahující kapacitu paměťové karty, je třeba propojení s počítačem.
kultivační komůrka (je možné sestavit na místě nebo využít hotových konstrukcí)
kultivovanou suspenzi řasové kultury (možno i z přírodního, čerstvého sběru)
počítač se softwarem skládajícím jednotlivé obrázky do sekvencí.
Nejobtížnější je zajistit dobré kultivační podmínky během delší doby sledování. V případě některých
organismů jsou to přibližně dva dny, během kterých dojde k dělení alespoň jedné buňky coenobia.
Obr. 15 ukazuje schematicky několik jednorázových kultivačních komůrek, pomocí nichž můžeme
pořídit krátkodobý záznam. Obrázek 15A ukazuje složení visuté kapky. Ta se hodí na pozorování při
menším zvětšení. Ke stěnám distanční vložky je možno umístit kapku vody, aby preparát nevysychal.
Montovaný preparát na obr 15B umožňuje pozorování při větších zvětšeních. Je-li pečlivě zhotoven,
je možno dělat záznam i při imersním objektivu. Obrázek 15C ukazuje schéma Ranvierovy komůrky,
která je vhodná pro dlouhodobější pozorování. Je-li těleso komůrky vysoké do dvou milimetrů, je
možno použít i objektivy o větším zvětšení.
Možností tvorby a konstrukce kultivačních komůrek je celá řada, některé jsou patentově chráněny.
To platí zejména o konstrukcích, které umožňují průtok kultivačního media, měření teplot, pH a
jiných parametrů, které jsou pro některé výzkumné úlohy nezbytné. Naše práce se však odehrává
v prostředí, v němž pozorujeme životní projevy krátkodobě, zaznamenáváme je a obraz
vyhodnocujeme pomocí statistických metod.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
21
organismy
přirostlé na
krycím skle
krycí sklo
suspenze organismů
vazelínové těsnění
visutá kapka
montovaný preparát
podložní sklo
A
B
krycí sklo
kapka vody
vazelína
suspenze organismů
tělo komůrky
Ranvierova komůrka
C
Obrázek 15: Schéma jednoduchých kultivačních komůrek pro krátkodobou kultivaci v mikroskopu
a pořízení kinematografického záznamu.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
22
Obrázek 15a: Ukázka Ranvierovy
komůrky vysoké 10 mm.
Na obrázku 16 vidíte sestavu mikroskopu, kamery a kultivační komůrky, která umožnila výzkum
životního cyklu mnoha mikroorganismů. Výsledek je možno vidět v přiloženém časosběrném
záznamu.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
23
Obrázek 16: Sestava mikroskopu, kamery, kultivační komůrky, eventuelně počítače se softwarem na
časové ovládání kamery. Současné kamery umějí použít časosběrný režim bez nutnosti zapojení do
počítače.
Správně seřídit mikroskop a udělat kvalitní preparát je základem jakékoli mikroskopické práce. Jak ale
správně připravit preparát pro optickou mikroskopii? Schéma je uvedeno na obrázku 17.
objektiv
krycí sklo
cca 0,15 mm silné
objekt v kapce vody
kondenzor
Obrázek 17: Schéma uložení preparátu na stolek optického mikroskopu
Základem je podložní sklíčko. Sklo řádně očistíme a vyleštíme do sucha, neboť na čistotě použitých
skel závisí kvalita výsledného obrazu. Na podložní sklo, asi doprostřed, umístíme malou kapku
zkoumané buněčné suspense, nebo do kapky vody přeneseme zkoumaný objekt. Opatrně přiklopíme
řádně očištěným a vyleštěným krycím sklíčkem a dbáme přitom na to, aby byl preparát bez bublin. Ty
by byly vidět jako ostře ohraničené kruhy. Takto udělaný preparát vložíme na stolek mikroskopu,
krycím sklem nahoru, směrem k objektivu.
Jak jste asi z předchozího zjistili, použití objektivů o vysoké numerické apertuře je vázáno na přestup
paprsků v podobném prostředí, tedy na prostředí o podobném indexu lomu, pokud chceme využít
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
24
rozlišovací schopnosti optiky. Imerzní technikou zvýšíme světelnost objektivu. Tato technika využívá
imerzní tekutiny (imerzního oleje, vody přidané na podložní sklíčko), do které se vnoří objektiv
optického mikroskopu. Tato technika je možná pouze s imerzním objektivem.
sklo objektivu
index lomu 1,25
paprsky, které jsou
díky shodnému
indexu lomu oleje a
skla zachyceny
optikou
paprsek, který není
optikou zachycen,
protože index lomu
vzduchu jej láme
optika
přechodové médium
olej – index lomu 1,51
olej
vzduch
index lomu 1,00
sklo
Obrázek 18: Použití imerzního oleje.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
25
2
Terénní odběry mikroorganismů
Sběr přírodního materiálu a jeho dokumentace vyžadují naši pečlivost. Je nutné připravit si všechny
pomůcky potřebné ke sběru materiálu a řádně je udržovat. Doporučujeme vytvořit si speciální
odběrovou soupravu do terénu, včetně zápisníku a tužky.
2.1
Pomůcky ke sběru
Pomůckou k odběru přírodního materiálu, může být jakýkoli nástroj, kterým oddělíme část vzorku, za
účelem jeho pozdějšího podrobného studia. Během sběru vzorků jde vždy o (1) odběr na místě
výskytu, (2) přemístění do vzorkovnice a (3) transport do laboratoře. Pokud nepředpokládáme
studium živého materiálu a jeho následnou kultivaci, pak vzorek ve vzorkovnici ihned fixujeme
(usmrtíme).
Typem odběrových pomůcek se zabývá specializovaná literatura, pro naše účely postačí vyjmenovat
několik základních.
1. Odběrové lahvičky (vzorkovnice, odběrovka) – pro naše účely jsou vhodné pěti až desetimililitrové
skleničky, někdy nazývané lékovky. Jsou skladné a mají obvykle dobře těsnící plastovou zátku.
Můžeme ale použít i jiné lahvičky nebo zkumavky. Pro těsné uzavření může posloužit vhodná
korková, či gumová zátka. Dbáme na to, aby hrdlo nebylo příliš úzké, abychom do odběrovky snadno
vkládali větší části vzorku i delší vlákna. Pokud odebíráme vzorek vody s planktonem, pak je vhodnější
asi půllitrová láhev, nejlépe z umělé hmoty, ta je nerozbitná. Opět by měla mít široké hrdlo pro
pozdější snadnou manipulaci se vzorkem.
2. Miska na dělení vzorku -
je velmi užitečná, potřebujeme-li si odebraný vzorek rozdělit,
předběžně prohlédnout (třeba lupou) a do odběrovky přemístit jen tu část, která se nám zdá nejlepší.
Pro tento účel skvěle vyhovuje petriho miska, ale může to být i jakákoli jiná miska, např. fotografická.
3. Lžička – na škrábání nánosů na kamenech (bentosu). Vhodná je nerezová polévková lžíce, ale
poslouží dobře nožík i pinzeta.
4. Pipetka na odběry planktonu – výhodou je nerozbitná pipeta z umělé hmoty, která má zároveň i
sací balonek. Pro odběry planktonu postačí menší pěti mililitrová. Pokud nemáme pipetu z plastu,
postačí obyčejná skleněná, zakončená sacím balonkem, což může být obyčejný dětský dudlík.
5. Pinzeta – pro odběr stačí hrubší pinzeta asi 15 cm dlouhá, seženeme-li delší, bude snadnější
odebrat vzorek z nepřístupných míst.
6. Preparační tyčinky – dobré pro práci v misce, když dělíme vzorek. Je vhodné mít alespoň dvě,
dobře poslouží obyčejné špejle, ale preparační jehly jsou lepší. Ty si nakonec můžeme udělat sami.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
26
2.2
Měření v terénu
Při odběru vzorku je samozřejmě nutné změřit fyzikální parametry prostředí, ze kterého vzorky
odebíráme. Změříme teplotu vody a její kyselost, popíšeme, jde-li o proudící nebo klidnou vodu. Dále
změříme teplotu ovzduší a charakterizujeme ozářenost stanoviště. Stačí odhadem – například
zastíněno, ozářeno plným sluncem, zarostlé křovinami apod. Poznamenáme také datum a čas
odběru.
K měření teploty potřebujeme teploměr, s dělením od 0 do 50 °C s přesností na půl stupně. Pokud
zkoumáme teplé vody, například termální prameny, je nutný teploměr o vyšším rozsahu. Teplotu
ovzduší musíme měřit suchým teploměrem (aby nedošlo ke snížení skutečné hodnoty způsobené
odpařováním vody na povrchu teploměru) a ve stínu. K měření kyselosti vody použijeme papírky
nebo tekuté indikátory se srovnávací barevnou tabulkou. Dobrý pH metr je pomůcka poměrně
nákladná a pro terénní měření, kde jde o hrubé stanovení, není nezbytná. Změřit kyselost vody je
však nutným předpokladem, pokud zamýšlíme vzorky dále kultivovat. V takovém případě musíme
zajistit shodné pH i v kultivačním mediu.
2.3
Záznamy o sběru a vzorcích
Každá vzorkovnice musí být opatřena štítkem a řádně očíslována. Číslo napsané na vzorku pak
souhlasí s číslem, které uvádíme v záznamu. Obvykle číslujeme vzorky z odběrových dní vzestupnou
řadou, někdo však používá jednu číselnou řadu třeba pro celý rok. Závisí to na našem rozhodnutí, co
se nám bude zdát výhodnější a přehlednější a jak často budeme do terénu chodit. Pro záznam si
opatříme zápisník, nejlépe čtverečkovaný. Pro terénní sběry se osvědčil tzv. Učitelský zápisník, který
je velmi vhodně členěn pro zápisy i dokumentaci.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
27
3
Laboratoř
Biologické laboratoře jsou si značně podobné zejména tehdy, nejde-li pouze o poznávání, či určování
druhů, ale také o pozorování života a funkce jak populace, tak i jednotlivých buněk. Zabýváme se
mikroorganismy, což pro většinu z nás znamená studovat růst a dělení buňky či populace a pohyby
cytoplasmy.
Zejména
pak
pohyby
chloroplastů,
lokomoční
pohyby,
pohyby
buněčných
kompartmentů a celou řadu dalších momentů, které nám spolu se soustavnějším studiem blíže
osvětlí biologii těchto zajímavých a užitečných organismů.
3.1
Preparační nástroje a pomůcky
Základem úspěšného zvládnutí mikroskopických technik je zvládnutí potřebných kultivačních a
preparačních postupů. Podmínkou jsou kvalitní preparační nástroje. Řada z nich je komerčně
dostupná. Často si je však vytváříme nebo upravujeme sami.
1. Pasteurova pipeta – je zúžená skleněná trubice o průměru asi 6 mm a délce přibližně 15cm. Ústí
trubice je zúženo pravidelně na průměr asi 0,5 mm, jsme však schopni si ústí trubice upravit nad
plamenem do žádaného průměru, až
vlasového. Pohyb tekutiny v trubici je
ovládán savičkou, umístěnou na jejím
širším konci.
2. Očkovací
klička
–
pod
tímto
termínem označujeme nástroj, pomocí
něhož očkujeme převážně tuhé půdy. Je
to vlastně tyčinka zakončená hrotem,
s různou tvarovou úpravou. Obvykle se
jedná o očko o průměru asi 2 mm, což je
ta aktivní část kličky, která musí být
odolná zahřívání do ruda. Klička se totiž sterilizuje vypálením. Z toho plyne, že aktivní část je drátek
z materiálu, který vydrží časté rozžhavování.
Mezi očkovací nářadí zařazujeme i jiné tvary, zhotovené ze skleněných tyčinek průměru asi 2 mm. Ty
si vyrábíme podle potřeby sami nad plamenem (postačuje lihový kahan). Obvykle jsou to triangly,
nebo tvar podobný hokejce. Sterilizace je u skleněného materiálu jednoduchá – vypálením.
3. Preparační jehly – opět ruční nástroj, dosažitelný komerčně, popřípadě vyrobitelný podle přání
na tuhost a pružnost použitého materiálu. S pomocí preparační jehly upravujeme vzorek,
rozdělujeme ho, či pouze přeuspořádáme. Obvykle pracujeme se dvěma jehlami, často pod pevnou
lupou, či preparačním mikroskopem.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
28
4. Hodinová skla – kulatá vydutá skla různého průměru, která slouží většinou k separaci
odděleného vzorku nebo ke krátkodobému odložení zajímavého materiálu.
5. Rovná skla (podložní a krycí) – rovná skla mají v praxi široké využití. Je dobré udělat si přípravek
na preparaci tak, že mezi dvě tabulová
skla o rozměrech přibližně formátu A5
uzavřeme černý a bílý papír a okraje
zalepíme páskou. Získáme tak podložku,
na které se vzorek dobře prohlíží proti
bílému nebo černému pozadí.
Rovným
sklem
je
také
podložní
mikroskopové sklo (tloušťka asi 1,5 mm) a krycí preparátové sklo (tloušťka 0,16 mm). Krycí skla se
dodávají v různých rozměrech a různých tloušťkách.
6. Chemické, odměrné a kultivační sklo - má různé tvary a různé použití. Je nutno vybírat podle
katalogu dodavatelských firem. Patří sem odměrky, kádinky, zkumavky, Petriho misky, pipety…
7. Tlakový hrnec (Papinův hrnec), autokláv - Autoklávování, jako způsob sterilizace, můžeme ve
skromných podmínkách domácí laboratoře nahradit tlakovým hrncem. Princip jeho funkce je stejný,
je jím sterilizace tlakovou párou. Počínáme si stejně, jako při vaření v tlakovém hrnci, nesmíme
zapomenout na podložku, která slouží k umístění sterilizovaného materiálu, a nesmíme zapomenout,
že pod touto podložkou musí být vrstva vody, z níž se tvoří pára.
8. Lihový kahan - je důležitá pomůcka v laboratoři široce využitelná. Na jeho plameni opalujeme
očkovací nástroje, ústí kultivačních nádob, kultivační zátky. Slouží také na drobné úpravy skleněných
nástrojů, zejména trubic, které vytahujeme na žádaný průměr.
Nyní je ta pravá doba na to, abychom si připomněli, jak udělat správně preparát pro optickou
mikroskopii.
Správně seřídit mikroskop a udělat dobrý preparát je základem jakékoli biologické práce. Schéma je
uvedeno na obrázku 17. Základem je podložní sklo normalizovaných rozměrů. Sklo řádně očistíme
a vyleštíme
do
sucha.
Na
podložní sklo asi doprostřed
umístíme
malou
kapku
zkoumané buněčné suspense
(nebo
do
přeneseme
kapky
jiný
vody
objekt).
Opatrně přiklopíme krycí sklo,
také
řádně
očištěné
a vyleštěné. Na čistotě skel
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
29
závisí do značné míry kvalita výsledného obrazu. Dbáme, aby preparát byl bez bublin, ty jsou vidět
jako ostře ohraničené kruhy. Takto udělaný preparát vložíme na stolek mikroskopu, krycím sklem
směrem k objektivu.
3.2
Zdroj pokusných organismů
1. Přírodní sběr, voda ze stanoviště, krátkodobá kultura.
Přírodní sběr je podmíněn měřením a záznamy naměřených hodnot vnějšího prostředí. Pro kultivace,
kterým říkáme krátkodobé, se hodí voda ze stanoviště, do které v laboratoři přemístíme odebraný
vzorek. Vznikne tak tzv. krátkodobá kultura. Ta se hodí zejména pro první mikroskopování, kdy
určíme, zda je přítomen organismus, který hledáme. Misku s krátkodobou kulturou je možné držet
přibližně týden. Poněvadž bývá pravidelně umisťována do okna, někdy se jí také říká okenní kultura.
2. Sbírka, jak udělat vlastní sbírku, jak udržovat sbírku, jak namíchat a uvařit půdu, jak udržet
sterilitu, co je pasterizace, jak pasážovat, jak očkovat šikmé agary, jak roztírat suspenzi na pevnou
agarovou půdu v Petriho misce, jak očkovat tekuté půdy.
Rozhodneme-li se, že kulturu uchováme za účelem izolace žádaného mikroorganismu, začínáme
vytvářet sbírku. Pro jednoduchost budeme užívat termíny kultura v tekutém médiu a kultura na
pevném médiu. Jak namíchat živný roztok je uvedeno v kapitole 3.6, kde jsou popsány dva základní
druhy tekutého media. V živném roztoku kultivujeme řasy v Erlenmayerových lahvích, anebo v jiných
lahvích, které mají zúžené hrdlo. S úspěchem lze užít například skleněné lahve od kečupu. Tekuté
půdy očkujeme buď suspensí kultury
pasteurovou pipetou, anebo kusem
kolonie,
vybrané
z agarové
plotny
pomocí očkovací kličky, či jehly.
K jednomu ze základních a nezbytných
pracovních postupů ve sbírce patří
zejména řádné mytí skla, sterilizace,
pasážování
kultur
a
vedení
dokumentace. Sklo umýváme naložením
do vody, když před tím odstraníme
pevnou
agarovou
půdu.
Ve
vodě
zbavíme sklo pevných ulpívajících částic
pomocí houbiček a kartáčů. Po několikerém vypláchnutí vodovodní vodou promyjeme vodou
destilovanou a usušíme. Destilovaná voda se užívá k závěrečnému oplachu kvůli zamezení skvrn po
kapkách vodovodní vody.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
30
Ve sbírce většinou užíváme pevnou agarovou půdu. Tu získáme přídavkem asi 1,5% agaru do tekuté
půdy. Agar nutno v půdě rozvařit, aby zkapalněl. Je možné to udělat v tlakovém hrnci. Tekutou půdu
s agarem rozléváme za sterilních podmínek do sterilních kultivačních nádob (erlenmayerovy lahve)
nebo do zkumavek. Zkumavky klademe po nalití půdy šikmo, aby se po ztuhnutí vytvořila co největší
plocha, na níž očkujeme. Zkumavky či jiné nádoby kryjeme vatovou, či tylovou zátkou, pochopitelně
sterilní. Teplou (tekutou) agarovou půdou můžeme plnit i Petriho misky, které jsou kryty víkem
(agarová plotna). V petriho miskách provádíme obvykle separaci buněk roztěrem. Šikmé agary
očkujeme pomocí očkovací kličky, petriho plotny rovněž, anebo pomocí hokejky, či trianglu ze skla.
Do suchých lahví, či misek naléváme
tekuté půdy, uzavřeme vatovou zátkou a
jsme
připraveni
ke
sterilizaci.
Tu
provádíme v autoklávu, dobře poslouží
tlakový hrnec. Na kovovou síťku na dně
tlakového
hrnce
uložíme
předměty
určené ke sterilizaci, zkontrolujeme, zda
je dno tlakového hrnce pokryto vodou,
hrnec uzavřeme a vaříme. Postačí cca 20
minut v tlakové páře, aby byly předměty
pro naše účely sterilní. Nemáme-li tlakový hrnec, můžeme užít tzv. pasterizaci, což je vaření ve vodní
páře při normálním tlaku po dobu cca 20 minut. Toto vaření opakujeme druhý den, kdy
předpokládáme, že vyklíčily spory, které následným varem zničíme.
Užíváme-li pevných půd, je nutno nalévat je ve sterilním prostředí do sterilních misek, nebo
zkumavek. Sterilita v tomto případě není kritická, postačí, není-li v místnosti průvan a pracovní plocha
je čistě umytá pomocí aseptika. Na ústech je dobré mít sterilní roušku. Pochopitelně naléváme
opatrně pod nadzvednutým víkem petriho misky, kterou ihned přiklopíme. Zkumavky ihned
uzavíráme a klademe do šikmé polohy k utuhnutí. Jsou uzavírány zátkou, zhotovujeme si ji z buničité
vaty, složením, stočením a fixací přelepením vhodnou páskou, či ovázáním nití. Existují také uzávěry
komerční, kovové.
Mezi základní dokumentaci sbírky patří přírůstkový seznam (sešit), do kterého zapisujeme
manipulace se sbírkovým materiálem, data pasáží (přeočkování buněk do nového kultivačního
média), popřípadě datum primární kultivace. Číslování a způsob zápisu volí každý tak, aby mu
vyhovoval. Je ovšem nutné, držet se zásady zpětného dohledání původu jakékoli sbírkové kultury. Jeli kultura předána pro další výzkum, je dobré i o tomto učinit zápis.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
31
3.3
3.3.1
Kultivace
Okenní kultivace, krátkodobá kultura pro orientační pohled
Význam okenní kultivace je krátkodobý, objekty jsou obvykle umístěny ve vodě z naleziště.
Provádíme přehled toho, co jsme nasbírali, co hodláme držet i do budoucna a zaznamenáváme
poznatky při pozorování. Zde je dobré mít tzv. pracovní deník, který je základní pracovní
dokumentací, ke které se budeme často vracet.
3.3.2
Kultivace na pevných půdách, růst kolonií, výběr kolonií, převod do sbírky
Zajímá-li nás nějaký organismus či společenstvo, očkujeme z této základní krátkodobé kultivace
příslušný zlomek a přemístíme ho na pevnou nebo tekutou půdu do petriho misky. Pevná půda má
své přednosti v následné manipulaci s vhodně narostlou kolonií. Vybranou kolonii vypíchneme
z mateřské plotny a přemístíme na dceřinou plotnu, kde ji rozetřeme. Smyslem je izolovat buňky
vhodných vlastností a izolovat druhově čisté kolonie. Pokud jsme si jisti, že jsme získali čistou kulturu,
převedeme ji na šikmý agar do sbírky. Techniky izolace a separace kultury a zejména techniky
klonování jsou velmi rozsáhlé a tvoří jednu ze základních úloh v biotechnologiích.
3.3.3
Experimentální kultivace, jak nasadit pokus, jak zajistit stálou teplotu a intenzitu světla
Podaří-li se izolovat populaci řas nebo sinic, je nutno učinit experimentální kultivaci. Účelem je zjistit
optimální kultivační podmínky pro její dobrý růst, případně zjistit, při jakých kultivačních podmínkách
se tvoří biologicky aktivní látky.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
32
Každý
pokus
je
složen
z pokusných variant a jejich
opakování. Varianty slouží ke
kvantifikaci
závislosti
mezi
dávkou (například zkoumané
látky,
nebo
rozsahem
fyzikálního faktoru) a účinkem
(ten
je
počtem
měřen
například
buněk,
optickou
denzitou, obsahem barviv, či
hledané
látky,
atd.).
Opakování
slouží
k tomu,
abychom eliminovali případné chyby, či nepravidelnosti. Každý pokus musí obsahovat kontrolu, tedy
variantu neovlivněnou. Zkoumáme-li otázku toxicity nějaké látky, je nutno zařadit ještě tzv. kontrolu
pozitivní, to je taková, o které víme, že působí toxicky
Při kultivačním pokusu je nutno zajistit stálé podmínky prostředí, v případě růstového pokusu
s řasami je to hlavně teplota a intenzita světla, ale může to být i stálý přísun oxidu uhličitého,
intenzita probublávání, střídání dne a noci, popřípadě stálé osvětlení. Proto byla zkonstruována celá
řada kultivačních zařízení, často zcela automatizovaných. Pro naše skromné podmínky, kdy nejde o
přesné experimenty, ale spíš o udržení kultury v dobrém růstovém stavu, je dobré postavit si
jednoduché zařízení, se zářivkou, která zajistí dobré světlo pro růst. To prozatím stačí.
Mikrokultivace, jak zajistit kultivace malého počtu buněk v mikroskopu, jak udělat jednoduchou
komůrku pro pozorování buněčných projevů
Obr. 15 ukazuje schéma jednoduchých komůrek použitelných pro obrazový záznam projevů buňky.
Komůrky jsou vhodné pro krátkodobé pozorování, je nutno, aby součástí prostoru byla vzduchová
bublina, odkud řasy čerpají plyny, aby byla zajištěna výživa, což je splněno kultivačním médiem. Bývá
problém s nechtěným pohybem buněk, to je obvykle řešeno montáží do polotekutého agaru (tak
zvaný softagar o přibližné koncentraci 0,1 až 0,05 %.) Takový agar je zhotoven zpevněním tekutého
média, jinak by nebyla zajištěna výživa. Agar je pro plyny prostupný. Uvedené konstrukce komůrek
jsou vhodné pro krátkodobé pozorování, obvykle do 50 hodin. Výjimku tvoří komůrka Ranvierova,
kde můžeme buňky udržet v dobrém stavu dlouhodobě až 14 dní.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
33
3.4
3.4.1
Metody preparace
Fixovaný materiál, cytologie
Jistě se nevyhneme studiu řas a sinic ve fixovaném stavu. Rozumí se tím šetrné usmrcení buňky tak,
aby následnou preparací mohly být zviditelněny buněčné struktury. Fixované preparáty jsou užitečné
i tehdy, děláme-li průzkum druhového složení společenstva. Má to tu výhodu, že fixovaný vzorek
nemusíme zpracovávat ihned. Univerzálním fixativem je 2-4% formaldehyd. Máme-li v úmyslu
mikroskopování odkládat, je dobré přidat ke sběrovému materiálu ještě několik kapek glycerolu.
Fixáží existuje nepřeberné množství a pro různé barvící cytologické metody jsou předepsány i různé
fixáže. Pro naše účely postačí Lugolův roztok.
Ten obsahuje:
Jodid draselný ........................................................... 1,5 g
Vody do................................................................... 100 ml
Jod............................................................................. 0,3 g
Pro řasy je vhodné ředit tento roztok 1:1.
Lugolův roztok barví zároveň škrob do modra, bílkoviny jsou barveny žlutě až hnědě.
Pokud se hodláme věnovat řasové cytologii systematicky, je nutno studovat literaturu, která se
tomuto oboru věnuje.
3.5
3.5.1
Studium na živých organismech
Stanovení životního cyklu
Studium životního cyklu má dva aspekty.
První užívá rostoucí kulturu, z níž odebíráme v pravidelných intervalech po dobu několika dnů vzorky,
které fixujeme a barvíme, popřípadě ihned mikroskopujeme. Zaznamenáváme morfologické, či
cytologické změny, které promítneme na časovou osu. Z té můžeme vyčíst přibližnou generační dobu,
pokud užíváme vhodný parametr, například délku, objem, anebo počet jader.
Druhý aspekt užívá obrazového záznamu, který je snímán v pravidelných časových intervalech.
Složením fotozáznamů vzniká sběrný snímek, na němž je možno zachytit nejenom dělení buněk, ale
i morfologické změny a dělení či pohyb organel, tedy parametry spíše fyziologické. Záznam je pořízen
na živých buňkách. K tomu ovšem potřebujeme vhodnou kultivační komůrku.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
34
3.5.2
Určení generační doby a růstové křivky
Generační doba je doba od dělení buňky po další dělení stejné buňky. Určíme ji nejpřesněji pomocí
mikrokinematografického záznamu. Je ovšem možné určit průměrnou generační dobu jako
průměrnou dobu zdvojení počtu buněk v rostoucí kultuře. K tomu je zapotřebí počítací komůrka,
která může mít mnoho různých konstrukcí. V pravidelných intervalech odebíráme vzorky z rostoucí
populace a pomocí počítací komůrky určíme počet buněk na jednotku objemu. Seřadíme-li data do
časové řady, získáme růstovou křivku. Stanovení růstové křivky je jedním ze základů biologické práce.
Má význam především pro studium růstu populace ovlivněné některou z nepříznivých látek.
Růstovou křivku lze konstruovat také z odvozených parametrů, například stanovením optické
hustoty.
3.5.3
Studium pohybu
Pohyb je významným fyziologickým parametrem. Je nutno rozlišit pohyby lokomoční, kdy se jedná o
přemisťování celého organismu, například buňky, a pohyby, které pozorujeme uvnitř buňky,
například pohyby cytoplasmy, pohyby chloroplastů, pohyby bičíků atd.
Oba druhy pohybů jsou kvantifikovatelné a ukazují fyziologický stav organismů. Je možno určit
rychlost, směr a také tvar výsledné dráhy, stanovit náhodnost, popřípadě účelovost. Pohyby na
buněčné úrovni jsou nejpřesněji studovány pomocí sběrné mikrokinematografie, tedy pomocí
obrazového záznamu snímaného v pravidelných časových intervalech.
3.6
Živná media
K získání prvních biologických materiálů potřebných ke studiu mikroorganismů můžeme využít
tekoucích nebo stojatých vod z lokálních zdrojů. Získaný vzorek prohlédneme pod mikroskopem a
můžeme jej separovat (izolovat) k získání primární kultury. Zde se rozhodneme, zda budeme pro
účely dalšího studia dále kultivovat, nebo přistoupíme k izolaci zajímavých mikroorganismů. Primární
kultura je obvykle přemístěna do vody přinesené ze stanoviště. Nezapomínáme na krytí ústí
kultivační nádoby vatovou zátkou, či folií (například hliníkovou). Rozhodneme-li se o další kultivaci, je
nutno připravit živné médium, buď pevné, nebo tekuté. V tomto přehledu se soustředíme na několik
málo osvědčených postupů, protože smyslem příručky je rychlý úvod do experimentální práce.
V literatuře lze pochopitelně nalézt tisíce návodů na specializované živné roztoky.
3.6.1
Jednoduchá živná media s půdním odvarem
Příprava půdního odvaru. Mezi nejjednodušší živná média patří půdní odvar, který připravíme tak, že
zahradní zeminu necháme nasáknout vodou. Poté přidáme stejný objem vody. Tuto směs zahříváme
a udržujeme asi dvě hodiny tak, aby neprocházela varem. Poté zbylou vodu přelijeme do vyšší
kádinky (sklenice) a necháme asi jeden den odstát. Supernatant přefiltrujeme přes vatu, či hrubý filtr,
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
35
rozlijeme do menších objemů (asi po 50 ml) a sterilizujeme v Papinově hrnci, popřípadě
pasterizujeme. Takto připravený sterilní půdní odvar slouží jako přídavek do jednoduchých živných
médií, kde do média doplňuje stopové prvky, případně látky, jejichž účinky mikroorganismům
prospívají.
Médium L-C: Připravíme roztoky anorganických solí jako 1% roztoky ve vodě. K použití přidáváme
dále uvedená množství a doplníme do 1000 ml.
KNO3 .................................................................20 ml
KH2PO4 ............................................................... 4 ml
MgSO4 ................................................................ 3 ml
Ca(NO3)2 ............................................................. 3 ml
FeCl3 ............................................................... 0,15 ml
Půdní odvar .......................................................10 ml
Vody do ......................................................... 1000 ml
Máme-li větší spotřebu media, nebo když nemáme přesnější váhy, připravíme si zásobní roztoky tak,
abychom k použití přidávali vždy stejný objem. Pochopitelně vše je rozpouštěno ve vodě buď běžně
pitné, anebo destilované, ta ovšem nesmí být destilována v mědi nebo jiném přístroji, produkujícím
toxicitu.
Zásobní roztok
Roztok k použití
KNO3 ..................................... 200 g/1000 ml .........................................1 ml/litr
KH2PO4 ................................... 40 g/1000 ml .........................................1 ml/litr
MgSO4 .................................... 30 g/1000 ml .........................................1 ml/litr
Ca(NO3)2 ................................. 30 g/1000 ml .........................................1 ml/litr
FeCl3 ........................................ 1,5 g/1000 ml + 5 ml HCl ........................1 ml/litr
Půdní odvar ......................................................................................... 10 ml/litr
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
36
3.6.2
Jednoduchá plně definovaná kultivační media
Vyznačují se tím, že neužívají půdního odvaru, tedy nedefinované složky media. Uvádíme pouze
jedno, které je možno chápat jako standard pro počáteční kultivace, zejména pro školní účely. Pro
receptury jiných médií odkazujeme na literaturu.
Boldovo bazální médium: Je připraveno ze šesti zásobních roztoků makroelementů a čtyř zásobních
roztoků mikroelementů (stopových prvků)
Kultivační médium je poměrně jednoduché a vystačíme s ním pro většinu experimentálních kultivací.
Pokud budeme srovnávat s jinými medii, je možno užívat Boltovo basální médium jako standard.
Makroelementy:
1. NaNO3 ................................................................................. 10 g
Vody do .............................................................................. 400 ml
2. CaCl2 . 2H2O ...........................................................................1 g
Vody do ............................................................................. 400 ml
3. MgSO4 . 7H2O .........................................................................3 g
Vody do ............................................................................. 400 ml
4. K2HPO4 .................................................................................. 3 g
Vody do ............................................................................. 400 ml
5. KH2PO4 .................................................................................. 7 g
Vody do ............................................................................. 400 ml
6. NaCl .......................................................................................1 g
Vody do ............................................................................. 400 ml
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
37
Mikroelementy:
1. 50 g EDTA a 31 g KOH rozpustit v 1000 ml vody
2. 4,78 g FeSO4 . 7 H2O rozpustit v 1000 ml acidifikované vody – tu připravíme přidáním 1ml H2SO4
do 999 ml vody
3. 11,42 g H3BO3 rozpustit v 1000 ml vody
4. ZnSO4 . 7H2O ................................................................. 8,82 g
MnCl2 . 4H2O ................................................................ 1,44 g
MoO3 .... ....................................................................... 0,71 g
CuSO4 . 5H2O ................................................................ 1,57 g
Co(NO3)2 . 6H2O............................................................ 0,49 g
K použití připravíme živný roztok tak, že do 900 ml destilované vody přidáme po 10 ml roztoků
makroelementů a po 1 ml roztoků mikroelementů. Doplníme do 1000 ml. Živný roztok se sterilizuje
autoklávováním nebo v tlakovém hrnci (Papinův hrnec). Možno sterilizovat filtrací přes filtr porozity
0,22 um.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
38
4
Závěr
Doufáme, že vám příručka pomohla při přípravě a sběru biologického materiálu, ke snadnější
orientaci při využívání mikroskopových technik a žákům rozšířila teoretické základy o praktické
dovednosti. Možná, že v praktických úlohách probudila v žácích zájem o přírodu a přírodní obory. To
bychom si přáli, rozvinout v nich chuť po dalším vzdělávání a výrazně pomoci při výběru jejich dalšího
profesního směřování.
TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044
39