Příručka soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit

Říjen 2015
Příručka soupravy
®
artus HHV-6 RG PCR
Kit
96
Verze 1
Pro použití s přístroji Rotor-Gene® Q
4521265
altona Diagnostics GmbH,
Mörkenstraße 12, 22767 Hamburk, NĚMECKO
R3
1096238-CS
Distributor: QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, NĚMECKO
Sample to Insight__
Obsah
Použití ..................................................................................................................................4
Shrnutí a vysvětlení ..............................................................................................................4
Informace o patogenu ...............................................................................................4
Princip Postupu ....................................................................................................................5
Materiál poskytovaný se soupravou .....................................................................................6
Obsah soupravy ........................................................................................................6
Vyžadovaný materiál, který není součástí soupravy .............................................................6
Upozornění a nařízení ..........................................................................................................7
Před použitím testu si pozorně přečtěte všechny pokyny. ........................................7
Varování ....................................................................................................................8
Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, jednorázové
rukavice a ochranné brýle. ........................................................................................8
Opatření ....................................................................................................................8
Skladování a nakládání s reagenciemi .................................................................................9
Součásti soupravy .....................................................................................................9
Postup ................................................................................................................................11
DNA extrakce ..........................................................................................................11
Protokol: Detekce HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA ..........................................13
Interpretace výsledků .........................................................................................................24
Platnost běhu ..........................................................................................................24
Kvalitativní analýza .................................................................................................25
Kvantitativní analýza ...............................................................................................26
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
2
Omezení .............................................................................................................................28
Kontrola kvality ...................................................................................................................28
Výkonnostní charakteristiky ................................................................................................29
Analytická senzitivita ...............................................................................................29
Analytická specificita ...............................................................................................30
Lineární rozsah .......................................................................................................31
Přesnost ..................................................................................................................32
Diagnostické ohodnocení ........................................................................................34
Opakovatelnost .......................................................................................................35
Symboly..............................................................................................................................36
Řešení problémů ................................................................................................................37
Informace pro objednání.....................................................................................................38
3
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Použití
Souprava artus® HHV-6 RG PCR Kit (96) je in-vitro diagnostický test, založený na
technologii real-time PCR pro detekci, rozlišení a kvantifikaci lidského herpesviru 6A (HHV6A) a lidského herpesviru 6B (HHV-6B).
Shrnutí a vysvětlení
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit je založena na předpřipraveném systému pro detekci
specifické DNA HHV-6A a HHV-6B viru za použití real-time PCR na přístrojích Rotor-Gene
Q. Test zahrnuje heterologní amplifikační systém (interní kontrola) pro identifikaci možné
PCR amplifikace a pro potvrzení PCR inhibice a potvrzení integrity reagencií soupravy.
Informace o patogenu
HHV-6 je souhrnný název pro dva příbuzné podtypy virů z rodiny Betaherpesvirinae, HHV6A a HHV-6B. K primární infekci virem HHV-6 obvykle dochází v dětství před dosažením
věku dvou let. Symptomy zahrnují horečku, průjem a exantém subitum, což je vyrážka
běžně známá jako roseola. V některých případech, může počáteční infekce vést k febrilním
křečím, encefalitidě nebo nepoddajným záchvatům. Po primární infekci zůstává virus
v latentní fázi v těle.
Latentní HHV-6 lze znovu aktivovat v pozdějším životě. Klinické projevy reaktivace mohou
mít vliv na řadě míst uvnitř těla, jako např. v mozku, plicích, srdci, ledvinách a trávicím
traktu. Reaktivace HHV-6 v mozkové tkáni je spojena s neurologickými poruchami a ve
vzácných případech může vést k poškození kognitivních funkcí, trvalé invaliditě a smrti.
Zatímco HHV-6B způsobuje klinické projevy u pacientů s oslabenou imunitou a u dětí v
USA, Japonsku a Evropě, HHV-6A je více převládající formou u dětí v Africe. HHV-6A se
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
4
často vyskytují u pacientů s chronickými neurologickými nemocemi - zejména
neurozánětlivými
onemocněními,
jako
např.
roztroušená
skleróza
(MS)
a
rhombencefalitida.
Princip Postupu
HHV-6 RG Master A a HHV-6 RG Master B obsahují činidla a enzymy pro specifickou
amplifikaci cílových regionů v rámci genomů HHV-6A a HHV-6B a pro přímou detekci
specifických amplikonů v zeleném a červeném fluorescencenčním kanálu v přístrojích
Rotor-Gene Q.
Kromě toho obsahuje souprava artus HHV-6 RG PCR Kit heterologní amplifikační systém
pro identifikaci potenciálních chyb v průběhu procesu testování. Tento systém je
detekován jako interní kontrola (IC) ve fluorescenčním žlutém kanálu přístrojů Rotor-Gene
Q.
Sondy specifické pro HHV-6A DNA jsou označeny fluoroforem FAM™, zatímco sondy
specifické pro HHV-6B DNA jsou označeny fluoroforem, který má stejné vlastnosti jako
®
Cy 5. Konkrétní sonda pro interní kontrolu (IC) je značena fluoroforem JOE™. Použití
sond značených spektrálně rozlišitelnými fluorofory umožňuje simultánní detekci a
kvantifikaci HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA, stejně i detekci interní kontroly v
odpovídajících kanálech přístroje Rotor-Gene Q.
5
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Materiál poskytovaný se soupravou
Obsah soupravy
artus HHV-6 RG PCR Kit
Katalogové číslo
Počet reakcí
(96)
4521265
96
Modrá
HHV-6 RG Master
A
8 x 60 µl
Růžová
HHV-6 RG Master
B
8 x 180 µl
Zelená
HHV-6 RG IC
1 x 1000 µl
Červená
HHV-6 QS*
4 x 250 µl
Bílá
H2O
1 x 500 µl
Příručka
1
* artus HHV-6 RG PCR Kit obsahuje 4 kvantifikační standardy (QS1–QS4).
Vyžadovaný materiál, který není součástí
soupravy
Před použitím se ujistěte, že přístroje byly kontrolovány a kalibrovány dle doporučení
výrobce.
Reagencie

QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN kat. č. 51304 nebo 51306; viz “DNA extrakce”,
strana 11)
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
6
Spotřební materiál

0.1 ml stripové zkumavky s víčky pro použití s 72-jamkovým rotorem (QIAGEN, kat. č.
981103 nebo 981106)

Mikrocentrifugační „LowBind“ zkumavky bez nukleáz pro přípravu mastermixů

Špičky s filtrem bez nukleáz
Vybavení

Přístroj Rotor-Gene Q MDx 5plex, Rotor-Gene Q 5plex nebo Rotor-Gene Q 6plex

Rotor-Gene Q software verze 2.3.1 nebo vyšší

Loading Blok pro 72 x 0.1 ml zkumavky, hliníkový bloček pro manuální namíchání
reakce (QIAGEN, kat. č. 9018901)

Příslušné nastavitelné pipety pro příravu vzorku

Příslušné nastavitelné pipety pro přípravvu PCR mastermixu

Příslušné nastavitelné pipety pro rozpipetování templátové DNA

Vortex

Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml reakční zkumavky
Upozornění a nařízení
Pouze pro použití in vitro.
Před použitím testu si pozorně přečtěte všechny pokyny.
7
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Varování
Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a
ochranné brýle.
Opatření

Použití tohoto výrobku je omezeno na pracovníky speciálně poučené a vyškolené v
technikách real-time PCR a diagnostických postupech in vitro.

Vzorky by měly být vždy považovány za infekční a/nebo nebezpečné v souladu s

Při manipulaci se vzorky používejte ochranné jednorázové rukavice bez pudru,
bezpečnými laboratorními postupy.
laboratorní plášť a ochranu očí.

Zabraňte kontaminaci vzorku a komponent soupravy mikroby a nukleázami

Vždy používejte jednorázové špičky s filtrem, které jsou bez DNáz/RNáz.

Při manipulaci s komponenty soupravy používejte vždy ochranné jednorázové rukavice
(DNázy/RNázy).
bez pudru.

Používejte oddělené pracovní plochy pro přípravu vzorků, míchání PCR reakcí a
amplifikaci/detekci. Pracovní postup v laboratoři by měl probíhat jednosměrně. Vždy
noste jednorázové rukavice v každém kroku přípravy a měňte je před vstupem do
různých oblastí přípravy.

Vyčleňte zásoby a vybavení pro samostatná pracoviště a nepřenášejte je z jedné
oblasti do druhé.

Skladujte pozitivní nebo potenciálně pozitivní materiál odděleně od ostatních součástí
soupravy.

Neotevírejte reakční zkumavky/platíčka po amplifikaci, zabráníte tak kontaminaci
amplikony.

V souladu s pokyny nebo požadavky místních, státních a/nebo federálních předpisů
nebo akreditačních organizací mohou být testovány další kontroly.

Nepoužívejte součásti soupravy, které mají prošlou dobu expirace.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
8

Vzorky a odpad z testů zlikvidujte v souladu s místními bezpečnostními předpisy.
Skladování a nakládání s reagenciemi
Součásti soupravy
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit je dodávána na suchém ledu. Složky soupravy by měly
dorazit ve zmrazeném stavu. Pokud jedna nebo více složek nejsou po obdržení zmrazeny,
nebo pokud byly během přepravy poškozeny zkumavky, kontaktujte QIAGEN technický
servis. Po převzetí uložte všechny komponenty soupravy do -30°C až -15°C.
Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování mastermixů (více než dvakrát),
protože by mohlo dojít ke zhoršení jejich funkčnosti. Uchovávejte reagencie zmrazené v
alikvótách, pokud budou použity opakovaně. Neskladujte reagencie při teplotě 4°C po
dobu delší než 2 hodiny. Chraňte HHV-6 RG Master A a HHV-6 RG Master B před
světlem.
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit zahrnuje:

Dva mastermixy (HHV-6 RG Master A a HHV-6 RG Master B)

Templát Interní kontroly (HHV-6 RG IC)

Čtyři kvantifikační standardy (HHV-6 QS1–4)

Voda pro PCR (H2O)
Reagencie HHV-6 RG Master A a HHV-6 RG Master B obsahují všechny složky (pufr,
enzymy, primery a sondy) pro amplifikaci a detekci HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA a
interní kontrolu v jedné reakci.
Kvantifikační standardy obsahují standardizované koncentrace HHV-6A- a HHV-6Bspecifické DNA. Mohou být použity samostatně jako pozitivní kontroly nebo společně k
vytvoření standardní křivky, která může být použita pro stanovení koncentrace HHV-6A-
9
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
a/nebo HHV-6B-specifické DNA ve vzorku. Koncentrace kvantifikačních standardů jsou
uvedeny v Tabulce 1.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
10
Tabulka 1. Koncentrace kvantifikačních standardů
Koncentrace (kopie/µl)
Kvantifikační standard
HHV-6A
HHV-6B
QS1
10,000
10,000
QS2
1000
1000
QS3
100
100
QS4
10
10
Postup
DNA extrakce
HHV-6A a HHV-6B specifické cílové sekvence jsou amplifikovány z DNA. Provedení testu
je proto závislé na kvalitě templátové DNA. Ujistěte se, že používáte pro přípravu vzorku
soupravu, z níž je výsledná DNA vhodná pro použití v následné PCR reakci.
Pro izolaci DNA a následné použití soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit se doporučuje
použít QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, kat. č. 51304 nebo 51306). Provádějte izolaci DNA
dle pokynů uvedených v příručce soupravy QIAamp DNA Mini Kit.
Vzhledem k tomu, že promývací pufry v soupravě QIAamp DNA Mini Kit obsahují etanol,
proveďte před elucí přídavný krok centrifugace. Umístěte kolonky QIAamp Mini spin do
nové sběrné zkumavky 2 ml a zlikvidujte starou zkumavku s filtrátem. Centrifugujte po
dobu 10 minut při přibližně 17000 x g (~ 13000 rpm) ve stolní centrifuze.
Důležité: Použití carrier RNA je zásadní pro účinnost extrakce a stabilitu extrahovaných
nukleových kyselin.
11
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Důležité: Etanol je silným inhibitorem real-time PCR. Pokud příprava vzorku používá pufry
obsahující etanol, ujistěte se, že jste odstranili všechny zbytky etanolu před elucí
nukleových kyselin.
Interní kontrola
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit obsahuje heterologní interní kontrolu, která může být
použita pro kontrolu inhibice PCR nebo pro kontrolu izolace vzorku (extrakce nukleových
kyselin) a jako PCR inhibiční kontrola.
V případě, že interní kontrolu používáte jako kontrolu inhibice PCR, ale ne jako kontrolu
pro přípravu vzorku, přidávejte interní kontrolu přímo do směsi HHV-6 RG Master A a
HHV-6 RG Master B, jak je popsáno v kroku 2b v protokolu (strana 14).
Bez ohledu na to, který způsob/systém používáte pro extrakci nukleových kyselin, interní
kontrola nesmí být přidána přímo do vzorku. Interní kontrola by měla být vždy přidána do
směsi vzorku a lyzačního pufru. Objem interní kontroly, která má být přidána do směsi
vzorku a lyzačního pufru závisí pouze na elučním objemu, a představuje 10% elučního
objemu. Například při použití QIAamp DNA Mini Kitu, je DNA eluována do 60 µl pufru AE.
Z tohoto důvodu se přidá 6 µl interní kontroly do směsi vzorek-lyzační pufr pro každý
vzorek.
Důležité: Nepřidávejte interní kontrolu a carrier RNA přímo do vzorku.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
12
Protokol: Detekce HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA
Důležité body před započetím práce

Před začátkem procedury čtěte “Opatření”, strana 8.

Než začnete práci, seznamte se s přístrojem Rotor-Gene Q. Přečtěte si uživatelský
manuál.

Ujistěte se, že alespoň jedna pozitivní a jedna negativní kontrola (PCR voda) jsou
zahrnuty do běhu PCR.
Úkoly před startem práce

Ujistěte se, že máte předchlazený loading blok na 2-8°C. Loading blok je
příslušenstvím přístroje Rotor-Gene Q).

Před každým použitím musí být všechny reagencie kompletně rozmrazeny a
zamíchány (opakovaně pipetováním nahoru a dolů nebo krátkým vortexováním) a
krátce stočeny v centrifuze.
Postup
1. Umístěte požadované množství PCR zkumavek do adapteru chladicího loading bloku.
2. Pokud používáte interní kontrolu pro monitoring izolace DNA a pro detekci možné
inhibice, následujte krok 2a. Pokud používáte interní kontrolu výhradně pro kontrolu
inhibice PCR, následujte krok 2b.
Použijte interní kontrolu podle kroku 2b pro všechny vzorky, kontroly a kvantifikační
standardy, které budete analyzovat.
2a. Internní kontrola byla již přidána do izolace (viz “Interní kontrola”, strana 12).
V tomto případě připravte mastermix podle Tabulky 2.
Reakční mix typicky obsahuje všechny součásti potřebné pro PCR s výjimkou vzorku.
13
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Tabulka 2: Připravte mastermix (interní kontrola je použita k sledování DNA izolace a
k zjištění inhibice PCR)
Komponenta
1 reakce
12 reakcí
HHV-6 RG Master A
5 µl
60 µl
HHV-6 RG Master B
15 µl
180 µl
Celkový objem
20 µl
240 µl
2b. Interní kontrola musí být přidána přímo do směsi HHV-6 RG Master A a HHV-6
Master B. V tomto případě připravte mastermix podle Tabulky 3.
Reakční směs obsahuje všechny součásti potřebné pro PCR s výjimkou vzorku.
Tabulka 3. Příprava mastermixu (Interní kontrola je použita pouze pro detekci PCR
inhibice).
Komponenta
1 reakce
12 reakcí
HHV-6 RG Master A
5 µl
60 µl
HHV-6 RG Master B
15 µl
180 µl
1 µl
12 µl
21 µl
252 µl
HHV-6 RG IC
Celkový objem
* Nárůst objemu způsobený přidáním interní kontroly je při přípravě PCR opomíjen. Citlivost detekčního systému tím
není narušena.
3. Pipetujte 20 μl mastermixu do každé PCR zkumavky. Poté přidejte 10 μl eluátu vzorku
DNA a dobře zamíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpovídajícím způsobem přidejte
také 10 μl pozitivní kontroly nebo kvantifikačních standardů nebo 10 μl vody (PCR
voda) jako negativní kontrolu.
Ujistěte se, že jste použili alespoň jednu pozitivní a jednu negativní kontrolu na běh.
Pro kvantifikaci použijte všechny 4 kvantifikační standardy (QS1–QS4).
4. Zavřete PCR zkumavky. Ujistěte se, že jste umístili na vrch rotoru pojistný kroužek
(locking ring, který je příslušenstvím Rotor-Gene Q přístroje).
5. Pro detekci HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA vytvořte teplotní profil dle následujících
kroků.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
14
Základní nastavení parametrů pro test
Obrázky 1, 2, 3, 4
Počáteční aktivace hot-start enzymu
Obrázek 5
Amplifikace DNA
Obrázek 6
Nastavení senzitivity fluorescenčního kanálu
Obrázek 7
Odstartování běhu
Obrázek 8
Všechny specifikace se vztahují k softwaru Rotor-Gene Q verze 2.3.1 a vyšší. Další
informace o naprogramování přístrojů Rotor-Gene naleznete v manuálu přístroje. Na
obrázcích jsou tyto vlastnosti zvýrazněny černým rámečkem.
6. Zaprvé, otevřete dialogové okno New Run Wizard ve verzi Advanced a vyberte Two
Step (Obrázek 1). Pokračujte kliknutím na Next.
15
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
1
2
Obrázek 1. Dialogové okno nového běhu (New Run).
7.
V následujícím dialogovém okně New Run Wizard (Obrázek 2), se ujistěte, že pojistný
kroužek byl vložen (Locking Ring Attached) a klikněte na Next.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
16
1
2
Obrázek 2. Dialogové okno nového běhu (New Run Wizard).
8. Vyberte 30 (µl) pro nastavení reakčního objemu PCR reakce a klikněte na Next
(Obrázek 3).
17
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
1
2
Obrázek 3. Nastavení základních parametrů testu.
9. Klikněte na tlačítko Edit Profile v následujícím dialogovém okně New Run Wizard
(Obrázek 4), a naprogramujte teplotní profil, jak je ukázáno na Obrázcích 5–6.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
18
1
2
3
Obrázek 4. Úprava profilu.
19
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
1
2
3
Obrázek 5. Počáteční aktivace hot-start enzymu.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
20
1
2
3
4b
4a
5
Obrázek 6. Amplifikace DNA.
10. Detekční rozmezí fluorescenčních kanálů by mělo být stanoveno podle fluorescenčních
intenzit v PCR zkumavkách. Klikněte na Gain Optimisation v dialogovém okně New
Run Wizard (viz. Obrázek 4, krok 2), abyste otevřeli dialogové okno Auto-Gain
Optimisation Setup (Obrázek 7). Zatrhněte políčko Perform Optimisation Before 1st
Acquisition (Obrázek 7). Ujistěte se, že jsou vybrány všechny tři kanály (Zelený,
Červený a Žlutý) pro Auto-Gain Optimisation (Obrázek 7). (Najděte kanály
v rozbalovacím menu pod nabídkou Channel Settings a klikněte na Add.) Klikněte na
Close v dialogovém okně Auto-Gain Optimisation Setup poté, co je kalibrace gain
hotova.
21
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
1
2
Obrázek 7. Nastavení fluorescenční senzitivity.
11. Hodnoty gainu stanovené na základě kalibrace kanálů jsou automaticky uloženy a jsou
uvedeny v posledním okně programovací procedury (Obrázek 8). Klikněte na Start
Run.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
22
1
Obrázek 8. Odstartování běhu.
12. Poté co je běh zakončen, analyzujte data (viz “Interpretace výsledků”, strana 24).
23
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Interpretace výsledků
Platnost běhu
Platnost kvalitativního běhu
Následující kontrolní podmínky musí být dodrženy, aby byl běh prohlášen za platný
(Tabulka 4).
Tabulka 4. Kontrolní podmínky pro platný kvalitativní běh
Detekční kanál
Zelený kanál
Červený kanál
Žlutý kanál
Pozitivní kontrola
(QS)
POZITIVNÍ
POZITIVNÍ
POZITIVNÍ
Negativní kontrola
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
Kontrolní ID
Neplatný kvalitativní běh
Kvalitativní běh je neplatný, pokud běh nebyl dokončen nebo pokud některá z podmínek
kontrol nebyla dodržena.
V případě neplatného kvalitativního běhu opakujte PCR nebo opětovně vyizolujte DNA
z originálních vzorků (v případě, že již žádnou DNA nemáte).
Platný kvalitativní běh
Kvalitativní běh je platný, pokud jsou všechny kontrolní podmínky pro kvalitativní běh
dodrženy (viz Tabulka 4, nahoře). Pro kvantitativní výsledky navíc musí být generována
standardní křivka. V případě kvantitativního běhu musí mít standardní křivka následující
parametry hodnot (Tabulka 5).
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
24
Tabulka 5. Kontrolní parametry pro validní standardní křivku
Kontrolní parametr
Platná hodnota
Sklon křivky (Slope)
–3.743/–2.765
Účinnost PCR
85%/130%
2
Koeficient R
>0.98
Neplatný kvantitativní běh
Kvantitativní běh je neplatný, jestliže běh nebyl dokončen, nebo pokud nebyla splněna
některá z kontrolních podmínek pro platný kvantitativní běh.
V případě neplatného kvantitativního běhu opakujte PCR nebo opětovně vyizolujte DNA
z originálních vzorků (v případě, že již žádnou DNA nemáte).
Kvalitativní analýza
Souhrn interpretace výsledků je zobrazen v Tabulce 6.
25
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Tabulka 6. Souhrn interpretace výsledků
Detekční kanál
ID vzorku
Zelený
Červený
Žlutý
Výsledek
interpretace
A
POZITIVNÍ
POZITIVNÍ
POZITIVNÍ *
HHV-6A- a HHV-6Bspecifická DNA
detekována.
B
POZITIVNÍ
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ *
HHV-6A-specifická
DNA detekována.
C
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
POZITIVNÍ *
HHV-6B-specifická
DNA detekována.
POZITIVNÍ
Ani HHV-6A-, ani
HHV-6B-specifická
DNA nebyla
detekována. Vzorek
neobsahuje
detekovatelná
množství HHV-6Anebo HHV-6Bspecifické DNA.
NEGATIVNÍ
Inhibice PCR nebo
selhání reagencií.
Opakujte postup
s použitím původního
vzorek nebo odeberte
a testujte nový
vzorek.
D
E
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
* Detekce interní kontroly ve žlutém kanálu není vyžadována, pokud se objeví pozitivní výsledek v zeleném nebo
červeném detekčním kanálu. Vysoká nálož HHV-6A a HHV-6B ve vzorku může vést k malému nebo žádnému
signálu interní kontroly.
Kvantitativní analýza
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit obsahuje 4 kvantifikační standardy (QS). Abyste mohli
vygenerovat standardní křivku pro kvantitativní analýzu, musíte nadefinovat standardy
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
26
v příslušných koncentracích (viz. Tabulka 1, strana 10). Standardní křivka pro kvantitativní
analýzu může být generována s použitím standardů o známé koncentraci.
CT = m log(N0) + b

CT = Prahová hodnota cyklu

m = Sklon (Slope)

N0 = Počáteční koncentrace

b = Intercept
Koncentrace pozitivních vzorků o neznámé koncentraci mohou být odvozeny od
standardní křivky (Obrázek 9).
N0 = 10(CT-b)/m
A
B
Pozitivní
Negativn
Cycle number
Počet cyklů
Threshold cycle
Fluorescence
QS1-4
log concentration
Obrázek 9. Kvantifikační standardy, pozitivní a negativní vzorky zobrazeny v obrázku (A) amplifikační graf a
(B) analýza standardní křivky.
Poznámka: Koncentrace vzorku je zobrazena v kopiích/µl a týká se koncentrace virové
DNA v eluátu.
Tento vzorec použijte pro stanovení virové nálože původního vzorku.
27
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Virová nálož vzorku [kopie/ml] =
Objem eluátu [µl] x virová nálož eluátu [kopie/µl]
Vstupní objem vzorku [ml]
Omezení

Použití tohoto výrobku je omezeno pouze na pracovníky speciálně poučené a
proškolené v technikách real-time PCR a diagnostických postupech in vitro.

Dobrá laboratorní praxe je základem pro správné provedení testu.

Věnujte mimořádnou péči zachování čistoty součástí soupravy a také při namíchání
reakcí. Pozorně sledujte všechna činidla, zda neobsahují nečistoty a kontaminaci.
Všechna činidla podezřelá z kontaminace zlikvidujte.

Správný odběr, transport, skladování a zpracování jsou vyžadovány pro správné
provedení testu.

Nepoužívejte tento test přímo na vzorky. Před testováním proveďte příslušnou izolaci
nukleových kyselin.

Přítomnost inhibitorů PCR může vést k zisku falešně negativním nebo neplatným
výsledkům.

Potenciální mutace v rámci cílových oblastí genomu HHV-6A a/nebo HHV-6B pokryté
primery a/nebo próbami použitými v soupravě může vést k chybnému vyhodnocení
přítomnosti patogenů.

Stejně jako u všech diagnostických testů, interpretace výsledků získaných pomocí
soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit musí být provedena po zvážení všech klinických a
laboratorních nálezů.
Kontrola kvality
Aby byla zajištěna konzistentní kvalita produktu, je každá šarže soupravy artus HHV-6 RG
PCR Kit testována proti předem stanoveným specifikacím.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
28
Výkonnostní charakteristiky
Specifické výkonnostní charakteristiky soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit byly stanoveny
s použitím HHV-6A-specifické DNA (kmen GS) a HHV-6B-specifické DNA (kmen Z-29) o
známé koncentraci.
Analytická senzitivita
Analytický senzitivita soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit je definována jako koncentrace
(kopie na µl eluátu) HHV-6A- nebo HHV-6B-specifické DNA, která může být detekována
s pravděpodobností ≥95%. Analytická senzitivita byla stanovena na základě analýzy ředící
řady HHV-6A DNA a HHV-6B DNA o známé koncentraci (Tabulky 7 a 8).
Tabulka 7. Výsledky PCR použité pro výpočet analytické senzitivity specifické
amplifikace HHV-6A
29
Vstupní
koncentrace
(kopie/µl)
Počet replikátů
Počet pozitivních
vzorků
Četnost
pozorování (%)
3.33
18
18
100
1.05
18
18
100
0.33
18
11
61.11
0.11
18
10
55.55
0.03
18
3
16.66
0.01
18
1
5.55
0.003
18
1
5.55
0.001
18
0
0
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Tabulka 8. Výsledky PCR použité pro výpočet analytické senzitivity specifické
amplifikace HHV-6B
Vstupní
koncentrace
(kopie/µl)
Počet replikátů
Počet pozitivních
vzorků
Četnost
pozorování (%)
10.50
18
18
100
3.33
36
36
100
1.05
18
16
88.88
0.33
18
8
44.44
0.11
18
1
5.55
0.03
18
3
16.66
0.01
18
1
5.55
0.003
18
0
0
Analytická senzitiva soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit stanovená na základě probitové
analýzy je stanovena pro HHV-6A-specifickou DNA 1.46 kopie/µl eluátu [95% interval
spolehlivosti (CI): 0.72–4.57 kopií/µl] a analytická senzitivita pro detekci HHV-6B-specifické
DNA je 2.58 kopie/µl eluátu (95% CI: 1.44–6.30 kopií/µl).
Analytická specificita
Analytická specificita soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit je zajištěna pečlivým výběrem
oligonukleotidů (primerů a prób). Oligonukleotidy jsou kontrolovány srovnáním sekvenční
analýzy s veřejně dostupnými sekvencemi v databázích, aby bylo zajištěno, že jsou
zjištěny všechny příslušné genotypy HHV-6. Krom toho byla specificita soupravy artus
HHV-6 RG PCR Kit testována na panelu genomové DNA/RNA extrahované z jiných
herpes virů nebo patogenů, které jsou relevantní pro pacienty se sníženou imunitou
(Tabulka 9).
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
30
Tabulka 9. Organismy testované pro křížovou reaktivitu
Detekční kanál
Organizmus
Zelený
(HHV-6A)
Červený
(HHV-6B)
Žlutý
(IC)
Herpes simplex virus 1
Negativní
Negativní
Platný
Herpes simplex virus 2
Negativní
Negativní
Platný
Varicella-Zoster virus
Negativní
Negativní
Platný
Epstein-Barr virus
Negativní
Negativní
Platný
Cytomegalovirus
Negativní
Negativní
Platný
Lidský herpesvirus 7
Negativní
Negativní
Platný
Lidský herpesvirus 8
Negativní
Negativní
Platný
BK virus
Negativní
Negativní
Platný
JC virus
Negativní
Negativní
Platný
Parvovirus B19
Negativní
Negativní
Platný
Virus hepatitidy A
Negativní
Negativní
Platný
Virus hepatitidy B
Negativní
Negativní
Platný
Virus hepatitidy C
Negativní
Negativní
Platný
Lidský virus imunodeficience 1
Negativní
Negativní
Platný
Souprava artus HHV-6 RG PCR Kit nevykazovala žádnou křížovou interakci s žádným
jiným organismem.
Lineární rozsah
Lineární rozsah soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit byl posouzen analýzou logaritmického
sériového ředění HHV-6A- a HHV-6B-specifické DNA s použitím koncentračního rozsahu
8
od 10 kopií/µl do 1 kopie/µl (Obrázek 10). Bylo analyzováno alespoň 6 replikátů na jedno
ředění.
31
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
1
Počet cyklů
45
Stanovený log10 koncentrace
(kopie/µl)
Fluorescence
A
Y = 0.9914x + 0.0849
R2 = 0.9996
nominální log10 koncentrace (kopie/µl)
1
Počet cyklů
45
Stanovený log10 koncentrace
(kopie/µl)
Fluorescence
B
Y = 0.9332x – 0.5573
R2 = 0.9998
nominální log10 koncentrace (kopie/µl)
Obrázek 10. Amplifikační křivky a analýza lineární regrese u ředících řad (A) HHV-6A- a (B) HHV-6Bspecifických DNA.
Lineární rozsah soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit se rozprostírá v intervalu nejméně
sedmi řádů pro HHV-6A- a HHV-6B-specifickou DNA.
Přesnost
Přesnost soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit byla stanovena na základě variability testu
(variability v rámci jednoho experimentu), variability mezi testy (variability mezi jednotlivými
experimenty) a variability šarže (rozdílů mezi různými šaržemi).
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
32
Údaje o variabilitě jsou vyjádřeny jako standardní odchylky, rozptyl a variační koeficient.
Údaje jsou založeny na kvantifikační analýze definovaných koncentrací genomové HHV-6
DNA a na prahových hodnotách cyklu (CT) s ohledem na interní kontrolu (Tabulky 10-12).
Nejméně 6 opakování jednoho vzorku bylo analyzováno na základě variability v rámci
experimentu, mezi testy a mezi šaržemi. Celková odchylka byla vypočtena na základě
kombinace všech třech analýz.
Tabulka 10. Přesnost amplifikace HHV-6A
Průměrná
konc.
(kopie/µl)
Standardní
odchylka
Rozptyl
Variační
koeficient (%)
Odchylka
v rámci
experimentu
22.07
2.75
7.56
12.50
Odchylka mezi
testy
23.32
2.88
8.28
12.34
Odchylka mezi
šaržemi
23.63
3.02
9.10
12.76
Celková
odchylka
23.94
2.85
8.12
11.90
HHV-6A
specifický
systém
Tabulka 11. Přesnost amplifikace HHV-6B
Průměrná
konc.
(kopie/µl)
Standardní
odchylka
Rozptyl
Variační
koeficient (%)
Odchylka
v rámci
experimentu
21.58
4.83
23.32
22.37
Odchylka mezi
testy
25.55
3.62
13.10
14.17
Odchylka mezi
šaržemi
24.54
4.63
21.44
18.87
Celková
odchylka
24.23
4.36
19.04
18.01
HHV-6B
specifický
systém
33
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Tabulka 12. Přesnost amplifikace interní kontroly
Průměrná
prahová
hodnota cyklu
(CT)
Standardní
odchylka
Rozptyl
Variační
koeficient (%)
Odchylka
v rámci
experimentu
21.97
0.11
0.01
0.51
Odchylka mezi
testy
21.98
0.09
0.01
0.40
Odchylka mezi
šaržemi
21.97
0.10
0.01
0.44
Celková
odchylka
21.97
0.09
0.01
0.39
Interní
kontrola
Diagnostické ohodnocení
Diagnostická senzitivita a specificita soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit jsou pravidelně
hodnoceny analýzou referenčních a diagnostických vzorků analyzovaných dříve referenční
metodou (Tabulka 13).
Tabulka 13. Diagnostické ohodnocení soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit
Referenční
metoda
artus HHV-6 RG PCR Kit
HHV-6A
HHV-6B
NEGATIVNÍ
HHV-6A
8
0
0
HHV-6B
0
19
0
NEGATIVNÍ
0
0
3
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
34
Opakovatelnost
Specificita, senzitivita a přesnost kvantifikace soupravy artus HHV-6 PCR Kit byla
hodnocena pomocí analýzy odborné způsobilosti panelů pro HHV-6. Aby byla zajištěna
opakovatelnost soupravy artus HHV-6 RG PCR Kit, byly specificita a senzitivita hodnoceny
na základě analýzy odborné způsobilosti panelů pro HHV-6 i diagnostických vzorků v
pravidelných intervalech (Tabulka 14).
Tabulka 14. Výsledky analýzy způsobilosti panelů pro HHV-6 (QCMD)
Způsobilost panelu
artus HHV-6 RG PCR Kit
Detekovaná Detekovaná
Očekávaná konc. HHV- konc. HHV6B
6A
konc.
(kopie/ml)
(kopie/ml)
(kopie/ml)
Interní
kontrola
ID vzorku
Obsah
vzorku
HHV6DNA14-01
HHV-6B
1002
–
474
Platný
HHV6DNA14-02
HHV-6A
596
94
–
Platný
HHV6DNA14-03
HHV-6A
3020
522
–
Platný
HHV6DNA14-04
HHV-6A
171
66
–
Platný
HHV6DNA14-05
HHV-6B
10,000
-
6330
Platný
HHV6DNA14-06
HHV-6B
294
–
93
Platný
HHV6DNA14-07
HCMV
–
–
–
Platný
HHV6DNA14-08
HHV-6
negativní
–
–
–
Platný
HHV6DNA14-09
HHV-6B
843
–
894
Platný
HHV6DNA14-10
HHV-6B
8954
–
9300
Platný
35
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Symboly
Symboly uvedené v následující tabulce jsou použity v příručce.
Symbol
Definice Symbolu
Obsahuje dostatek reagencií pro 96 testů
96
In vitro diagnostický zdravotnický prostředek
Katalogové číslo
Číslo šarže
Teplotní omezení
Výrobce
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
36
Symbol
Definice Symbolu
Doba použitelnosti
Materiálové číslo
Globální číslo obchodní položky
Sledujte návod k použití
Řešení problémů
Vědci z QIAGEN Technické podpory Vám vždy rádi zodpoví všechny otázky, které můžete
mít ohledně informací a/nebo protokolů v této příručce, nebo technologií zpracování vzorků
(kontaktní informace naleznete www.qiagen.com).
37
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Informace pro objednání
Produkt
Obsah
Kat. č.
artus HHV-6 RG PCR Kit (96)
Pro 96 reakcí: Master A, Master B, 4
Kvantifikační Standardy, Interní
kontrola, H2O (pro PCR)
4521265
QIAamp DNA Mini Kit (50)
Pro 50 DNA izolací: 50 QIAamp Mini
Spin kolonek, Proteináza K,
Reagencie, Pufry, Sběrné zkumavky
(2 ml)
51304
QIAamp DNA Mini Kit (250)
Pro 250 DNA izolací: 250 QIAamp
Mini Spin kolonek, Proteináza K,
Reagencie, Pufry, Sběrné zkumavky
(2 ml)
51306
Rotor-Gene Q a příslušenství
Rotor-Gene Q MDx 5plex
Systém
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalaci a školení
9002023
Rotor-Gene Q MDx 5plex
Platform
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalace a školení
nejsou zahrnuty
9002022
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
38
Kat. č.
Produkt
Obsah
Rotor-Gene Q 5plex Priority
Package Plus
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje Priority
Package se softwarem, instalaci,
školení, 3-letou záruku na součástky,
a 3 návštěvy preventivní údržby
9001866
Rotor-Gene Q 5plex Priority
Package
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje Priority
Package se softwarem, instalaci,
školení, 2-letou záruku na součástky,
a 2 návštěvy preventivní údržby
9001865
Rotor-Gene Q 5plex Systém
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalaci a školení
9001640
Rotor-Gene Q 5plex Platform
Real-time PCR cykler s 5 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalace a školení
nejsou zahrnuty
9001570
39
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Kat. č.
Produkt
Obsah
Rotor-Gene Q 6plex Priority
Package Plus
Real-time PCR cykler s 6 kanály
(modrý, zelený, žlutý, oranžový,
červený, karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje Priority
Package se softwarem, instalaci,
školení, 3-letou záruku na součástky,
a 3 návštěvy preventivní údržby
9001870
Rotor-Gene Q 6plex Priority
Package
Real-time PCR cykler s 6 kanály
(modrý, zelený, žlutý, oranžový,
červený, karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje Priority
Package se softwarem, instalaci,
školení, 2-letou záruku na součástky,
a 2 návštěvy preventivní údržby
9001869
Rotor-Gene Q 6plex Systém
Real-time PCR cykler s 6 kanály
(modrý, zelený, žlutý, oranžový,
červený, karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalaci a školení
9001660
Rotor-Gene Q 6plex Platform
Real-time PCR cykler s 6 kanály
(zelený, žlutý, oranžový, červený,
karmínový), laptop, software,
příslušenství: zahrnuje 1-roční záruku
na součástky, instalace a školení
nejsou zahrnuty
9001590
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
40
Kat. č.
Produkt
Obsah
Loading blok pro 72 x 0.1 ml
zkumavky
Hliníkový blok pro manuální přípravu
reakcí s jednokanálovou pipetou v 72
x 0.1 ml zkumavkách
9018901
Stripové zkumavky s víčky,
0.1 ml (250)
250 čtyřstripů a víček pro 1000 reakcí
981103
Stripové zkumavky s víčky,
0.1 ml (2500)
10 x 250 čtyřstripů a víček pro 10,000
reakcí
981106
41
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Tato stránka byla záměrně ponechána prázdná
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
42
Tato stránka byla záměrně ponechána prázdná
43
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
Omezení licenční smlouvy pro artus HHV-6 RG PCR Kit
Použití tohoto výrobku znamená souhlas jakéhokoli kupujícího nebo uživatele výrobku s následujícími podmínkami:
1.
Produkt může být použit pouze v souladu s protokoly dodávanými společně s výrobkem a touto příručkou s použitím složek obsažených v sadě QIAGEN
neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití nebo k začlenění přiložených komponent sady s komponenty, které
nejsou zahrnuty v této soupravě, s výjimkou případů uvedených v příručce této sady a dodatečných protokolů dostupných na www.qiagen.com. Některé z
těchto dodatečných protokolů byly poskytnuty uživateli QIAGEN pro uživatele firmy QIAGEN. Tyto protokoly nebyly důkladně testovány a optimalizovány
společností QIAGEN. QIAGEN nezaručuje, že neporušují práva třetích stran.
2.
QIAGEN neposkytuje žádnou jinou záruku než výslovně stanovené licence v tom smyslu, že tato sada a/Nebo její použití nenarušuje práva třetích stran.
3.
Tato sada a její díly jsou licencovány k jednorázovému použití a nesmí se používat opakovaně, přepracovávat ani opakovaně prodávat.
4.
Tento kit a jeho komponenty jsou licencovány pro jednorázové použití a nesmí být znovu použity, renovovány, nebo před dalším prodejem.
5.
QIAGEN se výslovně zříká jakékoliv jiné licence, vyjádřené nebo předpokládané nebo jiné než výslovně uvedeno.
6.
Kupující a uživatel této sady souhlasí s tím, že neposkytne a nepovolí nikomu jinému provádět žádné kroky, které by mohly vést nebo by usnadnily jakékoliv
shora zakázané činnosti. QIAGEN může zákazy tohoto Omezeného licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích
a soudních poplatků, vč. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto omezeného licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv
duševního vlastnictví vztahujících se na tuto soupravu a/nebo její komponenty.
Aktualizované licenční podmínky viz www.qiagen.com.
Koupě tohoto výrobku umožňuje kupujícímu, aby jej použil k výkonu diagnostických služeb pro člověka v diagnostice in vitro. Žádný obecný patent ani jiná licence
jakéhokoliv jiného než tohoto konkrétního užití práva na nákup druhu není poskytována.
®
®
®
®
®
®
Ochranné známky: QIAGEN , QIAamp , artus , Rotor-Gene , Sample to Insight (QIAGEN Group); FAM™, JOE™ (Life Technologies Corporation); Cy (GE
Healthcare).
HB-1996-003
© 2015 altona Diagnostics GmbH, všechna práva vyhrazena.
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015
44
Objednávejte na www.qiagen.com/contact | Technická podpora support.qiagen.com | Webové stránky
www.qiagen.com
MAN-Q311R13-CS-01
1096238 151045258 10/2015
45
Příručka artus HHV-6 RG PCR Kit 10/2015