Prezentace aplikace PowerPoint - Laboratoř experimentální medicíny

Laboratoř experimentální medicíny
(LEM)
Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D.
Mgr. Marta Dziechciarková, Ph.D.
MUDr. Petr Džubák
MUDr. Josef Srovnal
RNDr. Radek Trojanec, Ph.D.
MUDr. David Vydra
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Muž ? Žena ?
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Význam i v onkologii: RFC gen
(Reduced Folate Carrier Gene)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Fluorescenční in situ hybridizace
(FISH)
Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze
lokalizovat cílové nukleotidové sekvence
přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je
založena na schopnosti jednořetězcové DNA
sondy vázat komplementární úsek cílové DNA
fixované na mikroskopickém skle.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATOŘ
EXPERIMENTÁLNÍ
MEDICÍNY
CEP 17
Her-2/neu
Nepravá
amplifikace
Jádro s
normálním
počtem kopií genu
a chromozomu
Amplifikace
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
t(9;22)(q34;q11)
Philadelphia (Ph) chromozom
(Nowell, Hungerford,1962)
BCR-ABL
CML, ALL, AML, ST
STI-571 (Glivec)
t(15;17)(q22;q11-21)
PML-RARA
AML M3 (PML)
ATRA
Comparative Genomic Hybridisation
(Kallioniemi, 1992)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Mnohobarevná FISH
Microarrays
– analyza tisice genu soucasne
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Molekularni diagnostika v onkologii
• Detekce molekularnich markeru
– Geny, jejichz proteinove produkty se podileji na
maligni transformaci bunky
– Geny s prognostickym vyznamem
– Geny s diagnostickym vyznamem
• Naroky na molekularne-biolgicke metody
– Citlivost
– Specifita
– Rychlost
Některé další geny, účastnící se maligní transformace
buňky, jejichž význam pro cílenou léčbu je nejasný či
není zcela potvrzen
• Protoonkogeny
rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.)
• Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a
n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny)
• Tumor-supresorové geny (TP53, RB1)
• Protoonkogeny rodiny RAS
• BCL-2 a příbuzné protoonkogeny
• TOP2A, RARA a jiné
LABORATOŘ
EXPERIMENTÁLNÍ
MEDICÍNY
Her-2/neu (c-erbB-2)
•Receptor EGF
•Nejčastěji amplifikovaný onkogen
u ca prsu (10-34%)
•Protein p185HER-2 – souvisí s maligní
transformací a agresivitou choroby
•Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací
genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou
trastuzumab (Herceptin)
•Různé metody vyšetření
Vyšetření Her-2/neu (c-erbB-2): IHC x FISH
IHC:0
FISH: normální
Her-2/neu
CEP 17
IHC: 1+ až 2+
FISH: normální
nepravá amp.
amplifikace
IHC: 3+
FISH: amplifikace
IHC fotografie byly
získány ve spolupráci s
Ústavem patologie LF UP
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
CEP 17
LSI Her-2/neu
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy:
¾
senzitivita na antracykliny
¾
aplikace Herceptinu
TOP2A: Topoizomeráza II α = cíl pro některé typy
cytostatik: inhibitory topoizomeráz II
tj. senzitivita na antracykliny
RARA: Citlivost k léčbě retinoidy?
MTT test: (Mihál et al, Klin Onkol 2000;2:39-42)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
PROCENTO PŘEŽÍVAJÍCÍCH BUNĚK
V ZÁVISLOSTI NA KONCENTRACI
CYTOSTATIKA
100
50
0
Podíl žívých buněk (v %)
%
C max
C min
Koncentrace cytostatika (v přísl. jednotce)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Exprese MDR proteinů u
karcinomu plic.
MRP-1
p53
TopoIIα
Pgp
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Mnohočetná léková rezistence (MDR)
• P- glykoprotein (Pgp, P170)
• Multidrug resistance related protein
(MRP 1-7)
• Breast cancer resistance protein
(BCRP, MXR, ABCP)
• Lung resistance related protein
(LRP, MVP)
transport přes
cytoplazmatickou
membránu
ABC transportní
proteiny
nukleocytoplazmatický
transport
• Glutathion (GSH) a
glutathion-S-transferáza π (GST-π)
detoxifikační systém
buňky
• DNA topoizomerázy
replikace DNA
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Látky transportované proteiny MDR
Pgp
Antracykliny, Vinca alkaloidy, deriváty Camptotecinu, epipodofylotoxiny,
taxany, chromopeptidové antibiotika, HIV-1 proteázové inhibitory, flurofory
kortikoidy (Dexametazon)
MRP
Organické anionty, glutathionové konjugáty, leukotrien LTC4,
antagonisté leukotrienových receptorů LTsR, deriváty Pt, glukuronidy.
BCRP
Mitoxantron, topotecan, flavopyridol, prazosin a řada dalších hydrofobních
a amfifilních látek.
LRP
Antracykliny, Vinka alkaloidy, VP-16, deriváty platiny.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
VÝSKYT MNOHOČETNÉ LÉKOVÉ
REZISTENCE
U NĚKTERÝCH CYTOSTATIK
MDR častá
MDR vzácná
aktinomycin D
doxorubicin
daunorubicin
vepesid
mitoxantron
taxol
vinkristin
bleomycin
cisplatina
cyklofosfamid
cytosin arabinosid
5-fluorouracil
ifosfamid
metotrexát
topotekan
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Používané inhibitory MDR
Pgp
Verapamil 6-10 μM, Nifedipin 35μM, CyA 0.8-2μM,
PSC 833 0.1μM
MRP
CyA 0.8-2μM
Probenecid 2mM,
BCRP
Fumitremorgin C 1μM
Metody používané k hodnocení
exprese a funkce MDR.
Exprese: Western blott, Imunoprecipitace
Imunohistochemie
Flow cytometrie
Funkce: flow cytometrické stanovení akumulace,
či efluxu fluorescenčních substrátů ( DNR,
Rhodamin123) za použití specifických či
nespecifických inhibitorů (CyA, PSC833).
scintigrafie - in vivo hodnocení akumulace
99mTc-MIBI v nádorové tkáni
cytotoxické testy - MTT
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Exprese Pgp - přímá
imunofluorescence (FACS)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Funkční aktivita Pgp
Hodnocen eflux DNR(1μM)
1. Prekultivace v čistém médiu
s a bez inhibitorů 1 hodinu.
2. Přidání DNR, kultivace 1 hod.
3. Odmytí a kultivace v čistém
médiu s a bez inhibitorů 2hod.
CyA(1μM), Probenecid(2mM).
Hodnocení BC pomocí průtokové
cytometrie.
Vztah procenta S fáze k
prognóze nádorů.
Vyšší % S
fáze znamená
Druh nádoru
prognózu
Horší
Kolorektální karcinom, karcinom močového měchýře,
astrocytomy vyššího stupně, velkobuněčný nonHodgkinský lymfom, karcinomy děložního čípku,
germinální nádory varlat, non-Hodgkinské lymfomy,
myelodysplastický syndrom.
Lepší
nefroblastom
Hodnocení ploidity pomocí
průtokové cytometrie.
Hodnotíme změnu vůči
„normální“ diploidní populaci.
Pro hodnocení používáme DNA
index (DI).
Haploidní DI = 0,5
Hypoploidní DI < 1
Diploidní (Euploidní) DI = 1
Hyperploidní DI > 1
Tetraploidní DI = 2 (1,85 –2,1)
Aneuploidní – DI jiný než 0,5, 1 a2
Multiploidní - více populací s
různým DI.
Vztah DNA-ploidie k prognóze
nádorů.
Aneuploidie
znamená
prognózu
Druh nádoru
Horší
Karcinom močového měchýře, karcinom ledviny, karcinom žaludku,
karcinom prsu, kolorektální karcinom, karcinom jícnu, maligní melanom,
ovariální karcinomy, nazofaryngeální karcinom, karcinom žaludku,
mnohočetný myelom, gliální nádory CNS, germinální nádory varlat i
extragonadální, nemalobuněčný karcinom plic, adrenokoritíkální
karcinom, endometriální karcinom, karcinom děložního čípku, karcinom
prostaty, karcinom uretry, mycosis fungoides, sarkomy měkkých tkání u
dospělých, papilární a medulární karcinom štítné žlázy, maligní
ependymom, myelodysplastický syndrom, non-Hodgkinské lymfomy,
condrosarkom, thymom, leiomyosarkom dělohy
Lepší
Neuroblastom, meduloblastom, akutní lymfoblastická leukemie pre – B
typu dětského věku, karcinom dutiny ústní, hydatiformní mola.
Hmotnostní spektrometrie:
Jak vypadá hmotnostní hmotnostní
spektrometr?
Analytický instrument, který přeměňuje složky vzorku na ionty v plynné fázi a
měří jejich hmotnost.
● Vstup: vstup vzorků (tělní tekutiny, kondenzát, extrahovaná tkáň) do
systému –a to jako pevná fáze, kapalina nebo plyn
● Zdroj: přeměna složek vzorku na ionty - bombardování fotony, elektrony,
ionty, atomy...
● Analyzátor: separace iontů dle m/z - el. pole, mag. pole, čas na dráze.
● Detektor: detekce separovaných iontů – fotonásobič, supercitlivý magnet.
● Data processor: příjem a zpracování dat - obrovské množství dat.
● Vakuum: eliminace okolních atomů - výkonné vakuové pumpy.
U nás v laboratoři MALDI-TOF MS/MS
Co je to MALDI?
● Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - typ zdroje.
● Metoda umožňující odpaření a ionizaci (měkkou) netěkavých biologických vzorků z
pevné fáze přímo do plynné.
● Vzorek je smíchán s tzv. matricí (~1000× molární přebytek) a ozářen pulsním
laserem (UV nebo IR) - odpaření a ionizace.
● Vhodné pro peptidy, proteiny, DNA, polysacharidy i některé synth. polymery.
● 2002 - Nobelova cena.
Co je to TOF?
Time-Of-Flight - typ analyzátoru.
● Ionty jsou ze zdroje urychleny vysokým napětím do letové trubice bez el.
pole.
● Separace dle doby letu k detektoru - závislá na m/z.
● Ep = Ekin = U × z = ˝mv2 ... m/z ~ t2
● Nutná kalibrace na známé hmotnosti.
K čemu to celé je?
Hmotnostní spektrometr umí pouze měřit molekulové
hmotnosti – na nás je, jak toho využijem.
● Stanovení MW
● Identifikace proteinů - "protein mass fingerprint".
● Identifikace posttranslačních modifikací.
● Identifikace "single nucleotide polymorfism".
● Ověřování sekvence peptidů.
● Ověřování čistoty vzorků.
Určení MW – MALDI
Luminex xMAP® technologie
http://www.luminexcorp.com
Luminex xMAP® technologie
http://www.luminexcorp.com
Luminex xMAP® technologie
http://www.luminexcorp.com
LUMINEX vs. ELISA
™ Multiplexní kvantifikace až 100 různých analytů v
jednom vzorku.
™ Flexibilní – je možné jednoduše rozšířit stávající
vyšetření o další analyty.
™ Je požadován pouze malý objem vzorku. (25 μl)
™ Je rychlejší. Jsou kratší inkubační časy, někdy
není třeba použít promývání.
™ Srovnatelná sensitivita. Může detekovat cytokiny
až k ~1 pg/ml.
Screening: LUMINEX analyty
Panel I
Panel II
Panel
III
Cytokiny:
IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-17, IL18, TNFα, TNFR I, TNFR II, IFNγ , GM-CSF, G-CSF,
Chemokiny:
RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, Eotaxin, MIG
Růstové a angiogení faktory:
EGF, EGFR, VEGF, bFGF, HGF, VEGF, NGF
Nádorové antigeny: CA 125, CA 15-3, CEA, AFP, CA 19-9
Apoptotické proteiny: sFas and sFasL
Růstové faktory, onkogeny: EGFR, Her2/neu
Proteázy: PSA free, kallikrein 8, MMP-2,3,7,9, TIMP-1, TIMP-2,
Další markery: Cyfra 21-1, TPA, M-CSF, HMGB-1, S-100, LDH, CRP
Cirkulující protilátky:
Cytokiny: IL-6, IL-8; Růstové faktory, receptory: EGF, EGFR, VEGF,
Her2/neu, PDGF, PDGFR; Nádorové antigeny: CA 125, 15-3, 19-9,
72-4, CEA,MUC-1, PSA; Diferenciační molekuly: AFP, bhCG;
Apoptotické moleculy: survivin, Fas, FasL; transglutamináza;
Onkogeny: c-myc, N-Ras, K-Ras, Akt1, p53; Molekuly zasahující do
budněčného cyklu: cyklin B, cyklin D
Luminex xMAP® sérové koncentrace cytokinů u
pacientů s časným stádiem karcinomu ovária a
zdravých kontrol.
70
IL-8, pg/ml
9.1±2.51 (0-64.1)
100
*
10.6±1.67 (2.3-51.4)
50
40
30
20
10
Control
0
OvCA
Control
700
400
300
200
***
400
300
200
100
0
0
OvCA
49.2±11.90 (0-290.8)
17.9±7.86 (0-257.6)
*
200
100
0
Control
450
230.9±20.18 (23.4-560.0)
500
100
Control
0
OvCA
189.4±21.05 (45.0-620.1)
600
VEGF, pg/ml
MCP-1, pg/ml
210.3±20.30 (17.1-502.3)
500
300
Control
OvCA
OvCA
223.7±11.46 (29.0-402.6)
348.4±20.88 (135.5-695.7)
700
600
250
EGF, pg/ml
0
209.8±16.90 (52.3-500.0)
170.0±13.22 (20.0-400.0)
500
Control
OvCA
110.6±15.4 (0-396.9)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
***
Control
OvCA
114.4±22.67 (0-592.0)
600
500
CA 125, IU/ml
IL-6, pg/ml
60
200
24.0±5.91 (2.0-180.6)
80
G-CSF, pg/ml
***
IL-12p40, pg/ml
64.2±12.57 (0-280)
300
400
300
200
9.7±2.31 (0-87.0)
100
0
Control
OvCA
***
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM)
LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně.
Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
PRINCIP LASEROVÉ
MIKRODISEKCE
• inverzní mikroskop se
zabudovaným nízko
výkonnostním infračerveným
laserem a UV laserem
• nad dehydratovaný preparát
je umístěno víčko s
termoplastickou membránou
• vyřezávání buněk pomocí
laseru
• vyřezané buňky jsou uchyceny
na víčko
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
TECHNIKA LASEROVÉ
MIKRODISEKCE
Cytologický preparát
adenokarcinomu plic
Parafinový/kryořez
nádorové tkáně
Cytospin, buněčná
linie K562
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LINEÁRNÍ AMPLIFIKACE DNA
PK-trávení
MseI štěpení
Annealing a ligace adaptérů
PCR - amplifikace
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Výsledek CGH po LCM – idiogramy
K 562 – směsná populace
Cytogenetický nález:
REV ISH ENH (3q29qter; 5p12-13.3; 5p15.2pter; 6p25.1pter;
12p11.1pter; 16p11.2-12; 18q21.3qter)
REV ISH DIM (9q34.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter;
16q12.1-13; 17p11.1-11.2; 18q11.2-12.1; 19p13.3pter)
K 562 - 1 buňka po LCM
Cytogenetický nález:
REV ISH ENH (1p36.2pter; 3q26.3qter; 4p11.1pter; 4q35qter;
6p11.1-12.1; 9q13-21; 12p11pter; 15q11.2-24.1; 16p11.2.-12;
17p12.1pter; 17q22qter; 18q22qter)
REV ISH DIM (5q11.2-15; 5q34.0-35.1; 7q11.2-21.1; 9p12-21;
9q21.3qter; 10q22.1-22.3; 10q26.1qter; 12q21.1-21.3;
13q11.1qter; 16q12.1.-22; 19p13.3pter)
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
VYUŽITÍ LCM A LINEÁRNÍ AMPLIFIKACE
NUKLEOVÝCH KYSELIN PRO ÚČELY
GENETICKÝCH A CYTOGENETICKÝCH ANALÝZ
•
•
•
•
•
Zvýšení detekčního limitu genetických, cytogenetických a expresních
změn v nádorech a tkáních s minimálním zastoupením cílových buněk
(< 50%)
Genetická a cytogenetická diagnostika z minimálního množství
biologického materiálu.
Studium heterogenity nádorové populace na jednobuněčné úrovni
Studium expresních profilů a genetických charakteristik v různých
buněčných populacích (např. stromální versus nádorové buňky)
Materiál po LCM je technicky použitelný pro studium pomocí
prakticky všech PCR technik, mikroarray technologií, sekvenování
DNA i pro proteomické studie založené na principu hmotnostní
spektrometrie.
Metoda PCR
denaturace a následný anealing primerů
denaturace a následný anealing primerů
denaturace a následný anealing primerů
syntéza nové řetězce
dvoušřoubovice DNA
denaturace a následný anealing primerů
syntéza nové řetězce
syntéza nové řetězce
syntéza nové řetězce
Rozdělení DNA a vizualizace na agarózovém gelu
1 2 3 4
5 6
7 8 9 X
1 2
3
4
5 6
7 8
9 10 11 12
Sekvenace DNA
ATCCACGGCTG
ATCCACGGCTG
Množení DNA pomocí baktérií
Příklad praktického výstupu analýzy DNA
- detekce bodových mutací v sekvenci
Příklad praktického výstupu analýzy DNA
- delece části genu
produkt částečně
deletovaného genu
produkt odpovídající
nedeletovanému genu
Detekce minimální reziduální choroby
• Detekujeme přítomnost izolovaných nádorových buněk v krvi,
kostní dřeni a lymfatickém systému – možné prekurzory
mikrometastáz
• Metoda spadá na základě citlivosti do oblasti ultrastagingu;
běžné zobrazovací metody sloužící v oblasti onkologie spadají do
oblasti stagingu
Detekce MRD (minimal residual disease) - detekce znaků
epiteliálních buněk v kompartmentech mesenchymálního
původu
•
•
•
•
Imunohistochemie – citlivost 1:10 000
Průtoková cytometrie – citlivost 1: 100 000
PCR – citlivost 1: 1 000 000
V naší laboratoři zavedená metoda
Real time RT-PCR– citlivost až 1: 10 000 000
(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)
Princip detekce mimimální reziduální choroby metodou
RT-PCR – studium genové exprese
Epiteliální (nádorová) buňka
Mezenchymální (nenádorová) buňka
DNA
hledaný mRNA znak
mRNA
cDNA
DNA amplikon
Izolace RNA–možná
jen ze živých buněk
Reverzní transkripce s
náhodnými (random) primery
PCR reakce se specifickými
primery
detekce amplikonu na
gelu
Real time RT-PCR, detekce fluorescenčně označeného amplikonu v reálném čase v průběhu PCR
reakce, fluorescenční značení je buď nespecifické (DNA interkalátory) nebo specifické (sondy),
díky standardům je detekce kvantitativní
Příklad real-time RT-PCR záznamu
Využití detekce minimální reziduální
choroby v klinické onkologii
•
•
•
•
•
•
Detekce MRD a rozhodnutí o adjuvantní léčbě
Monitoring MRD v čase – relaps vs. remise
Včasný záchyt recidivy
Hodnocení léčebné odpovědi
Diferenciální diagnostika
Autologní transplantace při HD chemoterapii
Markery zavedené v naší laboratoři pro
detekci minimální reziduální choroby
1. Mamaglobin 1 – MGB1
- patří do rodiny uteroglobinů - malých epiteliálních sekrečních
proteinů; známe 6 lidských mamaglobinů
- vysoce specifický pro prsní tkáň, v prsní nádorové tkáni až 10-ti
násobná overexprese
- není exprimován v buňkách mezenchymálního původu
2. Karcinoembryonální antigen - CEA
- glykoprotein patřící do velké rodiny CEA, blízké imunoglobulinům
- gen je zvýšeně exprimován u karcinomů trávicí trubice a fetálních
tkání
- nízká exprese i v leukocytech zdravých dárců
3. Glyceraldehydfosfátdehydrogenáza – GAPDH - kontrolní gen
- kontrola kvality zpracovaných vzorků (degradace RNA, úspěšnost
transkripce)
Další možné dosud nezavedené markery-EGFR, cytokeratiny, EpCAM,
mucin, tyrozináza
Detekce minimální reziduální choroby u pacientů s
kolorektálním karcinomem – hledaný znak CEA
•
•
•
•
•
•
V den operace - detekce karcinoembryonálního antigenu (CEA) v nádorové
tkáni, popř. v metastáze, v systémové a portální krvi před i po operaci.
Následné odběry kostní dřeně a systémové krve v čase – 1 měsíc po operaci
a u vytipovaných pacientů i v dalších časových intervalech
Stanovená Cut-off hodnota na základě vyšetření 58 zdravých dárců
250 kopií CEA / µg RNA
K září 2005 vyšetřeno cca 250 pacientů
Pro dosažení větší specifity a senzitivity je nutné zavádění dalších znakůvytvoření multipanelu
Příklady vyšetření MRD u pacientů s různým rozsahem onemocnění
Počet kopií CEA v jednotlivých vzorcích na množství 1µg RNA
Pacient Tumor
Meta
PK před PK po SK před SK po SK II.od. KD
MRD 69
98 280 320 ND
25
155
332
478
618
MRD 70
5 655 150 ND
55
5
355
260 20 360
MRD 72
9 220 ND
170 77 140
100
40
50
MRD 74
64 459 440 ND
82
60 ND
970
292
MRD 94 195 213 570 ND
205
0
125
5
430
MRD 97 206 063 270 ND
30
380 ND
520
280
MRD 106 108 918 050 ND
0
90
150
223
260
MRD 34 166 363 370 57 178 380 183 979 2 782
0
30
430
LU
Staging
KD II.od. pozit. v % TNM Dukes Stad.
0 pT1N0MX A
0
583
420
220
10
100 pT4N3MX D
4
165
0 pT3N0
B
2
260
150 ND
40 pT3N1M1 D
4
15
10 pT3N1
C1
3
265
5
17 pT2N1
C1
2
400
0 pT2N0MX A
1
340
1 022
100 pT3N1M1 D
4
410 ND
MRD u karcinomu prsu – sentinelová uzlina
•
Sentinelová „strážní“ uzlina – drénující nádor – přítomnost
nádorového postižení sentinelové uzliny značí postižení axillárních
uzlin ve více jak 95%
• Vyšetření sentinelové uzliny – dvě skupiny pacientů – rozdílná léčba
• Výhody real-time RT-PCR: 1. Vysoká senzitivita
2. Zpracování celého vzorku
• Markery – mammaglobin MGB1 a karcinoembryonální antigen