zde - AUC.cz

ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE
JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH
BUDĚJOVICÍCH
ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU
Projekt
Název projektu: Multilocus sequence analysis as a tool for robust phylogeny in
heterocytous cyanobacteria
Průběh řešení projektu :
V průběhu řešení projektu byly splněny všechny hlavní cíle stanovené v původním návrhu.
Bylo shromážděno několik desítek izolátů málo prostudovaných zástupců terestrických
heterocytózních sinic r. Scytonema, Brasilonema, Microchaete, Tolypothrix a dalších, a
přibližně 20 environmentálních vzorků obtížně kultivovatelných sinic r. Stigonema a
Petalonema pro amplifikaci DNA z izolovaných buněk (single cells). Vzorky pocházejí
z široké škály geografických oblastí včetně málo prostudovaných tropických oblastí (Filipíny,
Havajské ostrovy, Kostarika) a lokalit v temperátním pásmu (Evropa, USA).
V úvodní části projektu byla podrobně zpracována fylogeneze celé skupiny (Nostocales)
na základě všech kvalitních (> cca 800 bp) sekvencí 16S rDNA z databáze GenBank a
vlastních sekvencí získaných před zahájením a v průběhu práce na projektu. Tato
fylogenetická studie představuje dosud nejkompletnější a nejaktuálnější přehled o evoluci
heterocytózních sinic a bude využita v několika připravovaných publikacích a v důležité
monografii řádu Nostocales (viz výsledky). Na základě výsledků této předběžné analýzy byly
vybrány vhodné kmeny pro testování multilokusové analýzy (Tab. 1., Obr. 1.).
Hlavním cílem projektu byla optimalizace multilokusové fylogenetické analýzy pro použití
na vzorky terestrických heterocytózních sinic. V průběhu projektu byly na fylogeneticky
reprezentativním výběru kmenů testovány primery a PCR protokoly pro amplifikaci pěti
široce využívaných lokusů s použitím dříve publikovaných prací s vlastními úpravami (Tab.
2.). Dosud byla optimalizována amplifikace a sekvenace tří různých markerů.
Dalším cílem projektu bylo zavedení metod izolace jednotlivých buněk (single cells)
obtížně kultivovatelných zástupců pro molekulární analýzu. Tato metodika byla úspěšně
optimalizována pro relativně širokou škálu vzorků r. Stigonema, u kterých se zdařilo
z izolovaných buněk amplifikovat gen pro 16S rRNA (Obr. 1., Tab. 1.). Vzhledem k náročné
optimalizaci izolace buněk a navazujících PCR protokolů nebyly u těchto vzorků dosud
studovány ostatní DNA markery. Byly též učiněny pokusy o amplifikaci celého genomu
z buněk metodou multiple displacement amplification (MDA, Ishoey et al. 2008). Tato
metoda přinesla úspěch pouze u jednoho vzorku a bude vyžadovat další optimalizaci.
Dosažené výsledky:
Byla zpracována celková fylogenetická analýza heterocytózních sinic na základě všech
dostupných 16S rDNA dat z databáze GenBank a vlastních nepublikovaných sekvencí
zástupců méně prostudovaných čeledí Microchaetaceae, Stigonemataceae, Rivulariaceae a
Scytonemataceae. Výsledky fylogenetické analýzy budou mimo vlastního projektu a
navazujících studií použity pro 2 další publikace, které jsou v současnosti v recenzním řízení
nebo v přípravě do tisku:
1. Komárek J. & Mareš J. (2012): Modern taxonomy (2011) of freshwater planktic
heterocytous cyanobacteria. - Submitted to Hydrobiologia.
2. Komárek J. (2012): Cyanoprokaryota. 3. Teil: Nostocales. Süβwasserflora von
Mitteleuropa 19/3. - Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier GmbH, München, in
prep.
Na základě 16S rDNA stromu byli vybráni zástupci fylogenetických větví, které dosud
nebyly studovány pomocí multilokusové analýzy (viz Obr. 1.). Vybrané kmeny posloužily
k testování zvolených markerů, které se běžně využívají zejména ve studiích zaměřených na
planktonní typy heterocytózních sinic (Rajaniemi et al. 2005, Lyra et al. 2005, Moreira et al.
2011). Doposud byla provedena optimalizace PCR pro tyto testovací kmeny a sekvenace 3
vybraných DNA lokusů - rbcLX, rpoC1 a nifD (viz. Tab. 2. a 3.). Fungující protokoly budou
využity v nejbližší době pro konstrukci statisticky robustního fylogenetického stromu
heterocytózních sinic a dále v následných podrobných studiích jednotlivých skupin
(Scytonemataceae, Stigonemataceae, Microchaetaceae, Rivulariaceae).
Tabulka č. 1. Vybrané kmeny heterocytózních sinic použité v rámci projektu pro testování
DNA markerů a single-cell PCR.
Název vorku
Původ
Izolace
DNA/
buňky
Sekvence
Brasilonema sp. F20B II.
terestrický nárost,
Filipíny
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
Scytonema sp. F26 II.
terestrický nárost,
Filipíny
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
Tolypothrix sp. T3
nárost, skleník,
bot. zahrada
Teplice
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
Scytonema hyalinum
terestrický nárost,
Havaj
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
“Scytonema” sp. F26 III.
terestrický nárost,
Filipíny
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
Scytonematopsis sp. Sic09
kámen, Cava
Grande di
Cassibile, Sicílie
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1, nifD
Microchaete sp. T10
nárost, skleník,
bot. zahrada
Teplice
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1
Tolypothrix distorta CCALA 194
půda, květináč,
Nizozemsko
DNA
16S+ITS rDNA, rbcLX, rpoC1
Stigonema cf. mammilosum 5-4 CR
kámen, horský
mlžný les,
Kostarika
kámen, potok,
Norsko
skalní stěna, Great
Smoky Mts., USA
vlhký kámen,
Great Smoky Mts.,
USA
vlhký kámen,
Great Smoky Mts.,
USA
kámen, Great
Smoky Mts., USA
kámen, Great
Smoky Mts., USA
mrtvé dřevo, Great
Smoky Mts., USA
kámen, Great
Smoky Mts., USA
skála, Holubovské
hadce, CZ
skála, ostrov
Kauai, Havaj
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
buňky
16S rDNA
Stigonema mammilosum Nor. 2007
Stigonema mammilosum CDBWA
Stigonema cf. tomentosum CAT1C
Stigonema ocellatum CAT1 IIII
Stigonema informe CAT5C
Stigonema hormoides CAT3A
Stigonema ocellatum NRO
Stigonema cf. mammilosum CDBWD
Stigonema panniforme CZ
Stigonema panniforme Hawaii
V rámci testování metod pro analýzu izolovaných buněk (single-cells) byla úspěšně
optimalizována amplifikace genu pro 16S rDNA z buněk u 11 vybraných kmenů r. Stigonema
(Tab. 1, Obr. 1.). Opakovaná sekvenace buněk ze všech vzorků potvrdila reprodukovatelnost
výsedků. Fylogenetická analýza potvrdila existenci monofyletického rodu Stigonema a
upřesnila jeho postavení v rámci systému sinic. Genomová amplifikace (MDA), PCR
amplifikace dalších markerů, a studium dalších nekultivovatelných sinic nebyly dosud
dokončeny nebo zoptimalizovány a jsou v plánu v následujícím roce.
Tabulka č. 2. Testované primery pro multilokusovou analýzu.
primer
sekvence
cíl
zdroj
HEPF
5´-TTT GGG GTT AAC TTT TTT GGG CAT AGT C-3´ mcyE
Jungblut & Neilan 2006
?1
HEPR
5´-AAT TCT TGA GGC TGT AAA TCG GGT TT-3´
mcyE
Jungblut & Neilan 2006
?1
mcyE-F2
5´-GAA ATT TGT GTA GAA GGT GC-3´
mcyE
Rantala et al. 2004
-
mcyE-R4
5´-AAT TCT AAA GCC CAA AGA CG-3´
mcyE
Rantala et al. 2004
-
nifD552-F
5´-TCC GKG GKG TDT CTC AGT C-3´
nifD
Roeselers et al. 2007
78%
nifD861-R 5´-CGR CWG ATR TAG TTC AT-3´
nifD
Roeselers et al. 2007
78%
nifD-F
5´-GAT GGC GAT GTA TGC TGC TAA CAA C-3´
nifD
Henson et al. 2004
-
nifD-R
5´-GTA CGG AAG TAA GCA ACG CAA CCT TG-3´
nifD
Henson et al. 2004
-
CW
5´-CGT AGC TTC CGG TGG TAT CCA CGT-3´
rbcLX
Rudi et al. 1998
100%
CX
5´-GGG GCA GGT AAG AAA GGG TTT CGT A-3´
rbcLX
Rudi et al. 1998
100%
rpc/MF
5´-GGT GAR GTN ACN AAR CCA GAR AC-3´
rpoC1
Seo & Yokota 2003
100%
rpc/CR-1
5´-CCA GAR TAG TCN ACC CGT TTA CC-3´
rpoC1
Seo & Yokota 2003
100%
GB/3MF
5´-AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG-3´
gyrB
Seo & Yokota 2003
-
GB/CR-2
5´-CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC-3´
gyrB
Seo & Yokota 2003
-
gyrB-F
5´-GGC ATC ATT TCA CCC AAA CCT TTG-3´
gyrB
vlastní design
-
gyrB-R
5´-ATG ACG AGC AGT TAC AGT GCC GA-3´
gyrB
vlastní design
-
* – vztahuje se k 9 vybraným kmenům pro testování multilokusových markerů
1 – dosud není dokončena optimalizace PCR
úspěšnost*
Obrázek č. 1. 16S rDNA strom heterocytózních sinic (Maximum likelihood, 512 boostrap
replikací, phyML GTR+G+I, 168 OTUs). Modrá čára – rod Stigonema, tučně jsou vyznačeny
sekvence získané po PCR amplifikaci single cells; zelené šipky – fylogenetické větve, v rámci
kterých již byla provedena multilokusová analýza jinými autory; červené šipky –
fylogenetické větve, ze kterých byli vybráni zástupci pro multilokusovou analýzu v rámci
projektu.
Stav čerpání finančních prostředků:
Byly vyčerpány veškeré finanční prostředky na nákup laboratorního materiálu pro
molekulární analýzy podle navrženého rozpočtu, viz Tabulku č. 3. Byla zakoupena učebnice
bioinformatiky Beginning Perl for Bioinformatics (Tisdall, J. 2001, O´Reilly Media, USA)
v hodnotě 700 Kč.
Tabulka č. 3. Čerpání finančních prostředků (materiál).
Popis materiálu
Qiagen REPLI-g Mini Kit (100) - 1x
Invisorb Fragment CleanUp, 250 purifications - 1x
2X Red PCR Master mix; 500 reactions - 2x
Rukavice latexové nezaprašované S - 40x
Rukavice latexové nezaprašované M - 10x
Celkem
Cena včetně DPH (Kč)
17280
9116
12362
5680
1420
45858
Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce:
Výsledky projektu budou použity v řadě navazujících prací v rámci dlouhodobého
výzkumu evoluce a taxonomie heterocytózních sinic v naší laboratoři. Fylogenetický strom
vypočtený v průběhu projektu z 16S rDNA dat je součástí dvou publikací v recenzním řízení a
nadále bude využíván jako základní srovnávací model pro další studie. Optimalizované
protokoly pro amplifikaci 3 dalších DNA markerů nám v nejbližších měsících umožní rychle
shromáždit data potřebná pro tvorbu fylogenetického stromu Nostocales na základě dosud
nejreprezentativnějšího datasetu (4 lokusy, přítomnost sekvencí z málo prostudovaných
vývojových větví). Očekáváme odeslání těchto výsledků k publikaci v příštím roce.
Multilokusová analýza bude dále využita při řešení projektu GAČR P506/12/1818
zaměřeného na fylogenezi a diverzitu čeledi Scytonemataceae. Důležitým výsledkem je také
úspěšné zavedení metodiky sekvenace 16S rDNA z izolovaných buněk u nekultivovatelných
sinic r. Stigonema. Výsledky této práce budou v příštím roce připraveny k publikaci. Pokud se
potvrdí využitelnost i pro další typy sinic, bude se jednat o metodický průlom v současné
molekulární taxonomii sinic.
V Českých Budějovicích dne 29. 11. 2011
RNDr. Jan Mareš
(řešitel projektu)
Literatura:
Henson B.J., Hesselbrock S.M., Watson L.E. & Barnum S.R. 2004. Molecular phylogeny of
the heterocystous cyanobacteria (subsections IV and V) based on nifD. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 54:493-497.
Ishoey T., Woyke T., Stepanauskas R., Novotny M. & Lasken R.S. 2008. Genomic
sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol.
11:198-204.
Jungblut A.-D. & Neilan B.A. 2006. Molecular identification and evolution of the cyclic
peptide hepatotoxins, microcystin and nodularin, synthetase genes in three orders of
cyanobacteria. Arch. Microbiol. 185:107-114.
Lyra C., Laamanen M., Lehtimaki J.M., Surakka A. & Sivonen K. 2005. Benthic
cyanobacteria of the genus Nodularia are non-toxic, without gas vacuoles, able to glide
and genetically more diverse than planktonic Nodularia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
55:558-568.
Moreira C., Fathalli A., Vasconcelos V. & Antunes A. 2011. Genetic diversity and structure
of the invasive toxic cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii. Curr. Microbiol.
62:1590-1595.
Rajaniemi P., Hrouzek P., Kaštovská K., Williame R., Rantala A., Hoffmann L., Komárek J.
& Sivonen K. 2005: Phylogenetic and morphological evaluation of the genera Anabaena,
Aphanizomenon, Trichormus and Nostoc (Nostocales, Cyanobacteria). Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 55:11-26.
Rantala A., Fewer D.P., Hisbergues M., Rouhiainen L., Vaitomaa J., Borner T. & Sivonen K.
2004. Phylogenetic evidence for the early evolution of microcystin synthesis. Proc. Nat.l
Acad. Sci. U S A 101:568-573.
Roeselers G., Stal L.J., van Loosdrecht M.C.M. & Muyzer G. 2007. Development of a PCR
for the detection and identification of cyanobacterial nifD genes. J. Microbiol. Meth.
70:550-556.
Rudi K., Skulberg O.M. & Jakobsen K.S. 1998. Evolution of Cyanobacteria by exchange of
genetic material among phyletically related strains. J. Bacteriol. 180:3453-3461.
Seo P-S. & Yokota A. 2003. The phylogenetic relationships of cyanobacteria inferred from
16SrRNA, gyrB, rpoC1 and rpoD1 gene sequences. J. Gen. Appl. Microbiol. 49:191-203.