07_3_3_Integrita_gen..

STABILITA GENOMU I.
Poškození DNA
Mutace genů a chromosomů
Poškození DNA...
V jakém rozsahu?
odhadem dochází
k 1 000 000 000 000 000 000
událostí poškození DNA u každého dospělého člověka denně
Zdroje poškození DNA
Exogenní
potrava ‐ mykotoxiny (aflatoxiny, aktinomycin D aj.)
sluneční záření (UV složka)
ionizující záření (rozpad radonu)
dehtové zplodiny (tabák, výfukové plyny) chemoterapie
Endogenní
spontánní alterace DNA
oxidační poškození, chemické modifikace
metabolismus DNA – replikace, transkripce, V(D)J rekombinace
Základní pojmy
Genetická toxikologie ‐ vyhodnocuje účinek chemických látek a fyzikálních vlivů na DNA
‐ řada dědičných a získaných chorob (zhoubné bujení) vzniká následkem mutací genomu
‐ identifikuje mutageny/genotoxiny pro vyhodnocení rizika jejich působení na organismy
‐ k mutacím genomu dochází tehdy, vede‐li poškození
DNA ke změně sekvence DNA nebo struktury chromosomů
‐ mutagen je látka působící mutace ‐ karcinogen je mutagen, který způsobuje vznik zhoubného bujení
Silné exogenní karcinogeny
etylenoxid; 1,2‐butadien; benzen; benzpyren
V játrech:
oxidovaná forma BP
Karcinogeny z potravy
aflatoxin přirozený produkt plísní Aspergillus
Přehled typů poškození DNA
Ztráta jednotlivých bází
Modifikace bází
deaminace
chemické modifikace
fotopoškození
Inkorporace analogů bází
Interkalace
Chyby replikace
Příčné vazby
mezivláknové
intravláknové
DNA‐proteinové příčné vazby
Zlomy řetězců jedno‐, dvouvláknové
Průměrná frekvence jednotlivých typů
poškození DNA v buňce za 24 hodin
TYPE OF DAMAGE events/cell/day
Single‐strand breaks
N7‐MethylGuanine
Depurination O6‐MethylGuanine Oxidized DNA Depyrimidation Cytosine deamination Double‐strand breaks Interstrand cross‐links 120 000
84 000
24 000
3 120 2 880 1 320 360 9
8
% of total daily damage
50.9 35.6 10.2 1.3 1.2 0.5 0.2 0.01 0.01
Ztráty bází
Vznik:
‐ spontánní depurinace (cca 10 tis. depurinací/buňku za den za fyziologických podmínek) ‐ oxidace hydroxylovými radikály (cca 10 tis. depurinací/buňku za den během aerobní respirace) Selhání oprav abasických míst vede k delecím:
Deaminace cytosinu
‐ nejčastější báze podléhající deaminaci ‐ může se párovat s tyminem
a způsobovat transverzi C‐>A
‐ odstraňován uracilglykohydrolyasou
‐ denně vzniká v každé buňce cca několik set uracilů
‐ odstraňován specifickou GT mismatch glycosyllyasou, která odstraňuje thymin z GT párů
‐ tranzice C‐>T
Selhání oprav deaminací cytosinu vede k bodovým mutacím:
Deaminace purinových bází
‐ méně časté než deaminace cytosinu
‐ hypoxantin se může párovat s cytosinem (způsobuje A‐>G
tranzici)
Chemické modifikace
‐ oxidace bází a deoxyribózy (volnými radikály)
‐ modifikace nukleofilních skupin bází
(např. alkylace bází)
Volně radikálové oxidace
‐ vedlejší produkty metabolismu
‐ ionizující záření
nereparovaný thyminglykol blokuje replikaci DNA a je pro buňku potenciálně letální
8‐oxoG je snadno překonán DNA polymerázou, nereparovaný je vysoce mutagenní (páruje se s dA a působí G‐>T transverzi)
Typy oxidačních modifikací bází yOH
ROS:
cca 200 000 lézí
bází/buňku denně
formamidopyrimidiny
Modifikace nukleofilních skupin bází
Alkylace ‐ vedlejší produkt normálního metabolismu
‐ S‐adenosylmethionin, donor metylových skupin, reaguje náhodně s bázemi DNA za tvorby několika stovek 3‐
methyladeninu/den/savčí
haploidní genom
Chemické modifikace guanosinu
Fotopoškození
Thyminový můstek/dimer
6‐4PP
cyklobutanpyrimidinové dimery (CPDs)
(6‐4) pyrimidonové fotoprodukty
Absorbce UV bázemi DNA indukuje chemické
změny
Oba typy lézí vytvářejí
výraznou distorzi, ohyb DNA:
7‐9o CPD 44o 6‐4PP
T‐T>T‐C>C‐T>>CC
T‐C>>C‐C>T‐T>C‐T
Analoga bází
‐ inkorporací do DNA při replikaci vyvolají mispárování a mutace v dalším replikačním cyklu – tranzice a transverze
‐ 5‐bromouracil – analog thyminu ‐ se páruje s guaninem (T‐>C tranzice)
Interkalace ‐ vmezeření interkalačních látek mezi báze působí poruchy replikace (např. ethidium bromid)
Chyby při replikaci
(Replication Errors)
‐ generování záměn nukleotidů a malých inzercí nebo delecí
během replikace DNA (rychlost misinkorporace 10‐7‐ 10‐6)
DNA polymerázy nejsou 100% přesné, ale většina jejich chyb je bezprostředně
odstraněna polymeráza‐asociovanou „proofreading“ exonukleázovou aktivitou.
Přes přesnost replikáz je generováno několik set chyb na celý genom během jednoho replikačního cyklu.
Většina misinkorporací je opravena systémem opravy záměn bází (BMR) zanechávajícím přibližně 1 x 10‐10 záměn bází na jedno buněčné dělení.
‐ „smeknutí‐sklouznutí“ replikačního komplexu na repetitivních sekvencích (mikrosatelity a minisatelity)
Mezivláknové příčné vazby
(Interstrand Cross‐links)
‐ bifunkční alkylující činidla jako jsou psoraleny mohou kovalentně vázat oba řetězce DNA
‐ příčné vazby mohou být také generovány UV a ionizujícím zářením
DNA‐proteinové příčné vazby (DNA‐Protein Crosslinks)
‐ DNA topoisomerázy generují kovalentní vazby mezi sebou a DNA substrátem během průběhu jejich enzymatického působení, narušení procesu uvolnění topoisomerázy (např. inhibitorem topoizomeráz camptotecinem) může vést k tvorbě
trvalé příčné vazby mezi molekulami DNA a proteiny ‐ bifunkční alkylační činidla, diketony a radiace mohou také
vytvářet příčné vazby mezi DNA a proteinovými molekulami
Zlomy vláken (Strand Breaks)
‐ jedno‐ a dvou‐vláknové zlomy vznikají s nízkou frekvencí
během normálního metabolismu DNA účinkem topoisomeráz, nukleáz, „kolapsemʺ replikačních vidlic, během reparačních procesů
‐ ionizující radiace
‐ oxidace deoxyribózového zbytku kostry DNA hydroxylovým radikálem
2. část
Následky poškození DNA
Poškození DNA či pokus o jeho opravu mohou vést: ‐ k mutacím genů (kódujících a regulačních oblastí)
‐ k deviacím normálního počtu chromosomů
charakteristického pro daný organismus či změnám jejich struktury, tj. k mutacím chromosomů či chromosomálním aberacím
Mutace genů ‐ bodové mutace
‐ jsou nerozsáhlé změny sekvence DNA zahrnující oblast jednoho genu
‐ substituce
‐ náhrada správného nukleotidu nesprávným ‐ tranzice
purin → purin (G → A, A → G)
pyrimidin → pyrimidin (C → T, T → C)
‐ transverze
purin → pyrimidin (G → C/T, A → C/T)
pyrimidin → purin (C → G/A, T → G/A)
‐ malé adice/inzerce a delece
‐ genový přeskok a transpozice segmentů DNA
‐ programované přeuspořádání, např. při protilátkové odpovědi
‐ posuny čtecího rámce (frameshift mutations) jsou
inzerce/delece jednoho či několika párů bází (vyjma násobků
3) v úseku genomu kódujícího protein Chromosomální aberace
‐ chromosomální mutace můžeme rozdělit do dvou obecných kategorií:
1. Strukturální změny
2. Početní změny
Strukturální změny chromosomů
‐ vznikají následkem nesprávného spojení částí chromosomů během reparace poškozené DNA buď uvnitř jednoho chromosomu (např. inverze a delece) nebo mezi chromosomy (např. dicentrické chromosomy či reciproční
translokace)
‐ zlomy
‐ inzerce a delece
‐ translokace
‐ mezi sesterskými chromatidami (SCE, sister chromatid exchange)
‐ mezi nehomologními chromosomy
‐ inverze
‐ duplikace části chromosomů
Delece a inzerce
Mechanismus vzniku delecí ionizujícím zářením From: Biological Dosimetry, pg 18
Dědičné delece
„cry cat“ syndrom ‐ frekvence 1/50 000 narození
‐ způsobený delecí části krátkého raménka chromosomu 5
‐ pláč dětí připomíná kočky
‐ mentální retardace
‐ mikrocefalie
‐ úmrtí okolo 4. roku života
Dědičné delece
„cry cat“ syndrom ‐ frekvence 1/50 000 narození
‐ způsobený delecí části krátkého raménka chromosomu 5
‐ pláč dětí připomíná kočky
‐ mentální retardace
‐ mikrocefalie
‐ úmrtí okolo 4. roku života
Translokace mezi homologními chromosomy, SCE
‐ záměna sesterských chromatid během S‐fáze ‐ vzniká pravděpodobně následkem chyb během replikace DNA, v místech zástavy replikace (stalled replication complexes) či zpomalením procesu replikace DNA
Wojcik et al., Mutagenesis, Vol. 14, No. 6, 633‐638, November 1999
Translokace mezi nehomologními chromosomy
‐ přenos (nevyvážený) či výměna (vyvážená, reciproční) určitých úseků dvou nehomologních chromosomů
‐ Robertsoniánská
translokace
‐ může vést k tvorbě acentrických a dicentrických chromosomů
Vznik filadelfského chromosomu u chronické myeloidní leukemie (CML) reciproční
translokací chromosomu 9 a 22
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Inverze
‐ převrácení orientace určitých úseků chromosomů
‐ pericentrické inverze (okolo centromery) ‐ většinou nevedou ke vzniku specifických fenotypických abnormalit
‐ paracentrické inverze
‐ spojené s neplodností (způsobují defekty meiosy problém párovaní
chromosomů u heterozygotů)
Během párování chromosomů dochází k tvorbě
charakteristické smyčky...
‐ samo o sobě je bez efektu, pokud nedojde ke crossing‐overu...
Crossing‐over paracentrické inverze: inverze nezahrnuje centromery
Výsledkem v sekundární meiotické
fázi je buňka obsahující:
1 normální chromosom
2 delece chromosomů
(letální)
1 invertovaný chromosom
(přítomny všechny geny; viabilní)
Crossing‐over pericentrické inverze: inverze zahrnuje centromery
Výsledkem v sekundární meiotické fázi je buňka obsahující: 1 normální chromosom
2 delece‐duplikace chromosomu
(letální)
1 invertovaný chromosom
(přítomny všechny geny; viabilní)
Duplikace části chromosomů
‐ zdvojení určitých úseků chromosomů
‐ může se fenotypicky projevit, např. duplikace u mutanty Bar Drosophila melanogaster
Různý počet kopií oblasti 16A X chromosomu vzniklých duplikací
Vznik duplikací u Bar mutanty Drosofily asymetrickým crossing‐
overem
Fúze chromosomů
Vznik dicentrických chromosomů
‐ tvorba dicentrických, prstencových
chromosomů či anafázových můstků
(např. v důsledku poruchy mechanismu udržování telomer či tvorbou zlomů
radiolýzou a jejich následnou fúzí)
‐ vede ke změně počtu chromosomů v genomu
Fúze chromosomů
Vznik dicentrických chromosomů
‐ tvorba dicentrických, prstencových
chromosomů či anafázových můstků
(např. v důsledku poruchy mechanismu udržování telomer či tvorbou zlomů
radiolýzou a jejich následnou fúzí)
‐ vede ke změně počtu chromosomů v genomu
Vznik prstencovitých chromosomů
Vznik prstencovitých chromosomů
Vznik anafázových můstků
‐ vznikají
ze zlomů po replikaci chromosomů v pozdní G2‐fázi buněčného cyklu
‐ zlomy mohou vznikat na obou chromatidách stejného chromosomu, lepivé konce se pak mohou spojit nesprávně
za tvorby spojených sesterských chromatid
‐ při pohybu chromosomů
k opačným pólům v anafázi, úsek chromatid mezi centromerami je natáhnut mezi póly a brání tak rozchodu chromosomů do dceřinných buněk From: Radiobiology for the Radiologist, pg 24
Vznik anafázových můstků
‐ vznikají
ze zlomů po replikaci chromosomů v pozdní G2‐fázi buněčného cyklu
‐ zlomy mohou vznikat na obou chromatidách stejného chromosomu, lepivé konce se pak mohou spojit nesprávně
za tvorby spojených sesterských chromatid
‐ při pohybu chromosomů
k opačným pólům v anafázi, úsek chromatid mezi centromerami je natáhnut mezi póly a brání tak rozchodu chromosomů do dceřinných buněk From: Radiobiology for the Radiologist, pg 24
Změny počtu chromosomů
‐ vznikají buď fúzí chromosomů nebo častěji vlivem poruch segregace chromosomů během buněčného dělení
‐ změny počtu individuálních chromosomů (aneuploidie) monosomie, trisomie ...
‐ změny počtu chromosomálních sad (polyploidie) triploidie, tetraploidie
‐ změny počtu chromosomů jsou vyvolány řadou látek interagujících s komponentami aparátu pohybu chromosomů
‐ např. mikrotubulární toxiny benomyl, griseofulvin, nokodazol, kolchicin, kolcemid, vinblastin a taxol, které
interferují s polymerizací tubulinu a stabilitou mitotického vřeténka
‐ projeví se často tvorbou mikrojader
Nondisjunkce
‐ dochází k ní, když problémy meiotického vřeténka způsobí chyby v dceřinných buňkách
– k tomu může dojít, pokud tetráda chromosomů se správně
nerozdělí během I. meiotického dělení
– nebo se sesterské chromatidy správně nerozdělí během II. meiotického dělení
‐ následkem toho některé gamety získají dvě kopie stejného chromosomu a jiná gameta žádnou ‐ potomci vzniklí oplodněním normální gamety s gametou po nondisjunkci budou mít abnormální počet chromosomů ‐
aneuploidii
– trisomické buňky mají tři kopie určitého chromosomu a mají
celkový počet chromosomů 2n + 1
– monosomické buňky mají pouze jednu kopii určitého chromosomu a mají celkový počet chromosomů 2n ‐ 1
Nondisjunkce
Aneuploidie
‐ pro většinu autosomů je u člověka letální v embryonálním stádiu
‐ pokud organismus přežije, vede aneuploidie většinou k zřetelnému fenotypu = syndromu
– např. trisomie 21 Downův syndrom
‐ aneuploidie může také vzniknout selháním mitotického vřeténka během buněčného dělení
Trisomie 21 – Downův syndrom
Aneuploidie pohlavních chromosomů
• nondisjunkce pohlavních chromosomů vede u člověka k různým aneuploidním stavům
• na rozdíl od autosomů, tento druh aneuploidie nenaruší genetickou balanci tak vážně
– příčinou může být, že chromosom Y obsahuje relativně málo genů
– a nadbytečné kopie chromosomu X jsou v somatických buňkách inaktivovány v Barrových tělíscích
Aneuploidie pohlavních chromosomů
• Klinefelterův syndrom, XXY, 1 : 2000 živě
narozených
– mužské pohlavní orgány , avšak sterilita
– s feminimními rysy
• muži s extra Y chromosomem (XYY) jsou vyššího vzrůstu než průměr
• trisomie X (XXX), 1 : 2000 živě narozených, bez zdravotních projevů
• monosomie X ‐ Turnerův syndrom (X0), 1 : 5000 živě narozených, ženský fenotyp, pohlavní
nezralost
Polyploidie
• extra sada chromosomů (letální)
• může vzniknout chybou při dokončení I. zygotického dělení (tetraploidie)
• nebo pokud normální gameta oplodní jinou gametu s kompletní nondisjunkcí všech chromosomů
– výsledná zygota bude triploidní (3n)
• obdobně, pokud se 2n zygota nerozdělí po replikaci chromosomů, vyvine se z následujících ‐ již úspěšných ‐
mitotických cyklů tetraploidní (4n) embryo
• je častá u rostlin, mnohem vzácnější u živočichů
• spontánní vznik polyploidních jedinců hraje důležitou úlohu v evoluci rostlin
– v podstatě téměř 60% všech kvetoucích druhů rostlin mohlo vzniknout hybridizací, která je často následovaná polyploidií
Polyploidie
• extra sada chromosomů (letální)
• může vzniknout chybou při dokončení I. zygotického dělení (tetraploidie)
• nebo pokud normální gameta oplodní jinou gametu s kompletní nondisjunkcí všech chromosomů
– výsledná zygota bude triploidní (3n)
• obdobně, pokud se 2n zygota nerozdělí po replikaci chromosomů, vyvine se z následujících ‐ již úspěšných ‐
mitotických cyklů tetraploidní (4n) embryo
• je častá u rostlin, mnohem vzácnější u živočichů
• spontánní vznik polyploidních jedinců hraje důležitou úlohu v evoluci rostlin
– v podstatě téměř 60% všech kvetoucích druhů rostlin mohlo vzniknout hybridizací, která je často následovaná polyploidií
Triploidie
• tři sady chromosomů (69)
• nejčastější forma polyploidie
• 15–18% všech spontánních potratů
• přibližně 75% má dvě sady paternálních chromosomů
• pravděpodobně následkem polyspermie
• 1% početí je triploidních, ale 99% plodů
odumře před narozením (letální)
Tetraploidie
• čtyri sady chromosomů (92)
• 5% všech spontánních potratů
• extrémně vzácná u živě narozených • může vznikat následkem selhání
cytokineze v 1. mitotickém dělení
• často vzniká mosaicism
• ohrožující život
Mikrojádra
‐ vznikají
v cytoplasmě
‐ neschopností inkorporovat acentrický fragment chromosomu do dceřinného jádra během anafáze/telofáze
‐ poruchou segregace celého chromosomu během anafáze k buněčným pólům
a) dvoujaderná buňka s jedním mikrojádrem
b) dvoujaderná buňka s dvěmi mikrojádry
c) trojjaderná buňka s dvěmi mikrojádry
d) čtyřjaderná buňka s jedním mikrojádrem
a)
b)
c)
d)