prenatální diagnostika

Biochemický screening
v graviditě
Základní metody prenatální
diagnostiky
Genetické poradenství
Screeningové testy v těhotenství
• cílem primárního screeningu je identifikace těhotenství s
vyšším rizikem vrozené vady a poskytnutí cílené prenatální
diagnostiky
• screeningová vyšetření sice nedokáží určit, zdali je plod
skutečně postižen, ale pomohou zúžit okruh těhotných se
zvýšeným rizikem
• primární screening by měl splňovat určitá kritéria:
a) vyhledávací test musí být jednoduchý, nenáročný a
snadno proveditelný
b) test musí mít vysokou senzitivitu a specificitu
c) screeningový test musí být ekonomicky únosný pro
veřejný zdravotnický systém, má-li být dostupný všem
pacientkám
d) screeningový test musí být nezatěžující pro matku a plod
1
Screeningové testy v těhotenství
• ideální screeningový test by identifikoval 100% vrozených
vad (=100% senzitivita) a byl by zároveň negativní u
všech nepostižených těhotenství (=100% specificita)
• ve vztahu ke každé jednotlivé pacientce by měl mít lékař
jistotu, že při pozitivním nálezu je plod skutečně postižen
(100% pozitivní prediktivní hodnota) a že při negativním
nálezu postižen není (100% negativní prediktivní hodnota)
• doposud však žádný takovýto screeningový test
neexistuje a současné screeningové metody se tomuto
optimu jen více či méně přibližují
Screeningové testy v těhotenství
• screening v I. trimestru těhotenství - zhodnocení
koncentrace PAPP-A, volné beta-podjednotky hCG v krvi
matky a fetální ultrazvukové vyšetření nuchální
translucence
• screening v II. trimestru těhotenství (triple test) zhodnocení koncentrace AFP, hCG a uE3 v mateřské krvi
• kombinovaný screening (zhodnocení 1. a 2. testu + UZ
vyšetření)
2
Sérum integrovaný test
Zásadní pro výsledek je UZ určení přesného stáří plodu
Sérum integrovaný test I. a II. trimestru se skládá z dvou
odběrů krve k biochemickému vyšetření:
• 1. odběr PaPP–A v I. trimestru → nejefektivnější odběr je
mezi 10+0 – 11+3 dle UZV
2. odběr AFP, hCG, uE3 v II. trimestru → za 4 týdny, tedy
od 14+0
• výsledek sérum integrovaného testu je znám ve stejném
období gravidity jako výsledek samotného I. trimestrálního
testu
• malá falešná pozitivita (5%)
• v případě vysokého rizika (vyšší než 1:30 – asi 1 žena
z 200) je možné urychlit diagnózu pomocí CVS
Sérum integrovaný test
Nejefektivnější metoda screeningu Downova syndromu
pokrývající celou populaci
• má vyšší záchytnost než I. trimestrální test
• urychluje diagnózu → vybere z celé populace díky nízkému
PaPP-A část patologií již v I. trimestru
• zachytí rozštěpy páteře již v 16. týdnu gravidity (na rozdíl
od I. trimestrálního testu, který rozštěpy páteře nezachytí)
• odhalí i rozštěpy břišní stěny a anencefalii
• snižuje množství invazivních výkonů (falešná pozitivita 5%
proti 9% u triple testu v II. trimestru)
• vysoká záchytnost i v mladších věkových skupinách
• jde o populační test (x vybrané pacientky u testu v
I.trimestru)
3
hCG (human chorionic gonadotropin)
• glykoprotein (m.w. 36 700 Da) produkovaný
syncytiotrofoblastem
• α a β subjednotka (α subj. stejná jako u LH, FSH a TSH;
β subj. má 145aa je podobná u hCG a LH)
• stimuluje produkci progesteronu žlutým tělískem
• v mateřské krvi je detekován již 8. den po otěhotnění, v
moči asi 10. den
• v krvi i v moči se nachází jak intaktní molekula hCG, tak
volné α a β subjednotky; v moči se také nachází
tzv. β -core fragment (výsledek odbourávání)
• kvantitativní hodnocení hCG (během 1.- 6. týdne
normálního těhotenství hCG stoupá asi o 70% za dva
dny); vrcholu dosahuje v 8.-10. týdnu, poté klesá a v druhé
polovině těhotenství se udržuje na stálé hladině
Abnormální hodnoty hCG
• nízké hodnoty na počátku těhotenství → ektopická
gravidita, missed abort
• extrémně vysoké hodnoty na počátku těhotenství → mola
hydatidosa (patologický růst trofoblastu), chorioadenom až
choriokarcinom (maligní nádor z trofoblastu)
• vysoké hodnoty v II. trimestru: m.Down
• nízké hodnoty v II. trimestru: m.Edwards
0-2 týdny: 0-250 mIU/ml
2-4 týdny: 100-5000 mIU/ml
1-2 měsíce: 4000-200 000 mIU/ml
2-3 měsíce: 8000-100 000 mIU/ml
II. trimestr: 4000-75 000 mIU/ml
III. trimestr: 1000-5000 mIU/ml
4
Alfa-1 fetoprotein (AFP)
• specifický fetální alfaglobulin glykoproteinového charakteru
(m.w. 67 600 Da)
• funkce: transportní (vazba estrogenů, mastných kyselin, bilirubinu,
těžkých kovů, steroidů atd.); faktor spojený s regulací růstu, s
diferenciací, s antioxidačními procesy, s transformací v ontogenetickém
i onkogenním procesu
• zajišťuje imunitní ochranu plodu při rozdílnosti antigenních systémů
plodu a matky
• AFP je produkován žloutkovým váčkem od začátku krvetvorby
(~ 10. den), od 10. týdne biosyntézu zajišťují fetální játra
• v séru těhotné ženy se hladina postupně zvyšuje od 12.týdne (maxima
dosahuje ve 30.-33.týdnu); pak nastává rychlý pokles a při porodu je
koncentrace AFP v séru matky velice nízká tj.prakticky shodná s
hodnotami dospělé populace
• zvýšené hodnoty AFP → poruchy uzávěru neurální trubice,
hydrocefalus, encefalokéla, omfalokéla , gastroschisis, agenese ledvin,
oligohydramnion, kongenitální nefrosa (vrozené onemocnění ledvin)
• výrazně snížené hladiny AFP → IURG, toxémie, placentární tumor,
Downův syndrom, odumřelý plod
Nekonjugovaný estriol (uE3)
• během těhotenství produkován placentou z fetálního
adrenálního prekursoru dehydroepiandrosteron sulfátu
• k jeho konjugaci s dalšími látkami dochází v játrech,
v krevním řečišti se tedy vyskytuje směs nekonjugovaného
estriolu a jeho nejrůznějších konjugátů
• z celkového estriolu jsou asi 2/3 vázány na bílkoviny
• v kombinaci s hCG a AFP vytváří uE3 jeden z
nejefektivnějších biochemických systémů pro sledování
průběhu těhotenství během druhého trimestru
• nižší hodnoty → m.Down; Smith-Lemli-Opitzův sy.
(porucha ve tvorbě cholesterolu)
• trvale nízké hladiny → porucha fetoplacentární jednotky =
ohrožení plodu
5
PAPPs - Pregnancy Associated Plasma Proteins
Protein PAPP-A
• placentární glykoprotein m.w. 750 000
• gen pro PAPP-A leží na 9q33.1
• metaloproteináza závislá na zinku štěpí IGFBP-4, 2 a 5
(insulin like growth factor binding protein), uvolněny jsou
IGF, které hrají roli při regulaci lokálních proliferačních
reakcí (reprodukční pochody), hojení ran, ateroskleróze
• nízké hodnoty v I.trimestru ⇒ m. Down, IURG,
hrozící potrat
• zvýšené hodnoty ve III. trimestru ⇒ preeklampsie
PAPPs - Pregnancy Associated Plasma Proteins
PAPP-C (SP1 – specific pregnancy protein)
• trofoblast-specifický β-1-globulin (produkován syncytiotrofoblastem)
• heterogenní glykoprotein (několik molekulárních variant, nejvíce
zastoupená složka m.w. 80-120 000, asi 30% sacharidů)
• imunosupresivní vlastnosti
• zvýšené hodnoty ⇒ m.Down
• snížené hodnoty ⇒ IUGR, spontánní abort, mola hydatidosa, germinální
nádory
PAPP-D (lidský placentární laktogen hPL)
• stimuluje růst a vývoj prsů pro tvorbu mléka
• biologickým působením a imunologickými vlastnostmi blízký
hypofyzárnímu růstovému hormonu
• hraje roli v tělesném metabolismu během těhotenství (ovliňuje
metabolismus dusíku, draslíku, lipidů a glycidů)
• ovlivňuje metabolismus bílkovin plodu
• využívá se k posouzení funkce placenty
6
Další markery
Acetylcholinesteráza v plodové vodě
• izoenzym relativně specifický pro nervovou tkáň (normální
plodová voda obsahuje izoenzym z erytrocytů)
• u defektů neurální trubice (spina bifida, anencefalie)
• abdominální defekty (gastroschisis)
Dimer inhibinu A (inhibin je glykoprotein syntetizovaný
placentou; molekulu tvoří dimer složený z α-podjednotky a z
β-podjednotky, která ještě může mít 2 varianty: A nebo B)
• zvýšená hodnota dimeru α,βA → m.Down
(v I.i v II. trimestru těhotenství)
Stavy komplikující či znemožňující
výpočet rizika VVV
• choriokarcinom a mola hydatidosa – vysoké hCG a SP1,
často snížení či zvýšení AFP imituje m.Down
• redukce počtu plodů při vícečetném těhotenství po IVF často extrémně zvýšené AFP a hCG, hodnoty se rychle
mění
• vícečetné těhotenství – zvýšení biochemických markerů
není symetrické, může imitovat defekty neurální trubice či
m.Down
• zamlklý potrat; intrauteriní smrt plodu – zpočátku mohou být
hodnoty biochemických markerů značně zvýšené, později
klesají
• darovaný oocyt (zpravidla od mladší dárkyně) – komplikace
při výpočtu (hmotnostní korekce na nositelku, věková na
biologickou matku)
7
Prenatální diagnostika
• neinvazivní metody
ultrazvukové vyšetření
kardiotokografie
růst dělohy
pohyby plodu
• invazivní metody
amniocentéza
odběr choriových klků
kordocentéza (odběr pupečníkové krve)
fetoskopie
Ultrazvukové vyšetření
Ultrasonografie (USG) - metoda odstupňované šedi (gray
scale) umožňuje odlišit tkáně s různými akustickými
vlastnostmi, metoda dynamického zobrazení (real time)
registruje pohybující se struktury a dynamické děje
• transabdominální USG vyšetření
• transvaginální USG vyšetření - velmi dokonalá vizualizace
blízko uložených vnitřních rodidel; vzdálenost sondy od
těchto orgánů je standardnější než při vyšetření
transabdominálním; velice přínosné při diagnostice v
časném těhotenství (do 3. měsíce gravidity) a také při
diferenciální diagnostice extrauterinní gravidity;
v pokročilejším těhotenství se zobrazuje při tomto
vyšetřovacím přístupu především děložní hrdlo
8
Ultrazvukové vyšetření
•
•
•
•
•
•
•
zjištění gestačního stáří a polohy plodu
diagnóza vícečetného těhotenství
kontrola růstu plodu a porovnání s růstovými křivkami
určení pozice a tvaru placenty
určení množství plodové vody
sledování pohybů plodu
může odhalit mnoho odchylek od normálu i přímé fyzické
znaky vrozené vady
• pokud je vyšetření podstoupeno cíleně, může zachytit
velké množství různých vad, jako je třeba anencefalie,
Downův nebo Turnerův syndrom…
• neustále se vylepšuje, nicméně některé vady či některé
případy určitých vad jsou na ultrazvuku neidentifikovatelné
Ultrazvuk v I. trimestru těhotenství
• optimální termín mezi 11.–14. týdnem gravidity
• měří se biometrie plodu – především CRL (crown-rump
length = temenokostrční vzdálenost )
• specifické UZ markery pro záchyt genetických syndromů:
– NT – šíjové projasnění
– NB – přítomnost a délka nosní kůstky
– TR – trikuspidální regurgitace (průkaz zpětného
krevního toku přes trojcípou srdeční chlopeň)
– frontomaxilární úhel – úhel, který svírá linie obličeje s
rovinou horní čelisti
• sledování dalších anatomických znaků, srdeční frekvence,
pohyblivost plodu, plodové obaly, umístění placenty apod.
• v případě vícečetného těhotenství lze určit, zda plody mají
společnou nebo oddělenou placentu
9
Nuchální translucence
normální
zvýšená
Ultrazvuk ve II. trimestru těhotenství
• optimální mezi 18.–22. týdnem gravidity
• provádí se biometrie plodu - základní rozměry pro určení
gestačního stáří plodu jsou:
BPD - biparietal diameter (průměr hlavičky)
HC - head circumference (obvod hlavičky)
AC - abdominal circumference (obvod bříška)
FL - femoral length (délka stehenní kosti)
TTD - trunc transverse diameter (příčný průměr trupu)
• měření určitých orgánů ve vztahu k určení rizika některých
vývojových vad (např. šířku mozečku, délku nosní kůstky,
šířku ledvinných pánviček apod.)
• hodnocení základní anatomie orgánů plodu
• hodnocení vývoje srdce – tzv. fetální echokardiografie
• sledování nepřímých známek VVV plodu: charakter placenty
a pupečníku, poloha plodu, množství plodové vody,
pohyblivost plodu apod.
10
11
Ultrazvuková flowmetrie
• využívá Dopplerův princip změny frekvence vlnové energie
odražené pohybujícím se reflektorem → v případě
dopplerovského měření průtoku krve (dopplerovské
flowmetrie) je využíváno ultrazvukové vlnění reflektované
krvinkami pohybujícími se v krevním řečišti
• Dopplerovské signály registrované ze zvolené oblasti těla
plodu jsou barevně kódovány podle směru toku krve a
zobrazeny v dvojrozměrném pohyblivém ultrazvukovém
obrazu vyšetřovaného orgánu
• technický vývoj dopplerovské techniky umožnil detekci
signálů i z velmi malých cév plodu
3D/4D ultrazvuk
• 3D UZ → ze série klasických dvourozměrných obrázků
rekonstruován 3D obrázek
• 4D zobrazení představuje nejnovější ultrazvukovou
technologii, při níž rychle snímané trojrozměrné obrázky
umožňují vyšetření plodu nebo jeho orgánů plasticky v
reálném čase
• možnost detailně studovat pohyby končetin plodu, mimiku
obličeje, srdeční činnost
• umožňuje dokonalou orientaci při biopsii orgánů a mnohé
další
• metoda nenahrazuje klasické 2D zobrazení → doplňuje jej
• v některých případech (špatná poloha plodu, menší
množství plodové vody, špatné akustické podmínky….)
nelze ani touto špičkovou technologií získat kvalitní
zobrazení
• optimální zobrazení plodu je mezi 22.- 26. týdnem
těhotenství
12
Vzdálenost děložního fundu
od stydké kosti
• klinický standard
• přibližné určení velikosti plodu
• děloha z hmotnosti 50 až 60 g před
otěhotněním dosáhne koncem těhotenství
hmotnosti 900 až 1000 g
• objem její dutiny se zvýší ze 2 až 3 ml před
těhotenstvím na 4500 až 5000 ml i více
koncem těhotenství
• mění se i uspořádání svalových vláken v
děložní stěně → probíhají spirálovitě v několika
vrstvách
• zmnoží se cévní zásobení → průtok krve se
zvýší ze 30 až 50 ml/min u netěhotné dělohy
na 800 až 900 ml/min koncem těhotenství
13
Kardiotokogram (kardiotokografie)
Kardiotokografie umožňuje sledovat:
• srdeční frekvenci plodu
• četnost a sílu stahů dělohy
K vyšetření se používá kardiotokograf
frekvenční křivka = kardiotachogram
křivka děložní činnosti = tokogram (bazální tonus, délka
kontrakčního cyklu, délka mezikontrakčního období,
amplituda kontrakce)
Kdy se používá CTG:
• u rizikového těhotenství
• po 36. týdnu těhotenství (preventivní sledování)
• při přenášení – tedy po 41. týdnu těhotenství
• při příchodu rodičky na operační sál a v průběhu porodu
Kardiotokograf
14
Amniocentéza (AMC)
Invazivní metoda, kdy je pomocí tenké jehly odebrán vzorek
plodové vody přes břišní stěnu v oblasti dělohy
• probíhá pod ultrazvukovým dohledem
• jednorázově se odebírá 20-30 ml plodové vody (ztráta
tohoto množství nijak neohrožuje plod a v krátké době se
doplní)
• umožňuje chromozomální a biochemické vyšetření
kultivovaných i nekultivovaných buněk plodové vody
(buňky nesoucí genetickou informaci plodu)
• cílené vyšetření, kterým lze zjistit pouze několik typů vad a
postižení (chromozomální aberace, rozštěpové vady)
• riziko spontánního potratu (komplikace většinou souvisí s
únikem plodové vody) je výrazně malé (cca 0,5-1,0%)
15
Amniocentéza
• věk těhotné 35 a více let
• patologický biochemický screening v I. nebo II. trimestru
těhotenství
• abnormální ultrazvukový nález u plodu
• prenatálně zjistitelná dědičná choroba v rodině
• další důvody vyplynuvší z genetické konzultace
• časná AMC 12-14.t.g.
• klasická AMC 15-18.t.g.
• pozdní AMC
Odběr choriových klků (CVS)
• invazivní metoda, prováděna podobným stylem jako
amniocentéza
• místo plodové vody se odebírají buňky choriových klků,
tzv. trofoblastu (i tyto buňky mají genetickou informaci
stejnou jako plod)
• za mírně zvýšené riziko komplikací oproti amniocentéze
získáme materiál, ze kterého můžeme získat karyotyp
mnohem rychleji než u materiálu z amniocentézy
• nevýhodou je tzv. placentární mozaicismus - fenomén,
kdy v malém procentu případů vznikají chromosomální
abnormality v choriových klcích, ne však ve vyvíjejícím
se plodu
• CVS se obvykle provádí mezi 10. a 13. týdnem gravidity
16
Kordocentéza
• přímý odběr krve plodu z pupečníku (resp. z pupečníkové žíly) →
ultrazvukem se zobrazí pupečník a jeho úpon k placentě; vpichem v
oblasti podbřišku se skrze placentu do nitra pupečníku zavede jehla
o průměru 0,42-0,53 mm
• je odebráno asi 2-3 ml pupečníkové krve plodu, což je pouze malá
část celkového objemu krve plodu a rychle se nahradí; odběr krve
plodu z pupečníku lze přirovnat k odběru krve
• vyšetření bílých krvinek plodu umožní velmi rychle (48 – 72 hodin)
stanovit chromozomální výbavu plodu
• vyšetření červených krvinek stanoví krevního obraz a krevní skupinu
plodu
• počet krevních destiček plodu u matek trpících snížením krevních
destiček umožňuje zvolit vhodnou strategii při vedení porodu
• stanovením protilátek z krve plodu lze zjistit, zda plod je infikovaný
některými těžkými infekcemi
• riziko potratu je 1%; mezi možné komplikace po výkonu patří
předčasné zahájení děložní činnosti, zpomalení srdeční frekvence
plodu, hematom v pupečníku, infekce plodového vejce, či předčasné
odloučení lůžka
Fetoskopie
• metoda umožňující přímé pozorování plodu v dutině
plodového vejce speciálním přístrojem fetoskopem s
vlastním zdrojem světla a optickým systémem umožňujícím
pozorování a též fotografování
• fetoskop se zavádí přes břišní stěnu z malého kožního řezu
a děložní stěnu do dutiny plodového vejce za kontroly
ultrazvukem
• prováděla se dříve ojediněle k odhalování defektů vývoje
plodu a k odběru tkáně z povrchu těla plodu
• tento radikální zásah je užíván jen ve zcela výjimečných
případech:
→ podezření na malformaci především obličeje a končetin
→ odběr jednotlivých tkání, například kůže (u těžších
vrozených vad s postižením kůže) nebo jater, určených k
analýze
17
Fetoskopie
Laboratorní diagnostika
•
•
•
•
kultivace buněk plodové vody
kultivace buněk choriových klků
kultivace lymfocytů pupečníkové krve
kultivace lymfocytů periferní krve
• barvení klasické
• barvení diferenciální (pruhování)
• FISH
• PCR
• mikročipy (CGH, SNP microarray)
18
Kultivace lymfocytů
1.
2.
odběr krve do heparinizované stříkačky
kultivace v médiu s bovinním sérem a fythemaglutininem
(stimuluje dělení) ~ 3 dny
3. přidání kolchicinu (kolcemidu) → zastavení dělení buněk
v metafázi
4. hypotonizace v KCl → porušení cytoplazmatické
membrány a uvolnění chromozómů
5. fixace směsí metanol : kys.octová (3:1)
6. přenesení suspenze na podložní sklo
7. barvení
HRT (high resolution technique) – umožňuje získat
prometafázické chr. (jsou více natažené → lze rozeznat i
méně patrné chr. aberace např. mikrodelece)
Kultivace buněk plodové vody a CVS
• dlouhodobá (9-14 dní)
• kultivace sedimentu buněk (kolonie rostoucí na dně
kultivační nádoby) v kultivačním médiu s antibiotiky
• tkáň choriových klků se natráví trypsinem ještě před
nasazením do kultivačního média (rozvolnění buněk)
• pasážování = rozdělení buněk rostoucích kolonií
• z povrchu kult. nádoby se buňky stahují trypsinem
• další postup obdobný jako u lymfocytů
(kolcemid, hypotonie, fixace)
19
Barvení metafázních chromozómů
G-banding: krátkodobé působení trypsinu, barvení roztokem
Giemsa-Romanowski → rozlišení chr. na základě
uspořádání světlých a tmavých pruhů
Q-banding: barvení fluorescenčnám barvivem chinakrinem;
jasné pruhy obsahují DNA bohatou na AT oblasti
R-banding: krátké působení vysoké teploty (85°C →
denaturace proteinů a oblastí DNA bohaté na AT) a
následné barvení Giemsou (opačné zbarvení než u Gpruhů)
C-banding: krátké působení NaOH (nebo BaCl2) a následné
barvení Giemsou → obarvení oblastí s konstitutivním
heterochromatinem (lze sledovat variabilitu konst.
heterochr. u různých osob např. strukturální aberace
postihující heterochr. oblasti Y-chr.)
NOR: barvení AgNO3; barvení p-ramének akrocentrických
chr.; oblastí, které tvoří v interfázi jadérka (mnohonásobné
kopie genů pro rRNA)
G-banding
20
Q-banding
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
využití sondy (značeného vlákna DNA komplementárního k
určitému úseku cílové DNA)
→ denaturace sondy a cílové DNA
→ hybridizace
→ odstranění nespecifických signálů
Značení sond:
• fluorescenční barvivo (fluorochrom)
• enzym katalyzující vznik barevného produktu
• látka s antigenními vlastnostmi (nepřímé značení), kterou
lze detekovat pomocí značené protilátky → možnost
zesílení hybridizačního signálu
• radioaktivní izotop
21
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Typy sond:
• satelitní (centromerické) – hybridizují s repetitivními
satelitními sekvencemi především v centromerických
oblastech (vyšetření aneuploidií, detekce chr. neznámého
původu)
telomerické - specifické sekvence TTAGGG
• lokus specifické (genové) – hybridizují s jedinečnými
sekvencemi DNA (vyšetření mikrodelecí, specifických
translokací, zjištění amplifikace onkogenů)
• celochromozómové (malovací) – hybridizují s
mnohočetnými chr. sekvencemi, označují celý chromozóm
(vyšetření chr. přestaveb)
22
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
modifikace metody – umožňuje současnou identifikaci a
lokalizaci chr. aberací, aniž bychom předem museli zacílit na
konkrétní lokus, chromozóm nebo omezenou skupinu
• m-FISH (multicolour) – směs rozdílně značených malovacích
sond (každá hybridizuje s jiným chr.) → na základě jediné
hybridizace lze označit všech 24 chr. (odlišnost značení
dosažena použitím rozdílných fluorochromů a jejich
vzájemnou kombinací) → použití při objasnění složitých chr.
translokací zahrnujících větší počet chr.
• SKY (spectral karyotyping) – varianta m-FISH, k odlišení
jednotlivých barev se používá spektrometr
SPECTRAL KARYOTYPING
23
Amnio-PCR
• rychlé vyšetření nejčastějších chromozomálních vad (výsledky
jsou k dispozici do dvou dnů)
• Amnio-PCR je variantou vyšetření známého jako qF-PCR
(kvantitativní flourescenční PCR) ⇒ rychlá prenatální detekce
nejčastějších aneuploidií pomocí vysoce polymorfních STR
markerů specifických pro každý chromozom; amplifikace
s fluorescenčně značenými primery ⇒ separace a kvantifikace
produktů na automatickém genetickém analyzátoru
• vyšetření odhalí numerické chromozomální aberace určitých
chromosomů - dle použitých primerů (většinou jde o chromosomy
13, 18, 21, X a Y)
• vyšetření však neodhalí numerické aberace ostatních
chromosomů či strukturální aberace - proto je pro definitivní
diagnózu stále nutný karyotyp z kultivace
• může zjistit až 90% nejzávažnějších vad počtu chromozomů
(aneuploidií) s nízkým rizikem falešné pozitivity nebo negativity
• k vyšetření metodou AmnioPCR stačí množství buněk, které je
obsažené asi v mililitru plodové vody
• touto metodou lze vyšetřovat i fixované neživé buňky potracených
plodů
Detekce fetální DNA v krvi matky
• fetální DNA se v maternální plazmě vyskytuje
ve formě fragmentů různé délky (celkově menší než
molekuly maternálního původu → do 300 bp)
• fragmenty fetální DNA pocházejí z apoptotických buněk
trofoblastu (Dennis Lo et al. 1997)
• množství se zvyšuje v průběhu těhotenství (5-25%)
– izolace
– kvantifikace
– sekvenace (MPS) spojená s bioinformatickou a
statistickou analýzou výsledků
Možnosti využití:
– určení pohlaví
– zjišťování Rh skupiny plodu
– diagnostika monogenních onemocnění
– neinvazivní diagnostika trizomií
– určení otcovství
24
Detekce fetální DNA v krvi matky
PrenatalSafe KARYO
• testování všech chromozómů z krve matky
(početní i strukturální abnormality)
• sekvenování s vysokým rozlišením
(hloubka čtení ~ 30 milionů sekvencí)
• algoritmus vyhodnocuje skutečné údaje vyplývající z analýzy,
aniž by nejprve vyhodnocoval rizikové faktory např. věk
pacienta
• výsledky jasně definovány buď jako pozitivní nebo negativní,
tj. přítomnost /nepřítomnost chromozomální aneuploidie
PRENASCAN
Účinnost (záchytnost) testu:
• 99,91% na m. Down,
• 98,79% trizomie chromozomu 18 Edwardsův syndrom,
• 98,7% trizomie chromozomu 13 Patauův syndrom,
• 95% aneuploidie pohlavních chromozomů
Historie prenatální diagnostiky v ČR
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1970 - kultivace buněk plodové vody
1971 - první prenatálně zachycený morbus Down
1977 - placentocentéza
1978 - fetoskopie
1980 - ultrazvuková diagnostika plodu
1983 - CVS
1985 - prenatální molekulárně genetická diagnóza
(hemofilie)
1987 - kordocentéza
1988 - časná amniocentéza
1990 - prenatální biochemický screening
2000 - preimplantační genetická diagnostika
2013 – prenatální diagnostika z fetální DNA
25
Genetické poradenství
Rozvoj lékařské genetiky a fetální medicíny jako
samostatných lékařských oborů
• zkoumání vlivu genetických a vnějších faktorů na vznik
různých chorob a vad
• detailnější poznání geneticky podmíněných mechanismů
zajišťující vývoj člověka
• již před narozením informace o genetických a fenotypických
vlastnostech dítěte
• snaží se ovlivněním lidské reprodukce dosáhnout zdravého
vývoje budoucích generací
• pro úspěšné zavedení preventivních a terapeutických
postupů je nezbytné nejlepší porozumnění patogenezi
onemocnění na molekulárně-genetické úrovni
Genetické poradenství
Specializované genetické poradenství pro prenatální
genetickou diagnostiku
Prekoncepční genetické poradenství
1. Geneticky podmíněné choroby zhoršované graviditou
2. Choroby matky ohrožující vývoj embrya a plodu
3. Poruchy prenatálního vývoje v důsledku imunitních vlivů
Genetické poradenství při hodnocení teratogenních zásahů
1. Rizika fyzikálních teratogenů
2. Teratogenní účinek infekcí
3. Teratogenní účinek léků
26
Úkoly lékařské genetiky
Prevence - zjišťování genetického rizika různých vad nebo
chorob; zjišťování rizika případných vnějších faktorů
Diagnostika – odhalení VVV nebo geneticky podmíněných
chorob
•
prenatální
•
postnatální
•
vyšetření nosičství
Léčba vad a chorob
•
symptomatická péče – omezení projevů choroby
•
molekulární úroveň
Registrace - prenatálně a postnatálně diagnostikované
vrozené vady v populaci
Genetická konzultace
základním poznatkem je rodinná anamnéza
• věk, pohlaví a zdravotní stav příbuzných probanda
• u zemřelých jedinců příčina smrti
• zda není některý z příbuzných tzv. nevlastní
• u nádorových onemocnění bližší určení choroby (např. zda
se jedná o rakovinu prsu, prostaty atd.)
→ indikace ke specializovanému vyšetření (nezbytné pro
pokračování diagnostického procesu) – odběr periferní krve
za účelem stanovení karyotypu, molekulárně-genetické
vyšetření, biochemická analýza
výpočet konkrétního rizika:
• známé typy dědičnosti (monogenní choroby)
• modifikace populačního rizika (polygenní a multifaktoriální
onemocnění)
27
Indikace ke genetické konzultaci
• předchozí dítě s vrozenou vadou, s mentální retardací nebo s jiným
typem dědičného onemocnění
• opakované potrácení; infertilita či sterilita; dárci gamet
• děti s vrozenými vývojovými vadami, poruchami zraku, sluchu... a jejich
rodiny; děti s podezřením či potvrzením dědičné choroby a jejich rodiny;
děti s podezřením či potvrzenou dědičnou poruchou metabolismu a
jejich rodiny
• pacienti s psychomotorickou retardací; děti s předčasnou či opožděnou
pubertou
• děti s podezřením na vrozenou chromozómovou aberaci
• příbuzenské páry
• děti s vývojovými vadami genitálu
• opakovaný výskyt onkologického onemocnění v rodině; podezření na
hereditární nádorové onemocnění
• těhotné ženy s pozitivní rodinnou anamnézou
• těhotné ženy s nepříznivou anamnézou v těhotenství (chronické
onemocnění - DM, epilepsie, colitis ulcerosa apod.; akutní onemocnění v
počátku gravidity - teploty, léky, rtg, CT...)
• těhotné ženy s patologickým UZ nálezem u plodu - vývojová vada plodu
• těhotné ženy s patologickým nálezem v biochemickém screeningu
• těhotné ženy starší 35 let
28