Izolace bílkovin z přírodních zdrojů (izolace kaseinu z mléka)
Transkript
Izolace bílkovin z přírodních zdrojů (izolace kaseinu z mléka)
Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková Izolace bílkovin z přírodních zdrojů (izolace kaseinu z mléka) Izolace proteinů srážením Při tomto typu izolace se využívá nastavení takových podmínek, při kterých je daný protein nerozpustný a vzniklou sraženinu je možno od zbytku oddělit (centrifugací, filtrací). Při srážení může, ale nemusí, dojít k denaturaci proteinu. Způsoby srážení bílkovin: • Vysolování - molekuly vody hydratující protein mají větší afinitu k iontům soli a desolvatované molekuly proteinu se shlukují • Převedení na izoelektrický bod - v IEB nenese molekula proteinu žádný náboj, je nejméně rozpustná. • Srážení organickými rozpouštědly s vodou mísitelnými (ethanol, aceton) - podobný princip, jako u vysolování, rozpouštědla působí podobně jako ionty solí. ... Kasein Kaseiny tvoří hlavní složku mléka (asi 80% proteinů). Jsou to fosfoproteiny (tj. některé jejich OH skupiny jsou esterifikovány kyselinou fosforečnou) Obsahují značné množství prolinu, který způsobuje zlomy v řetězci proteinu a inhibuje vytvoření kompaktní struktury. Neobsahují sulfidové můstky. Mají velice málo sekundární struktury (a téměř žádnou terciární), takže je obtížné je denaturovat. V mléku se nachází v micelách, které drží pohromadě díky vápenatým iontům a hydrofobním silám. Izoelektrický bod (tj. pH, při kterém protein nese nulový výsledný náboj) je 4.6. Při tomto pH je kasein nerozpustný, čehož se využívá při jeho izolaci. tabulka 1 Skupiny kaseinů α (s1)-casein molecular weight 23,000; 199 residues, 17 proline residues α (s2)-casein molecular weight 25,000; 207 residues, 10 prolines ß -casein molecular weight 24,000; 209 residues, 35 prolines κ -casein molecular weight 19,000; 169 residues, 20 prolines Two hydrophobic regions, containing all the proline residues, separated by a polar region, which contains all but one of eight phosphate groups. It can be precipitated at very low levels of calcium. Concentrated negative charges near N-terminus and positive charges near C-terminus. It can also be precipitated at very low levels of calcium. Highly charged N-terminal region and a hydrophobic Cterminal region. Very amphiphilic protein acts like a detergent molecule. Self association is temperature dependant; will form a large polymer at 20° C but not at 4° C. Less sensitive to calcium precipitation. Very resistant to calcium precipitation, stabilizing other caseins. Rennet cleavage at the Phe105-Met106 bond eliminates the stabilizing ability, leaving a hydrophobic portion, para-kappa-casein, and a hydrophilic portion called kappacasein glycomacropeptide (GMP), or more accurately, caseinomacropeptide (CMP). Chemická analýza vzorku Biuretová zkouška Bílkoviny a peptidy poskytují v alkalickém prostředí s měďnatými ionty červenofialově zbarvené komplexy. Název reakce je odvozen od biuretu (kondenzační produkt močoviny), 1 Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková jednoduché látky obsahující peptidovou vazbu, která dává také pozitivní reakci. Fialově zbarvený komplex biuretu s mědí. Ninhydrinová zkouška Ninhydrin se používá k detekci primární aminů a amoniového iontu. Výsledný produkt reakce má fialové zbarvení. Xanthoproteinová zkouška používá se k detekci proteinů obsahujících fenylovou skupinu. Při reakci kyseliny dusičné s fenylovým kruhem vzniká žlutě zbarvená aromatická nitro-sloučenina. Materiál mléko, ledová kyselina octová, 95% ethanol, koncentrovaná kyselina dusičná, 2% albumin, tyrosin 1%, glycin 2%, 0.4 % ninhydrin v EtOH, 5% CuSO4, 10% NaOH Pracovní postup 1. Pomocí pH papírku otestujte pH mléka 2. Do 50 ml centrifugační zkumavky dejte 40 g mléka, centrifugujte 20 min při 3000 RPM. Opatrně odsajte tuk, který zůstal na povrchu, zfiltrujte přes gázu. 3. Filtrát zahřívejte na vodní lázni za průběžného míchání. Když teplota dosáne 40° C, vyndejte z lázně a přidejte asi 10 kapek ledové kyseliny octové (za stálého míchání). Pozorujte tvoření sraženiny. Znovu otestujte pH. 4. Filtrujte přes filtrační papír, filtrát přeneste do kádinky (nebo vymyté centrifugační zkumavky) 5. Přidejte 25 ml ethanolu, míchejte 5 min. 6. Znovu zfiltrujte. 7. Kasein rozprostřete na filtrační papír, nechte uschnout (v exsikátoru, pokud bude k dispozici). Zvažte usušený kasein a určete procentuální výtěžek. 2 Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková 8. Proveďte biuretovou, ninhydrinovou zkoušku a xanthoproteinovou zkoušku. Připravte si testovací roztoky (pokud již nejsou k dispozici): 2% glycin, 2% albumin, 1% tyrosin, kasein (zhruba polovinu špachtle + 45 kapek destilované vody). Od každého připravte 3 zkumavky po 15 kapkách. 9. Biuretová zkouška: k 15 kapkám zkoumaných roztoků přidejte 5 kapek 10 % NaOH a 2 kapky 5% CuSO4, míchejte. 10. Xanthoproteinová zkouška (v digestoři!) přidejte 10 kapek koncentrované HNO3, míchejte. Zahřívejte opatrně na vodní lázni. 11. Ninhydrinová zkouška: K testovacím roztokům přidejte 5 kapek ninhydrinu a zahřívejte ve vroucí lázni 5 min. Literatura: Je třeba, abyste měli základní znalosti o složení a struktuře proteinů - např. z www. wikipedia.org. více o složení mléka: http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/chem.html#protein1 Pozn. V některé z internetových databází (např. na www.ncbi.nlm.nih.gov) můžete zkusit najít sekvence některého z kaseinů a hovězího sérového albuminu (BSA) a podívat se na to, kolik obsahují prolinů, aminokyselin obsahujících primární aminovou skupinu a aromatických amino kyselin. Protokol z praktika Skupina: Datum: Výtěžek izolace: Hmotnost mléka: Hmotnost sušiny (kasein): Procentuální výtěžek: g g % Chemická analýza: (zaznamenejte barvu, případně další pozorování) Glycin Tyrosin BSA Kasein Biuretová zkouška Xanthoproteinová zk. Ninhydrinová zk. 3