Metabolismus vápníku a fosforu

ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1. LF UK
Metabolismus vápníku a fosforu
Praktické cvičení z lékařské biochemie
Všeobecné lékařství
Lenka Fialová, Martin Vejražka
2009/2010
Metabolismus vápníku a fosforu
Obsah
1.
2.
Kostní tkáň ................................................................................................................................................... 3
Vápník .......................................................................................................................................................... 3
2.1.
Homeostáza vápníku ............................................................................................................................ 3
2.2.
Vápník v séru ....................................................................................................................................... 5
2.3.
Vápník v moči...................................................................................................................................... 6
2.4.
Metody stanovení vápníku v séru a v moči.......................................................................................... 7
3.
Fosfor............................................................................................................................................................ 7
3.1.
Homeostáza fosforu ............................................................................................................................. 7
3.2.
Fosfor v séru ........................................................................................................................................ 8
3.3.
Fosfor v moči ....................................................................................................................................... 9
3.4.
Metody stanovení fosforu v séru........................................................................................................ 10
4.
Biochemické ukazatele kostní přestavby ................................................................................................. 11
4.1.
Základní charakteristika..................................................................................................................... 11
4.2.
Ukazatelé novotvorby kostí ............................................................................................................... 11
4.3.
Ukazatele kostní resorpce .................................................................................................................. 14
5.
Vybraná metabolická onemocnění kostí.................................................................................................. 16
5.1.
Osteoporóza ....................................................................................................................................... 16
5.2.
Osteomalacie a rachitis ...................................................................................................................... 16
5.3.
Pagetova kostní choroba .................................................................................................................... 17
2
Metabolismus vápníku a fosforu
1. Kostní tkáň
Kost slouží jako mechanická opora a ochrana měkkých orgánů, umožňuje pohyb, je sídlem
hemopoetické dřeně a je zásobárnou kalcia, fosforu a magnesia.
Kost je tvořena z 1/3 bílkovinnou matrix a ze 2/3 minerálem.
• Hlavní složkou kostní matrix je kolagen typu 1 (90 %), minoritními složkami jsou další bílkoviny osteokalcin, osteonektin, osteopontin a další (10 %).
• Kostní minerál je tvořen malými krystalky hydroxyapatitu Ca10(PO4)6(OH)2. Nevyskytuje se
zcela v čisté formě, nýbrž obsahuje též další složky (např. uhličitan vápenatý, fluorid vápenatý,
fosforečnan hořečnatý).
Metabolickou aktivitu kostí zajišťují kostní buňky. Jsou to osteoblasty, které tvoří osteoid čili
kostní matrix, do níž se ukládají minerální soli. Dalším buněčným typem jsou osteoklasty, jejichž
hlavní funkcí je kostní resorpce, a osteocyty, které jemně regulují kostní resorpci a tím doplňují funkci
osteoblastů.
V kosti probíhá celoživotní stálá přestavba - remodelace, která spočívá v osteoklastické
resorpci a následné osteoblastické kostní tvorbě. Při resorpci kostí se pomocí osteoklastů rozpouštějí
minerální složky a odbourává se kostní matrix. Činnost osteoblastů spočívá v intracelulární syntéze
prekursorů složek kostní matrix. Funkční spřažení osteoresorpce a novotvorby zajišťuje obnovu kostí.
Metabolismus kostí je úzce svázán s metabolismem kalcia a fosforu.
2. Vápník
2.1. Homeostáza vápníku
V lidském těle je obsaženo zhruba 1 000 g vápníku. Většina z tohoto množství (98 – 99 %) je
zabudována v tvrdých tkáních - kostech a zubech, zbytek je lokalizován extraoseálně, a to většinou
extracelulárně. Z tvrdých kalcifikovaných tkání se vápník uvolňuje podle potřeb organismu.
Velmi malé množství se nachází v intracelulární tekutině. Buněčné kalcium je obsaženo
z 55 % v endoplazmatickém retikulu, zbytek v buněčných organelách. Cytoplazmatická koncentrace
Ca2+ (10-7 mol/l) je řádově nižší než koncentrace v plazmě (10-3 mol/l). Na udržení vysokého
koncentračního gradientu mezi extracelulární a intracelulární tekutinou se podílí řada membránových
transportních mechanismů. Zvýšení Ca2+ v cytosolu slouží jako signál pro řadu buněčných procesů
(např. svalová kontrakce, přenos nervového vzruchu, sekreční mechanismy, dělení buňky).
Denní příjem kalcia potravou kolísá kolem 1,0 g denně; v období zvýšené potřeby (růst,
gravidita, laktace) může být až 1,5 g. Za fyziologického stavu se ve střevě vstřebává asi 25 – 40 %
přijatého vápníku. Z extracelulární tekutiny přechází kalcium hlavně do kostí, kde je podstatnou
součástí kostního minerálu. Výměna mezi kostní tkání a extracelulární tekutinou pomáhá vyrovnávat
kalcemii. Na vylučování vápníku se podílí střevo (cca 80 %) a ledviny (cca 20 %)(obr. 1). Stolicí
odchází především vápník, který se ve střevě neresorboval. Vylučování ledvinami je rozhodujícím
mechanismem, který ovlivňuje bilanci kalcia. U dospělých je normálně příjem a vylučování kalcia
v rovnováze. Pro období dětství a dospívání je charakteristická pozitivní bilance vápníku. Ve stáří a u
žen po menopauze se setkáváme s negativní bilancí.
Hladina vápníku v krvi je regulována parathormonem, 1,25-dihydroxycholekalciferolem
(kalcitriolem) a kalcitoninem (obr. 2).
3
Metabolismus vápníku a fosforu
Obr. 1 Denní bilance vápníku
Obr. 2 Regulace kalciové homeostázy
↓Ca2+
v plazmě
↑parathormonu
KOST
↑ mobilizace Ca z kostí
↑ Ca2+
v plazmě
LEDVINY
↑ reabsorpce Ca v ledvinách
↑ kalcitoninu
↑ syntéza kalcitriolu
stimulace
inhibice
STŘEVO
↑ absorpce Ca ve střevě
4
Metabolismus vápníku a fosforu
2.2. Vápník v séru
Stanovení koncentrace vápníku v séru je základním vyšetřením pro hodnocení homeostázy vápníku.
Celkový vápník v séru existuje v několika formách (obr. 3):
• 60 % kalcia je difuzibilní – tato forma je filtrována ledvinnými glomeruly
- 50 % vápníku je volné neboli ionizované kalcium (označuje se Ca2+) a představuje
vlastní biologicky aktivní formu;
- 10% vápníku se vyskytuje v nízkomolekulárních komplexech s citráty, fosfáty a
hydrogenuhličitany;
• 40 % kalcia je vázáno s plazmatickým bílkovinami (albumin - 90%, globuliny - 10 %). Představuje
nedifuzibilní formu, která neprochází ledvinnými glomeruly. Vápník vázaný na proteiny není
biologicky aktivní, ale představuje rychle dostupnou rezervu, ze která se při hypokalcemii může
snadno uvolnit.
Při hypoalbuminemii klesá frakce vázaná na albumin. Pokles plazmatického albuminu o 10 g/l
je doprovázen snížením celkového kalcia o 0,2 mmol/l, aniž by se změnila koncentrace ionizovaného
vápníku. Naopak hyperproteinemie (např. při maligním myelomu) může vést k velkému vzestupu
celkové kalcemie, opět beze změny koncentrace ionizovaného vápníku. Z tohoto důvodu je nutné
posuzovat oba parametry současně. Množství Ca2+ je závislé na pH, klesá při alkalóze a stoupá při
acidóze, protože se snižuje schopnost albuminu vázat vápník v důsledku soutěže mezi Ca2+ a H+ o
vazebná místa na albuminu.
Obr. 3 Formy vápníku v séru
0,9-1,0 mmol/l
1,1-1,3 mmol/l
Referenční hodnoty:
Koncentrace celkového kalcia v séru (S-kalcium):
Normální koncentrace celkového kalcia v séru je udržována v úzkém rozmezí 2,2 - 2,6
mmol/l. Za horní mez kalcemie slučitelné se životem se považuje hodnota 4 - 5 mmol/l. Smrt nastává
při hyperkalcemii zástavou srdce. Za dolní hranici ještě slučitelnou se životem se považuje hodnota
1 mmol/l. Těžká hypokalcemie může vést ke křečím (tetanii).
Ionizované kalcium: 1,1 – 1,3 mmol/l
Některé příčiny zvýšených a snížených koncentrací kalcia v séru jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
5
Metabolismus vápníku a fosforu
Tab. 1 Některé příčiny hyperkalcemie
Příčina
Nádory příštítných tělísek – primární
hyperparatyreóza
Některé maligní nádory
a metastázy do kostí
Hyperproteinemie
Mechanismus
zvýšené hladiny parathormonu
aktivace osteoklastů - převaha
resorpce kostního minerálu
zvýšení neionizovaného
vápníku
zvýšená střevní absorpce kalcia
Předávkování vitaminem D
Tab. 2 Některé příčiny hypokalcemie
Příčina
Mechanismus
Odstranění nebo poškození příštítných tělísek snížené hladiny parathormonu
– hypoparatyreóza
Gastrointestinální onemocnění
porucha absorpce vápníku ve
střevě
snížení absorpce vápníku ve
Hypovitaminóza vitaminu D
střevě
• porucha absorpce vitaminu D
• nedostatečný přívod vitaminu D
v potravě
• nedostatečná přeměna vitaminu D na
aktivní metabolity v důsledku např.
onemocnění ledvin a jater
Porucha tubulární resorpce vápníku
zvýšené ztráty vápníku
v ledvinách
ledvinami
Nadměrný přívod fosfátů
kompenzační pokles kalcia
2.3. Vápník v moči
Difuzibilní Ca se v glomerulech ledvin přefiltruje do primární moči, v ledvinných tubulech se
z 98 – 99 % reabsorbuje a zbytek se vylučuje močí.
Množství vápníku v moči (kalciurie) závisí:
• na obsahu vápníku v potravě a jeho resorpci ve střevě;
• na stupni osteoresorpce;
• na funkci ledvinných tubulů.
Vápník v moči můžeme zjišťovat v moči sbírané 24 hodin, jejíž objem změříme. Ve vzorku
moči z celodenního sběru stanovíme koncentraci vápníku. Na základě těchto údajů vypočteme
množství vyloučeného kalcia močí a vyjádříme v mmol/24 hodin – ztráty Ca močí/24 hodin
(dU-kalcium).
dU-kalcium (mmol/24 h) = U-kalcium (mmol/l) × objem moči (l/24 h)
Výsledek je závislý na přesném sběru moči, proto se současně s vápníkem stanovuje v moči i
kreatinin.
Hyperkalciurie se zjišťuje u 50 % nemocných s urolitiázou.
6
Metabolismus vápníku a fosforu
Referenční hodnoty:
Ztráty kalcia močí za 24 h (dU-kalcium): 2,5 - 7,5 mmol/24 hodin.
2.4. Metody stanovení vápníku v séru a v moči
Referenční metodou pro stanovení celkového kalcia je atomová absorpční spektrofotometrie.
Pro rutinní stanovení jsou doporučovány metody založené na spektrofotometrickém měření
barevných komplexů, které vznikají reakcí komplexotvorných látek s kalciem. Jako komplexotvorné
látky se používá o-kresolftalexon, který v alkalickém prostředí s vápenatými ionty poskytuje fialově
zbarvený komplex, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci vápenatých iontů. Jiným
používaným komplexotvorným činidlem je metalochromogen arsenaso III. Stanovení celkového
vápníku v krvi patří mezi metody často zatížené poměrně velkou chybou měření. To je dáno tím, že
komplexotvorné činidlo použité pro měření nevyváže z krve veškerý vápník – soutěží o něj
s plasmatickými bílkovinami a ostatními chelátory vápníku v krvi. Výraznější odchylky ve složení
krve (např. těžší dysproteinemie) může proto vést k falešně nižším či naopak vyšším hodnotám.
Volné (ionizované) kalcium můžeme stanovit potenciometricky pomocí iontově selektivních
elektrod. Výhodou této techniky je její rychlost. Podstatná je rovněž skutečnost, že nás informuje o
koncentraci biologicky aktivní formy kalcia bez ohledu na další vlivy, které mění koncentraci
celkového vápníku (např. těžká hypoproteinémie, výrazná porucha acidobazické rovnováhy apod.).
Obtíže naopak přináší nutnost zpracovávat zcela čerstvou krev – pokud vzorek není okamžitě
zpracován, rychle se mění jeho pH, což míru ionizace vápníku rychle mění.
3. Fosfor
3.1. Homeostáza fosforu
Fosfor je důležitou strukturální součástí buněk (nukleové kyseliny, fosfolipidy) a kostní
tkáně (hydroxyapatit), významně se uplatňuje při uchovávání energie ve formě makroergních
sloučenin (ATP, kreatinfosfát), plní funkci při regulaci enzymové aktivity (fosforylace, defosforylace
enzymů) a v krvi a v moči se ve formě hydrogenfosforečnanů a dihydrogenfosforečnanů uplatňuje
jako pufr.
Člověk denně ve stravě přijímá zhruba 1000 mg fosforu. V tenkém střevě se z dietních zdrojů
resorbuje asi 70 – 80 %. Absorpce fosforu je proporcionální jeho obsahu ve potravě, částečně je
regulována kalcitriolem. Kromě absorpce probíhá ve střevě i sekrece fosforu (kolem 100 mg denně).
Větší podíl fosforu je vylučován ledvinami (viz níže) a množství fosforu vyloučeného ledvinami je
pod kontrolou parathormonu.které regulují homeostázu fosforu (obr. 4).
V těle dospělého člověka je obsaženo přibližně 700 g fosforu.
Fosfor se nachází:
• v kostech (cca 80 %), kde je součástí hydroxyapatitu;
• ve svalech a viscerálních orgánech (cca 10 – 20 %);
• v extracelulární tekutině (cca 1,0 %).
Intracelulární fosfor je převážně ve formě organických esterů kyseliny fosforečné
(meziprodukty v metabolismu sacharidů, lipidů), včetně ATP, 2,3-difosfoglycerátu a cAMP. Fosfáty
jsou nejzastoupenějšími intracelulárními anionty. Extracelulární fosfor se vyskytuje hlavně
v anorganické podobě. Mezi extracelulárním a intracelulárním prostorem probíhá výměna fosfátů,
která může ovlivňovat jejich sérové koncentrace (viz níže). Do intracelulárního prostoru se fosfáty
přesouvají zejména při jejich zapojení do metabolismu glukosy, při němž vznikají různé estery
s glukosou. Alkalóza rovněž podporuje vstup fosfátů do buňky.
7
Metabolismus vápníku a fosforu
Obr. 4 Denní bilance fosforu
3.2. Fosfor v séru
V séru je fosfor přítomen ve dvou hlavních formách:
• organický fosfor (cca 70 %), který je součástí především fosfolipidů;
• anorganický fosfor (cca 30 %), který je většinou volný a pouze menší část je vázaná na bílkoviny
(rozdíl proti vápníku) nebo s vápníkem a hořčíkem (obr. 5). Pouze anorganický fosfát je běžně
stanovován v klinicko-biochemických laboratořích. Při fyziologickém pH 7,4 je v séru směs
hydrogenfosforečnanů a dihydrogenfosforečnanů v poměru 4:1.
Koncentrace fosfátů v séru závisí zejména na funkčním stavu příštítných tělísek a na funkci
ledvin (na glomerulární filtraci i na zpětné resorpci v tubulech). Parathormon snižuje zpětnou resorpci
fosfátů ledvinami. Při nedostatečné činnosti ledvin stoupá koncentrace fosfátů v krvi. Koncentrace
v séru je dále výrazem rovnováhy mezi příjmem fosfátů potravou a pohybem zásob v kostní tkáni.
Změny hladin fosfátů často doprovázejí změny hladiny kalcia. Obvykle existuje inverzní vztah
mezi koncentrací kalcia a fosfátů, např. u primární hyperparatyreózy se zvyšuje kalcium a fosfáty
klesají, ale při předávkování vitaminem D se společně se zvýšením kalcia zvyšují i fosfáty. Je potřeba
si uvědomit, že volný fosfát může bezprostředně reagovat s ionizovaným kalciem. Těžká
hyperfosfatémie tak může přímo vést k závažnému poklesu koncentrace ionizovaného kalcia.
Významný je také iontový součin plazmatických koncentrací kalciových a fosfátových iontů
(kalciofosfátový produkt). Obecně platí, že už za fyziologických podmínek je vyšší, než je nutné pro
tvorbu nerozpustného fosforečnanu vápenatého (krev je tedy z tohoto hlediska přesycený roztok). Při
vzestupu tohoto součinu (nejčastěji při selhání ledvin) se fosforečnan vápenatý může začít srážet
v měkkých tkáních, nejčastěji v medii tepen – vytvářejí se tzv. metastatické kalcifikace.
Sérové koncentrace fosfátů neodrážejí vždy spolehlivě množství intracelulárního fosforu. Do
buněk fosfor vstupuje pro potřebu metabolických a energetických procesů. Naopak při katabolických
dějích se fosfor přesouvá z intracelulárního do extracelulárního prostoru. To může být příčinou
hyperfosfatemie u těžkých katabolických stavů. Při přechodu do anabolické fáze se v buňce výrazně
8
Metabolismus vápníku a fosforu
zvyšuje potřeba fosforu pro obnovení ATP a dalších fosforylovaných substrátů a hladina fosforu
v séru klesá. Aby se zabránilo výrazné hypofosfatemii, je zapotřebí při těchto stavech dodávat fosfor.
U primární hyperparatyreózy klesají fosfáty a zvyšuje se kalcium, ale při předávkování
vitaminem D se společně se zvýšením kalcia zvyšují i fosfáty.
Obr. 5 Formy fosforu v séru
Referenční hodnoty:
Koncentrace anorganických fosfátů v séru (S-anorganické fosfáty): 0,7 - 1,6 mmol/l
V krvi jsou fosfáty fyziologicky zvýšeny u dětí, což souvisí s růstem kostí.
3.3. Fosfor v moči
Ledviny se významně uplatňují v udržení homeostázy fosforu. Fosfor filtrovaný glomeruly je
přibližně z 80 % reabsorbován v proximálním tubulu a z 10 % v distálním tubulu; zbytek je vyloučen
moči. Při zvýšeném příjmu fosfátů potravou se zvyšuje jejich renální exkrece a naopak.
U zdravých osob množství fosfátů vyloučených močí kolísá v širokém rozmezí. Izolované
stanovení fosfátů v moči je na posouzení metabolismu fosforu nedostatečné, protože při dobré funkci
ledvin se mění v závislosti na příjmu fosfátů potravou.
Přesnější informaci poskytuje stanovení některých indexů, pro jejichž výpočet je zapotřebí
ještě stanovit kreatinin v séru a v moči. Hodnotí se clearance fosfátů a tubulární resorpce fosfátů
(TRP). Pro stanovení TRP není potřeba sbírat moč v přesně stanoveném období. Hodnoty TRP se
snižují při hyperparatyreóze, při hypoparatyreóze stoupají.
Denní ztráty fosfátů močí, clearance fosfátů a tubulární resorpci fosfátů vypočteme podle
následujících vzorců:
9
Metabolismus vápníku a fosforu
Ztráty anorganických fosfátů moči za 24 h:
dU-anorganické fosfáty (mmol/24 h) = U-anorganické fosfáty (mmol/l) x objem moči (l/24 h)
Clearance fosfátů
Cp =
UP × V

SP
UP koncentrace fosfátů v moči
SP koncentrace fosfátů v séru
V diuréza v ml/s
Tubulární resorpce fosfátů
UP × SKr
TRP = 1 – 
SP × UKr
SKr koncentrace kreatininu v séru
UKr koncentrace kreatininu v moči
Koncentrace fosfátů v moči a v séru, stejně jako koncentrace kreatininu v moči a v séru musí být
dosazeny ve stejných jednotkách.
Referenční hodnoty:
Denní renální ztráty fosfátů:
Clearance fosfátů:
Tubulární resorpce fosfátů:
15 – 90 mmol/24 h
0,135 – 0,225 ml/s
0,85 – 0,95
3.4. Metody stanovení fosforu v séru
Stanovení fosforu je založeno na reakci fosfátů s molybdenanem amonným v kyselém
prostředí, při níž vzniká bezbarvý fosfomolybdenanový komplex. Lze ho měřit přímo v UV oblasti
nebo po přeměně na fosfomolybdenanovou modř. Další modifikací je reakce fosfátů s molybdenanem
amonným a vanadičnanem amonným. V tomto případě se vytváří žlutá kyselina molybdátovanadátofosforečná.
10
Metabolismus vápníku a fosforu
4. Biochemické ukazatele kostní přestavby
4.1. Základní charakteristika
Biochemické ukazatele kostní přestavby nejsou specifické pro určité kostní onemocnění, ale
vypovídají o metabolickém stavu skeletu. Posuzujeme je společně s nálezy metabolismu kalcia a
fosforu.
Jejich stanovení je vhodné pro:
• určení stupně osteoresorpce a kostní novotvorby;
• odlišení různých onemocnění skeletu;
• pro sledování účinnosti léčby.
Jako biochemické ukazatele kostní přestavby využíváme:
• degradační produkty kostní matrix, které se z ní uvolňují při odbourávání kosti;
• proteiny kostní matrix a kostní enzymy syntetizované v osteoblastech nebo osteoklastech a
uvolňované do cirkulace nebo do moči.
4.2. Ukazatelé novotvorby kostí
K ukazatelům novotvorby kostí patří tyto produkty osteoblastů v séru:
• osteokalcin;
• alkalická fosfatasa a její kostní izoforma;
• propeptidy prokolagenu typu I.
Osteokalcin
Osteokalcin je nejhojněji zastoupený nekolagenní kostní polypeptid, někdy označovaný jako
BGP (bone gla protein)1. Má vysokou afinitu k hydroxyapatitu. Je syntetizován v osteoblastech, zčásti
se ukládá do extracelulární kostní matrix, zčásti přechází do oběhu. Je specifický pro kostní tkáň, je
však značně labilní a jeho stanovení je spojeno s některými problémy.
Alkalická fosfatasa (ALP) a její izoformy
Alkalická fosfatasa (EC 3.1.3.1) je enzym katalyzující hydrolýzu monoesterů kyseliny
fosforečné v alkalickém prostředí. ALP se nachází ve všech buňkách těla, kde je vázaná na
membránách prostřednictvím glykosyl-fosfatidyl-inozitolové kotvy. Existuje v několika izoformách,
které jsou kódovány čtyřmi geny. Produktem tkáňově nespecifického genu jsou jaterní, kostní a
ledvinová izoforma. Ostatní tři geny kódují placentární, střevní a další izoenzymy. Rozdíly mezi
těmito mnohočetnými formami vznikají posttranslační modifikací sacharidové složky molekuly
enzymů. U zdravých dospělých jedinců převládá v cirkulaci ALP jaterního původu, zatímco u dětí
v období růstu je mnohem vyšší podíl kostní ALP, produkované osteoblasty. Stanovení ALP a
izoenzymů ALP se uplatňuje především u onemocnění jater, žlučových cest a kostních onemocnění
(tab. 3).
1
Gla je zkratka pro γ-karboxyglutamovou kyselinu, jež je obsažena v osteokalcinu a váže kalcium.
11
Metabolismus vápníku a fosforu
Tab. 3 Izoformy a izoenzymy alkalické fosfatasy
Izoforma
ALP
Původ
osteoblasty
kostní
•
•
membrána
hepatocytu,
epitelie
žlučových cest
jaterní
enterocyty
střevní
•
•
•
•
•
•
•
Zvýšení katalytické
koncentrace v séru příklady
primární kostní nádory
(osteosarkom)
sekundární kostní nádory
(metastázy do kostí u
karcinomu prostaty, prsu)
hojení kostních zlomenin
rachitis
hyperparatyreóza
překážka odtoku žluči obstrukce žlučových cest
na podkladě cholelitiázy
nebo nádoru
poškození hepatocytů
nádory jater
některá zánětlivá
onemocnění střev
placentární trofoblast
atypické
některé nádory
Poznámka
• zvýšení je projevem zvýšené
činnosti osteoblastů
• u dospělého jedince tvoří
méně než polovinu celkové
aktivity
• u dětí především v růstovém
období je podíl kostní ALP
mnohem vyšší
• při vysokých katalytických
koncentracích jaterního
izoenzymu se může prokázat
další izoforma s odlišnou
elektroforetickou pohyblivostí
• střevní izoenzym souvisí s
určitými krevními skupinami fyziologicky se vyskytuje u
lidí se skupinou B a O, u
skupin A a AB je za
normálního stavu
neprokazatelný
• fyziologicky se zvyšuje po
jídle
• fyziologicky ve 3. trimestru
těhotenství
• je termostabilní
• např. Reaganův izoenzym
Princip stanovení alkalické fosfatasy
Fosfatasy mohou katalyzovat hydrolýzu různých typů organických fosfomonoesterů na
fosforečnanový anion a příslušný alkohol nebo fenol. Vedle hydrolýzy zprostředkuje ALP i
transfosforylační reakci, při níž je fosfátová skupina přenesena na vhodný akceptor.
Při použití substrátu 4-nitrofenylfosfátu katalyzuje alkalická fosfatasa tyto reakce:
1. hydrolýza
4-nitrofenylfosfát + H2O
4-nitrofenol + fosforečnan
2. transfosforylace (přenos fosfátové skupiny)
4-nitrofenylfosfát + N-methyl-D-glukamin
4-nitrofenol + N-methyl-D-glukaminfosfát
12
Metabolismus vápníku a fosforu
Obr. 6 Princip stanovení katalytické aktivity alkalické fosfatasy
V první reakci se ze substrátu hydrolyticky odštěpuje fosforečnan. (obr. 6). Ve druhé reakci se
uplatní transfosforylační aktivita ALP, kdy N-methyl-D-glukamin působí jako akceptor
fosforečnanových aniontů a zároveň jako pufr. Tímto způsobem je urychlován průběh reakce.
Enzymová reakce je startována substrátem.
Substrát 4-nitrofenylfosfát je v alkalickém prostředí téměř bezbarvý. Produkt jeho hydrolýzy
vznikající působením ALP 4-nitrofenolátový ion má při alkalickém pH chinoidní formu,
charakterizovanou žlutým zbarvením. Množství uvolněného 4-nitrofenolu, které je mírou aktivity
ALP, se stanovuje fotometricky buď kinetickým způsobem nebo metodou konstantního času po
zastavení enzymové reakce inhibitorem. ALP je aktivována chloridem sodným.
Stanovení izoenzymů alkalické fosfatasy
Izoenzymy ALP mohou být rozlišovány na základě fyzikálních, chemických, imunologických
a elektroforetických vlastností
Metody stanovení izoenzymů ALP využívají selektivní inaktivace některých izoenzymů
(odlišná citlivost na teplo, inhibice fenylalaninem, leucinem nebo močovinou) nebo rozdílů
v elektroforetické pohyblivosti. Problémem je někdy úplné oddělení jaterní a kostní ALP. Nověji je
možno kostní ALP stanovit pomocí imunochemických metod nebo vazbou kostní ALP na specifický
lektin v kombinaci s elektroforézou.
Referenční hodnoty:
Celková katalytická koncentrace ALP v séru µkat/l (S-ALP):
muži 0,9 – 2,3 µkat/l
ženy 0,74 – 2,1 µkat/l
děti
1,2 – 6,3 µkat/l
Kostní izoenzym ALP:
muži < 0,83 µkat/l
ženy < 1,0 µkat/l
Propeptidy prokolagenu typu I
Kolagen je v osteoblastech syntetizován jako prokolagen. Před zabudováním do kostní matrix
se proteolyticky odštěpují oba konce, které vznikají v ekvimolárním poměru k syntéze kostního
kolagenu. Z každé molekuly kolagenu, která je vestavována do kolagenní fibrily, se uvolňuje jeden Cterminální propeptid (PICP – prokolagen-I-C-terminální propeptid) a jeden N-terminální propeptid
(PINP – prokolagen-I-N-terminální propeptid) (obr. 7).
13
Metabolismus vápníku a fosforu
Obr. 7 Propeptidy prokolagenu
N-konec
N-peptidasa
C-peptidasa
ko l ag e n
N-terminální
propeptid
(PINP)
proteolytické
štěpení
odštěpený PINP
(sérum)
C-konec
C-terminální
propeptid
(PICP)
odštěpený PICP
(sérum)
4.3. Ukazatele kostní resorpce
Během kostní resorpce se rozpouští minerální složka a odbourává se kostní matrix. To je
doprovázeno vyplavením vápníku, fosforu, mnoha enzymů a degradačních produktů matrix do krve a
do moči.
Mezi ukazatele kostní resorpce patří:
• pyridinolin a deoxypyridinolin v moči;
• N- a C-telopeptidy kolagenu typu I;
• hydroxyprolin v moči;
• kostní izoenzym kyselé fosfatasy.
Pyridinolin a deoxypyridinolin (Pyr a Dpyr) a N- a C-telopeptidy kolagenu typu I
Pyridinoliny a deoxypyridinoliny, tzv. cross-links (příčné spojky) vznikají ve zralém
kolagenu intermolekulárním propojením 3 lysinových nebo hydroxylysinových zbytků kolagenních
fibril. Pyridinolin je tvořen spojením 3 hydroxylysinových zbytků, deoxypyridinolin 2
hydroxylysinových a 1 lysinového zbytku postranního řetězce. Při degradaci kolagenu se příčné
spojky uvolňují do krevního oběhu a přestupují do moči, kde se stanovují. Množství pyridinolinů a
deoxypyridinolinů odráží intenzitu kostní resorpce. Jejich koncentrace nezávisí na přítomnosti
kolagenu v potravě. V oběhu jsou pyridinoliny a deoxypyridinoliny přítomné volné nebo jsou
součástí koncových úseků kolagenu a označované jako C-telopeptid (ICTP - C koncový telopeptid
kolagenu typu I) a N-telopeptid (INTP - N koncový telopeptid kolagenu typu I) (obr. 8). Stanovení
těchto parametrů je poměrně náročné. Využívá se buď vysokoúčinná kapalinová chromatografie
(HPLC) nebo imunochemické metody.
14
Metabolismus vápníku a fosforu
Obr. 8 Telopeptidy kolagenu typu I
(upraveno podle Calvo et al., Endocrine Review,17, 333 – 366, 1996)
N-terminální
telopeptid
s příčnou vazbou
příčná vazba
kolagen typu I
N-konec
příčná vazba
C-terminální
telopeptid
s příčnou vazbou
Hydroxyprolin
Kolagen obsahuje velké množství hydroxyprolinu. Při degradaci kolagenu se hydroxyprolin
uvolňuje do cirkulace a je vylučován močí, zbytek je metabolizován játry. Hydroxyprolin v moči se
zvyšuje při zvýšené kostní resorpci (např. osteoporóza, hyperparatyreóza). Patří mezi méně specifické
markery osteroresorpce, neboť může vznikat i ze složek komplementu a při odbourávání propeptidů
kolagenu. Hydroxyprolinurie je ovlivněna dietním příjmem kolagenu (maso, vývary z masa, želatina).
Proto je nutné, aby pacient alespoň 1 den před vyšetřením dodržoval dietu s vyloučením výše
uvedených potravin.
Kyselá fosfatasa (ACP) a její kostní izoenzym
Kyselá fosfatasa (EC 3.1.3.2) hydrolyzuje různé fosforečnanové estery při pH nižším než 7.
Vyskytuje se v řadě tkání (prostata, kosti, játra, ledviny, slezina, krevní elementy). V cirkulaci
rozlišujeme několika izoenzymů:
• Kostní tzv. tartarát-rezistentní (TRACP) - je specifický pro kostní tkáň. Osteoklasty obsahují
velké množství tohoto lyzosomálního enzymu, který je secernován do oběhu během kostní
resorpce. Na rozdíl od výše uvedených ukazatelů kostní resorpce se nevylučuje ledvinami, takže
stanovení kostního izoenzymu je cenné u pacientů s poškozením ledvin.
• Prostatický - není normálně přítomen, objevuje se při karcinomu či hyperplasii prostaty, je citlivý
vůči vínanu.
• Trombocytový - uvolňuje se při srážení krve, proto jsou v séru vyšší hodnoty než v plazmě.
• Erytrocytový - uplatňuje se v hemolytickém séru.
15
Metabolismus vápníku a fosforu
Biochemické stanovení využívá štěpení syntetických esterů kyseliny fosforečné. Jedním
z používaných substrátů je 4-nitrofenylfosfát (podobně jako ALP), který v kyselém prostředí štěpí
kyselá fosfatasa na fosfát a 4-nitrofenol.
Referenční hodnoty:
Celková katalytická koncentrace ACP v plazmě: < 250 (nkat/l)
Prostatický (tartarát-labilní) izoenzym ACP: < 70 nkat/l)
5. Vybraná metabolická onemocnění kostí
Metabolická onemocnění kostí se většinou týkají kostí jako celku. Může být postižena buď
organická složka kostní tkáně nebo kostní minerál nebo obojího. Na prvním místě stojí osteoporóza,
ale k častým metabolicky podmíněným chorobám patří i osteomalacie a Pagetova kostní choroba.
5.1. Osteoporóza
Osteoporóza je charakterizována úbytkem kostní hmoty (rovnoměrným úbytkem organické i
anorganické matrix) a poruchami mikroarchitektury kostní tkáně s následným zvýšením fragility
kostí a tendencí ke zlomeninám. Úbytek kostní hmoty je větší než odpovídá věku, pohlaví nebo rase
určitého jedince.
Osteoporóza je dnes pokládána za „civilizační chorobu” s vysokým výskytem v průmyslově
vyspělých zemích. Předpokládá se, že osteoporóza se vyskytuje zhruba u 6 – 7 % našeho
obyvatelstva. Je onemocněním především starších žen. Vzniká z nepoměru mezi vystupňovanou
kostní resorpcí a normální nebo sníženou novotvorbou kostí. Až do 50 let se obsah i denzita kostního
minerálu u dospělých žen a mužů téměř nemění. Později začne u žen po menopauze převládat kostní
osteoresorpce nad novotvorbou kostí v souvislosti s vyhasínáním ovariálních funkcí a tento trend pak
pokračuje po celý život. I u mužů ubývá s postupujícím věkem kostní hmoty, ale tento proces probíhá
mnohem pomaleji, a proto jsou muži osteoporózou a zlomeninami ohroženi mnohem méně.
Diagnóza osteoporózy se vyslovuje na základě měření kostní hmoty pomocí zobrazovacích
technik. Laboratorní vyšetření mohou být také cenným přínosem při jejím zjišťování, při posuzování
stupně a prognózy rozvoje onemocnění. Vyšetřují se parametry metabolismu vápníku a fosforu a
ukazatele kostní přestavby. U žen po menopauze zvýšeně ohrožených osteoporózou se zjišťují výšší
hodnoty ukazatelů osteoresorpce, které nejsou kompenzovány zvýšením novotvorby kostí.
5.2. Osteomalacie a rachitis
Osteomalacie je charakterizována snížením minerální komponenty následkem porušené
mineralizace nově vytvořené kosti. Nalézáme zvýšené množství osteoidu (nemineralizované
organické matrix) v kostní matrix, která nekalcifikuje nebo jen zvolna. Rachitis (křivice) je termín
označující osteomalacii u dětí, neboť rozvoj křivice je podmíněn růstem kostí.
Nejčastější příčinou osteomalacie je nedostatek vitaminu D v důsledku jeho nedostatečného
obsahu v potravě, poruch trávení a vstřebávání. Rovněž nedostatek slunečního záření, jaterní a
ledvinové choroby, spojené s narušenou přeměnou vitaminu D na aktivní metabolity, mohou být
příčinou osteomalacie.
Pro osteomalacii je typický laboratorní nález:
• nízká kalcemie;
• nízká fosfatemie;
• vysoká katalytická koncentrace alkalické fosfatasy, zvláště její kostní izoformy.
16
Metabolismus vápníku a fosforu
5.3. Pagetova kostní choroba
Pro Pagetovu kostní nemoc je typické postižení pouze určitých částí skeletu. Je důsledkem
místní nekontrolované kostní resorpce, která je doprovázenou nadměrnou a neuspořádanou
novotvorbou kosti. Vzniká strukturně neplnohodnotná kost. Je zvýšen počet osteoklastů i osteoblastů.
Postižena může být jedna nebo více kostí. V biochemickém nálezu dominuje zvýšená hodnota
alkalické fosfatasy (především kostní izoformy). Užitečné je i stanovení markerů kostní remodelace.
Použitá literatura:
1. Broulík P.: Poruchy kalciofosfátového metabolismus. Grada Publishing, Praha
2. Bubnová E., Buděšínská A., Křemen J., Stříbrná J.: Praktická cvičení z lékařské chemie a
biochemie, část III. Karolinum, Praha 1998.
3. Burtis C.A., Ashwood E.R.: Tietz Textbook of Clinical Biochemistry, 2nd edition. W.B.Saunders
Company, Philadelphia 1994.
4. Doležalová V. a kolektiv: Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii. IDVPZ, Brno
1995.
5. Dzúrik R. a kolektiv: Štandardná klinickobiochemická diagnostika. Osveta, Martin 1996.
6. Chromý V., Fischer J.: Analytické metody v klinické biochemii. Masarykova universita, Brno
2000.
7. Kaplan L.A, Pesce A.J.: Clinical Chemistry. Theory, Analysis, Correlation. 3rd edition. Mosby
1996.
8. Kolektiv autorů: Lékařská chemie a biochemie. Praktikum. Avicenum, Osveta, Praha 1991.
9. Kraml J. a kolektiv: Návody k praktickým cvičením z lékařské chemie a biochemie. Karolinum,
Praha 1991.
10. Masopust J.: Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření I. a II. část.
Karolinum, Praha 1998.
11. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harperova biochemie. H+H, Praha
1998.
12. Racek J. a kolektiv: Klinická biochemie. Galén-Karolinum, Praha 1999.
13. Schneiderka P. a kolektiv: Stanovení analytů v klinické biochemii 1. část. Karolinum, Praha 1998.
14. Schneiderka P. a kolektiv: Vybrané kapitoly z klinické biochemie. Karolinum, Praha 1998.
15. Táborská E. a kolektiv: Návody ke cvičením z biochemie. Masarykova universita, Brno 1993.
16. Teplan V. a kol.: Praktická nefrologie. Grada Publishing 2006.
17. Thomas L.: Clinical laboratory diagnostics. TH-Books, Frankfurt/Main, Germany 1998.
18. Tichý V.: Stanovení aktivity kostní frakce alkalické fosfatasy pomocí termoinaktivace. Klin.
Biochem. Metab. 6, 194 – 195,1998.
19. Voet D., Voetová J. G.: Biochemie.Victoria Publishing, Praha 1995.
20. Zima T. a kolektiv: Laboratorní diagnostika. Galén, Praha 2002.
17
Metabolismus vápníku a fosforu
18