IngoFlowEx® Kit

IngoFlowEx® Kit
(100 tests / testů / testov)
h
ENGLISH
ED7040
5. Precautions


1. Manufacturer
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz





2. Intended use
IngoFlowEx® Kit is designed for quantification of phagocytic
activity of human granulocytes and monocytes by
measuring the ingestion of fluorescently labeled E. coli bacteria
in human heparinized whole blood using flow cytometry.

Intended for research use only.
Blood must be collected into a tube containing
heparin. Anticoagulants EDTA and citrate negatively
affects results of the analysis.
Blood samples should be measured within 8 hours
after collection.
The flow cytometer should be calibrated on a routine
basis using fluorescent microbeads to ensure the stable
sensitivity of detectors.
Do not use reagents after the expiration date stated on
vial labels.
Avoid contamination of reagents.
Use protective gloves and follow procedures for handling
potentially infectious materials.
Avoid contact of samples with skin, eyes and mucous
membranes.
Warning: 10x Lysing Solution (ED7040-3) contains
formaldehyde, methanol, and diethylene glycol.
3. Introduction
Phagocytosis is a part of the innate defense mechanisms in
which phagocytes ingest extracellular particulate material. The
ability of phagocytosis is a characteristic feature of the so-called
professional phagocytic cells (neutrophil and eosinophil
granulocytes, monocytes and macrophages). The process
includes particle binding, its ingestion and subsequent
degradation. Plasma proteins (C3b and antibodies) assist the
phagocytes in particle recognition and ingestion by covering the
surface of foreign particles with readily recognizable ligands.
DANGER
H phrases
H302+312+332: Harmful if swallowed, in contact with skin or if
inhaled.
H315: Causes skin irritation.
H317: May cause an allergic skin reaction
H319: Causes serious eye irritation.
H335: May cause respiratory irritation.
H351: Suspected of causing cancer
H371: May cause damage to organs.
H373: May cause damage to organs (kidney) through
prolonged or repeated exposure if swallowed.
4. Principle
The test is based on measuring the fluorescence of cells that
ingested FITC-labeled E. coli. A sample of heparinized blood is
mixed with fluorescent E. coli and incubated at 37 °C. A control
reaction without E. coli is performed in parallel with each
reaction with E. coli. This negative control is used to set the
discrimination boundery between the phagocyting and the nonphagocyting cells. The non-ingested bacteria are separated by
repeated washes. The fluorescence of remaining extracellular
and surface bound bacteria is quenched with trypan blue, a vital
dye does not cross the cellular membrane. Samples are then
subjected to erythrocyte lysis and fixed. Finally the cellular DNA
is stained with propidium iodide. DNA staining helps to define
nucleated cells from debris and clumps of bacteria.
Bacteria used in the test were opsonised with human AB
plasma, the results are not primarily dependent on opsonizing
activity of the tested blood sample.
P phrases
P270: Do not eat, drink or smoke when using this product.
P280: Wear protective gloves / protective clothing / eye
protection / face protection.
P301+P312: IF SWALLOWED: Call a POISON Center or
doctor/physician if you feel unwell.
P302+P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water.
P305+P351 + P338 IF IN EYES: Rinse cautiously with water for
several minutes. Remove contact lenses, if present and
easy to do. Continue rinsing.
1/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
Warning: Quenching Solution (ED7040-2) contains
0.08% Trypan Blue.
8. Storage
Store the IngoFlowEx® Kit at 2-8 C. Expiration date is stated on
reagent labels and on the IngoFlowEx® Kit box.
9. Assay procedure
DANGER
9.1
H phrases
H350: May cause cancer.
Wash Buffer
Dilute 25x Wash Buffer with PBS before use. Allow
the buffer to cool to 2-8 °C. Assign with the date of
preparation and store at 2-8 °C for up to 4 weeks.
Use the information given below as a quick guidance
to dilution volumes.
P phrases
P201: Obtain special instructions before use.
P270: Do not eat, drink or smoke when using this product.
P280: Wear protective gloves / protective clothing / eye
protection / face protection.
P301+P312: IF SWALLOWED: Call a POISON Center or
doctor/physician if you feel unwell.
P302+P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water.
P308+P313: IF exposed or concerned: Get medical advice/
attention
P501: Dispose of contents/container to authorized facility for
dangerous wastes.




ED7040-1 E. coli-FITC (Ready-to-Use) - one vial
containing 1 ml of fluorescein-labeled human plasma
opsonized E. coli strain K-12 in suspension, the vial is
intended for 100 reactions.
ED7040-2 Quenching Solution (Ready-to-Use) – one
vial containing 20 ml of buffered solution of trypan blue,
dark blue solution, the vial is intended for 200 reactions.
ED7040-3 10x Lysing Solution (10x concentrated
solution) – one vial containing 60 ml of 10x concentrated
transparent solution of fixation-lysing reagent. Each vial is
intended to prepare 600 ml of 1x Lysing Solution, i.e. 200
reactions.
ED7040-4 25x Wash Buffer (25x concentrated solution)
– one vial containing 80 ml of concentrated wash buffer.
Each vial is intended to prepare 2 liters of 1x Wash buffer,
i.e. 222 reactions.
ED7040-5 DNA Staining Solution (Ready-to-Use) – one
amber vial containing 60 ml of buffered propidium iodide
solution. Each vial is intended for 200 reactions.








Volume of
25x Wash
Buffer in ml
Volume of
PBS in ml
Total
volume
in ml
10
8
192
200
100
80
1920
2000
No. of
blood
samples
Volume of
10x Lysing
Solution in ml
Volume of
dH2O in ml
Total
volume
in ml
10
4
36
40
100
40
360
400
E. coli-FITC
Before use thoroughly mix the content of the vial
using vortex mixer.
9.2
Pipetting protocol
Allow 1x Wash Buffer to cool to 2-8 °C.
Allow 1x Lysing Solution to reach room
temperature.
Place E. coli-FITC, Quenching Solution and DNA
Staining Solution on ice.
Place a rack for test tubes on ice.
7. Necessary material not supplied



No. of
blood
samples
Lysing Solution
Dilute 10x Lysing Solution with deionized water.
Assign with the date of preparation and store at
2-8 °C or at room temperature for up to 4 weeks.
Use the information given below as a quick guidance
to dilution volumes.
6. Reagents provided

Preparation of reagents before measurement
Deionized water (dH2O), approximately 0.6 liter for one kit
Phosphate buffered saline (PBS), approximately 2 liters
Suitable 5ml test tubes for blood staining
(e.g. 12 × 75 mm)
Racks for the test tubes
Centrifuge with suitable rotor for 5ml tubes
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex
Thermal incubator or water bath (37 °C)
Container with ice (ice cubes or crushed ice) suitable for
placing a rack with tubes
Flow cytometer - blue laser excitation 488 nm, light
emission at 525 nm (FITC channel) and 617 nm (PE
channel).
Cylinders and glass bottles for the dilution of 25x Wash
Buffer and of 10x Lysing Solution
For each blood sample prepare two tubes:
- the reaction with E. coli
- the control reaction (without E. coli)
1. Pipette 50 l of blood into the test tubes.
2. Place the tubes on ice for 10 minutes.
3. Add 10 l of E. coli-FITC to the tube intended to
perfom reaction with Ecoli and mix using a
vortex mixer. Return the tube to ice.
4. Do not add anything into the control tubes.
5. Transfer the tubes (including the control tubes)
into a thermal incubator set to 37 °C (or a water
bath set to 37 °C).
2/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
6. Incubate for 30 minutes (10 minutes if using the
water bath).
7. Return the tubes to ice and incubate for
5 minutes.
11. Interpretation of results and the expected
values
The results can be interpreted as 1) percentage of phagocytes
containing fluorescent E. coli or 2) mean fluorescence of
phagocyting cells.
The following table shows the average percent phagocytosis
that was calculated from data obtained by measurement of
serie of blood samples from healthy donors.
8. Add 100 l of Quenching Solution (2-8 °C)
and mix well. Keep the tubes on ice.
9. Add 3 ml of 1x Wash Buffer (2-8 °C) and
centrifuge the tubes at 200 g for 5 min.
10. Remove the supernatant by aspiration into a
container with an appropriate disinfectant. Do
not disturb the pellet.
11. Repeat wash (steps 9 and 10).
12. Resuspend the pellet in the residual volume of
1x Wash buffer.
13. Add 2 ml of 1x Lysing Solution (room
temperature), mix and incubate for 20 minutes at
room temperature in the dark.
14. Centrifuge the cells at 200 g for 5 min.
15. Remove the supernatant but do not disturb the
pellet.
16. Add 3 ml precooled 1x Wash buffer and
centrifuge at 200 g for 5 min.
17. Remove supernatant and resuspend the pellet
in 300 l of DNA Staining Solution (2-8 °C).
18. Incubate for 10 minutes on ice in the dark.
19. Measure with flow cytometer within 2 hours
after adding the DNA Staining Solution.
Subpopulation of
cells
% phagocyting cells
(average +/- 2SD)
Granulocytes
91 (83-100)
Monocytes
82 (72-94)
12. Performance characteristics
Repeatability was determined by measuring four parallel
reactions from different healthy donors in different days and the
variability is expressed as the average coefficient of variation of
the acquired data.
10. Flow cytometric analysis
Setting up the cytometer before the first run:
(Optional)
The color compensation for spectral overlap may be assessed
with performing a set of single reagent stained blood samples.
To perform single stained reactions follow the assay procedure
described in section 8. Use only one kit component at a time.
1) blood and Ecoli-FITC (omit Quenching Solution and DNA
Staining Solution),
2) blood and Quenching Solution (omit E. coli-FITC and DNA
Staining Solution)
3) blood and DNA Staining Solution (omit E. coli-FITC and
Quenching Solution).
Use these measurements to adjust the cytometer settings.
Range of the
phagocytosis
percentage
among
measurements
(MIN-MAX)
Average CV (%)
% phagocyting
granulocytes
83.2-97.1
1.8
% phagocyting
monocytes
73.2-91.0
4.8
13. Limitations of the assay



Analysis of samples
Set a gate in PE channel (shown in Figure 1) and acquire a
sufficient number of cellular PE-bright events (at least 10,000
events). This gate excludes debris and clumps of bacteria from
further analysis.
Visualize the PE channel gated events in the side-scatter (SSC)
versus forward-scatter (FSC) dot-plot and set gates around the
granulocytes and monocytes (shown in Figure 2).
Then bring the gated subpopulations to histograms in FITC
channel (shown in Figure 3). Use the control reaction histogram
to place the discrimination line. A single discrimination line
setting is usually applicable for all tested samples within the
run. Calculate the percentage of positive cells (this parameter is
elswere called phagocytic activity) (Figure 3A and 3B).
3/11
Because the bacteria are provided as a ready-to-use
suspension their mean fluorescence intensity may change
during storage, however the results interpreted as percent
phagocytosis remains unaffected.
Reproducibility of the assay strongly depends on precise
working (incubation times, temperature, pipetting).
Flow cytometer may produce false results if the device has
not been regularly calibrated and maintained appropriately.
ED7040_EN_CZ_SK_150605

ČESKY
1. Výrobce

EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
Varování: 10x Lysing Solution (ED7040-3)
formaldehyd, metanol a diethylenglykol.
H věty
H302+312+332: Zdraví škodlivý při požití, při styku s kůží a při
vdechování
H315: Dráždí kůži.
H317: Může vyvolat alergickou kožní reakci.
H319: Způsobuje vážné podráždění očí.
H335: Může způsobit podráždění dýchacích cest.
H351: Podezření na vyvolání rakoviny.
H371: Může způsobit poškození orgánů.
H373: Může způsobit poškození ledvin při prodloužené nebo
opakované expozici.
IngoFlowEx® Kit je určený pro vyšetření fagocytární aktivity
granulocytů a monocytů měřením ingesce fluorescenčně
značených bakterií E. coli v plné heparinizované lidské krvi
pomocí průtokové cytometrie.
3. Úvod
Fagocytóza, pohlcení extracelulárně se vyskytujících
cizorodých částic buňkami, náleží k přirozeným obranným
mechanismům. Schopnost fagocytózy je charakteristickým
znakem tzv. profesionálních fagocytujících buněk (neutrofilní a
eosinofilní granulocyty, monocyty a makrofágy). Proces
zahrnuje navázání částice na povrch buněk, její pohlcení a
následnou degradaci. Některé plazmatické proteiny (C3b a
protilátky) napomáhají fagocytům v rozpoznávání částic
pokrytím jejich povrchu snadno rozpoznatelnými ligandy.
P věty
P270: Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte.
P280: Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné
brýle/obličejový štít.
P301+312: PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo
lékaře.
P302+352: PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím
vody a mýdlem.
P305+351+338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně
vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li
nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve
vyplachování.
P501: Odstraňte obsah/obal v autorizovaném místě sběru
nebezpečných odpadů.
4. Princip testu
Test je založen na měření intensity fluorescence buněk, které
pohltily fluorescenčně značené bakterie E. coli. Vzorek
heparinizované krve se smíchá s fluorescenčními bakteriemi a
nechá se inkubovat při 37 °C. Paralelně se provádí pro každou
reakci s E. coli také kontrolní reakce bez E. coli. Tato negativní
kontrola slouží při analýze k nastavení hranice mezi
fagocytujícími a nefagocytujícími buňkami. Volné bakterie jsou
odstraněny promytím buněk. Fluorescence bakterií navázaných
na povrchu buněk je potlačena přidáním trypanové modři,
vitální barvičky, která neproniká skrze buněčnou membránu.
Vzorky jsou poté vystaveny činidlu, které zafixuje leukocyty a
lyzuje erytrocyty. Nakonec je buněčná DNA obarvena
fluorescenčním činidlem, propidium jodidem. Označení DNA
napomáhá odlišení událostí odpovídajících leukocytům od
debrisu a shluků bakterií.
Bakterie použité v testu byly předem opsonizované lidskou AB
plazmou, výsledky nejsou primárně závislé na opsonizační
kapacitě vyšetřovaného vzorku.
Varování: Quenching
0.08% trypanovou modř.


Solution
(ED7040-2)
obsahuje
NEBEZPEČÍ
H věty
H350: Může vyvolat rakovinu.
P věty
P201: Před použitím si obstarejte speciální instrukce.
P270: Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte.
P280: Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné
brýle/obličejový štít.
P301+P312: PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo
lékaře.
P302+P352: PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím
vody a mýdlem.
P308+P313: PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte
lékařskou pomoc/ošetření.
P501: Odstraňte obsah/obal v autorizovaném místě sběru
nebezpečných odpadů.
5. Upozornění


obsahuje
NEBEZPEČÍ
2. Použití soupravy


Pracujte výhradně v ochranných rukavicích a při práci
dodržujte správné postupy pro zacházení s potenciálně
infekčním materiálem.
Vyvarujte se kontaktu vzorků s pokožkou, očima
a sliznicemi.
Souprava je určena pouze pro výzkumné účely.
Krev musí být odebrána do zkumavky s heparinem.
Antikoagulanty EDTA a citrát ruší stanovení.
Vzorky krve zpracujte do 8 hodin po odběru.
Průtokový cytometr denně kalibrujte pomocí
fluorescenčních kuliček, aby byla zajištěna stabilní
citlivost detektorů.
Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti.
Chraňte obsah vialek před kontaminací.
4/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
Lysing Solution
Nařeďte 10x Lysing Solution do deionizované vody
na pracovní koncentraci. Označte datem přípravy a
skladujte při 2-8 °C anebo při laboratorní teplotě po
dobu maximálně 4 týdnů. Jako pomůcku pro správné
ředění můžete použít níže uvedenou tabulku.
6. Obsah soupravy





ED7040-1 E.coli-FITC (připravené k použití) – vialka
z tmavého skla obsahující 1 ml suspenze opsonizovaných
fluorescenčně značených bakterii E. coli K-12, vialka je
určená pro 100 reakcí.
ED7040-2 Quenching Solution (připravené k použití)
– lahvička obsahující 20 ml pufrovaného roztoku trypanové
modři, tmavě modrý roztok, lahvička je určená pro
200 reakcí.
ED7040-3 10x Lysing Solution
(10x koncentrovaný
roztok) – lahvička obsahující 60 ml průhledného roztoku
koncentrátu fixačně-lyzačního činidla. Jedna lahvička je
určena pro přípravu 600 ml činidla, tj. 200 reakcí.
ED7040-4 25x Wash Buffer (25x koncentrovaný roztok)
– lahvička obsahující 80 ml koncentrátu promývacího pufru.
Jedna lahvička je určena pro přípravu 2 litrů promývacího
roztoku, tj. 222 reakcí.
ED7040-5 DNA Staining Solution (připravené k použití)
– tmavá neprůhledná lahvička obsahující 60 ml
narůžovělého roztoku propidium iodidu. Jedna lahvička je
určena pro 200 reakcí.









Objem
10xLysing
Solution
v ml
Objem
dH2O v ml
Celkový
objem
v ml
10
4
36
40
100
40
360
400
E.coli-FITC
Před použitím důkladně promíchejte obsah vialky na
vortexu.
9.2. Pipetovací protokol
Nechte vychladit 1x Wash buffer na 2-8 °C.
Nechte vytemperovat 1x Lysing solution na
laboratorní teplotu.
Připravte si nádobu s ledem a umístěte do ní
stojánek na zkumavky.
Vialku s E. coli-FITC, lahvičky s Quenching
solution a DNA Staining Solution umístěte na led.
7. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván


Počet
vzorků
krve
Deionizovaná voda (dH2O), přibiližně 0,6 litru pro jeden kit
Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), přibližně
2 litry
Vhodné 5 ml zkumavky pro inkubaci buněk
(např. 12 × 75 mm).
Stojánky pro zkumavky
Centrifuga s rotorem pro 5 ml zkumavky
Sada automatických pipet s jednorázovými špičkami
Vortex
Inkubátor nebo vodní lázeň (37°C)
Nádoba s ledem (ledové kostky nebo tříšť) vhodná pro
umístění stojánku se zkumavkami
Průtokový cytometr - excitace modrým laserem 488 nm,
emise záření při 525 nm (FITC) a 617 nm (PE).
Nádoby a odměrné válce pro naředění Wash Buffer a
Lysing Solution na pracovní koncentraci
Pro každý vzorek krve si připravte dvě zkumavky:
reakce s E. coli
kontrolní reakce (bez E. coli)
1.
2.
Napipetujte 50 l krve do zkumavek.
Umístěte zkumavky na led a nechte 10 minut
chladit.
3.
Přidejte 10 l E.coli-FITC do zkumavky
určené pro reakci s E.coli a promíchejte obsah
na vortexu. Vraťte ihned zkumavku na led.
Do kontrolních zkumavek nic nepřidávejte.
Přeneste všechny zkumavky (i kontrolní) do
inkubátoru nastaveného na 37 °C (nebo do
vodní lázně nastavené na 37 °C).
Nechte inkubovat 30 minut (anebo 10 minut ve
vodní lázni).
Vraťte zkumavky na led a nechte 5 minut
chladit.
4.
5.
8. Skladování soupravy
6.
IngoFlowEx® Kit skladujte při teplotě 2-8 C. Doba použitelnosti
je vyznačena na jednotlivých reagenciích a na obalu soupravy.
7.
9. Postup testu
9.1
8.
Příprava reagencií před měřením
Wash Buffer
Nařeďte 25x Wash Buffer do PBS na pracovní
koncentraci. Nechte roztok vychladit na 2-8 °C.
Označte datem přípravy a skladujte při 2-8 °C po
dobu maximálně 4 týdnů. Jako pomůcku pro správné
ředění můžete použít níže uvedenou tabulku.
Počet
vzorků
krve
Objem
25xWash
Buffer v ml
Objem PBS
v ml
Celkový
objem
v ml
10
8
192
200
100
80
1920
2000
9.
10.
11.
12.
13.
5/11
Přidejte 100 l vychlazeného Quenching
Solution a promíchejte obsah na vortexu.
Stále držte zkumavky na ledu.
Přidejte 3 ml vychlazeného 1x Wash Buffer
(2-8 °C) a centrifugujte zkumavky při 200 g po
dobu 5 minut.
Odsajte supernatant do nádoby s desinfekcí.
Opakujte promytí (krok 9 a 10).
Resuspendujte sediment ve zbytkovém
objemu promývacího pufru.
Přidejte 2 ml 1xLysing solution
(vytemperovaný na laboratorní teplotu),
promíchejte a nechte inkubovat 20 minut při
laboratorní teplotě chráněné před světlem.
ED7040_EN_CZ_SK_150605
14. Centrifugujte buňky při 200 g po dobu 5 min.
15. Odsajte supernatant do nádoby s desinfekcí.
16. Přidejte 3 ml vychlazeného 1x (2-8 °C) a
centrifugujte buňky při 200 g po dobu 5 min.
17. Odsajte supernatant do nádoby s desinfekcí a
resuspendujte sediment ve 300 l DNA
Staining Solution.
18. Nechte inkubovat 10 minut na ledu chráněné
před světlem.
19. Změřte vzorky na průtokovém cytometru do
2 hodin od přidání DNA Staining Solution.
11. Vyhodnocení testu a očekávané hodnoty
Na vzorku lze hodnotit procentuální zastoupení fagocytů, které
pohltily fluorescenční E. coli, a také střední hodnotu
fluorescence buněk s fagocytovanými E. coli.
V následující tabulce jsou uvedeny průměrné hodnoty
procentuálního zastoupení fagocytujících buněk, které byly
vypočítané z dat naměřených na sadě vzorků krve od zdravých
krevních dárců.
10. Analýza v průtokovém cytometru
Nastavení cytometru před prvním měřením:
(volitelné)
Provedením jednobarevných reakcí na vybraném vzorku krve
můžete stanovit úroveň spektrálního přesvitu pro
kompenzování signálu v jednotlivých detekčních kanálech.
Jednobarevné reakce proveďte podle pipetovacího protokolu
popsaného v oddíle 8. Použijte jen jednu fluorescenční
komponentu ze soupravy.
1) vzorek krve a E. coli-FITC (bez použití Quenching
Solution a a DNA Staining Solution)
2) vzorek krve a Quenching Solution (bez použití E. coliFITC a DNA Staining Solution)
3) vzorek krve a DNA Staining Solution (bez použití E. coliFITC a Quenching solution)
Měření použijte k optimalizaci nastavení cytometru.
Populace buněk
% fagocytujících buněk
(průměr +/- 2SD)
Granulocyty
91 (83-100)
Monocyty
82 (70-94)
12. Parametry testu
Opakovatelnost stanovení procenta fagocytujících buněk byla
vypočítána z výsledků měření čtyř paralelních reakcí u 13
vzorků krve od zdravých krevních dárců. Variabilita je vyjádřena
průměrným koeficientem variability ze všech stanovení.
Měření vzorků
Nastavte si v kanálu pro PE region, který odfiltruje debris a
shluky bakterií z další analýzy (ukázáno na obrázku č. 1).
Nechte nahrát dostatečný počet (alespoň 10 000) buněčných
silně svítících událostí.
Zobrazte naměřené buňky v grafu side-scatter (SSC) versus
forward-scatter (FSC) a ohraničte subpopulace granulocytů a
monocytů (ukázáno na obrázku č. 2).
Zobrazte ohraničené granulocyty a monocyty v histogramech
detekčního kanálu pro FITC (ukázáno na obrázku č. 3).
Použijte histogramy kontrolních reakcí pro umístění
diskriminační hranice. Obyčejně je dostačující jedno společné
nastavení diskriminační hranice pro vyhodnocení všech právě
vyšetřovaných vzorků. Spočítejte procentuální zastoupení
fagocytujících buněk (někdy je tento parametr nazýván
fagocytární aktivita) (ukázáno na obrázku č. 3A a 3B).
Rozsah
naměřených hodnot
fagocytární aktivity
testovaných vzorků
(MIN-MAX)
Průměrný CV
(%)
%
fagocytujících
granulocytů
83,2-97,1
1,8
%
fagocytujících
monocytů
73,2-91,0
4,8
13. Omezení metody



6/11
Bakterie jsou dodávány v suspenzi připravené k použití,
jejich průměrná intenzita fluorescence se může během
skladování měnit, nicméně výsledky testu při hodnocení
procentuálního zastoupení aktivních fagocytů zůstávají
nezměněné.
Reprodukovatelnost měření je závislá na dodržování
inkubačních časů, inkubační teploty a na preciznosti
pipetování.
Průtokový cytometr může poskytovat nesprávné hodnoty,
pokud není pravidelně kalibrován a udržován.
ED7040_EN_CZ_SK_150605

SLOVENSKY
1. Výrobca

EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
Pracujte výhradne v ochranných rukaviciach a pri práci
dodržujte správne postupy zaobchádzania s potenciálne
infekčným materiálom.
Vyvarujte sa kontaktu vzoriek s pokožkou, očami
a sliznicami.
Varovanie: 10x Lysing Solution (ED7040-3)
formaldehyd, methanol a diethylenglykol.
2. Použitie súpravy
NEBEZPEČENSTVO
IngoFlowEx®
Kit je určený na vyšetrenie fagocytárnej aktivity
granulocytov a monocytov meraním ingescie fluorescenčne
značených bakterií E. coli v plnej heparinizovanej ľudskej krvi
pomocou prietokovej cytometrie.
H vety
H302+312+332: Zdraviu škodlivý po požití, pri kontakte
s pokožkou, pri vdýchnutí.
H315: Dráždi kožu.
H317: Môže vyvolať alergickú kožnú reakciu.
H319: Spôsobuje vážne podráždenie očí.
H335: Môže spôsobiť podráždenie dýchacích ciest.
H351: Podozrenie, že spôsobuje rakovinu.
H371: Môže spôsobiť poškodenie orgánov.
H373: Môže spôsobiť poškodenie obličiek pri dlhšej
alebo opakovanej expozícii.
3. Úvod
Fagocytóza, pohltenie extracelulárne sa vyskytujúcich
cudzorodých častíc bunkami, patrí k prirodzeným obranným
mechanizmom. Schopnosť fagocytózy je charakteristickým
znakom tzv. profesionálnych fagocytujúcich buniek (neutrofilné
a eozinofilné granulocyty, monocyty a makrofágy). Proces
zahŕňa naviazanie častice na povrch bunky, jej pohltenie a
následnú degradáciu. Niektoré plazmatické proteíny (C3b
protilátky) napomáhajú fagocytom v rozpoznávaniu častíc
pokrytím ich povrchu ľahko rozpoznateľnými ligandami.
P vety
P270: Pri používaní výrobku nejedzte, nepite ani nefajčite.
P280: Noste ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné
okuliare/ochranu tváre.
P301+312: PO POŽITÍ: Pri zdravotných problémoch, volajte
NÁRODNÉ TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ
CENTRUM alebo lekára.
P302+352: PRI KONTAKTE S POKOŽKOU: Umyte veľkým
množstvom vody a mydla.
P305+351+338: PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Niekoľko minút ich
opatrne vyplachujte vodou. Ak používate kontaktné
šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo
vyplachovaní.
P501: Zneškodnite obsah/nádobu do autorizovaného miesta
sberu nebezpečných odpadov.
4. Princíp testu
Test je založený na meraní intenzity fluorescencie buniek, ktoré
pohltili fluorescečne označené baktérie E. coli. Vzorka
heparinizovanej krvi sa zmieša s fluorescenčnými baktériami a
nechá sa inkubovať pri teplote 37 °C. Paralelne je pre každú
reakciu s E. coli pripravovaná kontrolná reakcia bez E. coli.
Táto slúži na nastavenie hranice medzi fagocytujúcimi a
nefagocytujúcimi bunkami. Voľné baktérie sú odstránené
premytím buniek. Fluorescencia baktérií naviazaných na
povrchu buniek je potlačená pridaním trypánovej modrej,
vitálnej farbičky, ktorá nepreniká skrze bunkovú membránu.
Vzorky sú potom vystavené činidlu, ktoré zafixuje leukocytov
lyzuje erytrocytov. Nakoniec je bunková DNA označená
fluorescenčným činidlom, propidium iodidom. Označenie DNA
napomáha odlíšeniu udalostí odpovedajúcich leukocytom od
debris a zhlukov baktérií.
Baktérie pouzite v teste boli vopred opsonizované ľudskou AB
plazmou, výsledky nie sú primárne závislé na opsonizačnej
kapacite vyšetrované vzorky.
Varovanie:Quenching Solution (ED7040-2) obsahuje
0.08% trypanovou modrou.
NEBEZPEČENSTVO
H vety
H350: Môže spôsobiť rakovinu.
5. Upozornenie






obsahuje
P vety
P201: Pred použitím sa oboznámte s osobitnými pokynmi.
P270: Pri používaní výrobku nejedzte, nepite ani nefajčite.
P280: Noste ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné
okuliare/ochranu tváre.
P301+P312: PO POŽITÍ: Pri zdravotných problémoch, volajte
NÁRODNÉ TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ
CENTRUM alebo lekára.
P302+P352: PRI KONTAKTE S POKOŽKOU: Umyte veľkým
množstvom vody a mydla.
P308+P313: Po expozícii alebo podozrení z nej: Vyhľadajte
lekársku pomoc/starostlivosť.
Súprava je určená len na výskumné účely.
Krv musí byť odobratá do skúmavky s heparínom.
Antikoagulanty EDTA a citrát narúšajú stanovenie.
Vzorky krvi spracujte do 8 hodín po odbere.
Prietokový cytometer denne kalibrujte pomocou
fluorescenčných guličiek, aby bola zaistená stabilná
citlivosť detektorov.
Nepoužívajte reagencie po uplynutí času použiteľnosti.
Chráňte obsah fľaštičiek pred kontamináciou.
7/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
P501: Zneškodnite obsah/nádobu v autorizovanom mieste
zberu nebezpečných odpadov.
Počet
vzorkov
krve
Objem
25xWash
Buffer v ml
Objem
PBS v ml
Celkový
objem
v ml
6. Obsah súpravy
10
8
192
200
100
80
1920
2000





ED7040-1 E.coli-FITC (pripravené na použitie) - fľaštička
z tmavého skla obsahujúca 1 ml suspenzie
opsonizovaných fluorescenčne označených baktérií E. coli
K-12, fľaštička je určená pre 100 reakcií.
ED7040-2 Quenching Solution (pripravené na použitie)
- fľaštička obsahujúca 20 ml pufrovaného roztoku
trypanovej modrej, tmavo modrý roztok, fľaštička je určená
pre 200 reakcií.
ED7040-3 10x Lysing Solution (10x koncentrovaný
roztok) - fľaštička obsahujúca 60 ml priehľadného roztoku
koncentrátu fixačného-lyzačného činidla. Jedna fľaštička je
určená pre prípravu 600 ml lyzačného činidla, tj 200
reakcií.
ED7040-4 25x Wash Buffer (25x koncentrovaný roztok)
- fľaštička obsahujúca 80 ml koncentrátu premývacieho
roztoku. Jedna fľaštička je určená pre prípravu 2 litrov
premývacieho roztoku, tj 222 reakcií.
ED7040-5 DNA Staining Solution (pripravené na
použitie) - tmavá nepriehľadná fľaša obsahujúca 60 ml
svetlo ružového roztoku propidium iodidu. Jedna fľaštička
je určená pre 200 reakcií.
Lysing Solution
Narieďte 10x Lysing Solution do deionizovanej
vody na pracovnú koncentráciu. Označte dátumom
prípravy a skladujte pri 2-8 ° C alebo pri laboratórnej
teplote po dobu maximálne 4 týždňov. Ako pomôcku
pre správne riedenie môžete použiť nižšie uvedenú
tabuľku.










Objem
dH2O v ml
Celkový
objem
v ml
10
4
36
40
100
40
360
400
9.2 Pipetovací protokol
Nechajte vychladiť 1x Wash Buffer na 2-8 °C.
Nechajte vytemperovať 1x Lysing Solution na
laboratórnu teplotu.
Pripravte si nádobu s ľadom a umiestnite do nej
stojan na skúmavky.
Fľaštičku s E. coli-FITC, fľaštičky s Quenching
Solution a DNA Staining Solution umiestnite na
ľad.
Deionizovaná voda (dH2O), približne 2,5 litra pre jeden kit.
Fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS), približne 2
litre
Vhodné 5 ml skúmavky pre inkubáciu buniek
(napr. 12 × 75 mm).
Stojančeky na skúmavky
Centrifúga s rotorom pre 5 ml skúmavky
Sada automatických pipiet s jednorazovými špičkami
Vortex
Inkubátor alebo vodný kúpeľ (37 °C)
Nádoba s ľadom (ľadové kocky alebo triešť) vhodná pre
umiestnenie stojančeku so skúmavkami
Prietokový cytometer - excitácia modrým laserom 488 nm,
emisia žiarenia pri 525 nm (FITC) a 617 nm (PE).
Nádoby a odmerné valce pre nariedení Wash Buffer
a Lysing Solution na pracovnú koncentráciu
Pripravte si pre každú vzorku krvi dve skúmavky:
-
reakcia s E. coli
kontrolná reakcia (bez E. coli)
1. Napipetujte 50 l krvi do skúmaviek.
2. Umiestnite skúmavky na ľad a nechajte 10 minút
chladiť.
3. Pridajte 10 l suspenzie E. coli-FITC do
skúmavky určené pre reakciu s E. coli a
premiešajte obsah na vortexe. Vráťte ihneď
skumavku na ľad.
4. Do kontrolných skúmaviek nič nepipetujte.
5. Preneste všetky skúmavky (i kontrolné) do
inkubátora nastaveného na 37 °C (alebo do
vodného kúpeľa nastaveného na 37 °C).
6. Inkubujte 30 minút (alebo 10 minút vodnom
kúpeli).
7. Vráťte skúmavky na ľad a nechajte 5 minút
chladiť.
8. Skladovanie súpravy
IngoFlowEx ® Kit skladujte pri teplote 2-8 C. Doba použiteľnosti
je vyznačená na jednotlivých reagenciách a na obale súpravy.
9. Postup testu
9.1
Objem
10xLysing
Solution v ml
E.coli-FITC
Pred použitím dôkladne premiešajte obsah fľaštičky
na vortexe.
7. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý nie je
dodávaný


Počet
vzorkov
krve
Príprava reagencií pred meraním
Wash Buffer
Narieďte 25x Wash Buffer do PBS na pracovnú
koncentráciu. Nechajte roztok vychladiť na 2-8 °C.
Označte dátumom prípravy a skladujte pri 2-8 ° C po
dobu maximálne 4 týždňov. Ako pomôcku pre
správne riedenie môžete použiť nižšie uvedenú
tabuľku.
8. Pridajte 100 l vychladeného Quenching
Solution, premiešajte obsah skúmaviek na
vortexe. Stále držte skúmavky na ľade.
9. Pridajte 3 ml vychladeného 1x Wash Buffer
(2-8 °C) a centrifugujte skúmavky pri 200 g po
dobu 5 minút.
8/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
10. Odsajte supernatant do nádoby s dezinfekciou.
11. Opakujte premytie (krok 9 a 10).
12. Resuspendujte sediment vo zostatkovom
objeme premývacieho pufra.
13. Pridajte 2 ml 1x Lysing Solution
(vytemperovaného na laboratórnu teplotu),
premiešajte a inkubujte 20 minút pri laboratórnej
teplote chránené pred svetlom.
14. Centrifugujte pri 200 g po dobu 5 minút.
15. Odsajte supernatant do nádoby s dezinfekciou.
16. Pridajte 3 ml vychladeného 1x Wash Buffer a
centrifugujte pri 200 g po dobu 5 minút.
17. Odsajte supernatant do nádoby s dezinfekciou a
resuspendujte sediment v 300 l DNA Staining
Solution.
18. Nechajte inkubovať 10 minút na ľade chránené
pred svetlom.
19. Zmerajte vzorky na prietokovom cytometri do
2 hodín od pridania DNA Staining Solution.
Populácia
buniek
% fagocytujúcich buniek
(průměr +/- 2SD)
Granulocyty
91 (83-100)
Monocyty
82 (70-94)
12. Parametry testu
Opakovateľnosť stanovenia percenta fagocytujúcich buniek
bola vypočítaná z výsledkov meraní štyroch paralelných reakcií
u 13 vzoriek krvi od zdravých krvných darcov. Variabilita je
vyjadrená priemerným koeficientom variability zo všetkých
stanovení.
Rozsah nameraných
hodnôt fagocytárnej
aktivity testovaných
vzoriek (MIN-MAX)
10. Analýza prietokovym cytometrom
Nastavenie cytometru pred prvým meraním:
(volitelné)
Vykonaním jednofarebných reakcií na vybranej vzorke krvi
môžete stanoviť úroveň spektrálneho presvitu pre
kompenzovanie signálu v jednotlivých detekčných kanáloch.
Jednofarebné reakcie vykonajte podľa pipetovacieho protokolu
popsaného v oddiele 8. Použite iba jednu fluorescenčnú
komponentu zo súpravy.
1) vzorka krvi a E. coli-FITC (bez použitia Quenching Solution
a DNA Staining Solution)
2) vzorka krvi a Quenching Solution (bez použitia E. coli-FITC
a DNA Staining Solution)
3) vzorka krvi a DNA Staining Solution (bez použitia E. coliFITC a Quenching Solution)
Meranie použite k optimalizácii nastavenia cytometra.
Priemerný CV
(%)
%
fagocytujúcich
granulocytov
83,2-97,1
1,8
%
fagocytujúcich
monocytov
73,2-91,0
4,8
13. Obmedzenia metódy



Baktérie sú dodávané v suspenzii pripravené na použitie,
ich priemerná intenzita fluorescencie sa môže počas
skladovania meniť, avšak výsledky testu pri hodnotení
percentuálneho zastúpenia aktívnych fagocytov zostávajú
nezmenené.
Reprodukovateľnosť merania je závislá na dodržiavaniu
inkubačných časov, inkubačnej teploty a na precíznosti
pipetovania.
Prietokový cytometer môže poskytovať nesprávne hodnoty,
ak nie je pravidelne kalibrovaný a udržiavaný.
Meranie vzoriek
Nastavte región v PE kanáli, ktorý vylúči debris a zhluky baktérií
z ďalšej analýzy (obrázok č. 1). Nechajte nahrať dostatočný
počet (prinajmenej 10 000) bunkových silno svietiacich udalostí.
Namerané bunky zobrazte v grafe side-scatter (SSC) versus
forward-scatter (FSC) a orámujte supopulácie granulocytov a
monocytov (obrázok č. 2).
Zobrazte ohraničené subpopulácie v histograme pre kanál
FITC. Použite histogramy kontrolných reakcií pre umiestnenie
diskriminačné línie. Obyčajne je postačujúce jedno spoločné
nastavenie diskriminačné línie pre vyhodnotenie všetkých práve
vyšetrovaných vzoriek. Spočítajte percentuálne zastúpenie
fagocujúcich buniek (niekedy je tento parameter nazývaný
fagocytárna aktivita (obrázok č. 3A a 3B).
11. Vyhodnotenie testu a očakávané hodnoty
Na vzorke možno hodnotiť percentuálne zastúpenie fagocytov,
ktoré pohltili fluorescenčné E. coli, a tiež strednú hodnotu
fluorescencie buniek s fagocytovanými E. coli.
V nasledujúcej tabuľke sú uvedené priemerné hodnoty
percentuálneho zastúpenia fagocytujících buniek, ktoré boli
vypočítané z dát nameraných na sade vzoriek krvi od zdravých
krvných darcov.
9/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
14. Example of data / Vzorové vyhodnocení /
Vzorové vyhodnotenie
granulocytes
leukocytes
debris
monocytes
Fig. 2 Gates for granulocytes and monocytes.
Obr. 2 Ohraničení subpopulací granulocytů a monocytů.
Obr. 2 Ohraničenie granulocytov a monocytov.
Fig. 1
Gate for cells that exclude debris and bacterial clupms
from further analysis.
Obr. 1 Ohraničení buněk k odstranění debrisu a shluků
bakterií.
Obr. 1 Ohraničenie buniek k odfiltrovaniu debris a zhlukov
baktérií.
Fig. 3B Overalay of histograms of monocyte subpopulation
Obr. 3B Histogramy monocyte přeložené přes sebe.
Obr. 3B Histogramy monocytov preložené cez seba
Fig. 3A Overlay of histograms of granulocyte subpopulation.
Obr. 3A Histogramy granulocytů přeložené přes sebe.
Obr. 3A Histogramy granulocytov preložené cez seba.
10/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605
15. References / Literatura/ Literatúra
M. O’Gorman. Clinical evaluation of Myeloid and Monocytic Cell
functions in Manual of Molecular and Clinical Laboratory
Immunology edited by B. Detrick, 7th edition, AMS Press 2006,
Page 272-280.
16. Explanation of symbols / Vysvětlení
symbolů / Vysvetlenie symbolov
h
M
l
8 °C
2 °C
g
H
Catalog number
Katalogové číslo
Katalógové číslo
Manufacturer identification
Výrobce
Výrobca
Store within temperature limits
Rozmezí skladovacích teplot
Rozmedzie skladovacích tepltôt
Batch code
Číslo šarže
Use by
Použitelné do
Použiteľné do
11/11
ED7040_EN_CZ_SK_150605