CD14 PE

V
C
Monoclonal Antibody to CD14, PE conjugated
(CD14 PE)
Cat. No. / Kat. č.: ED7015
ENGLISH
5. Reagent provided
The reagent contains mouse monoclonal antibody against
human CD14 antigen (clone MEM-15) which was purified by
affinity chromatography and labeled with R-Phycoerythrin (PE).
The labeled antibody is diluted at optimum concentration in
phosphate buffered saline (PBS) containing 15mM sodium
azide and 0.2% (w/v) high-grade protease free Bovine Serum
Albumin (BSA) as a stabilizing agent. The content of a vial
(2 ml) is sufficient for 100 tests.
1. Specification
Specificity
Fluorochrome
Clone
Isotype
Content
Usage
 excitation
Emission maximum
Human CD14
PE
MEM-15
Mouse IgG1
100 tests, 2 ml
20 l per test
488 nm
575 nm
6. Storage
Store vial in the dark at 2-8°C. Do not freeze.
2. Intended use
7. Precautions
The reagent CD14 PE permits identification and enumeration of
cell populations expressing human CD14 antigen in whole
blood using flow cytometry.
Intended for professional use only.
Do not use after expiration date stamped on vial label.
Avoid prolonged exposure to light.
The content of the vial must not freeze.
Avoid contamination of the reagent.
Any non-performance of staining protocol may produce
false results.
 The reagent contains sodium azide (NaN3) which is highly
toxic in pure form. However, the concentration in the
reagent (15mM) is not considered as hazardous. When
disposing the reagent, flush the sink with large volume of
water to avoid accumulation of explosive metal-azide
in plumbing.
 Blood samples are considered as potentially infectious
and must be handled with care. Avoid all contact of the
sample with the skin, eyes and mucosa.






3. Principle
This test is based on specific binding of monoclonal antibody to
the antigenic determinant expressed on the surface of
leukocytes. The monoclonal antibody is labeled with
fluorochrome which is excited via laser beam from a flow
cytometer during analysis. Subsequent emission of light from
fluorochromes of each cell is collected and analyzed by a flow
cytometer. The fluorescence intensity differences enable
separation of cell subsets based on expression of analyzed
antigen.
Specific staining of blood cells is performed by incubation of
blood samples with the reagent followed by a lysis of red blood
cells. Afterwards, unaffected leukocytes are subjected to
analysis by a flow cytometer.
8. Necessary material not supplied
Material necessary for collection of peripheral blood, test tubes
for staining of blood samples (e.g. 12 × 75 mm), automatic
pipettes with disposable tips, vortex mixer, centrifuge,
commercial lysing solution, phosphate buffered saline (PBS),
isotype control antibody (mouse IgG1 PE), flow cytometer.
4. Specificity
The antibody MEM-15 reacts with CD14, a 53-55 kDa GPI
(glycosylphosphatidylinositol) linked membrane glycoprotein
expressed on monocytes, macrophages and weakly on
granulocytes; it is expressed by most tissue macrophages. This
antibody also reacts with soluble forms of CD14 found in serum
and in the urine of some nephrotic patients. The monoclonal
antibody MEM-15 was assigned to CD14 during the Human
Leukocyte Differentiation Antigen workshop (HLDA3 WS Code:
M 252).
9. Staining protocol
1.
1/5
Collect peripheral blood in a sterile tube with an
anticoagulant (e.g. Heparin, EDTA).
ED7015_EN_CZ_SK_101202
ČESKY
Add 20 l of CD14 PE reagent to a test tube, and the
necessary amount of isotype control to a control tube.
3. Add 100 l of blood sample to each tube. Vortex the
tubes.
4. Incubate tubes for 20-30 minutes at room temperature
in the dark.
5. Perform lysis of red cells using lysing solution. It is
recommended to use a commercial lysing solution
containing formaldehyde as a fixative. Follow the
instructions of the lysing solution manufacturer.
6. Centrifuge tubes for 5 minutes at 300 g.
7. Remove supernatant and resuspend pellet with
3-4 ml of PBS.
8. Centrifuge tubes for 5 minutes at 300 g.
9. Remove supernatant and resuspend pellet with 0.3 –
0.5 ml of PBS.
10. Analyze samples immediately using flow cytometer or
store samples at 2-8°C in the dark and analyze within
24 hours provided that cells were fixed.
2.
1. Specifikace produktu
Specificita
Fluorochrom
Klon
Izotyp
Obsah
Použití
 excitace
Emisní maximum
CD14
PE
MEM-15
Myší IgG1
100 testů, 2 ml
20 l na test
488 nm
575 nm
2. Použití
Reagencie CD14 PE je In vitro diagnostický zdravotnický
prostředek, který je určený pro identifikaci a počítání CD14
pozitivních lymfocytů v lidské periferní krvi pomocí průtokové
cytometrie
10. Data analysis
Analyze sample stained with CD14 PE using a flow cytometer.
Visualize recorded data using appropriate plot such as sidescatter (SSC) versus PE intensity as shown in figure 1. The
brightest population (CD14+) belongs to monocytes. Set
suitable gates for analysis. The region corresponding to the
negative population should be set up using control cells which
were stained by isotype control antibody.
3. Princip
Tento test je založen na specifické vazbě monoklonální
protilátky na antigen, který je exprimovaný na povrchu
leukocytů.
Monoklonální
protilátka
je
konjugovaná
s fluorescenční značkou. Během analýzy vzorku průtokovým
cytometrem je detekována fluorescence jednotlivých buněk.
Rozdíly v intenzitě fluorescence buněk umožňují separovat
skupiny leukocytů na základě rozdílné exprese analyzovaného
antigenu.
11. Limitations
 Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
 Data may be incorrectly interpreted if fluorescent signals
were compensated wrongly or if gates were positioned
inaccurately.
 Blood samples from abnormal patients may exhibit
abnormal values of positive cells.
 Red blood cells from abnormal patients may be resistant
to lysis using lysing solutions.
 In case of hyperleukocytose sample, it is recommended to
dilute blood sample with PBS to obtain leukocyte density
approximately 5 × 106 leukocytes/ml.
 Blood samples should be stained and analyzed within 24
hours from the blood collection.
Specifické barvení leukocytů probíhá v periferní krvi. Po
inkubaci vzorku se značenou protilátkou jsou červené krvinky
odstraněny pomocí lyze a leukocyty jsou analyzovány
průtokovým cytometrem.
4. Specificita
Monoklonální protilátka MEM-15 reaguje s molekulou CD14,
membránovým glykoproteinem o molekulové hmotnosti 5355 kDa zakotveným pomocí glycosylfosfatidylinositolu,
exprimovanou monocyty, makrofágy a slabě i granulocyty.
Protilátka MEM-15 reaguje také s rozpustnou formou CD14,
která se nalézá v séru a moči některých nefrotických pacientů.
Specificita monoklonální protilátky MEM-15 byla ověřena
v rámci mezinárodního pracovního semináře o lidských
leukocytárních diferenciačních antigenech (HLDA3 WS Code:
M 252).
5. Popis reagencie
Reagencie obsahuje myší monoklonální protilátku proti
lidskému antigenu CD14 (klon MEM-15), která byla purifikována
a označena R-phycoerythrinem (PE). Značená protilátka byla
naředěna na optimální koncentraci do stabilizačním roztoku,
který obsahuje PBS (pH 7,4), 0,2% hovězí sérový albumin
a 15mM NaN3. Obsah vialky (2 ml reagencie) odpovídá
provedení 100 testů.
2/5
ED7015_EN_CZ_SK_101202
6. Skladování
10. Analýza dat
Vialku s reagencií uchovávejte v temnu při teplotě 2-8 °C. Doba
použitelnosti reagencie je vyznačena na štítku vialky.
Vzorek obarvený pomocí reagencie CD14 PE analyzujte
průtokovým cytometrem. Naměřená data zobrazte ve vhodném
grafu, například side-scatter (SSC) versus intenzita
fluorescence PE jak je znázorněno na obrázku 1. Populace
buněk s nejvyšší intenzitou fluorescence (CD14+) představuje
monocyty. Populace oddělte vhodně nastavenými regiony.
Region odpovídající negativním buňkám je doporučeno předem
nastavit pomocí vhodné izotypové kontroly (myší IgG1 značená
PE). Izotypová kontrola pomůže odhadnout úroveň
nespecifických vazeb značené protilátky na buňky.
7. Upozornění
Výrobek je určen pro profesionální uživatele.
Nepoužívejte reagencii po uplynutí doby použitelnosti.
Reagencii nevystavujte dlouhodobému působení světla.
Obsah vialky nesmí zmrznout.
Chraňte obsah vialky před kontaminací.
Nedodržení postupu měření může ovlivnit výsledky testu.
Reagencie obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čistém
stavu vysoce toxický, avšak koncentrace, která je v této
reagencii (15 mM), není již považována za nebezpečnou.
Při likvidaci reagencie obsahující azid splachujte velkým
množstvím vody.
 Krevní vzorky jsou považovány za potenciálně infekční
materiál a proto s nimi musí být náležitě nakládáno.
Vyvarujte se kontaktu vzorků s pokožkou, očima
a sliznicemi.







11. Omezení metody
 Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
 Data mohou být špatně interpretována, pokud jsou
fluorescenční signály špatně kompenzované, případně
pokud jsou regiony buněk špatně umístěné.
 Krevní vzorky od abnormálních pacientů mohou
vykazovat abnormální hodnoty procent pozitivních buněk.
 Červené krvinky některých abnormálních pacientů mohou
být rezistentní k lyzi pomocí lyzačních roztoků.
 V případě krevního vzorku s abnormálně vysokým počtem
leukocytů je třeba vzorek naředit pomocí PBS na hodnotu
kolem 5 × 106 leukocytů na ml.
 Krevní vzorky by neměly být skladovány déle než 24
hodin před barvením.
8. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván
Nezbytný materiál pro odběr periferní krve, vhodné zkumavky
pro barvení buněk (např. 12 × 75 mm), sada pipet
s jednorázovými špičkami, centrifuga, vortex, lyzační roztok,
pufr PBS, izotypová kontrola (myší IgG1 PE), průtokový
cytometr.
SLOVENSKY
9. Postup barvení
1. Špecifikácia produktu
1. Odeberte periferní krev do sterilní odběrové zkumavky
obsahující antikoagulant (např. Heparin, EDTA).
2. Pipetujte 20 l reagencie CD14 PE do zkumavky
a stejné množství izotypové kontroly do kontrolní
zkumavky.
3. Přidejte 100 l promíchané periferní krve do každé
zkumavky a směs promíchejte pomocí vortexu.
4. Inkubujte zkumavky 20-30 minut v temnu za laboratorní
teploty.
5. Proveďte lyzi červených krvinek pomocí lyzačního
roztoku. Je doporučeno používat komerční lyzační
činidlo, které obsahuje formaldehyd fixující buňky.
Postupujte podle návodu výrobce lyzačního činidla.
6. Centrifugujte zkumavky 5 minut při 300 g.
7. Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocí 3-4 ml PBS.
8. Centrifugujte zkumavky 5 minut při 300 g.
9. Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocí 0,3-0,5 ml PBS.
10. Analyzujte vzorky ihned po obarvení pomocí
průtokového cytometru. V případě že byly vzorky
fixovány formaldehydem, je možné vzorky uskladnit
v temnu při 2-8°C a analyzovat do 24 hodin.
Špecifičnosť
Fluorochróm
Klon
Izotyp
Obsah
Použitie
 excitácia
Emisné maximum
CD14
PE
MEM-15
Myšie IgG1
100 testov, 2 ml
20 l na test
488 nm
575 nm
2. Použitie
Reagencia CD14 PE je In vitro diagnostický zdravotnícky
prostriedok, ktorý je určený na identifikáciu a počítanie CD14
pozitívnych lymfocytov v ľudskej periférnej krvi pomocou
prietokovej cytometrie
3. Princíp
Tento test je založený na špecifickej väzbe monoklonovej
protilátky s antigénom, ktorý je exprimovaný na povrchu
leukocytov. Monoklonová protilátka je konjugovaná
s fluorescenčnou značkou. V priebehu analýzy vzorky
prietokovým cytometrom sa zaznamená fluorescencia
jednotlivých buniek. Rozdiely v intenzite fluorescencie
3/5
ED7015_EN_CZ_SK_101202
jednotlivých buniek umožňujú separáciu skupín leukocytov na
základe rozdielnej expresie analyzovaného antigénu.
PBS tlmivý roztok, izotypová kontrola (myšie IgG1 PE),
prietokový cytometer.
Špecifické značenie leukocytov prebieha v periférnej krvi. Po
inkubácii vzorky s označenou protilátkou sú červené krvinky
odstránené pomocou lýzy a leukocyty sú analyzované
prietokovým cytometrom.
9. Postup značenia
1. Odoberte periférnu krv do sterilnej odberovej skúmavky
obsahujúcej antikoagulant (napr. Heparín, EDTA).
2. Pipetujte 20 l reagencie CD14 PE do skúmavky
a rovnaké množstvo izotypovej kontroly do kontrolnej
skúmavky.
3. Pridajte 100 l premiešanej periférnej krvi do každej
skúmavky a zmes premiešajte pomocou vortexu.
4. Skúmavky inkubujte 20-30 minút v temne pri
laboratórnej teplote.
5. Zlyzujte červené krvinky pomocou lyzačného roztoku.
Odporúča sa používať komerčné lyzačné činidlo, ktoré
obsahuje formaldehyd a fixuje bunky. Postupujte podľa
návodu od výrobcu lyzačného činidla.
6. Centrifugujte skúmavky 5 minút pri 300 g.
7. Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 3-4 ml PBS.
8. Centrifugujte skúmavky 5 minút pri 300 g.
9. Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 0,3-0,5 ml PBS.
10. Vzorky analyzujte na prietokovom cytometri ihneď po
označení. V prípade, že vzorky boli fixované
formaldehydom, je možné tieto vzorky uskladniť
v temne pri 2-8°C a analyzovať do 24 hodín.
4. Špecifičnosť
Monoklonová protilátka MEM-15 reaguje s molekulou CD14,
membránovým glykoproteínom s molekulovou hmotnosťou 5355 kDa zakotveným pomocou glykosylfosfatidylinositolu,
exprimovanou monocytmi, makrofágmi a v malej miere i
granulocytmi. Protilátka MEM-15 reaguje aj s rozpustnou
formou CD14, ktorá sa nachádza v sére a v moči niektorých
nefrotických pacientov. Špecifičnosť monoklonovej protilátky
MEM-15 bola v rámci medzinárodného pracovného seminára o
ľudských leukocytárnych diferenciačných antigénoch (HLDA3
WS Code: M 252).
5. Popis reagencie
Reagencia obsahuje myšiu monoklonovú protilátku proti
ľudskému antigénu CD14 (klon MEM-15), ktorá bola
purifikovaná a označená R-Phycoerythrinom (PE). Označená
protilátka bola nariedená na optimálnu koncentráciu do
stabilizačného roztoku, ktorý obsahuje PBS (pH 7,4), 0,2%
hovädzí sérový albumín a 15mM NaN3. Obsah fľaštičky (2 ml
reagencie) odpovedá uskutočneniu 100 testov.
10. Analýza dát
Vzorku označenú pomocou reagencie CD14 PE analyzujte
prietokovým cytometrom. Namerané dáta zobrazte vo vhodnom
grafe, napríklad side-scatter (SSC) proti intenzita fluorescencie
PE, ako je to znázornené na obrázku 1. Populácia buniek
s najvyššou intenzitou fluorescencie (CD14+) predstavuje
monocyty. Populácie oddeľte vhodne nastavenými regiónmi.
Región, ktorý odpovedá negatívnym bunkám sa odporúča
nastaviť dopredu pomocou vhodnej izotypovej kontroly (myšie
IgG1 označené PE). Izotypová kontrola pomôže odhadnúť
úroveň nešpecifických väzieb označenej protilátky na bunky.
6. Skladovanie
Fľaštičku s reagenciou uschovávajte v temne pri teplote 2-8 °C.
Doba použiteľnosti reagencie je vyznačená na štítku fľaštičky.
7. Upozornenie
Výrobok je určený pre profesionálnych užívateľov.
Nepoužívajte reagenciu po uplynutí doby použiteľnosti.
Reagenciu nevystavujte dlhodobému pôsobeniu svetla.
Obsah fľaštičky nesmie zmrznúť.
Chráňte obsah fľaštičky pred kontamináciou.
Nedodržanie postupu merania môže ovplyvniť výsledky
testu.
 Reagencia obsahuje azid sodný (NaN3), ktorý je v čistom
stave vysoko toxický, avšak koncentrácia prítomná v tejto
reagencii (15 mM) už nieje považovaná za nebezpečnú.
Pri likvidácii reagencie obsahujúcej azid splachujte
umývadlo veľkým množstvom vody.
 Krvné vzorky sú považované za potenciálne infekčný
materiál a preto sa s nimi musí zaobchádzať opatrne.
Vyvarujte sa kontaktu vzoriek s pokožkou, očami
a sliznicami.






11. Obmedzenia metódy
 Prietokový cytometer môže poskytovať nepresné
výsledky, ak nieje dobre nastavený a udržiavaný.
 Dáta môžu byť zle interpretované, ak sú fluorescenčné
signály nedostatočne kompenzované alebo ak sú regióny
buniek zle umiestnené.
 Krvné vzorky od abnormálnych pacientov môžu vykazovať
abnormálne percentuálne hodnoty pozitívnych buniek.
 Červené krvinky niektorých abnormálnych pacientov môžu
byť rezistentné voči lýze pomocou lyzačných roztokov.
 V prípade krvnej vzorky s abnormálne vysokým počtom
leukocytov je potrebné vzorku nariediť pomocou PBS na
hodnotu približne 5 × 106 leukocytov na ml.
 Krvné vzorky by nemali byť skladované dlhšie ako 24
hodín pred značením.
8. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva
Materiál potrebný na odber periférnej krvi, vhodné skúmavky
pre značenie buniek (napr. 12 × 75 mm), sada pipiet
s jednorázovými špičkami, centrifúga, vortex, lyzačný roztok,
4/5
ED7015_EN_CZ_SK_101202
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů /
Vysvetlenie symbolov
Example data / Vzorové vyhodnocení / Vzorové
vyhodnotenie
h
M
i
X
l
8°C
2°C
g
H
Fig. 1: Leukocytes stained with CD14 PE reagent
Obr. 1: Leukocyty obarvené pomocí reagencie CD14 PE
Obr. 1: Leukocyty označené pomocou reagencie CD14 PE
In Vitro Diagnostic Medical Device
In vitro diagnostický zdravotnický prostředek
In vitro diagnostický zdravotnícky prostriedok
Catalog number
Katalogové číslo
Katalógové číslo
Manufacturer identification
Výrobce
Výrobca
Consult the manual before use
Viz návod k použití
Viď návod na použitie
Sufficient for N test
Lze použít pro N testů
Postačujúce na vykonanie N testov
Store within temperature limits
Rozmezí skladovacích teplot
Rozmedzie skladovacích teplôt
Batch code
Číslo šarže
Use by
Použitelné do
Použiteľné do
Manufacturer / Výrobce / Výrobca
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
References / Literatura / Literatúra
Asai Y et al. (2007) Soluble CD14 Discriminates Slight
Structural Differences between Lipid As That Lead to Distinct
Host Cell Activation. J Immunol. 179: 7674-83
Lodrup Carlsen KC and Granum B (2007) Soluble CD14: role in
atopic disease and recurrent infections, including otitis media.
Curr Allergy Asthma Rep. 7: 436-43
Fernández-Real JM et al. (2003) CD14 monocyte receptor,
involved in the inflammatory cascade, and insulin sensitivity. J
Clin Endocrinol Metab. 88: 1780-4
Juan TS et al. (1995) Identification of a domain in soluble CD14
essential for lipopolysaccharide (LPS) signaling but not LPS
binding. J Biol Chem. 270: 17237-42
Bazil V et al. (1986) Biochemical characterization of a soluble
form of the 53-kDa monocyte surface antigen. Eur J Immunol.
16: 1583-9
Leukocyte Typing VI., Kishimoto T. et al. (Eds.), Garland
Publishing Inc. (1997).
Leukocyte Typing V., Schlossman S. et al. (Eds.), Oxford
University Press (1995).
Leukocyte Typing IV., Knapp W. et al. (Eds.), Oxford University
Press (1989).
Leukocyte Typing III., McMichael A. J. et al (Eds.), Oxford
University Press (1987).
5/5
ED7015_EN_CZ_SK_101202