Návod k použití

Návod k použití
LPU 022
Langer-Giedion
Pouze pro profesionální použití
Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních
chromozomech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá
DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozomy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní
doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované
fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bezformamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci.
Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku.
Specifikace sondy
TRPS1 (8q23.3) – červená
EXT1 (8q24.11-8q24.12) – zelená
8 cen:( ( D8Z2) - modrá
Úvod
Syndrom Langer Giedion ( LGS, tricho-rhino-phalangeal syndrom typu II ) se vyznačuje delecí sousedících genů zahrnující
pruhy 8q23.3 a 8q24.1. LGS je charakteristický kranio-faciálními a skeletálními abnormalitami: mnohočetné chrupavčité
exostózy, kuželovité výrůstky. Běžná je i mentální retardace. LGS slučuje klinické znaky dvou autozomálně dominantních
onemocnění: tricho-rhino-phalangeal syndrom typu I ( TRPS1) a mnohočetné chrupavčité exostózy ( EXT1). TRPS1 gen je
dlouhý více než 1,000Kb proximálně k EXT1.
Červeně značená sonda pro detekci oblasti TRPS1 je zhruba 311kb dlouhá a skládá se ze dvou ne-překrývajících se
klonů, které pokrývají většinu deletované oblasti. Zelená sonda pokrývá deleční oblast EXT1a skládá se ze dvou
nepřekrývajích se klonů zhruba 403kb dlouhých. Kombinace dvou barev rozliší delece. Modrá centromerická sonda
(D8Z2) je přidána jako sonda kontrolní pro identifikaci chromozomu 8. V normální buňce by měly být viditelné 2
červené, 2 zelené a dva modré signály ( 2R, 2G, 2B). Zatímco při deleci by měly být viditelné ve výsledku buď 1R 1G 2B
když oba TRPS1 a EXT1 jsou deletované nebo 2R 1G 2B když je pouze deletovaný EXT1 nebo 1R 2G 2B pouze při
deleci TRPS1. Zelený a červený signál mohou být viditelné jako žlutý signál z důvodu blízkosti sond.
Materiál obsažený v soupravě
Sonda: 50µl ve zkumavce ( 5 testů ) nebo 100µl ve zkumavce ( 10T )
Množství sondy TRPS1 – 64-80ng/test
Množství sondy EXT1 – 190-240ng/test
Množství sondy cen 8: 55-70ng/test
Směs sond je dodávána naředěná v hybridizačním roztoku ( Formamid, Dextran sulfát, SSC ) - připravená k použití .
Sondy jsou přímo značené: Sonda TRPS1 – pomocí červeného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru Texas Red,
sonda EXT1 – pomocí zeleného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru FITC a kontrolní sonda cen 8 pomocí
modrého fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru Aqua.
Podbarvení
150µl ve zkumavce ( 15T )
Podbarvení je DAPI antifade ( ES: 0.125 µg/ml DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindole )
Upozornění a bezpečnostní opatření
1. Pro použití in vitro. Pouze pro prefesionální použití.
2. Noste rukavice při práci s DNA sondami a DAPI.
3. Směs sondy obsahuje formamid, který je teratogenem: nevdechujte výpary a zabraňte kontaktu s kůží. Noste rukavice,
laboratorní kabát a při práci mějte zapnutý odsávač par. Po použití, vypláchněte dostatečným množstvím vody.
4. DAPI je potencionální karcinogen. Manipulujte s optarností. Noste rukavice a laboratorní kabát. Po upotřebení
vypláchněte dostatečným množstvím vody.
5. Se vším nebezpečným materiálem zacházejte dle vnitřních směrnic pro likvidaci nebezpečného odpadu.
Skladování a použití
Souprava Aquarius by měla být skladována při -20°C do data expirace uvedeného na obalu. Zkumavky se sondami a DAPI
musí být uskladněné v temnu.
Materiál potřebný k práci, nedodávaný v soupravě
a, Ohřívací plotýnka ( s pevnou deskou a přesnou kontrolou teploty do 80C)
b, Různě velké mikropipety v rozsahu 1µl-200µl
c, Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C
d, Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
e, Fluorescenční mikroskop ( viz sekce – Doporučení fluorescenčního mikroskopu )
f, Plastové nebo skleněné nádoby
g, Pinzety
h, Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop
i, Odstředivka
Doporučení fluorescenčního mikroskopu
Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy 63x nebo
100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení všech fluorochromů a DAPI současně.
Příprava a vhodnost vzorků
Souprava je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve. Tyto by měly být připravené dle
laboratorních směrnic.
FISH Protokol
Příprava podložního skla:
1. Naneste vzorek na čisté mikroskopické sklíčko
2. Omyjte sklíčko ve 2 x SSC, pH 7.0 - 2 minuty
3. Vysušte v etanolové vzestupné řadě (70%, 85% a 100%), každý 2 minuty
Pre – denaturace
4. Vyjměte sondu z mrazáku nechte zahřát na pokojovou teplotu
Ujistěte se, zda je roztok sondy a hybridizačního činidla konstantní pomocí opakovaného promíchání
pipetou
6. Napipetujte 10µl sondy a nakápněte na sklíčko se vzorkem, přikryjte krycím sklem 24x24 mm a zalepte gumovým
lepidlem nechte zaschnout.
Denaturace:
7. Denaturujte na ohřívací plotýnce při 75oC na 2 minuty
Hybridizace:
8.
Hybridizujte přes noc v temné komůrce při 37oC
5.
Posthybridizační omytí:
9.
Sejměte krycí sklo a odstraňte všechny zbytky lepidla
10. Omyjte sklo v 0.4 x SSC při 72oC (pH 7.0) 2 minuty
11. Okapejte sklo a omyjte ve 2 x SSC, 0.05% Tween 20 při pokojové teplotě (pH 7.0), 30 sekund
12. Okapejte a napipetujte 10µl DAPI
13. Přikryjte krycím sklíčkem a nechte vyvinout barvu ve tmě 10 minut.
14. Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Stabilita výsledných sklíček
Výsledná sklíčka jsou analyzovatelná 1 měsíc, pokud jsou uchované při pokojové teplotě nebo teplotě nižší.
Doporučení při postupu
1. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou
rozhodující pro optimální provedení testu.
2. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit
nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu.
3. Pečení nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, toto může snížit intenzitu fluorescenčního signálu.
Podpora zákazníkům
Kontaktujte: Technické oddělení Cytocell Ltd. nebo INTIMEX s.r.o.