Návod k použití

Návod k použití
LPP R/G
Řada celochromozomových malovacích sond, specifických pro jednotlivý lidský chromozom, přímo značených zeleným
nebo červeným fluorochrómem
Pouze pro profesionální použití
Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních
chromozómech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá
DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozómy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní
doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované
fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bezformamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci.
Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku.
Materiál obsažený v soupravě
Sonda: 50µl ve zkumavce ( 5 testů )
Množství malovací sondy, značené červeným fluorochrómem – 18-38 ng/test
Množství malovací sondy, značené zeleným fluorochrómem – 56-94 ng/test
Sondy se dodávají připravené k použití, naředěné v hybridizačním roztoku ( Formamid, Dextran sulfát, SSC ). Jsou přímo
značené zeleným ( FITC) nebo červeným ( Texas red ) fluorochrómem.
Podbarvení
150µl ve zkumavce ( 15T )
Podbarvení je DAPI antifade ( ES: 0.125 µg/ml DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindole )
Upozornění a bezpečnostní opatření
1. Pro použití in vitro. Pouze pro prefesionální použití.
2. Noste rukavice při práci s DNA sondami a DAPI.
3. Směs sondy obsahuje formamid, který je teratogenem: nevdechujte výpary a zabraňte kontaktu s kůží. Noste rukavice,
laboratorní kabát a při práci mějte zapnutý odsávač par. Po použití, vypláchněte dostatečným množstvím vody.
4. DAPI je potencionální karcinogen. Manipulujte s optarností. Noste rukavice a laboratorní kabát. Po upotřebení
vypláchněte dostatečným množstvím vody.
5. Se vším nebezpečným materiálem zacházejte dle vnitřních směrnic pro likvidaci nebezpečného odpadu.
Skladování a použití
Souprava Aquarius by měla být skladována při -20°C do data expirace uvedeného na obalu. Zkumavky se sondami a DAPI
musí být uskladněné v temnu.
Materiál potřebný k práci, nedodávaný v soupravě
Technické vybavení
a, Ohřívací plotýnka ( s pevnou deskou a přesnou kontrolou teploty do 80C)
b, Různě velké mikropipety v rozsahu 1µl-200µl
c, Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C
d, Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
e, Fluorescenční mikroskop ( viz sekce – Doporučení fluorescenčního mikroskopu )
f, Plastové nebo skleněné nádoby
g, Pinzety
h, Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop
i, Odstředivka
Doporučení fluorescenčního mikroskopu
Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy
100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení obou fluorochromů a DAPI současně.
63x nebo
Příprava a vhodnost vzorků
Souprava je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve. Tyto by měly být připravené dle
laboratorních směrnic.
FISH Protokol
Příprava podložního skla:
1. Naneste vzorek na čisté mikroskopické sklíčko. Nechte uschnout.
2. Omyjte sklíčko ve 2 x SSC, pH 7.0 - 2 minuty ( pokojová teplota )
3. Vysušte v etanolové vzestupné řadě (70%, 85% a 100%), každý 2 minuty ( pokojová teplota )
Pre – denaturace
4. Vyjměte sondu z mrazáku a nechte zahřát na pokojovou teplotu
5. Ujistěte se, zda je roztok sondy a hybridizačního činidla konstantní pomocí opakovaného promíchání
pipetou
6. Napipetujte 10µl sondy na jeden test do mikrocentrifugační zkumavky
7. Předehřejte sondu, vzorek a 24x24 mm krycí sklíčko na ohřívací plotýnce - 37oC, 10 minut
8. Nakápněte 10µl směsi sondy na buněčnou suspenzi a opatrně přikryjte krycím sklíčkem. Zalepte gumovým lepidlem.
Nechte zcela uschnout.
Denaturace:
10. Denaturujte sondu se i vzorek na ohřívací plotýnce - 75o C, 2 minuty
Hybridizace:
11. Hybridizujte přes noc v temné komůrce při 37oC.
Posthybridizační omytí:
12. Sejměte krycí sklo a odstraňte všechny zbytky lepidla
13. Omyjte sklo v 0.4 x SSC při 72oC (pH 7.0), 2 minuty.
14. Okapejte sklo a omyjte ve 2 x SSC, 0.05% Tween 20 při pokojové teplotě (pH 7.0), 30 sekund
15. Okapejte a napipetujte 10µl DAPI
16. Přikryjte krycím sklíčkem a nechte vyvinout barvu ve tmě 10 minut.
17. Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Míchání sond
- Smíchání jedné červeně značené sondy a jedné zeleně značené sondy: 5µl červeně značené sondy a 5µl zeleně
značené sondy na jeden test
- Smíchání jedné červeně značené, jedné zeleně značené sondy a žluté sondy: 3µl červeně značené sondy, 3µl zeleně
značené sondy a žlutá sonda: 2µl červeně značené sondy a 2µl zeleně značené sondy pro stejný chromozom na jeden
test
- Výše uvedené množství jsou pouze doporučené a mohou vyžadovat optimalizaci.
Stabilita výsledných sklíček
Výsledná sklíčka jsou analyzovatelná 1 měsíc, pokud jsou uchované při pokojové teplotě nebo teplotě nižší.
Doporučení při postupu
1. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou
rozhodující pro optimální provedení testu.
2.
Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit
nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu.
Očekávané výsledky při hybridizaci jedné sondy
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Malovací sondy pro akrocentrické chromozomy obsahují materiál z krátkých ramének. Toto mají společné
chromozomy skupiny D & G. V těchto oblastech může být pozorována cross-hybridizace.
Malovací sonda pro chromozom 16 může vykazovat slabou cross-hybridizaci s heterochromatickou oblastí
chromozomu Y.
Malovací sonda pro chromozom Y obsahuje pseudoautosomální oblasti společné s chromozomem X. Proto může být
v těchto oblastech pozorována cross-hybridizace.
Malovací sonda pro chromozom X obsahuje pseudoautosomální oblasti společné s chromozomem Y. Proto může být
v těchto oblastech pozorována cross-hybridizace.
Chromozomy 1, 5 a 19 mají společnou centromérovou DNA sekvenci. Proto může být pozorována cross-hybridizace
v těchto oblastech mezi těmito chromozomy.
Malovací sonda pro chromozom 1 může vykazovat jasnější signál v oblasti 1p36.
Malovací sondy nepokrývají heterochramatické úseky chromozomů 1, 9 a 16.
Malovací sonda pro chromozom 21 může vykazovat cross-hybridizaci se subtelomérovou oblastí 1p.
Podpora zákazníkům
Kontaktujte: Technické oddělení Cytocell Ltd. nebo INTIMEX s.r.o.