Návod k použití

Návod k použití
LPU 020
Sonda Monosomy 1p36 s kontrolní sondou 1qter
Pouze pro profesionální použití
Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních
chromozómech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá
DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozómy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní
doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované
fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bezformamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci.
Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku.
Specifikace sondy
SKI (1p36.33) – červená
1q – zelená
Úvod
Oblast sondy SKI je značená červeně a je zhruba 115 kb velká. Sonda zahrnuje marker D1S2515. Doprovodná specifická
subtelomérová sonda 1q, značená zeleně, slouží jako kontrolní sonda. V normální buňce by měly být viditelné dva červené a
dva zelené signály ( 2R, 2G), zatímco při deleci cílové oblasti jeden červený a dva zelené signály ( 1R, 2G ).
Materiál obsažený v soupravě
Sonda: 50µl ve zkumavce ( 5 testů ) nebo 100µl ve zkumavce ( 10T )
Množství sondy SKI – 7,3ng/test
Množství sondy 1q – 86,6ng/test
Směs sond je dodávána naředěná v hybridizačním roztoku ( Formamid, Dextran sulfát, SSC ) - připravená k použití .
Sondy jsou přímo značené: Sonda SKI – pomocí červeného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru Texas Red,
specifická subtelomérová sonda 1q – pomocí zeleného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru FITC.
Podbarvení
150µl ve zkumavce ( 15T )
Podbarvení je DAPI antifade ( ES: 0.125 µg/ml DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindole )
Upozornění a bezpečnostní opatření
1. Pro použití in vitro. Pouze pro prefesionální použití.
2. Noste rukavice při práci s DNA sondami a DAPI.
3. Směs sondy obsahuje formamid, který je teratogenem: nevdechujte výpary a zabraňte kontaktu s kůží. Noste rukavice,
laboratorní kabát a při práci mějte zapnutý odsávač par. Po použití, vypláchněte dostatečným množstvím vody.
4. DAPI je potencionální karcinogen. Manipulujte s optarností. Noste rukavice a laboratorní kabát. Po upotřebení
vypláchněte dostatečným množstvím vody.
5. Se vším nebezpečným materiálem zacházejte dle vnitřních směrnic pro likvidaci nebezpečného odpadu.
Skladování a použití
Souprava Aquarius by měla být skladována při -20°C do data expirace uvedeného na obalu. Zkumavky se sondami a DAPI
musí být uskladněné v temnu.
Materiál potřebný k práci, nedodávaný v soupravě
Technické vybavení
a, Ohřívací plotýnka ( s pevnou deskou a přesnou kontrolou teploty do 80C)
b, Různě velké mikropipety v rozsahu 1µl-200µl
c, Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C
d, Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
e, Fluorescenční mikroskop ( viz sekce – Doporučení fluorescenčního mikroskopu )
f, Plastové nebo skleněné nádoby
g, Pinzety
h, Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop
i, Odstředivka
Doporučení fluorescenčního mikroskopu
Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy
100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení obou fluorochromů a DAPI současně.
63x nebo
Příprava a vhodnost vzorků
Souprava je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve. Tyto by měly být připravené dle
laboratorních směrnic.
FISH Protokol
Příprava podložního skla:
1. Naneste vzorek na čisté mikroskopické sklíčko
2. Omyjte sklíčko ve 2 x SSC, pH 7.0 - 2 minuty
3. Vysušte v etanolové vzestupné řadě (70%, 85% a 100%), každý 2 minuty
Pre – denaturace
4. Vyjměte sondu nechte zahřát na pokojovou teplotu
5. Ujistěte se, zda je roztok sondy a hybridizačního činidla konstantní pomocí opakovaného promíchání
pipetou
6. Napipetujte 10µl sondy a nakápněte na sklíčko se vzorkem, přikryjte krycím sklem 24x24 mm a zalepte gumovým
lepidlem nechte zaschnout.
Denaturace:
7. Denaturujte na ohřívací plotýnce při 75oC na 2 minuty
Hybridizace:
8.
Hybridizujte přes noc v temné komůrce při 37oC
Posthybridizační omytí:
9.
Sejměte krycí sklo a odstraňte všechny zbytky lepidla
10. Omyjte sklo v 0.4 x SSC při 72oC (pH 7.0) 2 minuty
11. Okapejte sklo a omyjte ve 2 x SSC, 0.05% Tween 20 při pokojové teplotě (pH 7.0), 30 sekund
12. Okapejte a napipetujte 10µl DAPI
13. Přikryjte krycím sklíčkem a nechte vyvinout barvu ve tmě 10 minut.
14. Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Stabilita výsledných sklíček
Výsledná sklíčka jsou analyzovatelná 1 měsíc, pokud jsou uchované při pokojové teplotě nebo teplotě nižší.
Doporučení při postupu
1. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou
rozhodující pro optimální provedení testu.
2. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit
nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu.
3. Pečení nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, toto může snížit intenzitu fluorescenčního signálu.
Podpora zákazníkům
Kontaktujte: Technické oddělení Cytocell Ltd. nebo INTIMEX s.r.o.