Diagnostika rostlinných virů - Biologické centrum AV ČR, vvi

Transkript

Prof. Ing. Josef Špak, DrSc.
DIAGNOSTIKA ROSTLINNÝCH VIRŮ.
Studijní text ke kurzu EKOTECH
Diagnostika rostlinných patogenů
Adresa autora:
Biologické centrum Akademie věd České republiky, Ústav molekulární biologie rostlin,
Branišovská 31, 370 05 České Budějovice, e-mail: [email protected]
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů
Obsah
1.0. ÚVOD. ....................................................................................................................... 3
2.0. ROSTLINNÉ VIRY. ....................................................................................................... 4
2.1. STRUKTURA A MORFOLOGIE VIROVÝCH ČÁSTIC. .......................................... 4
2.2. SYSTÉM ROSTLINNÝCH VIRŮ.............................................................................. 5
3.0. DIAGNOSTICKÉ METODY. ......................................................................................... 11
3.1. HODNOCENÍ PŘÍZNAKŮ NA ROSTLINÁCH (SYMPTOMATOLOGIE). ............. 11
3.2. BIOLOGICKÉ TESTY........................................................................................... 16
3.3. ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE ........................................................................ 17
3.4. METODY ZALOŽENÉ NA SÉROLOGICKÝCH VLASTNOSTECH VIROVÝCH
PROTEINŮ ................................................................................................................. 21
3.5. METODY DETEKCE NUKLEOVÉ KYSELINY. .................................................... 29
4.0. UCHOVÁVÁNÍ STANDARDŮ........................................................................................ 37
5.0. ODBĚR, UCHOVÁNÍ A PŘEPRAVA VZORKŮ................................................................. 38
6.0. LEGISLATIVA, ORGANIZACE A PERSPEKTIVY FYTODIAGNOSTIKY V ČR A EU. ......... 39
7.0. SEZNAM LITERATURY. .............................................................................................. 42
1.0. Úvod.
Diagnostika rostlinných virů má značný praktický význam v několika oblastech.
První z nich je kontrola zdravotního stavu sadby a osiv. Vzhledem k tomu, ţe proti virům
neexistují prakticky pouţitelné pesticidy je produkce viruprosté sadby a osiv klíčovým
preventivním a ochranným opatřením proti virům.
Druhou oblastí je vnější a vnitřní karanténa, která brání zavlečení a rozšíření ekonomicky
významných virů. Její význam roste se zvyšující se mezinárodní obchodní výměnou
rostlinného materiálu. Poţadavky EU staví fytosanitární diagnostiku na úroveň diagnostiky
veterinární a dosaţení srovnatelné úrovně s EU je úkolem nemalým a dlouhodobým. Rychlé
detekční metody jsou nepostradatelné i pro poznání biologie a epidemiologie fytovirů.
Česká odborná literatura vyšlá do roku je jiţ v mnohém zastaralá (Bojňanský et al. 1963,
Musil et al. 1981). Rychle zastarávají i anglicky psané učebnice (např. Matthews 1991,
Walkey 1991) zejména v molekulárně biologických metodách diagnostiky, které se mezitím
jiţ staly standardními. Proto lze ke studiu doporučit novější učebnice Bos L.: Plant viruses,
unique and intriguing pathogens – a textbook of plant virology. 1999 a Hull, R. Comparative
Plant Virology 2009, které jsou dostupné v Akademické a univerzitní knihovně v Č.
Budějovicích.
Tento text poskytuje přehled prakticky vyuţívaných metod detekce rostlinných virů,
zhodnocení jejich předností a nedostatků. Je koncipován tak, aby mohl být vyuţit jako studijní
text a umoţnit rychlou orientaci v problematice všem, kteří se fytosanitární diagnostikou
zabývají.
3
2.0. Rostlinné viry.
2.1. STRUKTURA A MORFOLOGIE VIROVÝCH ČÁSTIC.
Rostlinný virus je řetězec jedné nebo více molekul nukleových kyselin, obvykle
uzavřený v ochranném plášti nebo pláštích z proteinu nebo lipoproteinu, který je
schopen organizovat svoji vlastní replikaci pouze uvnitř vhodných hostitelských buněk
(obr.1.) (Matthews 1991).
Obr.1. Modelová struktura částice viru mozaiky tabáku.
Uvnitř buněk hostitele replikace viru závisí na aparátu hostitele syntetizujícím proteiny,
organizuje se ze zásob nezbytných látek spíše neţ dělením buněk, probíhá v místech, která
nejsou oddělena od obsahu hostitelské buňky dvojitou lipoproteinovou membránou a neustále
umoţňuje vznik variant prostřednictvím různých změn virové nukleové kyseliny (Matthews
1991).
4
Nukleová kyselina viru obecně kóduje:
1) Enzymy, které se účastní při syntéze nukleové kyseliny (polymerázy) a proteázy.
2) Strukturní proteiny - subjednotky plášťového proteinu viru.
3) Nestrukturní proteiny. Ty rozdělujeme na transportní proteiny, umoţňující šíření
viru do sousedních buněk (cell to cell) a do celé rostliny (systemic movement proteins),
pomocné proteiny (helper component protein), umoţňující přenos viru vektory a proteiny
inkluzí.
2.2. SYSTÉM ROSTLINNÝCH VIRŮ
Podle druhu nukleové kyseliny, která je nositelkou genetické informace rozlišujeme viry
obsahující kyselinu deoxyribonukleovou (DNA) a ribonukleovou (RNA), které mohou být
dvouvláknové (double strand - ds) nebo jednovláknové (single strand - ss) a v podobě
lineární nebo kruhové molekuly (tab.1.). U ssRNA virů můţe být vlákno v pozitivní nebo
negativní orientaci. Některé izoláty určitých fytovirů mohou navíc obsahovat tzv. satelitní
viry, jejichţ RNA kóduje svůj vlastní obalový protein.
Tab. 1. Rozdělení rostlinných virů podle druhu nukleové kyseliny.
DNA viry
RNA viry
Kruhová dsDNA
dsRNA
Lineární dsDNA
Negativní ssRNA
Kruhová ssDNA
Pozitivní ssRNA
Satelitní viry ss RNA
Pro klasifikaci rostlinných virů se pouţívá těchto kriterií:
1. Vlastnosti nukleové kyseliny
2. Virové proteiny
5
3. Struktura virové částice (virionu)
4. Fyzikální a chemické a vlastnosti částice
5. Sérologické vztahy
6. Hostitelský okruh a příznaky na rostlinách
7. Způsoby přenosu
Nejčastěji uţívané taxonomické kategorie v rostlinné virologiii jsou čeleď, rod, druh,
kmen, izolát. Charakterizovat je přesně je obtíţné. Velmi zjednodušeně je však moţné říci, ţe
přílušnost k čeledi je dána druhem, formou a členěním nukleové kyseliny, příslušnost k rodu
tvarem a velikostí virových částic (obr.2.). Jako druh viru si lze představit populaci virových
částic vyvolávajících na určité rostlině charakteristické onemocnění. Ke kmeni zpravidla
řadíme sérologicky příbuzné nebo jinak podobné izoláty určitého druhu viru (například
nekrotický kmen Y viru bramboru). Kategorii izolát pak často pouţíváme k označení původu
podle hostitelské rostliny nebo země.
Úpravy systému provádí výkonný výbor International Committee on Taxonomy of Viruses
(ICTV) a publikuje je v 3 letém intervalu, zpravidla při příleţitosti mezinárodního
virologického kongresu. Nejnovější změny jsou přístupné na www stránkách ICTV
http://www.virustaxonomyonline.com .
Tab. 2. Systém DNA virů
6
Obr. 2. Čeledi a rody rostlinných virů. Originál Murphy et al. (1993).
7
Tab.3. Systém RNA virů.
dsRNA
Čeleď: Partitiviridae
Rod
Typový druh
Alphacryptovirus
white clover cryptic virus 1
Betacryptovirus
white clover cryptic virus 2
Fijivirus
Fiji disease virus
Phytoreovirus
wound tumor virus
Oryzavirus
rice ragged stunt virus
Čeleď: ?
Varicosavirus
lettuce big vein associated virus
Čeleď: Endoviridae?
Endornavirus
Vicia faba endornavirus
Čeleď: Reoviridae
Negativní ssRNA
Řád: Mononegavirales
Čeleď: Rhabdoviridae
Nucleorhabdovirus
Cytorhabdovirus
Čeleď: Bunyaviridae
ssRNA satelitní viry
potato yellow dwarf virus
lettuce necrotic yellows virus
Tospovirus
tomato spotted wilt virus
Tenuivirus
rice stripe virus
Ophiovirus
citrus psorosis virus
tobacco necrosis satellite
Tab. 4. Systém RNA virů
8
9
Systém rostlinných virů se vyvíjí velmi dynamicky. Přesný počet popsaných virů je velmi
obtíţné určit. Zaitlin a Hull (1987) uvádějí 632 virů (tab.5.), Brunt et al. (1996) uvádějí jiţ
864 virů a neustále jsou popisovány nové v současnosti se uvádí cca 1700 popsaných fytovirů.
Tab. 5. Četnost a % zastoupení virů podle typu jejich nukleové kyseliny (Zaitlin a Hull
1987)
Typ nukleové kyseliny
Počet virů
%
+ ssRNA
484
76.6
- ssRNA
82
13.0
dsRNA
27
4.3
ssDNA
26
4.1
dsDNA
13
2.0
10
Zatímco některé viry jsou prozkoumány velmi dobře, u jiných je údajů velmi málo a
nejsou řídké případy, kdy jeden virus napadající různé hostitele byl popsán pod různými
názvy. Vysoký je rovněţ počet virů, které nejsou definitivně zařazeny do určitého rodu a jsou
popisovány i natolik odlišné viry, ţe lze předpokládat vznik nových rodů a snad i čeledí.
3.0. Diagnostické metody.
Současná rostlinná virologie
disponuje širokou škálou diagnostických metod, které
jsou zaloţeny na:
1. Hodnocení příznaků (symptomů) onemocnění
2. Biologických testech
3. Elektronové mikroskopii
4. Sérologických vlastnostech virových proteinů
5. Zjišťování virové nukleové kyseliny
V praxi diagnostika řeší nejčastěji dva problémy. Prvním je určení původce onemocnění
(etiologie). To je zpravidla náročný a nákladný proces, který můţe trvat řadu měsíců i let a
vyuţívá většinu výše uvedených metod. Je tedy spíše záleţitostí vědeckých a výzkumných
pracovišť.
Druhým je detekce určitého viru nebo virů, například při kontrole zdravotního stavu osiv a
sadby, nebo v rámci fytokaranténních opatření. V tomto případě je ideální provádět rutinně
sériovou detekci jednou, vyjímečně více metodami. Vzhledem k malým znalostem řady
ekonomicky významných virů je však často nezbytné pro spolehlivou detekci pouţít i
několika metod, nebo jejich kombinace.
Kaţdá z uvedených metod má své přednosti a nedostatky. Pro jednotlivé viry nebo
účely je třeba vybrat nejvhodnější metodu.Významná je přitom citlivost metod (kvalitativní či
kvantitativní stanovení),
objektivnost (hodnota měřitelná přístroji či naopak subjektivní
posouzení zkušeným pracovníkem), cena (poţadavky na přístrojové a materiálové vybavení,
kvalifikaci pracovníků) a expeditivnost (moţnost provedení velkého počtu testů v
krátkém čase, s dostatečnou citlivostí a přijatelnými náklady).
11
3.1. HODNOCENÍ PŘÍZNAKŮ NA ROSTLINÁCH (SYMPTOMATOLOGIE).
Virová infekce můţe být na rostlině specificky zjevná podle změn viditelných na jejích
orgánech, podle změn anatomických, histologických, cytologických a podle změn
patofyziologických (Brčák 1983). Virózy (a podle nich i jejich původci - viry) dostávaly
nejčastěji názvy podle příznaků viditelných na nadzemních orgánech rostliny (obr.3.).
Reakce rostlin na infekci můţeme posuzovat podle jejich vnímavosti (susceptibility)
vyjadřující schopnost k nákaze (zcela nevnímavé rostliny jsou "imunní") a podle jejich
citlivosti (sensitivity), kterou vyjadřujeme intenzitu patogenního účinku (velmi nízká citlivost
se rovná toleranci; při tom se virus můţe v rostlině mnoţit, ale příznaky jsou velmi mírné).
Rezistenci můţeme charakterizovat
jako malou vnímavost nebo malou citlivost.
Hypersenzitivitu charakterizuje prudká reakce vedoucí k nekrotizaci. Latentní infekce
znamenají trvalý stav nakaţeného hostitele bez příznaků. Dočasné zmizení příznaků
označujeme jako maskování.
Lokální infekce vzniká v místě, kde virus vnikl do orgánu rostliny, nešíří-li se virus do
dalších orgánů, jde o lokalizovanou infekci, šíří-li se do neinokulovaných orgánů, jde o
systémovou infekci (z inokulovaného listu např. virus pronikne do kořenů, pak do vrcholu a
postupně do spodnějších listů). Jako primární symptomy označujeme příznaky, které jsou
prvně viditelné; nemusí při tom jít o příznaky lokální infekce. Rozlišujeme téţ akutní fázi
onemocnění (obvykle provázenou silnými šokovými příznaky) a chronickou fázi,
charakterizovanou zmírněním příznaků. Soubor všech symptomů způsobených patogenem
nazýváme syndrom. Habitus virózní rostliny můţe být změněn zpomalením růstu, projeví se
zakrslost, zkrácení internodií a podobně, nebo můţe dojít k vadnutí a odumírání rostliny
(např. při infekci okurky virem mozaiky okurky při nízkých teplotách). Osy bývají téţ
znetvořeny - např. u jabloní virem plochosti větví.
Listy lokálně infikované mohou mít chlorotické nebo nekrotické léze (skvrny), které jsou
často pro určité viry charakteristické. Systémově infikované listy jsou u mnoha viróz difúzně
chloroticky skvrnité nebo mozaikové (s ostře ohraničenými tmavými a světlými skvrnami; při
tom tmavé skvrny obsahují mnohem méně viru neţ světlé). Dalšími příznaky jsou ţloutnutí
ţilek, okrajová nebo celková chloróza čepele, prouţkovitost (u jednoděloţných), páskování
12
kolem ţilek, antokyanizace a bronzovitost (nekrotizují pouze pokoţkové buňky). Ţlutými
krouţky na čepeli se např. projevuje rod Ilarvirus, nekrotickými soustředěnými krouţky rod
Nepovirus, Potexvirus aj., které současně způsobují skvrnitost nebo mozaiku a různé nekrózy
(tečkovité, stonkové, vrcholové). Uvedené příznaky na listové čepeli bývají provázeny její
deformací, zúţením aţ nitovitostí, vrásčitostí, kadeřením, kroucením do strany nebo
epinastií, která vzniká rychlejším růstem pletiv na svrchní straně listu. Vadne-li
nekrotizovaný list, můţe buď odpadnout (autotomie) nebo zůstane viset na stonku (např. u
čárkovitosti bramboru způsobené Y virem). Ţloutnutí listů je typické pro rod Luteovirus, jeli provázeno (u řepy) nekrotickými tečkami, můţe jít o rod Closterovirus. Pro čeleď
Reoviridae jsou charakteristické drobné nádorkovité výrůstky na ţilkách na spodní straně
listů, nazývané téţ histoidní enace. Nádory se někdy tvoří i na stoncích a kořenech. U
některých viróz jsou enace anatomicky podobné listu. Mnoho druhů rodu Carlavirus
vyvolává jen slabé příznaky nebo latentní infekce (Brčák 1983).
Květní obaly mohou mít velmi nápadné příznaky; dobře známá je pestrá pruhovitost
perigonu u tulipánů nebo ţluté nepravidelné pruhování korunních plátků u Matthiola incana.
Také plody a semena mohou projevovat barevné, deformační a nekrotické změny (např. u
viru šarky švestky).
Symptomy na rostlinách nejsou působeny přímo
virem, ale jsou důsledkem
patofyziologických změn, ke kterým dochází rozsáhlým narušením metabolismu rostliny v
důsledku replikace (mnoţení) viru v napadených buňkách. Listy s lokálními lézemi mají vţdy
zvýšenou respiraci, v blízkosti lézí se hromadí některé aromatické sloučeniny (např.
skopoletin) nebo je tu indukována zvýšená syntéza ligninu, suberinu a kalózy. Při
systémové infekci jsou obvykle zaznamenány zvýšené aktivity mnoha enzymů (zejména
polyfenoloxidáz), které však během infekčního procesu různě kolísají.
U virů svinutky
bramboru a ţloutenky řepy je typické hromadění škrobu vedoucí ke křehkosti listů. Řada
prací dokumentuje změny v obsahu volných aminokyselin, kyseliny askorbové atd. Typické
jsou zejména změny v pigmentech (ztráta chlorofylů), zvýšení vakuolárního antokyanu,
sníţená aktivita růstových látek a fotosyntézy.
13
Symptomy jsou důleţité pro rychlé rozeznání virózních rostlin v kultuře. Výhodou této
metody jsou nízké náklady, rychlost a vysoká expeditivnost, nevýhodou subjektivnost
hodnocení a nezbytnost dlouholetých zkušeností. Je to kvalitativní metoda, která neumoţňuje
rozlišit směsné nebo latentní infekce. Je vhodná pro negativní výběry rostlin napadených viry,
které vyvolávají typické příznaky onemocnění. Neumoţňuje jednoznačné stanovení původce
onemocnění.
14
Obr. 3. Typy symptomů vyvolaných na rostlinách viry. Originál Kůdela et al. (1989).
15
3.2. BIOLOGICKÉ TESTY
Provádí se ve sklenících mechanickou inokulací (očkováním), roubováním nebo
přenosem vektory (např. mšice, křísi) na rostliny (klony) citlivé k infekci. Tyto rostliny
zpravidla reagují na infekci určitým virem tvorbou typických příznaků onemocnění. Proto je
nazýváme indikátorové, nebo také diferenční hostitelské rostliny. Jejich
předností je
především univerzálnost a poměrně vysoká citlivost. Indikátorové rostliny mohou zachytit
nejen široké spektrum
virů, ale i viroidů
a fytoplazem (dříve nazývaných organismy
připomínající mykoplazmy - MLO).
Mezi nejčastěji pouţívané bylinné indikátory patří druhy a odrůdy tabáku např. Nicotiana
tabacum cv. Samsun NN, cv. Xanthi, N. benthamiana, N. clevelandii, N. glutinosa, z
lilkovitých rostlin dále rajče, durman (Datura stramonium) z merlíků např. Chenopodium
quinoa, Ch. amaranticolor, dále Vigna sinensis, Phaseolus vulgaris, Tetragonia expansa,
Gomphrena globosa, Cucumis sativum, pro trávy a obiloviny Hordeum vulgare, pro
brukvovité Sinapis alba, Brassica chinensis, B. pekinensis a další.
Při výběru indikátorových rostlin pro test volíme i rostlinu příbuznou původní hostitelské
rostlině, z níţ virus přenášíme.
Očkování pouţíváme pro mechanický přenos virů z bylinných hostitelů. Část rostliny s
příznaky onemocnění se homogenizuje ve vhodném, nejlépe vychlazeném, tlumivém roztoku
(pufru) a vzniklá šťáva se nanáší na listy indikátorových rostlin. Tlumivý roztok stabilizuje
virové částice a zvyšuje úspěšnost přenosu. Často do něj proto přidáváme i další látky chránící
virový nukleoprotein před účinky enzymů. Nejčastěji pouţívanými pufry jsou fosfátový pufr
0,1M pH 7,2-7,4, 0,05M Tris-HCl pH 8,0 s 0.005M EDTA, pro dřeviny 2% roztok nikotinu.
Přenos virů z keřů a dřevin šťávou je velmi obtíţný vzhledem k nízké koncentraci virových
částic, jejich nerovnoměrnému výskytu v hostiteli a obsahu polysacharidů a polyfenolů
sniţujících infekčnost viru. Je proto nezbytné přidávat do homogenizačního pufru například
antioxidační a jiné stabilizující chemikálie. Přesto však úspěšnost přenosu viru bývá nízká.
Proto současně provádíme roubování na vybrané citlivé klony a kultivary příbuzných druhů
např. u jahodníku a maliníku, u peckovin např. podnoţ GF 305.
16
Indikátorové rostliny vyuţíváme i k udrţování izolovaných virů a jejich namnoţení pro
další studium.
Nevýhodou biologických testů je velká časová náročnost. Vyhodnocení se provádí 1 - 6
měsíců po inokulaci (naroubování, přenosu vektory) indikátorových
rostlin. Zdravé i
očkované (naroubované) indikátorové klony a rostliny je nezbytné pěstovat ve skleníku,
izolovaném
proti
přenašečům virů (např.
mšicím) ve sterilizované půdě. Rostliny i
jednotlivé pokusy je nezbytné prostorově izolovat a chránit proti houbovým chorobám (např.
padlí) a škůdcům (svilušky, molice, třásněnky aj.). Rovněţ je třeba kontrolovat bezvirózní
stav indikátorů a odděleně udrţovat chovy přenašečů. Teplota a vzdušná vlhkost ve skleníku
mohou významně ovlivnit úspěšnost přenosu a tvorbu příznaků.
Dodrţení výše uvedených podmínek a dlouhá doba nezbytná pro vyhodnocení testů
způsobují vysoké náklady. Expeditivnost metody je nízká pro její pracnost, zejména při
roubování a přenosech vektory. Podobně je tomu i s objektivností testů, které vyţadují
zkušenost při vyhodnocování příznaků na indikátorových rostlinách. Biologické testy jsou
nezbytné zejména v případech, kdy jsou naše znalosti o virech napadajících určitou plodinu
nedostatečné, nebo dosud nemáme jiné detekční metody například sérologické. Je tomu tak
velmi často u virů drobného ovoce (maliník, jahodník, rybíz) a ovocných dřevin.
3.3. ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
Histologické změny vyvolané virovou infekcí můţeme pozorovat i optickým
mikroskopem. Kromě hyperplasií a hypoplasií patří např. u mozaik neúplná diferenciace
mezofylu; ve ţlutých místech jsou menší rozdíly palisádového a houbového parenchymu a je
tam méně intercelulárních prostorů. Charakteristické bývají i nekrózy, které vznikají
současně s vodním deficitem. U viru svinutky bramboru byly v minulosti nekrózy floemu
vyuţívány jako diagnostický znak, s rozvojem sérologických metod však ztratily význam.
Pro diagnostické účely se v rostlinné virologii vyuţívá výhradně transmisní elektronová
mikroskopie, při níţ svazek emitovaných elektronů zobrazuje preparát na síťce vloţené do
mikroskopu. Preparáty se připravují dvěma způsoby - metodou negativního kontrastu a
metodou ultratenkých řezů.
17
3.3.1. Metoda negativního kontrastu.
Při negativním kontrastu se nepatrná část pletiv homogenizuje v destilované vodě, roztok
se nanese na síťku potaţenou pouhlíkovanou formvarovou membránou a obarví se nejčastěji
octanem uranu, nebo kyselinou fosfowolframovou (obr.4.). Vhodných barviv a technik je
však mnoho, jejich přehled uvádí Roberts (1985). Největší předností této metody je zjištění
velikosti a tvaru virových částic, které značně usnadňuje zařazení viru do rodu. Podobně lze
prokázat i směsnou virovou infekci v případě, kdy pozorujeme částice odlišné tvarem a
velikostí. Předností metody je rychlost a citlivost, která je niţší u virů malých rozměrů a s
velmi nízkou koncentrací v rostlině (např. rod Luteovirus). V těchto případech je moţné
zvýšit citlivost pouţitím imunosorpční elektronové mikroskopie.
Obr. 4. Elektronogram purifikovaných částic viru mozaiky vodnice.
3.3.2. Imunosorpční elektronová mikroskopie (ISEM)
Metoda je kombinací negativního kontrastu a imunosorpční techniky, kdy specifické
protilátky nanesené na síťku koncentrují („vychytávají“) virové částice z roztoku. Virové
částice adsorbované na síťku je rovněţ moţné „dekorovat“ homologními nebo heterologními
18
protilátkami a posoudit tak odlišnost nebo příbuznost částic v rámci rodu či druhu viru
(obr.5). Toho se vyuţívá zejména u vláknitých a tyčinkovitých virů (Milne 1985).
Obr. 5. Imunosorpční elektronová mikroskopie. Směs purifikovaných částic viru nekrózy
tabáku a viru keříčkovité zakrslosti rajčete („dekorované částice“). Originál
Matthews
(1991).
3.3.3. Metoda ultratenkých řezů
Přestoţe se v praktické diagnostice nevyuţívá, je třeba zmínit moţnosti, které nám
poskytuje. Především nám umoţňuje pozorování viru v rostlině „in situ“ a tedy i lokalizaci
virionů v jednotlivých pletivech a buněčných organelách. Pouze několik milimetrů velké
částic pletiv se poměrně sloţitým postupem fixují a barví, aby z nich bylo moţné na
speciálním přístroji ultramikrotomu připravit ultratenké řezy, které lze prohlíţet v
transmisním elektronovém mikroskopu a pozorovat cytopatologické změny vyvolané
virovou infekcí.
Cytopatologické změny se projevují především tvorbou krystalů virových částic tzv.
inkluzí. Ty mohu být tvořeny krystaly virových částic, nebo nestrukturními virovými
proteiny.
Pro virus mozaiky tabáku jsou typické hexagonální destičky, jehlicovité nebo amorfní
inkluze, které leţí v cytoplasmě a bývají větší neţ jádro buňky a je dokonce moţné je
19
pozorovat optickým mikroskopem. Velké komplexní inkluze jsou známy hlavně u rodu
Potyvirus. Jsou to masivní amorfní útvary často spojené s jádrem a obsahující různé normální
i poškozené organely, shluky rovnoběţně uspořádaných virových částic a válcovité
proteinové inkluze, které na příčném řezu mají vzhled svitků, růţic nebo lamel. Tyto
proteinové inkluze představují nestrukturní proteiny, jejichţ syntéza je řízena virovou RNA.
Cytologické změny mohou téţ dokumentovat histotropismus virů: některé viry dosahují
vyšší koncentrace v pokoţce, jiné v lýku; např. virus ţloutenky řepy je zpočátku pouze ve
floemu, později i v mezofylu a epidermis. K běţným cytologickým změnám patří i tloustnutí
a deformace buněčné stěny, patologické změny chloroplastů a mitochondrií aj. (Brčák
1983).
Pozorovat na ultratenkých řezech jednotlivé virové částice, zejména sférických virů, je
velmi obtíţné. I zde je však moţné, podobně jako u imunosorpční elektronové mikroskopie,
vyuţít komplexu protilátek a koloidního zlata k jejich značení (obr.6.), byť tyto metody jsou
laboratorně velmi náročné (Van Lent a Verduin 1985).
Obr. 6. Částice viru mozaiky tabáku a chlorotické strakatosti kravského hrachu značené
komplexem proteinu A a koloidního zlata. Originál Matthews (1991).
Obecně jsou nevýhodou elektronmikroskopických metod vysoké náklady na přístrojové
vybavení, odbornou kvalifikaci personálu a zkušenost při přípravě a vyhodnocování
preparátů. Expeditivnost metody je nízká, i kdyţ negativně barvené preparáty je moţné
připravit během několika minut. Moţnost vidět velikost a tvar virionů však činí z elektronové
mikroskopie metodu diagnosticky zcela nepostradatelnou.
20
3.4. METODY ZALOŢENÉ NA SÉROLOGICKÝCH VLASTNOSTECH VIROVÝCH
PROTEINŮ.
Virové částice mají na povrchu plášťového proteinu specifické struktury, které nazýváme
epitopy. Jestliţe izolovaný (purifikovaný) virus naočkujeme do vhodného obratlovce,
nejčastěji králíka, vytvoří ve svém těle proti těmto bílkovinám specifické protilátky zvané
imunoglobuliny G (IgG). Krevní sérum pak obsahuje směs protilátek proti různým
epitopům. Takové protilátky nazýváme polyklonální. Koncentraci protilátek v séru
označujeme jako titr. Titr označuje ředění, při kterém protilátka ještě reaguje s antigenem
(virem). Antiséra vhodná pro diagnostiku virů by měla mít vysoký titr (1:512 a více). Pouţít
lze i antiséra s titrem
niţším (1:64), v kaţdém případě však musí být reakce IgG s
bílkovinami ve šťávě zdravých rostlin buď negativní nebo nejvýše
velmi slabá. Jinak
antisérum neumoţňuje odlišit zdravé a virem infikované rostliny (je nespecifické) a není pro
diagnostiku pouţitelné.
Izolace viru v dostatečném mnoţství a čistotě vyţaduje nákladné přístrojové vybavení a
příprava protilátek je tedy záleţitostí výzkumných pracovišť nebo komerčních firem, od nichţ
je moţné antisérum získat.
Pro praktickou diagnostiku se pouţívají sérologické metody, které vyuţívají kompletního
antiséra a imunoenzymatické metody, kdy pracujeme s předem izolovanými IgG.
3.4.1. Sérologické metody.
Aţ do poloviny 70. let byly hlavní diagnostickou metodou testy zaloţené na precipitaci
virového antigenu s protilátkami (Jermoljev a Pozděna 1972). Nejprve v podobě
precipitačního testu později testů difúze v agaru (Ouchterlony 1958) v četných modifikacích.
Nejpouţívanější metoda, která se pro svoji jednoduchost běţně pouţívá dosud, je dvojitá
difúze v agaru (obr.7.). Test je moţné provést s minimálním laboratorním vybavením.
Rozvařený 0,8% agar nalijeme do Petriho misek ve vrstvě 2-3 mm. V agarovém gelu
korkovrtem vyřízneme jamky a jejich obsah odsajeme např. vodní vývěvou. Do jamek po
obvodu pak pipetujeme šťávu z testovaných rostlin, do centrální jamky antisérum. Protilátky a
21
virový antigen difúzí pronikají gelem a v místech jejich vzájemné reakce vzniká precipitační
linie. Reakci je moţné provést v řadě modifikací a při vhodném uspořádání testu je moţné
usuzovat podle tvaru precipitačních linií i na serologickou příbuznost virů.
Předností této metody jsou nízké náklady, nevýhodou omezené pouţití pro viry s nízkou
koncentrací v rostlině nebo s vláknitými částicemi, které obtíţně procházejí gelem. Ve
srovnání s imunoenzymatickými metodami je nevýhodou vysoká spotřeba protilátek a nízká
expeditivnost.
Obr. 7. Test dvojité difúze v agaru s virem ţilkové mozaiky květáku (As - antisérum, 1-5
vzorky z rostlin, K - zdravá kontrola, barveno amidočerní).
3.4.2. Imunoenzymatické stanovení.
Imunoenzymatické stanovení (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA)
rostlinných virů pouţili poprvé Clark a Adams (1977). Dnes je nejrozšířenější metodou pro
vysokou citlivost, objektivnost a expeditivnost. Zatímco specifičnost IgG je stejná jako u
sérologie v agaru, vysoké citlivosti je dosaţeno reakcí enzymu navázaného na IgG s
odpovídajícím substrátem. Standardně se pouţívá enzymu alkalické fosfatázy a substrátu 4EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů
22
nitrofenyl fosfátu. Metodu lze provést v řadě modifikací, z nichţ nejčastější je tzv. dvojitá
sendvičová metoda (Clark a Adams 1977).
Vlastnímu testu předchází izolace IgG z antiséra a konjugace IgG s alkalickou
fosfatázou. I kdyţ se stále více pouţívají komerční diagnostické soupravy, můţeme, máme-li
k dispozici vhodné antisérum, poměrně jednoduše izolovat z 1ml antiséra 2 - 5 mg IgG. Z
nich připravíme reagencie pro několik tisíc testů coţ podstatně sniţuje cenu testu.
Izolaci IgG z antiséra lze provést vysráţením protilátek nasyceným roztokem síranu
amonného. Následuje odstředění sraţeniny a několikanásobná dialýza. Získané IgG můţeme
dále čistit iontovou chromatografií např. na DEAE celulóze. IgG můţeme uchovávat řadu let,
nejlépe lyofilizované, nebo zmrazené. Metod pouţitelných pro izolaci IgG existuje více
(Gallo a Dědič 1986).
Ke značení IgG enzymem (konjugaci) běţně pouţíváme alkalickou fosfatázu firmy
Loewe Biochemica (nejniţší cena při dobré kvalitě) nebo jiných firem. Po smíchání 1 mg IgG
s
2 500 U alkalické fosfatázy a přidání glutaraldehydu dojde k vytvoření vazby mezi
enzymem a IgG. Glutaraldehyd pak odstraníme dialýzou. Připravené konjugáty lze v plné
aktivitě uchovat nejméně l8 měsíců při 5oC. Pozor! Mraţením dochází ke zničení konjugátu.
Pro test
pouţíváme mikrotitrační desky s 96 jamkami s plochým dnem např. firmy
Gama. Lze téţ pouţít jamkové pásky na speciálním nosiči, vhodné pro menší počet vzorků
nebo k testování IgG a konjugátu. Při rozvrţení testů na destičce je velmi důleţité pamatovat
na slepý pokus (blank), který stanovuje pozadí testu, dále negativní kontrolu (ověřuje
specifičnost protilátek) a pozitivní kontrolu (potvrzuje správnost provedení testu). Kromě
toho, ţe tyto hodnoty jsou nezbytné pro stanovení hodnoty absorbance rozlišující vzorky
zdravé od nemocných, umoţňují nám v případech, kdy je například celá destička nezbarvená
nebo naopak ţlutá, rychle odhalit moţnou chybu.
Odběr vzorků rostlinného materiálu. Pro přípravu průměrného vzorku z rostlinného
materiálu a pro dobu testu nelze stanovit obecná pravidla. Úspěch závisí do značné míry na
tom, je-li test proveden v době optimální koncentrace daného viru v určité části rostliny.
Zejména u dřevin proto provádíme odběry z předem narašených větví ve skleníku, z pupenů,
květů nebo lýka. I u bylin dochází po infekci k pomnoţení viru v pletivech do určitého
23
maxima a pak k poklesu koncentrace viru. U starších rostlin mohou test rušit i některé látky
přítomné ve šťávě.
Příprava vzorků. Rostlinný materiál (listy, květy, kůra, pokoţka plodů, hlízy, semena
a klíčky semen) homogenizujeme s extrakčním pufrem obsahujícím chemikálie pro
stabilizaci daného viru v poměru l:l0 - l:l00. Při malém počtu vzorků pouţijeme běţné třecí
misky, při větším počtu vzorků je výhodné pouţít lis na šťávu (firmy Pollahne, NSR, pro
brambory, zeleninu) anebo homogenizátor (Polytron) pro pletiva stromů. Pro listy drobného
ovoce např. jahodníku lze pouţit tekutý dusík, který výrazně usnadní homogenizaci listů v
třecí misce (Albrechtová 1986).
Vlastní test má následující kroky (obr.8.):
l. Navázání IgG na povrch stěn jamek. Do jamek desky pipetujeme 0,2 ml IgG v ředění
2 g ml-1 a desku inkubujeme 4 hodiny při 36oC. Jestliţe je totiţ koncentrace IgG niţší, při
slabé koncentraci viru ve vzorku nemusí dojít k dostatečnému navázání viru a výsledné
zabarvení je tak slabé, ţe vzorek je hodnocen jako negativní. Při koncentraci IgG vyšší neţ 5
gml-1 dochází zpravidla k nespecifickým reakcím.
2. Promývání. Promýváme třikrát promývacím pufrem po 3 min. Pokaţdé promývací
roztok velmi důkladně vyklepáme, naposledy na filtračním papíře.
3. Navázání testovaného vzorku. Z kaţdého
vzorku pipetujeme 0.2
ml šťávy do
minimálně dvou jamek desky. Pro hodnocení blanku naplníme pufrem nejméně 4 jamky.
Desku inkubujeme nejlépe přes noc při teplotě 5 oC, coţ se v praxi osvědčilo u vyššího
počtu vzorků, nebo 4 hodiny při 36oC. Virové částice ze surové testované šťávy se naváţou
na protilátky na stěnách jamek a vytvoří stabilní komplex. Protoţe příprava vzorků, zejména
homogenizace je velmi náročná a pracná, je výhodné připravit zhruba dvojnásobné mnoţství
šťávy a uchovat je v chladničce aţ do vyhodnocení testu. Tak je v případě nepříznivého
výsledku moţné test rychle opakovat.
4. Vymývání desek provádíme jako v případě IgG aţ do úplného odstranění stop šťávy.
5. Navázání konjugátu IgG a enzymu. Na komplex protilátky a viru naváţeme další
antigenní reakcí enzymem značenou protilátku. Do jamky pipetujeme 0,2 ml ředěného
24
konjugátu IgG a desku inkubujeme 4 hodiny při 36oC. Konjugát ředíme podle reaktivity IgG
l:250 aţ l:5000.
6. Promývání provádíme stejně jako po navázání IgG na desku.
7. Inkubace reakcí enzymovým substrátem. Do jamek pipetujeme 0,2 ml substrátu v
koncentraci 1 mg ml
-1
substrátového pufru. Desku inkubujeme 1 hodinu při pokojové
teplotě. Navázaný enzym štěpí bezbarvý p-nitrofenylfosfát na fosfát a ţlutý nitrofenol.
Mnoţství nitrofenolu je po určité době úměrné aktivitě fosfatázy a můţeme jej stanovit
spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm. Čím je ţluté zabarvení sytější, tím je vyšší
koncentrace viru v testovaném vzorku.
25
Obr. 8. Schéma dvojité sendvičové metody ELISA. Originál Boehringer, upraveno.
26
8. Vyhodnocení. Od naměřených hodnot absorbance odečteme průměrnou hodnotu
slepého pokusu a s vyuţitím průměrných hodnot pozitivní (infikované) a zdravé kontroly
určíme mezní hodnotu určující zdravé a virem infikované vzorky. K vyhodnocení dat můţeme
vyuţít i vhodné statistické programy dodávané většinou se spektrofotometrem. Zpracováním
dat se zabývali Sutula et al. (1986).
Kohler a Milstein (1975) vypracovali postup přípravy tzv. monoklonálních protilátek.
(monoclonal antibodies - Mab). Jejich předností je, ţe rozlišují pouze jediný epitop a mohou
tedy být mnohem specifičtější neţ protilátky polyklonální, coţ je výhodné při rozlišení
kmenů virů. Na druhé straně při sériové diagnostice můţe být jejich přílišná specifičnost
nevýhodou, neboť nedetekují všechny kmeny určitého viru (Van Regenmortel 1986). Příprava
monoklonálních protilátek v myších je mnohem náročnější neţ příprava polyklonálních
protilátek, postup přípravy uvádí např. Matthews (1991).
Hybridomy produkující
monoklonální protilátky je však moţné dlouhodobě uchovávat v tekutém dusíku a znovu je
pouţít. To je výhodné jestliţe
izolace (purifikace) viru je velmi obtíţná a výtěţek a
imunogenicita viru je velmi nízká (rod Luteovirus). Podobně lze s výhodou vyuţít technologie
Mab v případě, kdy nelze izolovat dostatečně čistý virus. Z mnoţství hybridomů, lze vybrat
takové, které produkují dostatečně specifickou protilátku.
Jak jiţ bylo uvedeno, ELISA se rychle stala standardem ve fytosanitární diagnostice.
Huttinga (1996) uvádí, ţe jen v Holandsku je ročně provedeno asi 11 milionů testů sadbových
rostlin. Nejen proto, ţe ELISA je vysoce citlivá a umoţňuje kvalitativní i kvantitativní
stanovení viru. Důleţitá je zejména objektivnost plynoucí z měření absorbance na fotometru.
Výsledek tedy není závislý na subjektivním úsudku a zkušenostech pracovníka, coţ sniţuje
nároky na kvalifikaci personálu. I kdyţ je moţné hodnotit zabarvení vizuálně, je nezbytné mít
odpovídající fotometr, coţ je spolu s pipetami dostatečné přístrojové vybavení pro provedení
testu. Pro sériová stanovení je vhodné zakoupit promývačky. Existují i plně automatická
zařízení dosahující vysokou expeditivnost.
Přínosem pro standardizaci výsledků v mezinárodním měřítku jsou diagnostické soupravy
firem pro stanovení řady ekonomicky významných virů. První byla v roce 1983 firma
27
Bioreba (Švýcarsko), postupně následovaly další (Německo),
Sanofi (Francie), Loewe Biochemica
Boehringer (Rakousko) a jejich počet neustále roste. Firma Agdia (USA)
pouţívá jako jediná namísto alkalické fosfatázy křenovou peroxidázu. Nabídku firem je
moţné sledovat i na Internetu. Liší se podstatně nejen sortimentem virů a kvalitou či původem
protilátek, ale i počtem testů 100, 500 nebo 1000. Dodávány jsou buď kity, které obsahují
IgG, konjugované protilátky, zdravou a nemocnou kontrolu a někdy i pufry a substrát, nebo
sety, které neobsahují kontroly. Tomu odpovídá i cena, kterou je velmi obtíţné porovnávat.
Nabídka se rozšiřuje i na fytopatogenní houby a bakterie.
28
3.5. METODY DETEKCE NUKLEOVÉ KYSELINY.
Nalézají uplatnění při detekci virů, proti kterým se dosud nepodařilo připravit specifické
protilátky,
nebo tam,
kde citlivost
sérologických a imunoenzymatických metod není
dostatečná. Tak je tomu u virů drobného ovoce a ovocných dřevin, z nichţ mnohé jsou
karanténní povahy. Metody detekce nukleových kyselin se začaly rozšiřovat s rozvojem
molekulární biologie v 80. letech.
Pro praktickou diagnostiku lze uţít metod:
a) Izolace dvouvláknové ribonukleové kyseliny (dsRNA)
b) Molekulární hybridizace
c) Polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction - PCR)
3.5.1. Izolace dvouvláknové ribonukleové kyseliny (dsRNA).
DsRNA se vyskytuje u rostlinných virů čeledí Reoviridae a Partitiviridae (cryptoviry)
jako genomová nukleová kyselina. V rostlinách infikovaných ssRNA viry je přítomna
dvouvláknová RNA, jako replikativní forma těchto virů. Tyto dsRNA mohou být z rostlin
izolovány a vyuţity pro diagnostiku. Diagnostiku pomocí dsRNA lze provést:
a) charakterizací dsRNA elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (PAGE)
b) pouţitím protilátek reagujících s dsRNA,
c) k přípravě specifických sond pro molekulární hybridizaci.
Izolace dsRNA byla velmi nadějnou metodou začátkem 80. let. Vychází ze skutečnosti,
ţe v podstatě kaţdý RNA virus lze charakterizovat odlišnými prouţky dsRNA, po jejím
rozdělení elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (Valverde et al., 1986). Touto metodou je
tedy moţné odhalit cizorodou dsRNA v rostlině a získat tak jednoduchý, prakticky vyuţitelný
test pro diagnostiku RNA virů. To má značný význam při testovaní matečných rostlin
29
vegetativně mnoţených plodin. DNA viry nejsou touto metodou zjistitelné, jejich počet je
však malý. Citlivost metody je srovnatelná s ELISA testem.
Diagnostické vyuţití dsRNA je však komplikováno skutečností, ţe zdravé rostliny
někdy obsahují dsRNA neznámého původu. Vzhledem k velké molekulové hmotnosti některé
z nich mohou pocházet z dosud nepopsaných virů čeledi Partitiviridae, které nevyvolávají na
rostlinách příznaky, rostlinám zjevně neškodí a byly popsány u mnoha plodin. DsRNA mohou
rovněţ indikovat přítomnost houbového patogena.
I přes tyto potíţe lze dsRNA vyuţít pro diagnózu virů v některých hostitelích, kdy
nemáme protilátky a neznáme sekvenci nukleotidů a zejména tam, kde je jedinou alternativou
ke zdlouhavému a pracnému roubování nebo přenosu viru mšicemi, zejména u virů drobného
ovoce, např. raspberry leaf spot viru v rodu Rubus (Martin 1986).
V našich pokusech s praktickou detekcí dsRNA v matečných rostlinách jahodníku jsme
narazili na problém nízké koncentrace virové RNA v rostlinách a rušivý vliv polysacharidů
při její izolaci. To spolu s pracností izolace dsRNA omezuje pouţití metody pro rutinní
detekci. S nástupem polymerázové řetězové reakce se význam této metody dále sníţil.
3.5.2. Molekulární hybridizace.
Metoda vyuţívá schopnosti jednovláknové nukleové kyseliny vázat se na jiné vlákno s
komplementární sekvencí nukleotidů.
Nejčastěji pouţívanou hybridizační metodou pro detekci fytovirů je dot blot hybridizace.
Principem metody je navázání (imobilizace) virové nukleové kyseliny na nitrocelulózovou
nebo nylonovou membránu a její detekce úsekem komplementární nukleové kyseliny, která je
radioaktivně nebo neradioaktivně značena a kterou nazýváme sonda. Optimální délka sondy
je 400-600 bází nukleotidů (Hull 1986).
Při srovnání dot blot hybridizace s ELISA nitrocelulózová membrána nahrazuje
polystyrenovou destičku s jamkami, na níţ se přímo váţe virus a značená sonda nahrazuje
protilátku značenou enzymem. Jestliţe v ELISE detekujeme protilátkami virový protein pak
dot blot hybridizací detekujeme sondou nukleovou kyselinu viru.
Příprava a značení sond.
30
Připravit a označit sondu lze řadou postupů, z nichţ nejvíce pouţívané jsou:
1. Reverzní transkripce. Virová RNA je přepisována do komplementární DNA (cDNA)
pomocí reverzní transkriptázy. V průběhu přepisování je nově syntetizované vlákno
radioaktivně nebo neradioaktivně značeno. Vzniká značená ssDNA.
2. Klonování úseku DNA. Dvouvláknová cDNA je začleněna do bakteriálního plasmidu
a v něm udrţována a mnoţena. DsDNA můţe být značena po celé své délce, nebo jen na
koncích. Před pouţitím je třeba sondu denaturovat.
3. Metoda polymerázové řetězové reakce. Sonda se značí v průběhu amplifikace.
Sondy lze připravit jako velmi specifické (rozlišují kmeny virů) nebo naopak při vyuţití
konzervativní sekvence, která je identická pro viry jednoho rodu, připravíme skupinovou
sondu.
Sondy lze značit radioaktivně, nečastěji izotopem 32P. Jeho výhodou je velmi silný signál u
pozitivních reakcí, nevýhodou je krátký poločas rozpadu izotopu. Diagnostické laboratoře
rovněţ nejsou běţně vybaveny pro práci s radioaktivními izotopy. Proto se stále častěji
vyuţívá značení neradioaktivní.
Nejlepší a nejuţívanější neradioaktivní metodou je v současné době značení digoxigeninem,
při pouţití souprav (kitů) pro přípravu sondy (DIG DNA labeling kit) a vlastní hybridizaci
(DIG nucleic acid detection kit), vyvinutých firmou Boehringer (obr.9.).
Základní kroky při dot blot hybridizaci:
1. Pipetování vzorků izolované nukleové kyseliny nebo šťávy z testovaných rostlin na
nylonovou membránu napuštěnou pufrem a umístěnou v bloku blotovacího zařízení
(blotter). Odsátí přebytečného pufru.
2. Fixace vzorků na membráně 30 minut při 120 o C v peci.
3. Prehybridizace vzorků v hybridizačním pufru 1 hodinu při 68 o C.
31
4. Hybridizace nukleové kyseliny se sondou, nejméně 6 hodin.
5. Vymývání nenavázané sondy.
6. Navázání konjugátu (protilátka proti digoxigeninu konjugovaná s alkalickou fosfatázou).
7. Vymývání nenavázaného konjugátu a stabilizace membrány.
8. Inkubace v roztoku substrátu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfát (BCIP) a nitroblue
tetrazolem (NBT), které po odštěpení fosfátu enzymem vytváří nerozpustný modrý
precipitát.
9. Vyhodnocení zbarvení.
Obr. 9. Schéma dot blot hybridizace se sondou značenou digoxygeninem. Originál
Boehringer, upraveno.
32
Metodu lze provádět i s minimálním laboratorním vybavením, pro sériová stanovení je
vhodné mít blotovací zařízení, UV crosslinker nebo hybridizační pec. Citlivost metody je
srovnatelná nebo vyšší neţ u ELISA, nevýhodou jsou vyšší náklady na chemikálie (kity),
které však na druhé straně zajišťují standardizaci metody. Náklady na přístrojové vybavení
jsou srovnatelné, expeditivnost metody je niţší. Jak jiţ bylo uvedeno, metoda nalézá uplatnění
především tam, kde nelze uţít ELISA. Je standardní (nikoliv experimentální) metodou
diagnostických laboratoří v řadě zemí.
V posledních letech jsou vyvíjeny detekční metody na bázi mikrohybriidizace tzv.
microarrays nukleových kyselin i proteinů viz např. http://www.cost853.ch/ , které umoţňují
simultánní detekci řady patogenů. Největším problémem zde však zůstává izolace nukleových
kyselin (RNA a DNA) z rozdílných částí rostlin.
3.5.3. Polymerázová řetězová reakce (PCR).
Vyuţití metody PCR, vyvinuté Saikim et al. (1988), v diagnostice rostlinných virů je
stejným kvalitativním skokem jako aplikace ELISA v 70. letech. Principem metody je
exponenciální namnoţení (amplifikace) určitých úseků (sekvencí) DNA in vitro (Henson a
French 1993). Základními kroky metody jsou:
a) denaturace cílové DNA (RNA) do formy jednoho vlákna
b) připojení (annealing) dvou primerů
(synteticky připravených oligonukleotidů -
krátkých úseků DNA) k cílové molekule DNA (RNA)
c) syntéza úseku DNA vymezeného primery pomocí termostabilní DNA polymerázy.
Specifičnost metody je určována sekvencí primerů, které se párují s cílovou nukleovou
kyselinou a určují konce sekvence, která má být amplifikována. Reakční směs se skládá ze
vzorku šťávy, která obsahuje (nebo neobsahuje) cílovou molekulu nukleové kyseliny
patogena, tlumivého roztoku, vody, solí, deoxyribonukleotidů (dNTPs), primerů a DNA
polymerázy v amplifikační zkumavce. Celkový objem reakce je pouze 20 l.
V prvním kroku dochází k tepelné denaturaci nukleové kyseliny při vysoké teplotě
(melting temperature) (obr.10.). Při amplifikaci se pouţívá speciální polymeráza izolovaná z
33
bakterie Thermus aquaticus (Taq), která je stabilní i při teplotě přes 90oC, nezbytné pro
denaturaci (oddělení vláken) nově syntetizované dvouvláknové DNA.
Ve druhém kroku je teplota sníţena na optimální pro spárování primerů s nukleovou
kyselinou (annealing temperature). Její výše závisí na nukleotidovém sloţení primerů.
Ve třetím kroku následuje zvýšení teploty na optimum pro syntézu DNA polymerázou.
Celý proces vyţaduje přesné dodrţení teplotních a časových intervalů. Provádí se proto ve
speciálním přístroji, který rychle a přesně mění teplotu reakční směsi ve zkumavce
(termocykler). Cyklus se opakuje asi 30 krát. Namnoţená DNA je pak vyhodnocena
elektroforézou v agarózovém gelu. Přítomnost prouţku odpovídající molekulové hmotnosti
amplifikovaného úseku signalizuje přítomnost viru. I kdyţ je moţné amplifikovat i úseky
DNA dlouhé několik tisíc párů bází, optimální pro diagnostiku fytovirů je rozmezí 200-800
párů bází.
Obr. 10. Schematické znázornění polymerázové řetězové reakce. Orig. Alberts et al., 1998
34
Předností metody je výjimečná citlivost. Teoreticky je moţné detekovat jednu cílovou
molekulu (virovou částici) v rostlinné šťávě.
Podle toho, jak jsou navrţeny primery, lze metodu vyuţít k detekcí úzkého (kmen) nebo
naopak širokého spektra virů (rod Potyvirus), či jednoho viru ve směsi několika virů.
Pro detekci fytovirů s genomovou RNA, jichţ je většina, poprvé metodu pouţili Vunsh et
al. (1990). U RNA virů je nezbytné před vlastní amplifikační reakcí provést syntézu
komplementárního vlákna DNA reverzní transkriptázou (reverse transcription - polymerase
chain reaction, RT-PCR). Původně se pouţívaly speciální enzymy, v současné době existují
polymerázy, např. z Thermus thermophilus (Tth polymeráza), které mohou v rozdílných
reakčních podmínkách plnit obě funkce. Dostupné jsou také kity pro izolaci nukleových
kyselin, jejich reverzní transkripci a amplifikaci.
Od počátku 90. let metoda doznala širokého uplatnění nejen v rostlinné virologii. Díky
širokému pouţití v molekulární biologii a v humánní i veterinární medicíně velice rychle
klesla cena termocyklerů (dnes na 50-60 000 Kč), polymerázy a dalších reagencií. Nezbytné
primery syntetizují firmy na zakázku během několika dnů. Jsou dostupné i soupravy pro
rychlou izolaci a amplifikaci RNA, čímţ se metoda dále standardizuje. Tím se cena jednoho
testu dostala na úroveň srovnatelnou s ELISA, přitom její citlivost je řádově vyšší. Další
výhodou PCR je moţnost vyuţít amplifikované úseky DNA jako sond, jak bylo uvedeno v
předchozí kapitole.
Z popisu metody je zřejmé, ţe návrh primerů velmi ovlivňuje citlivost a specifičnost
detekce. Primery o délce 18-30 nukleotidů se navrhují na základě znalosti sekvence nukleové
kyseliny patogenů, pomocí speciálních počítačových programů. Sekvence nukleových kyselin
jednotlivých rostlinných virů je moţné získat z mezinárodních databází (EMBL) pomocí
Internetu. Protoţe v současnosti jsou známy částečné nebo kompletní sekvence mnoha
fytovirů, lze návrh primerů provést velmi rychle. V mnoha případech lze vyuţít jiţ
vyzkoušené primery, jejichţ pouţití bylo publikováno v odborné literatuře.
PCR se v sériové diagnostice uplatní v případech, kdy není moţné pouţít ELISA.
Například proto, ţe proti některému viru dosud nebyly připraveny protilátky. Protoţe PCR je
citlivější metodou neţ ELISA, je výhodné ji pouţít při testování ozdravené sadby. Vzhledem
35
k vysoké citlivosti a minimální potřebě rostlinného materiálu pro vzorek, lze testovat
rostlinky odvozené z meristémů podstatně dříve neţ při ELISE. Jestliţe testujeme matečné
rostliny, například chmelu, je výhodné pouţít ELISA a pouze rostliny, které se jeví jako
zdravé, podrobit dodatečně citlivějšímu testu PCR (Petrzik a Svoboda 1997). Přitom lze navíc
vyuţít specifické IgG proti viru pro tzv. immunocapture PCR (imunopoutání, imunovázání)
(Wetzel et al. 1992).
Immunocapture PCR
Při této modifikaci PCR se nejprve na stěny mikrozkumavky naváţí IgG (podobně jako v
ELISA), následně se pipetuje šťáva z testovaných rostlin a po vymytí se do stejných
zkumavek pipetuje reakční směs pro PCR se specifickými primery. Výhodou této metody je
zvýšená citlivost a specifičnost a u některých virů odpadá nutnost izolace nukleové kyseliny
viru.
Přestoţe vyhodnocení produktu reakce PCR není obtíţné ani přístrojově náročné,
komplikuje moţnost pouţití PCR pro sériová stanovení. Zatímco termocyklery jsou
konstruovány k provedení 96 reakcí (počet reakcí na destičce pro ELISA), nanesení obsahu
zkumavek na gel je poměrně pracné.
Proto jsou vyvíjeny metody, které umoţňují provést například immunocapture PCR reakci
v termocykleru v destičce pro ELISA (Nolasco et al. 1993) a následně amplifikovanou DNA
detekovat hybridizací s digoxigeninem značenou sodou a vyhodnotit
barevnou reakci
(Rowhani et al., 1997).
V diagnostických laboratořích se PCR uplatní proto, ţe umoţňuje i detekci viroidů a
fytoplazem, jejichţ význam roste. Navíc podobně jako ELISA ji lze vyuţít i k detekci
fytopatogenních hub a bakterií. PCR lze tedy hodnotit jako objektivní metodu, citlivější neţ
ELISA (obr.11.), dostatečně expeditivní pro rutinní vyuţití v diagnostických laboratořích, i
kdyţ v tomto ohledu za ELISA dosud zaostávající.
36
4.0. Uchovávání standardů.
Uchovávání standardů, pozitivních virem infikovaných kontrol i zdravých rostlin
odvozených z meristémů, je v diagnostice rostlinných patogenů velmi významné. Představují
nejen srovnávací materiál, ale mohou i sníţit náklady na provedení testů.
Nejčastější a nejjednodušší je vysušení listů rostlin nad chloridem vápenatým v uzavřené
zkumavce. Pečlivě označené zkumavky uchováváme v chladicím boxu. Tato metoda je
vhodná především pro viry mechanicky přenosné, stabilní s vysokou koncentrací virionů v
rostlinných pletivech. Například virus ţluté mozaiky vodnice byl infekční po 20 letech
konzervace. Méně stabilní viry (rod Potyvirus) je vhodné kaţdoročně znovu naočkovat na
rostliny a následně připravit nové „konzervy“. Tím se však zvyšuje riziko kontaminace nebo
mutace viru.
Lyofilizace (vysušení sublimací) a zatavení vysušených vzorků do skleněných
ampulek je metoda uţívaná v mnoha laboratořích, kde je dostupný lyofilizační přístroj.
Podstatně prodluţuje moţnost uchování vzorků virů. Ampulky ukládáme většinou do
mrazícího boxu při 20 o C.
Uchování zdravých a infikovaných rostlin v tkáňových kulturách je velmi efektivní
metodou pro uchování obtíţně mechanicky přenosných virů dřevin a drobného ovoce nebo
těch, které nejsou mechanicky přenosné (rod Luteovirus). Laboratoře, které provádějí
ozdravení vegetativně mnoţených plodin tkáňovými kulturami, mají vyzkoušená vhodná
agarová média i způsob uchování rostlin v boxech.
37
5.0. Odběr, uchování a přeprava vzorků.
Správně provedený odběr, uchovávání a přeprava vzorků nemocných rostlin je
důleţitým předpokladem pro úspěšnou identifikaci původce choroby. U bylinných hostitelů je
ideální odebrat celou rostlinu včetně kořenů. Vzorky uchováváme v chladícím boxu
(nemrazíme!). Důleţitá je i průvodní dokumentace - údaje o lokalitě, odrůdě, provedených
agrotechnických zásazích, postřicích apod. a označení místa (například řádku, keře, stromu),
pro případné opakování odběrů. Pro přepravu je vhodné rostliny zabalit do vlhkého filtračního
papíru, mikrotenu a zvolit co nejrychlejší způsob přepravy do diagnostické laboratoře
(například EMS aj.). Je také velmi vhodné laboratoř předem upozornit na odeslání vzorků.
Jejich dobrý stav podstatně zvyšuje úspěšnost přenosu viru mechanickou inokulací nebo
roubováním na indikátorové rostliny, ale i provedení elektronmikroskopických,
imunologických a molekulárně biologických testů.
38
6.0. Legislativa, organizace a perspektivy fytodiagnostiky v ČR a
EU.
Laboratorní diagnostika je dním z klíčových článků rostlinolékařské péče v ČR.
Nedostatečný rozsah a zaostávání v kvalitě diagnostických sluţeb má za následek, ţe nejsme s
to se účinně bránit zavlékání nebezpečných karanténních organismů rostlin a jejich šíření na
území státu. Jsme v nevýhodě, máme-li vyvracet podezření, ţe rostlinný materiál exportovaný
z území ČR je infikován škodlivými patogeny rostlin. Zákazy vývozu některých komodit
mohou být případem skrytého antiimportního opatření.
EU poţaduje nejen sjednocení legislativy, ale i vybudování specializovaných laboratoří
nezbytných pro státní a mezinárodní kontrolu dodrţování právních předpisů a mezinárodních
smluv. Platná legislativa je dostupná na http://eagri.cz/public/web/srs/portal/
Základním právním dokumentem, kterým je vytvořeno institucionální postavení a obsah
činnosti Státní rostlinolékařské správy je zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o
změně některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 626/2004 Sb., zákona č. 444/2005
Sb., zákona č. 131/2006 Sb., zákona č. 189/2008 Sb., zákona č. 249/2008 Sb., zákona č.
227/2009 Sb., zákona č. 281/2009 Sb., zákona č. 291/2009 Sb., zákona č. 490/2009 Sb. a
zákona č. 102/2010 Sb..
Státní rostlinolékařská správa je správním úřadem rostlinolékařské péče, který působí
zejména v oblastech ochrany rostlin a rostlinných produktů proti škodlivým organizmům,
ochrany proti zavlékání organizmů škodlivých rostlinám a rostlinným produktům do České
republiky, registrace přípravků na ochranu rostlin a mechanizačních prostředků na ochranu
rostlin.
Zákon byl zpracován s ohledem na skutečnost přistoupení České republiky do Evropské
unie tzn., ţe z důvodu společného právního prostředí byly do zákona a příslušných vyhlášek
transponovány právní akty Evropských společenství v oblasti rostlinolékařské péče.
Základními prováděcími vyhláškami zákona 326/2004 Sb. upravující především
problematiku, která je z hlediska dodrţování zákona velmi závaţná a je proto nezbytné
podrobněji stanovit postupy a způsoby dodrţování příslušných ustanovení zákona jsou:
39
 Vyhláška č. 327/2004 Sb., o ochraně včel, zvěře, vodních organismů a dalších
necílových organismů při pouţívání přípravků na ochranu rostlin.
 Vyhláška č. 328/2004 Sb., o evidenci výskytu a hubení škodlivých organismů
ve skladech rostlinných produktů a o způsobech zjišťování a regulace jejich výskytu v
zemědělských veřejných skladech a skladech Státního zemědělského intervenčního
fondu.
 Vyhláška č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu
rostlin, ve znění vyhlášky č. 371/2006 a vyhlášky č. 146/2009 Sb.
 Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání
a šíření původce bakteriální krouţkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé
hniloby, ve znění vyhlášky č. 328/2008 Sb.
 Vyhláška č. 332/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání
a šíření původce rakoviny bramboru, háďátka bramborového a háďátka naţloutlého,
ve znění vyhlášky č. 75/2010 Sb.
 Vyhláška č. 333/2004 Sb., o odborné způsobilosti na úseku rostlinolékařské
péče.
 Vyhláška č. 334/2004 Sb., o mechanizačních prostředcích na ochranu rostlin,
ve znění vyhlášky č. 147/2009 Sb.
 Vyhláška č. 175/2005 Sb., o náhradách nákladů za odborné úkony provedené
Státní rostlinolékařskou správou.
 Vyhláška č. 215/2008 Sb., o optřeních proti zavlékání a rozšiřování
škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů, ve znění vyhlášky č. 159/2009
Sb. a vyhlášky č. 76/2010 Sb.
Vzhledem ke změnám a vzniku nových právních předpisů Evropské unie jsou vydávány
nové vnitrostátní právní normy nebo dochází aktuálně k novelizacím výše uvedených
příslušných právních předpisů.
Vyhláška č. 83/1997 Sb., obsahuje v souladu s předpisy EU více neţ 200 karanténních
škodlivých organismů, jejichţ diagnostiku je potřeba zajistit personálně a materiálně na
poţadované mezinárodní úrovni. V mnoha případech jde o druhy nové, s nimiţ nejsou u nás
praktické zkušenosti včetně údajů o jejich moţném výskytu na území republiky. Hlavní
40
příčinou je sloţitost diagnostiky většiny karanténních organismů, zejména virů, viroidů a
fytoplazem, ale i bakterií a hub. Ta vyţaduje nejen finančně náročné přístrojové vybavení, ale
zejména vysokou odbornou kvalifikaci pracovníků, srovnatelné s úrovní poţadovanou ve
veterinární oblasti. Důvodem jsou především poţadavky na průkaznost a srovnatelnost
výsledků, které mohou zajistit jen standardizované diagnostické metody např. ELISA.
Poţadavky evropské unie nejsou malé, na druhé straně je moţné vyuţít její pomoci ve
formě vědeckovýzkumných programů např. COST, rámcových programů např. 7th
Framework Program EU projekt QBOL (Vývoj nového diagnostického nástroje s pouţitím
DNA "barcoding" pro identifikaci karátnénních organizmů rostlin), .které umoţňují
spolupráci v rámci existujících sítí pracovišť a přesun nových technologií.
V rámci výzkumných programů např. EUPHRESCO http://www.euphresco.org/ byly
organizovány tzv. ring testy pro jednotlivé patogeny, při nichţ jsou porovnávány a vyvíjeny
diagnostické metody, které jsou posléze standardy členských a přidruţených zemí EU.
EUPHRESCO cílí na zvýšení spolupráce a koordinace národních programů ochrany rostlin na
úrovni EU vytvořením sítě výzkumných aktivit a vzájemného otvírání národních programů
pro zahraniční partnery. EUPHRESCO vytvořilo partnerství 24 organizací fytosanitárního
výzkumu v 17 zemích EU. Cílem je bránit zavlékání a šíření nových ekonomicky i pro ţivotní
prostředí škodlivých chorob a škůdců, zejména exotických, jejichţ počet trvale narůstá jako
důsledek expanze globálního obchodu s rostlinným materiálem.
Jestliţe dnes není problém vybavit laboratoř přístroji během několika měsíců, daleko
obtíţnější je vychovat specialisty nejen odborně, ale i jazykově zdatné, neboť fytokaranténa je
věcí mezinárodní. Je tedy nutné věnovat soustavnou pozornost výchově a vzdělávání
rostlinolékařů.
Velmi důleţité je i formulování priorit v oblasti vývoje diagnostických metod zejména
pro karanténní organismy. V zahraniční je běţným jevem vypisování grantových soutěţí na
řešení závaţných úkolů příslušným ministerstvem. To umoţňuje i vznik meziresortních
výzkumných týmů, schopných řešit daný problém v co nejkratší době.Je třeba pracovat na
obnovení komunikace mezi výrobci, šlechtiteli, orgány SRS, ÚKZÚZ, univerzitami i
vědeckovýzkumnými pracovišti v zájmu řešení problémů a zlepšení kvality rostlinolékařské
péče.
41
7.0. Seznam literatury
Alberts B. et al., Základy buněčné biologie, Espero publishing, ští nad labem 1998, 630 s.
Albrechtová L. Stanovení rostlinných virů dvojitou sendvičovou metodou ELISA s IgG
značenými alkalickou fosfatázou. In: Sborník referátů „Praktická diagnostika rostlinných
virů ELISA testem“, ČSVTS - VÚRV, Praha, 1986, 44 s.
Bojňanský a kol.: Vírusové choroby rastlín. SVPL, Bratislava, 1963, 540 s.
Bos L.: Plant viruses, unique and intriguing pathogens – a textbook of plant virology.
Backhuys Publishers Leiden. 1999. 358 s.
Brčák J.: Rostlinné viry. In: Urban Z.: Základy fytopatologie. Státní pedagogické
nakladatelství, Praha, 1983, s. 32-52.
Brunt A.A., Crabtree K., Dallwitz M.J., Gibbs A.J., Watson L. (eds.): Viruses of Plants. CAB
International, Wallingford, U.K., 1996, 1484 s.
Clark M.F., Adams A.N.: Characteristics of the microplate methods of enzyme-linked
immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. gen. Virol. 34:476-483, 1977.
Gallo J., Dědič P.: Vyuţitie niektorych modifikácií nepriameho ELISA na detekciu
rastlinných vírusov. In: Sborník referátů „Praktická diagnostika rostlinných virů ELISA
testem“, ČSVTS - VÚRV, Praha, 1986, 44 s.
Henson J.M., Frenbch R.: The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis. Annu.
Rev. Phytopathol. 31:81-109, 1993.
Hull R.: The potential for using dot-blot hybridisation in the detection of plant viruses. In:
Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing.
Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 3-12.
Hull, R. Comparative Plant Virology 2nd edition Academic Press. 2009, 376 s.
Huttinga H.: Sensitivity of indexing procedures for viruses and viroids. Advances in Botanical
Research 23:59-71, 1996.
Jermoljev E., Pozděna J.: Sérologie rostlinných patogenů. Academia, Praha, 1972, 264 s.
Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predetermined specificity. Nature 256:495-497, 1975.
Kůdela V. a kol.: Obecná fytopatologie. Academia, Praha, 1989, 388 s.
Martin R.: Use of double-stranded RNA for detection and identification of virus diseases of
Rubus species. Acta Hortic. 186:51-62, 1986.
Matthews R.E.F.: Plant Virology. 3rd edition. Academic Press, London 1991, 835 s.
Milne R.G.: New developments in electron microscope serology and their possible
applications. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus
testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s.179-192.
Murphy F.A., Faquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo
M.A., Summers M.D. (eds.): Virus Taxonomy. Springer Verlag Wien, 1993. 586 s.
Musil M., Kvíčala A., Lešková 0.: Diagnostika vírusov strukovín a datelinovín. Veda, SAV,
Bratislava, 1981, 175 s.
Nolasco G., de Blas C., Torres V., Ponz F.: A method combinig immunocapture and PCR
amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens.
J. Virol. Methods 45:201-218, 1993.
42
Ouchterlony 0.: Diffusion in gel methods for immunological analysis. Progr. allergy 5:1-78,
1958.
Petrzik K., Svoboda P.: Screning of apple mosaic virus in hop cultivars in the Czech Republic
by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta Virologica 41:101-103, 1997.
Roberts I.M.: Practical aspects of handling, preparing and staining samples containing plant
virus particles for electron microscopy. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments
and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K.,
1986, s. 213-246.
Rowhani A., Biardi L., Golino D.A.: Detection of viruses of woody host plants using
colorimetric PCR. Proc. 17. Internat. Symp. on Virus and Virus-like Diseases of
Temperate Fruit Crops, Bethesda, USA, 1997, s. 66.
Saiki R.K., Gelfand G.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.: Primer directed
enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. Science 239:487491, 1988.
Smith I.M., McNamara D.G., Scott P.R., Holderness M., Burger B.: Quarantine Pests for
Europe. CAB International, Wallingford, 1997, 1165 s.
Sutula Ch.L., Gillet, J.M., Morrisey S.M., Ramsdell D.C.: Interpreting ELISA data and
establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70:722-726, 1986.
Valverde R.A., Nameth S.T., Jordan R.L.: Analysis of double-stranded RNA for plant virus
diagnosis. Plant Disease 74:255-258, 1990.
Van Lent J.W.M., Verduin B.J.M.: Detection of viral protein and particles in thin sections of
infected plant tissue using immunogold labelling. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.):
Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists,
Wellesbourne, U.K., 1986, s. 193-212.
Van Regenmortel M.H.V.: The potential for using monoclonal antibodies in the detection of
plant viruses. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus
testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 89-102.
Vunsh R., Rosner., Stein A.: The use of polymeras chain reaction (PCT) for the detection of
bean yellow mosaic in gladiolus. Annals of Applied Biology 117:661-669, 1990.
Walkey D.G.A.: Applied Plant Virology. 2nd edition. Chapman and Hall, London, 1991, 338
s.
Wetzel T., Candresse T., Macquire G., Ravelonadro M., Dunez J.: A highly sensitive
immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox potyvirus detection. J.
Virol. Methods 39:27-37.
Zaitlin M., Hull R.: Plant-virus-host interactions. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:291-315, 1987
43

Diagnostika rostlinných virů - Biologické centrum AV ČR, vvi

Transkript

Podobné dokumenty

Počítačové viry - Masarykovo gymnázium Plzeň

POČÍTAČOVÉ INFILTRACE A PREVENCE

CHILDHOOD LINKS

Ponsetiho metoda léčby pedes equinovari congenitales

Katalog měřicích přístrojů Micronix 2015-16

samostatné cvičení

katalog ke stažení

KATEDRA INFORMATIKY PřF UP v OLOMOUCI

Viry - Kyberman.wz.cz

McAfee VirusScan