Prezentace aplikace PowerPoint

Moses Kunitz
(*19. 12. 1887- † 20. 4. 1978)
M. Kunitz izoloval a krystaloval
několik enzymů a jejich prekurzorů.
Přispěl k potvrzení skutečnosti, že
enzymy jsou svojí povahou proteiny.
Krystalizací RNasy a DNasy přispěl
ke znalostem funkce RNA a DNA.
Narodil se v městě Slonim (nyní v
Bělorusku) odkud odešel do USA, v
r. 1909 se usadil v NYC. Studoval na
Cooper Union School of Chemistry,
v r. 1916 získal bakalářský titul.
Pokračoval v oboru elektrické
inženýrství, v r. 1919 nastoupil na
Kolumbijskou
univerzitu
(1922
magisterské studium, 1924 Ph. D.).
zdroj: NAS,
Biographical Memoirs
Pokročilá studia absolvoval při zaměstnání (večerní kurzy), neboť
pracoval jako asistent u Jacquesa Loeba (1859-1974) na
Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum.
Po Loebově smrti nastoupil na vedoucí místo v r. 1924 John Howard
Northrop (1891-1987), který požádal Kunitze o pokračování v práci
na viskozitě, botnání a vlivu solí na vlastnosti proteinů. Spolupráce
Kunitz – Northrop trvala více než 30 let.
V r. 1926 odešel s Northropem do pobočky RÚ v Princetonu, kde se
rozvinul výzkum proteolytických enzymů. Northrop se věnoval pepsinu
a Kunitz trypsinu, tyto proteiny už tehdy byly dostupné komerčně.
Krystaly trypsinu byly získány v r. 1931, ale po náročné a únavné
proceduře. V r. 1933 navrhl Kunitz nový postup.
Trypsinogen z pankreatické šťávy byl stabilní ve studené zředěné
H2SO4. Takto bylo možné extrahovat nejen trypsinogen, ale i jiné
enzymy. Během frakcionačních experimentů objevil novou proteasu a
její proteasu. Pro schopnost srážet mléko nazval Kunitz prekurzor
jménem chymotrypsinogen a proteasu pak chymotrypsin.
Kunitzovi se podařilo krystalovat zymogeny a posléze i aktivní
enzymy. Zjistil, že konverze trypsinogenu na trypsin je
autokatalytická, přeměna chymotrypsinogenu na chymotrypsin pak
stejně tak probíhá působením trypsinu.
Během skladování čistého chymotrypsinu (α-chymotrypsin) si povšiml
toho, že vznikají aktivní autolytické produkty, které pojmenoval β- a
γ-trypsin.
Zajímavé bylo náhodné zjištění, že trypsinogen skladovaný v roztoku
HCl se proti očekávání aktivoval. Kunitz v zásobní láhvi HCl objevil
jako nečistotu plíseň, která produkovala proteasu štěpící trypsinogen.
Plíseň vyizoloval, napěstoval a z ní získal tuto proteasu, která mu
umožnila přípravu kvalitnějšího trypsinu z trypsinogenu.
Dalšími krystalovanými proteiny byly inhibitory trypsinu z pankreatu
a ze sóji. Nalezením inhibitoru v pankreatu byla zodpovězena otázka,
proč je tam trypsinogen inaktivní, když pH je optimální pro aktivaci.
Studoval i proces interakce s inhibitory.
V l. 1939-40 Kunitz izoloval RNasu z pankreatu. Zjistil, že tento protein
je extrémně stabilní a vydrží aktivní i po povaření. Později následovala
purifikace DNasy. Malá množství toho enzymu rozkládala DNA izolovanou
z pneumokoků (transformační princip – pokus Averyho, MacLeoda a
McCarthyho), což vedlo k potvrzení DNA jako nositelky dědičné
informace.
Kunitz také před válkou krystaloval hexokinasu a tři další enzymy.
Pro krystalizaci proteinů měl velký talent a kompetenci, jiné oddělení RÚ
vyvíjelo snahu krystalovat jistý rostlinný protein (v zájmu US
Ministerstva obrany), ale neúspěšně. Vzorek byl zaslán Kunitzovi s
žádostí o pomoc s krystalizací. Obdržel protein odpoledne, rozpustil ve
vodě, rozdělil na alikvoty a ve zkumavkách přidal postupně rostoucí
množství zředěné HCl. V jedné z prostředních zkumavek se objevil
precipitát. Do druhého dne protein v lednici vykrystaloval.
Po návratu do NYC a změně statutu RÚ na univerzitu se stal emeritním
profesorem. Jak o něm řekl jeho nadřízený J. H. Northrop, byl nápaditým
a trpělivým výzkumníkem s teoretickými znalostmi a technickým nadáním.
Byl schopen vyřešit každý problém, kterému se v laboratoři věnoval.
John Howard Northrop
(*5. 7. 1891 - †27. 5. 1987)
Americký biochemik Northrop prokázal,
že pepsin a trypsin jsou proteiny.
Důležitost toho výsledku byla ve
všeobecném pochopení, že enzymy jsou
proteinové povahy. V. r. 1946 získal
Nobelovu cenu za chemii spolu s
chemikem
Jamesem
B.
Sumnerem
(1887-1955) a biochemikem/virologem
Wendellem B. Stanleyem (1904-1971).
Byl potomkem anglických imigrantů ze 17.
stol., v rodu bylo několik vzdělanců a
podnikatelů. Oba jeho rodiče byli
zaměstnáni na univerzitě. Otec však
zemřel při požáru ještě před jeho
narozením. Matka syna vedla k přírodním
vědám. Navštěvoval Kolumbijskou kolej,
NYC, titul B. S. získal v r. 1912.
zdroj: NAS,
Biographical Memoirs
Magisterské studium chemie ukončil v r. 1913, spolu s ním studoval např.
George Scatchard (1892-1973), pozdější odborník na enzymovou
kinetiku. Jeho doktorské studium bylo zaměřeno na studium fosforu ve
škrobu (Ph. D. v r. 1915).
Jacques Loeb (1859-1974), biolog původem z Německa, ho přijal na
Rockefellerův ústav pro lékařský výzkum. Na Rockefellerově ústavu
(později univerzita), zůstal Northrop řadu let. V r. 1917 se oženil. Protože
nerad dojížděl do NYC, přešel do Laboratoře patologie živočichů při RU v
Princetonu, New Jersey (1926). V letním období pracoval v laboratoři ve
Woods Hole, Massachusetts. Měl syna a dceru.
Northrop byl fyzicky zdatný, provozoval kanoistiku, šermoval, střílel,
jezdil na koni, měl rád lov ryb i lov se psy (ale výzkum na zvířatech
považoval za nechutný). Měl však problémy se sluchem a vyhýbal se
vědeckým konferencím. Byl vcelku podnikavý (farmářství, výpravy na kanoi
– sjíždění peřejí). V redakci časopisu Journal of General Physiology
působil téměř 70 let jako editor.
S J. Loebem se nejdříve věnoval studiu environmentálních faktorů
ovlivňujících dědičnost (octomilky).
Zjistil, že octomilky žijí déle při nižší teplotě navzdory vyšší
energetické spotřebě. Mouchy pěstoval ve sterilních podmínkách
stovky generací ve tmě, což nemělo vliv na jejich životní parametry.
Během 1. světové války byla poptávka po výrobě nedostatkových
chemikálií, studovala se např. mikrobiální produkce acetonu. Northrop
vzpomínal v této souvislosti případ Chaima Weizmana (1874-1952),
později prvního prezidenta Izraele, který pomocí procesu
acetonového-butanolového-ethanolového kvašení cukrů (Clostridium
acetobutylicum) dokázal nahradit výpadek acetonu pro výrobu
výbušniny „cordite“ v Anglii. Britská vláda se odvděčila založením
Izraele.
Po skončení války se vrátil na RU, s Loebem studoval heliotropismus
krabů Limulus, Donnanovy rovnováhy. S Mosesem Kunitzem (18871978) sledoval micelární vlastnosti želatiny, s jinými kolegy pak např.
aglutinaci baktérií a krvinek.
Významný byl především výzkum kinetiky pepsinu a trypsinu včetně
inhibičního efektu některých produktů štěpení.
Povšiml si, že proteolytické enzymy nepoškozují struktury živých
organismů, zatímco mrtvé buňky jsou rychle rozkládány. Loeb zemřel
v r. 1924.
V Princetonu Northrop vytvořil skupinu s Kunitzem a Mortimerem
Louisem Ansonem (1901-1968). Dalšími členy byli nejdříve Albert
Krueger a pak Roger M. Herriott.
Northrop izoloval pepsin už v r. 1920, ale nebyl schopen ho
krystalovat. Úspěch J. B. Sumnera s krystalizací ureasy (1926)
znamenal návrat k pepsinu, který se podařilo získat v krystalickém
stavu (1929). Jeho proteinová povaha byla demonstrována řadou
experimentů (precipitační frakcionace). Důkazem byla nemožnost
oddělit protein od enzymové aktivity.
Pro další důkaz proteinové povahy se použil test rozpustnosti
(Sørensen), kdy s čistou látkou po určitém rozpouštěném množství
dostaví saturace. Změnami pH a koncentrace soli dostával křivky
rozpustnosti, které odpovídaly teorii pro jednu čistou látku.
V r. 1933 bylo v Evropě popsáno, že pepsinová aktivita se váže na proteiny
ze semen melounu, což se vysvětlovalo jako „přenos aktivní skupiny“ (proti
proteinové podstatě). Northrop opakováním postupu potvrdil tuto vazbu,
ale po okyselení roztoku pepsin příslušné proteiny rozštěpil a bylo možné
jej znovu získat nezměněný v krystalickém stavu.
V té době Kunitz pracoval na izolaci krystalického trypsinu. Northrop
studoval reverzibilní tepelnou denaturaci daného trypsinu a zjistil shodu
mezi aktivitou a obsahem proteinu během denaturace. To bylo jedním z
důkazů (kromě testů rozpustnosti), že trypsin je protein.
Dalším předmětem zájmu byly viry. Zkoumán byl virus mozaiky brambor a
virus mozaiky tabáku (TMV). Studovaly se bakteriofágy infikující kolonie
stafylokoků. Poté co Wendall Stanley na RÚ krystaloval TMV, věnoval se
Northrop od r. 1936 stafylokokovému fágu. Ze stovek litrů lyzátu
precipitoval fága a prokázal v něm nukleovou kyselinu, v TMV byla v té
době jinými potvrzena RNA. Role nukleových kyselin nebyla ještě známa,
předpokládalo se, že fágy vznikají z prekurzorových proteinů.
Následoval výzkum protilátek. Northrop připravil v krystalickém stavu
protilátku (antitoxin) vázající toxin záškrtu.
Během druhé světové války se zabýval metodikou detekce toxických
chemikálií.
V r. 1946 byl oceněn Nobelovou cenou za chemii, byla to první Nobelova
cena za práci vykonanou na RÚ. Na rok 1951 bylo ohlášeno zrušení
laboratoře v Princetonu. Northrop tedy přijal od r. 1949 místo profesora
na UCB na západním pobřeží (bakteriologie a biofyzika), kde se vrátil ke
studiu bakteriofága.
Zajímal se o buněčné změny v lysogenních buňkách Bacillus megatherium,
které indukovaly produkci fágů - fosfát inhiboval a hořčík zvyšoval.
Northrop ve svých závěrech předpověděl pozdější výsledky experimentů
Hersheye a Chaseové (1952) o důležitosti nukleové kyseliny jako
transformačního principu.
Lysosensitivní buňky jsou ty, které mohou být infikované fágem; přeživší
infikované buňky mohou nést virus v neinfekční (lysogenní) formě.
Northrop prokázal, že rychlost indukování produkce fágů u lysogenních
buněk je srovnatelná s rychlostí jejich mutace na rezistenci vůči
antibiotikům.
Northrop odešel do důchodu v r. 1962, jako 96ti letý spáchal sebevraždu.
Vincent du Vigneaud
(*18. 5. 1901- †11. 12. 1978)
Tento americký biochemik se narodil v
Chicagu jako syn vynálezce a konstruktéra
francouzského původu. Střední školu
ukončil v r. 1918, zde měl již zájem o
chemii. V posledním roce studia pracoval na
farmě a rozhodl se být farmářem, ale na
radu starší sestry začal studovat chemii na
Illinoiské univerzitě v Urbaně.
Během studia si přivydělával škubáním
kuřat, sbíráním jablek, prací v knihovně,
nebo jako číšník (na place se seznámil se
svou budoucí ženou). Diplomovou prací
prohloubil zájem na pomezí mezi biochemií
a organickou chemií (učitel Carl Shipp
„Speed“ Marvel, 1894-1988). Přednášeli
mu H. G. Lewis a W. C. Rose,
nutricionista, známý pokusy na potkanech.
Zdroj: Wiki
V r. 1924 získal VdV magisterský titul a přijal místo ve společnosti DuPont,
měl i kontakty s Všeobecnou nemocnicí ve Filadelfii. Na jaře 1925 obdržel
pozvání na Rochesterskou univerzitu, NY, provádět výzkumnou práci na
insulinu. Seznámil se tehdy s Hansem Thacherem Clarkem (1887-1972),
který byl později profesorem a vedoucím katedry biochemie na Lékařské a
chirurgické fakultě Kolumbijské univerzity.
V r. 1927 získal titul Ph.D. s prací o síře v insulinu, získal stipendium NRC a
pokračoval jako postdok na LF Univerzity Johnse Hopkinse (prof. John
Jacob Abel, 1857-1938 – po Poláku Napoleonu Cybulskim byl druhý, kdo
izoloval adrenalin; Oscar Paul Wintersteiner, Hans Jensen) ve studování
insulinu. Jiné stipendium umožnilo pobyt na KWI v Drážďanech (u Maxe
Bergmanna, 1886-1944, syntéza peptidů) nebo v Edinburghu.
Získal pak pozici na katedře fyziologické chemie na Illinoiské univerzitě v
Urbaně, kde pracoval tři roky. Od r. 1932 byl na LF Washingtonovy
univerzity ve Washingtonu jako vedoucí katedry biochemie. Od r. 1938 byl na
Cornellově univerzitě (LF) v Ithace, NY, katedra biochemie. Nobelovu cenu
za chemii získal v r. 1955, v r. 1967 se stal emeritním profesorem, ale dále
pracoval na katedře chemie. V r. 1974 prodělal mozkovou mrtvici a zemřel v r.
1978. Jeho děti jsou lékaři.
Jeho vědecká práce se týkala sloučenin obsahujících síru: insulin, cystein,
homocystein, methionin, cystathionin, biotin, penicilin, oxytocin a vasopresin.
V r. 1926 jeho mentor Abel získal krystalický insulin. VdV se zabýval
analýzou jeho aminokyselinového složení s použitím relativně primitivních
metod, dokázal přítomnost síry. Insulin byl předtím považován za jakýsi
koenzym, který působí pouze s proteinovou částí.
Ve 30. letech spolu s Ludwigem F. Audriethem vymysleli v Illinois techniku
S-benzylace cysteinu v kapalném amoniaku, našli tak chránící skupinu pro
peptidové syntézy.
V r. 1932 Bergmann a Zervas zavedli v Německu chránící skupinu
benzyloxykarbonyl, Boc, její odstranění z peptidů obsahujících síru se v
laboratoři VdV provádělo redukcí sodíkem v kapalném amoniaku. VdV
prostudoval vzájemný metabolismus Met, Cys, homocysteinu, cystathioninu a
cholinu. Rose ukázal, že Met může nahradit Cys v potravě potkanů, ale sám
je esenciální. Homocystein byl objeven jako produkt působení kys. sírové na
methionin; ukázalo se, že v potravě potkanů může nahradit Met.
Syntetizovali cystathionin a ukázali, že jím krmené krysy nepotřebují
cystein. Dokázali, že štěpením cystathioninu nevzniká homocystein.
U Clarka na Kolumbijské univerzitě Harold C. Urey připravoval D2O a
prvky obohacené o stabilní izotopy, což umožnilo efektivní studování
intermediárního metabolismu. S pomocí Met značeného na β- a γ-pozicï s 13C
a 34S, kterým krmil potkany, zjistil VdV, že do Cys se zabudovává pouze 34S
(keratin v srsti), „transsulfurace“.
Met -> homocystein (+Ser) -> cystathionin -> cystein + α-oxobutyrát
„Transmethylace“ byla objevena díky náhodě: experimenty s krmením
potkanů byly porovnávány výsledky Roseovy laboratoře. Byl-li homocystein v
potravě bez Met a Cys, Roseovy potkani přežili. Důvodem byla aditiva.
Skupina VdV používala vitamíny, Rose extrakt z rýžových otrub (obsahují
cholin!). Potkani v laboratoři VdV hynuli, tučná játra (cholin normálně
inhibuje vstup tuku do jater). Vyvstala otázka, zda je cholin donorem
methylů pro biosyntézu methioninu. Byl-li v potravě Met bez cholinu,
ztukovělá játra se neobjevila – Met donorem methylů pro biosyntézu
cholinu. To bylo prokázáno použitím CD3-Met.
Byl tak objeven princip „volného methylu“, původ methylu kreatinu z Met,
ukázali, že methyl z kreatinu není přenášen na homocystein. Zjistilo se, že
přenos CH3 z cholinu na Met a z Met na cholin je reverzibilní.
Primární donor methylu (S-adenosylmethionin) objevil až Giulio Cantoni.
Studium biotinu vzešlo ze spolupráce s Paulem Györgyim (1893–1976), který
našel faktor zvaný vitamín H (Haut = skin). Potkani s potravou obsahující
syrový vaječný bílek jako zdroj proteinů trpěli dermatitidou a nervovými
poruchami. Játra nebo kvasinky obsahovaly látku, která odstraňovala tyto
příznaky. Čistý biotin izolovaný Köglem a Tönnisem měl stejné účinky.
Struktura biotinu byla určena na Cornellově univerzitě (VdV).
Za války byl VdV přizván k práci na penicilinu (řada pracovníků na Cornellově
univerzitě), podíleli se na zpracování jeho chemické syntézy.
VdV se věnoval studiu hormonů ze zadního laloku hypofýzy – oxytocinu a
vazopresinu. Před válkou to byla např. purifikace, objev obsahu síry (cystinový
derivát). V r. 1947 byl izolován homogenní oxytocin, analýzou jeho aminokyselinového složení byl zjištěn obsah Cys-Cys, Glu, Asp, Gly, Ile, Leu, Pro a
Tyr plus tři moly amoniaku. Později byla se Sangerovým činidlem určena
sekvence a prokázán cyklický charakter peptidu. Amoniak pocházel z
deamidace Gln, Asn a glycinamidu. Pro potvrzení správnosti se přistoupilo k
chemické syntéze. Při odstranění chránících skupin redukcí v kapalném
amoniaku vznikl oxytocein s otevřeným řetězcem, jeho vzdušná oxidace
poskytla biologicky aktivní oxytocin.
Přišlo se na to, že 20ti členný kruh oxytocinu má preferovanou konformaci ,
která umožňuje správné složení a možnost vzniku disulfidové vazby.
Publikace o syntéze oxytocinu se objevila v JACS v roce 1953.
Současně se pracovalo i na vasopresinu. Bylo rovněž zjištěno, že jde o
cyklický peptid se dvěma aminokyselinový záměnami vůči oxytocinu : Ile
namísto Pha a Arg místo Leu (Arg-vazopresin) nebo Lys místo Leu (Lysvazopresin). Syntéza Lys-vasopresinu byla ukončena v r. 1960.
Ukázal se nový biologický princip, totiž že záměna AK v peptidovém
hormonu má výrazný dopad na biologické účinky.
Zajímavý byl systém jeho laboratoře – barevné paírky pro komunikaci s
podřízenými: papírky v barvě růžové – nové nápady, zelené – výsledky, bílé –
požadavky na servisní analýzy. Požadoval, aby výzkumníci předkládali každý
týden, třeba i neúplné.
Nobelovu cenu za chemii získal v roce 1955 za práci o biologicky
významných sírových sloučeninách, zejména za syntézu polypeptidového
řetězce.
Elmer Verner McCollum
(*3. 3. 1879 – †15. 11. 1967)
Byl americký biochemik známý pro
studie vlivu stravy na lidské zdraví.
Rodiče měli farmu v Kansasu, měl
bratra a tři sestry. Když mu bylo 10
let, otec onemocněl a mladý McCollum
se musel starat o hospodářství. V r.
1896 se rodina přestěhovala do
blízkosti Lawrence v Kansasu, kde
navštěvoval střední školu. Vzdělával se
čtením Encyklopedie Britanniky. Při
studiích
se
živil
zhášením
a
rozsvěcováním
pouličních
lamp,
pracoval v redakci Daily World. V r.
1900
nastoupil
na
Kansaskou
univerzitu, ve třetím ročníku získal
místo instruktora. Původně chtěl být
lékařem, od 2. ročníku byl ale
fascinován organickou chemií.
http://www.kansasmemory.org
Pokračoval magisterským studiem chemie, jeho diplomová práce se věnovala
analýzám plynu v dutých stoncích vodní lilie. V r. 1904 se přihlásil na Yaleovu
univerzitu, Ph. D. zde získal po dvou letech. Školitelem doktorátu byl Treat
Baldwin Johnson (1875-1947) na Sheffieldově fakultě přírodních věd.
Wiki
Připravoval a studoval pyrimidiny. Ve druhém ročníku prodělal zápal plic.
Profesor krystalografie mu pak slíbil, že mu uzná zmeškaný předmět, pokud
bude třikrát týdně posilovat ježděním na kánoi po řece. Trávil večery v
knihovně čtením svazků vědeckých časopisů. Přivydělával si doučováním,
získal školní vědomostní cenu 400 $. Před dokončením doktorátu začal v r.
1906 pracovat u Thomase Burra Osborna (1859-1929) na Connectituské
zemědělské experimentální stanici, analyzoval proteinové hydrolyzáty. Zde
se seznámil s postupem purifikace proteinů. Místo na Yaleově univerzitě se
mu však nepodařilo získat.
Od r. 1907 působil na Wisconsinské univerzitě v Madisonu jako instruktor
zemědělské chemie. Po získání místa se oženil, později měl syna a čtyři dcery.
Pod vedením prof. E. B. Harta zde byly jalovice krmeny jednodruhovou
rostlinnou potravou (kukuřice, pšenice, oves), analýza potravy pak ve spojení s
výsledky experimentů měla umožnit posoudit nutriční hodnoty. Bylo to
obrovské množství práce s minimálními výsledky (1907-1911).
Začal proto pracovat s potkany, které sám odchytil v maštali. První
laboratorní potkany pořídil v r. 1908 (poprvé použiti pro výzkum ve Spojených
státech). Spolupracoval v l. 1909-1916 s laborantkou Margueritou Davisovou.
Složení potravy bylo nejjednodušší možné, jen semena obilovin nebo hrách.
Pro optimální zajištění růstu a vývoje pak ale bylo třeba přidávat další
proteiny (kasein), vápník a „tuk podporující růst“ – vitamín A.
Nutriční hodnota pšenice a rýže se zvýšila přídavkem extraktu otrub (faktor
„antiberiberi“). Objev vitamínu A přišel v r. 1912, kdy s Davisovou zjistili,
že potkani dobře rostli po přídavcích másla a vaječného žloutku. Tento
faktor nebyl v sádle ani olivovém oleji. Zmýdelněním másla a suspendováním
nezmýdelnitelné části do olivového oleje získali kýžený efekt. Stejný faktor
byl i v etherovém extraktů listů. Výsledky byly publikovány v JBC v r. 1913.
McCollum a C. Kennedy postulovali v r. 1916 dva nutriční faktory pro
potkany: A (rozpustný v tucích) a B (rozpustný ve vodě). V l. 1916-1929
spolupracoval s Ninou Simmonds. Na leden 1917 byl pozván přednášet do
Harveyovy společnosti. Dostal při zpáteční cestě nabídku na místo profesora
a vedoucího katedry hygieny (později biochemie) na Univerzitě J. Hopkinse,
které přijal. Při vstupu USA do 1. světové války se stal členem poradního
týmu prezidenta Hoovera pro výživu.
V r. 1918 vydal své zvané přednášky na Harvardu jako úspěšnou knihu The
Newer Knowledge of Nutrition. Přednášel v amerických městech o správné
skladbě výživy. Ve 20. letech vedl letní školy na univerzitách.
V r. 1918 pozoroval rachitický stav potkanů s nevyváženým poměrem Ca/P v
potravě, úleva se dostavila s malým množstvím oleje z tresčích jater.
Spolupráce s J. Howlandem – testováno 300 různých experimentálních
zdroj: Bibliographical Memoirs
http://www.nbs.csudh.edu/chemistry/faculty/
nsturm/CHE452/16_Vitamin%20A%20and%20
Vision.htm
výživových přídělů, s tím probíhaly histologické studie páteře. Zjistili, že
hlavními faktory správného růstu páteře byly zdroj a množství dodaného
tuku bez ohledu na obsah vitamínu A a poměr Ca/P. Jelikož je vitamín A
snadno zničitelný oxidací, v r. 1922 byl navržen pokus s provzdušněním
zahřátého oleje z tresčích jater přičemž zůstala zachována antirachitická
aktivita. Takto se došlo k novému vitamínu D.
S pomocí testu, kdy se přidával zkoumaný vzorek k potravě vyvolávající
akutní křivici bylo v r. 1921 zjištěno, že sluneční světlo chrání před tímto
onemocněním.
Se studentem Cosmo Mackenziem pracoval na vitamínu E a svalové dystrofii
potkanů a králíků, která byla léčena přídavkem alfa-tokoferolu. Nefungovalo
však u lidí. Jiní studenti se věnovali studiím s kvantifikací thiaminu v
biologickém materiálu (H. Prebluda, 1939).
Během kariéry studoval význam stopových prvků – fosforu, hořčíku,
manganu atd. Výzkum byl podpořen dlouhotrvajícím grantem Rockefellerovy
nadace. Ve 30. a 40. letech byl členem mnoha národních i mezinárodních
výborů a poradních sborů pro výživu, i při Společnosti národů. Ovlivňoval
výzkum v laboratořích při Národní korporaci mléčných výrobků.
Byl proti obohacování chleba a mouky vybranými vitamíny a železem, navrhoval
použití pevného netučného materiálu z mléka, droždí a klíčky pšenice a
kukuřice. Věnoval se i vztahu výživy k problematice zubního kazu, podporoval
fluoridaci vody.
Na sklonku života se zabýval možnostmi jak získat určité aminokyseliny z
proteinových hydrolyzátů, např. V r. 1960 byl spoluautorem patentu pro
čištění glutaminu.
Jen v JBC 90 publikací!
Stanford Moore
(*4. 9. 1913 - †23. 8. 1982)
Moore získal v r. 1972 Nobelovu
cenu za chemii spolu s Christianem
B.
Anfinsenem
(1916-1995)
a
Williamem H. Steinem (1911-1980),
všichni za výzkum ribonukleasy
(vztah mezi sekvencí a strukturou,
vztah mezi strukturou aktivního
místa a katalytickou aktivitou).
Jeho
rodiče
se
poznali
na
Stanfordově
univerzitě,
odkud
dostal křestní jméno. Jeho otec na
univerzitách vyučoval právo, v r.
1924 získal místo na Vanderbiltově
univerzitě v Nashvillu.
zdroj: NAS,
Biographical Memoirs
S. Moore chtěl původně být učitelem, ale zaujala ho chemie, kterou od
r. 1931 na Vanderbildtově univerzitě spolu leteckým inženýrstvím. Ve
třetím ročníku se pod vlivem učitele zaujal organickou chemií a v r.
1935 v oboru chemie získal bakalářský titul jako vynikající student.
Pokračoval ve studiu ve Wisconsinu, kde diplomovou práci vypracovával
u Karla Paula Linka (1901-1978), objevitele antikoagulantu warfarinu,
který měl zkušenosti z pobytu u nobelisty Fritze Pregla (1869-1930)
ve Štýrském Hradci, specialisty na mikroanalytické techniky. To mělo
velký vliv na pozdější zájem o vývoj nových metod automatizované
analýzy. Studoval tehdy reakci fenylendiaminu se sacharidy, vzniklé
krystalické benzimidazoly bylo možné použít pro identidikaci
monosacharidů.
V r. 1939 dokončil disertaci a dostal nabídku na vědeckého pracovníka
v laboratoři Maxe Bergmana (1886-1944), žáka Emila Fischera
(1852-1919), na Rockefellerově ústavu pro medicínský výzkum v
NYC, který zde pracoval po přesídlení z Německa v r. 1934. Mooreův
výzkum byl zaměřený na strukturní chemii proteinů se zájmem na
gravimetrické stanovení aminokyselinového složení.
Do laboratoře se připojil W. H. Stein, který
ukázal
výhodu
použití
aromatických
sulfonových kyselin pro selektivní precipitaci
aminokyselin a sledování rozpustnosti s
korekcí na obsah rozpuštěné (neprecipitované aminokyseliny).
V době války (od r. 1941) dvojice pracovala na
válečném výzkumu, např. fyziologických
účinků zpuchýřujících plynů na molekulové
úrovni, za účelem vývoje léčiv. Od r. 1942
Moore narukoval a pracoval na několika
místech v USA. Max Bergmann zemřel v r.
1944 a jeho oddělení zaniklo. Po válce ředitel
RÚ Herbert Spencer Gasser (Nobelova cena
za fyziologii a medicínu v r. 1944) nabídl
Mooreovi a Steinovi prostory bývalého
oddělení pro pokračování aminokyselinové
analýzy.
Williamem H. Stein
(1911-1980)
V té době byla v Anglii vyvinuta rozdělovací chromatografie (A.J.P.
Martin a R.LM. Synge). Nabízela se tak pro analýzu aminokyselin,
současně chemik Lyman C. Craig (1906-1974) na RÚ ověřoval
frakcionaci peptidových antibiotik.
Kolonová chromatografie byla postavena na bramborovém škrobu a
dvoufázové směsi alkohol/vodný roztok kyseliny pro eluci. Pro detekci
AK v eluátu používali ninhydrinovou reakci známou od r. 1911, pro
reprodukovatelné výsledky prováděnou v přítomnosti redukovadla
(SnCl4). Eluát byl sbírán ve frakcích a zbarvení měřeno na
spektrofotometru. Zpočátku to šlo manuálně, pak byl vyvinut
automatický sběrač s počítadlem kapek (světelné hradlo).
V r. 1949 byla metoda optimalizována, takže pro určení AK složení v
hydrolyzátu bylo třeba tří běhů (14 dní). Analyzovány byly proteiny
beta-laktoglobulin a sérový albumin, potřebné množství bylo 5 mg a
chyba do 5 %. Pro každou analýzu byla nová kolona.
Nepraktický škrob byl posléze nahrazen iontoměničem (sulfonátovaná
polystyrenová pryskyřice).
K eluci sloužily citrátové a acetátové pufry o rostoucím pH a koncentraci
při různé teplotě. Problémy se standardizací byly překonány použitím
nových chromatografických materiálů. Obsah AK byl analyzován v
různých tělních tekutinách.
V r. 1948 začal Frederick Sanger (1918-2013) se spolupracovníky v
Anglii analyzovat primární strukturu řetězců insulinu metodikou
vycházející ze štěpení polypeptidu na malé peptidy, jejich separace a
určení sekvence. Moore byl u Sangera na stáži v r. 1950.
Moore a Stein si v 50. letech vybrali pro určení sekvence ribonukleasu,
paralelně vztah struktury a funkce studoval Christian B. Anfinsen
(1916-1995) v Bethesdě.
Hydrolýza oxidovaného proteinu proběhla s trypsinem, peptidy se
separovaly na iontoměniči a analyzovalo jejich složení. Pro poskládání
peptidů do sekvence enzymu se vycházelo z překryvů nalezených
chymotrypsinovým a pepsinovým štěpením. Rychlost byla limitována
aminokyselinovou analýzou.
Stein a Moore svoje metody a přístroje nikdy nepatentovali. Po smrti
Moore odkázal majetek Rockefellerově univerzitě.
Od r. 1956 se pracovalo na automatickém aminokyselinovém
analyzátoru dokončeném v první verzi do r. 1958. Oproti manuální
analýze vzorku trvající až tři dny (stovky měření na
spektrofotometru) se doba analýzy nakonec zkrátila až na hodinu a o
několik řádů se zvedla citlivost.
Úplná primární struktura RNasy byla publikována v r. 1963, o šlo
o první takto analyzovaný enzym. Následovala analýza inaktivace
enzymu jodoctovou kyselinou a byla nalezena místa zásahu v aktivním
místě v závislosti na pH. Práce na RNase byla oceněna Nobelovou
cenou za chemii pro Moorea, Steina i Anfinsena.
Rozsah další výzkumu rostl s množstvím studentů a postdoktorandů.
To vedlo k určení sekvence DNasy z pankreatu, strukturním
analýzám pepsinu a dalších hydrolas, studiu mechanismu reakcí
proteinů s inhibitoru apod.
V r. 1969 Stein po nemoci ochrnul, ale spolupráce dále pokračovala.
John Machlin Buchanan – „Jack“
(*29.9. 1917- †25.6. 2007)
Buchanan byl americký biochemik známý pro
svůj zásadní podíl k objevu biosyntézy purinů.
Jeho kariéra spadá do období po r. 1938, které
je možné považovat za dobu rozkvětu
biochemie.
Jeho motivací byly průkopnické nutriční studie
metabolismu AK u zvířat (W.C. Rose a
Howard B. Lewis) z 20. let 20. stol. Už jako
student se zapojil do využití radioizotopového
značení .
Narodil se v Indianě, chemie se stala jeho
zálibou na střední škole. Jako student
bakalářského studia na DePauwově univerzitě
se zapojil do vědeckého projektu (syntéza k.
mandlové), což vyústilo ve spoluautorství
publikace v JACS.
zdroj:
NAS, Biographical
Memoirs
Po přečtení knihy Physiological chemistry získal zájem tímto směrem.
Magisterské studium absolvoval na Michiganské univerzitě, kde Katedru
biochemie vedl Howard Lewis. Vzdělání ukončil v r. 1939, experimentálně se
zabýval studiem konkanavalinu A.
Pokračoval na Lékařské fakultě Harvardovy univerzity v Cambridge, kde
získal stipendium na Katedře biologické chemie u A. B. Hastingse. Byla tam
interdisciplinární skupina využívající cyklotron jako zdroj radioaktivního
izotopu 11C (s poločasem 20 min), studovala se glukoneogeneze z mléčné
kyseliny, k dispozici bylo Geigerovo počitadlo. Experimenty byly maximálně
čtyřhodinové, využívalo se značeného laktátu a CO2.
Práce s řezy potkaních a králičích jater in vivo potvrdila inkorporaci 11CO2
jako jednoho za atomů glukosy při biosyntéze glykogenu. Pokračovalo se s
výzkumem biosyntézy glykogenu z mastných kyselin – 1-11C značený acetát,
propionát a butyrát. Kyseliny se sudým počtem atomů uhlíku byly už tehdy
známé jako neglukogenní.
Na Katedře fyziologické chemie Pensylvánské univerzity se pracovalo se
stabilními isotopy 13C a 15N a k dispozici byl hmotnostní spektrometr,
předmětem byl metabolismus acetoacetátu. Acetoacetát se sledoval v
jaterních řezech po metabolizaci 1-13C oktanoátu.
Biosyntéza purinů
Již v době práce na ústředním metabolismu důkladně četl Krebsovy práce
včetně těch, které se zabývaly biosyntézou močoviny, metabolismem
aminokyselin a puriny.
Na počátku byl schopný student John Sonne, který v roce 1945 hledal
zajímavou práci v laboratoři. Náhodou se zajímal o nemoc dnu, proto se
dohodli na práci k objasnění biosyntézy močové kyseliny.
Krebs předtím prokázal, že první purinem syntetizovaným v řezech holubích
jater je hypoxanthin. Stará představa byla, že močová k. vzniká z močoviny
a tříuhlíkaté sloučeniny. Protože nešlo pracovat s řezy (kvůli množství) , byly
pokusy konány na holubech, urikotelní organismus.
Počítali s tím, že 3C prekurzorem je mléčná kyselina, krmili holuby 1-13Claktátem. Zjistilo se zabudování 13C do C6 atomu urátu (prováděna chemická
degradace urátu), ověřeno že 13CO2 se zabudovával do C6. Z 1-13C-acetátu se
izotop zabudovával do C2 a C8 (Sam Gurin) a ne do C4/C5, jak se
předpokládalo, bylo to z kontaminace, potvrzena mravenčí kyselina jako
donor. Jako další 2C donor se nabízel glycin, zkoušeli 1-13C –glycin, potvrzen
pro C4. Protože neměli 15N-glycin, krmili holuby 15N-amonnými solemi a
neznačeným glycinem – izotopové ředění v N7 a N9.
Během jednoho roku pak našel tým i prekurzory N1, N3 a N9, nebylo to v
in vivo systému (rychlá výměna) . Předpokládalo se studium enzymových
reakcí. Buchanan tak odjel na vědeckou dovolenou k Hugo Theorellovi do
Švédska (1946). Mezi mladými vědci tam byli např. i Anfinsen a de Duve.
Anfinsen a Buchanan purifikovali akonitasu, tehdy byly k dispozici pouze
precipitace a elektroforéza. Seznámil se zde se svou ženou Elsou Nilsby.
Po návratu do USA se od r. 1948 opět věnoval biosyntéze purinů. V té době
G. Robert Greenberg (foto) na Univerzitě Západní zálohy (Western
Reserve zjistil, že hypoxanthin se tvoří ve formě inosinové kyseliny.
Skupiny J. Buchana a A. Kornberga (s kolegy jako první potvrdil PRPP
jako prekurzor pro tvorbu AMP z adeninu) purifikovaly dvě
fosforibosyltransferasy specifické pro Hyp/Gua resp. Ade. Následně
se ukázalo, že PRPP vstupuje do biosyntézy purinů v úvodní fázi
biosyntézy.
V r. 1953 Buchanan přijal nabídku odejít na MIT (Massachusetský
technologický ústav) a začal vést Oddělení biochemie při Katedře
biologie. Na MIT pokračovaly isotopové studie s pomocí 15N a
hmotnostního spektrometru. Tým použil značené metabolity a
ethanolovou frakci holubích jater. Prokázali, že N3 a N9 pochází z
amidu glutaminu a N1 z aminoskupiny aspartátu.
Lidé z laboratoří Buchanana a Greenberga našli metabolity
fosforibosylglacinamid
(GAR)
a
fosforibosylformylglycinamid
(FGAR). FGAR se podařilo akumulovat díky inhibici enzymu
zabudovávajícího glutamin do FGAR pomocí analogu Gln – azaserinu.
Mapování celé biosyntetické dráhy bylo ukončeno v r. 1956.
Později se zájem přesunul od biosyntézy purinů ke spojení mezi Met,
vitaminem B12, perniciosní anémií, puriny a biosyntézou DNA. K dispozici byly
mutantní kmeny E. coli vyžadující Met. Jeden z mutantů byl defektní v
syntéze vitamínu B12 a přídavek toho vitamínu srovnával potřebu Met.
Výsledkem bylo zjištění, že 5-methyltetrahydrofolát je donorem methylu
pro methylaci homocysteinu na methionin v přítomnosti ATP.
V příslušné homocysteinmethyltransferase je koenzymem vitamin B12, který
váže na svém kobaltovém iontu methyl (tvoří se methyl-kobalamin) z 5methyl-THF a předává jej na homocystein.
Ukázalo se rovněž, že přenos methyl na homocystein je vlastně regenerací
THF, ke které je nutná přítomnost vitamínu B12. Byla taky ukázána
důležitost katalytická role S-adenosylmethioninu (methioninový cyklus).
Dalším studovaným tématem byly bakteriofágy. V. 50. a 60. letech 20.
století byly tyto viry modelem pro studium replikace DNA a biosyntézy
proteinů. V laboratořích v Cold Spring Harbor bylo jinými vědci (Flaks,
Cohen) zjištěno, že bakteriální DNA syntetizovaná v přítomnosti fága T má
hydroxymethylovaný deoxycytosinmonofosfát, což zprostředkovává fágem
indukovaný enzym dCMP-hydroxymethylasa (koenzym: 5,10-methylen-THF).
V Buchanově laboratoři našli fágem kódovaný enzym dCTPasu tvořící dCMP,
což potlačuje tvorbu bakteriální DNA.
V Buchananově laboratoři se fágům mj. věnoval Salvador Luria, popisovali
funkce fágových genů.
Na počátku 60. let se zájem přesunul k regulaci procesů syntézy
„prvotních“ proteinů (na počátku infekce), což vede k supresi bakteriální
DNA a replikaci fágové DNA. Po začátku syntézy fágové DNA tyto
proteiny mizí a pak se objevují „pozdní“ proteiny. Zjistilo se, že syntéza
fágových proteinů funguje jako regulace transkripce specifických mRNA.
Regulace buněčného růstu byla dalším předmětem zájmu. Takový faktor se
hledal např. v krevním séru, jehož růstový účinek byl znám. Vzhledem k
tomu, že v r. 1970 byl popsán trypsin jako růstový stimulátor, Buchananův
tým se zabýval rolí koagulační proteasy thrombinu.
Thrombin byl následně popsán jako mitogen. Efekt je dán proteolytickým
uvolňováním určitých proteinů z povrchu buněk (mj. fibronektin). Tato
aktivita však není jediná, jde i o vazbu na receptory.
Finálním projektem byl výzkum proteinů, které se účastní procesů
transformace působením RNA virů (např. RSV), např. tyrosinkinasa.
Poslední publikaci vydal v r. 1986.
Merton Franklin Utter
(*23. 3. 1917 - †28. 11. 1980)
Utter přispěl k vysvětlení reakcí
glukoneogeneze popsáním odlišností
vůči glykolýze. Se spolupracovníky
objevil fosfoenolpyruvátkarboxykinasu
(PEPCK) a pyruvátkarboxylasu. Taktéž
objevil význam těchto enzymů pro
regulaci sacharidového a lipidového
metabolismu. Zjištění regulačního
účinku
acetyl-CoA
na
pyruvátkarboxylasu bylo jedním z prvních
příkladů alosterické kontroly enzymů.
Regulace PEPCK insulinem, glukagonem,
adrenalinem a glukokortikoidy byla
studována jako model účinku hormonů
na genovou expresi. Jeho laboratoř
patřila ke špičce studia vrozených
poruch metabolismu pyruvátu.
zdroj: NAS,
Biographical Memoirs
Utter se narodil ve Westboro, Missouri, kam rodiče odešli z
Wisconsinu, pak se přestěhovali fo Iowy. Otec byl bankéř (zahynul při
autonehodě v r. 1935) a matka vyučovala hru na piano.
Od r. 1934 studoval na metodistické Simpsonově koleji v Indianole,
kterou ukončil v r. 1938. Dále studoval chemii na Iowské státní
univerzitě (ISU) v Amesu, v r. 1942 zde získal doktorát
(miktobiologie) a stal se asistentem.
Oženil se v r. 1939, od r. 1944 manželé přesídlili do Minneapolis, kde
se Utter stal asistentem na univerzitě. Od r. 1946 zakotvili v
Clevelandu, kde získal místo na Lékařské fakultě (Univerzita západní
rezervy), od r. 1956 byl profesorem, v l. 1965-76 byl vedoucím
Katedry biochemie. V průběhu celé doby působení v Clevelandu strávil
tři roky na hostování v cizině (Austrálie, Oxford, Leicester).
Jeho první výzkumné práce v Iowě se zabývaly přípravou
fermentačních enzymů z baktérií. Pro homogenizaci se používalo
zařízení vytvořené ze dvou v sobě umístěných Erlenmeyerových
baněk.
Pro studium mikrobiálního sacharidového metabolismu se využívalo
izotopu 13C. Utterovy výsledky ze 40. let ukázaly, že mikroorganismy
sdílejí podobné metabolické dráhy s živočichy.
H. G. Wood a C. H. Werkman objevili v r. 1936 fixaci CO2
heterotrofními organismy a navrhli schéma:
*CO2 + CH3COCOOH = HOO*CCH2COCOOH
V r. 1948 S. Ochoa, A. H. Mehler (fotorespirace = Mehlerova
reakce) a A. Kornberg purifikovali jablečný enzym:
CO2 + pyruvát + NADPH = malát + NADP
Uvažovala
se
spřažená
reakce
jablečného
enzymu
a
malátdehydrogenasy, která by vedla k tvorbě oxalacetátu. Utter s
Kurahashim však ukázali, že v kuřecích játrech se tvoří oxalacetát bez
jablečného enzymu a izolovali PEPCK, která katalyzuje reakci:
PEP + CO2 + GDP = oxalacetát + GTP
Vzhledem k záporné změně Gibbsovy energie bylo jasné, že
fosfoenolpyruvát nemůže vzniknout přímo z pyruvátu.
Utter a nezávisle H. A . Krebs (1900-1981) navrhli kombinaci reakce
jablečného enzymu, malátdehydrogenasy a PEPCK. Ale v kuřecích
játrech byly jen stopy jablečného enzymu.
V r. 1963 byla v mitochondriích kuřecích jaterních buněk nalezena
pyruvátkarboxylasa. Ve spojení s PEPCK se tak z pyruvátu vytváří
oxalacetát:
Pyruvát + ATP + GTP = PEP + ADP + GDP + Pi
Tato cesta tvorby PEP je klíčovou reakci udílející rychlost
glukoneogenezi a je modelovým příkladem pro regulaci metabolických
drah.
Pro určení struktury pyruvátkarboxylasy bylo ve 2. pol. 60. let využito
elektronové mikroskopie, čímž byla nalezena forma tetrameru
odpovídající přítomnosti 4 biotinů v molekule.
PC z bakterie Rhizobium
Vědělo se, že karboxylasa v chladu
disociuje na podjednotky a ztrácí
aktivitu, a že při zpětné asociaci se
vrací aktivita. I zjištěný tetramer
takto
disocioval,
nicméně
se
později ukázalo, že ve skutečnosti
sledovali jiný protein, nečistotu v
preparátu.
Správná
tetramerní
struktura
pyruvátkarboxylasy tak byla určena
až později (1979)
Na sklonku kariéry se Utter věnoval metabolickým nemocem v
souvislosti s pyruvátem, např. laktické acidóze u dětí. Analyzovali ve
vzorcích fibroblastů, retikulocytů a lymfocytů aktivity klíčových
enzymů
metabolismu
pyruvátu
(pyruvátdehydrogenasy,
pyruvátkarboxylasy, PEPCK a pyruvátkinasy)
Joshua Lederberg – „Josh“
(*23.5. 1925- †2.2. 2008)
Lederberg by americký biochemik
známý pro práci v oblasti mikrobiální
genetiky,
umělé
inteligence,
byl
spolupracovníkem vesmírného programu
NASA. Bylo mu pouhých 33 let, když v
r. 1958 získal Nobelovu cenu za
fyziologii a medicínu za objevy v
souvislosti s rekombinací a organizací
genetického materiálu baktérií. Cenu
tehdy dostali i G.W. Beadle a E. L.
Tatum (taktéž genetika).
Byl židovského původu. Narodil se v
New Jersey, jeho otec byl ortodoxním
rabínem. Krátce se po narození se
rodiče přestěhovali do NYC. Měl dva
mladší bratry.
Zdroj: wiki
Předpokládalo se, že bude rabínem. Už na základní škole četl knihu
Introduction to Physiological Chemistry a trávil čas v knihovně. V r. 1938
nastoupil na Stuyvesantovu střední školu v NYC s přípravou na vědu,
techniku, inženýrství a matematiku.
V r. 1941 nastoupil na Kolumbijskou univerzitu (v 16ti letech!) ke studiu
zoologie, a to se zkušenostmi z prázdninové výzkumné práce (American
Institute Science Laboratory). Jeho mentorem se stal Francis J. Ryan,
který jako postdok pracoval na Stanfordu u genetiků George Wells
Beadleho (1903-1989) a Edwarda Lawrie Tatuma (1909-1975), kteří se
zabývali mutagenezí plísně Neurospora crassa rentgenovými paprsky a
sledováním změn v metabolismu daných specifickými enzymy; odtud vzešla
teorie „jeden gen, jeden enzym“.
Předmětem experimentální práce Lederberga v laboratoři byla stejná plíseň,
Ryan ho učil provádět biochemické a genetické experimenty, psát záznamy o
výsledcích. Od r. 1943 plnil vojenskou službu v nemocnici US námořnictva
St. Albans na Long Islandu a pokračoval ve studiích. V nemocnici analyzoval
vzorky krve a stolice námořníků z Tichomoří kvůli parazitům (malárie).
V r. 1944 získal bakalářský titul a přešel na Fakultu lékařství a chirurgie.
G. W. Beadle
E. L. Tatum
Jeden gen – jeden enzym: myšlenka, že geny fungují prostřednictvím
enzymů. Odvozena byla z výsledků experimentů s plísní Neurospora crassa,
což je považováno za první významný výsledek molekulární biologie (1941).
Záhy se přišlo na to, že jde o velké zjednodušení skutečného stavu, upravená
formulace je „jeden gen – jeden polypeptid“, ale ani ta nevyjadřuje skutečné
vztahy mezi geny a proteiny. Beadle začal s výzkumy na drozofile (oční
pigmenty) v 30. letech. Pokusy s N. crassa využívaly rentgenového záření a
selekce metabolických mutantů na různých médiích, předpokládalo se, že je
ovlivněna jedna metabolická dráha (chybějící AK či vitamín).
Inspirován pokusem Averyho, MacLeoda a McCartyho (1944), který
potvrzoval molekulu DNA jako nositele dědičné informace při transformaci
pneumokoků prováděl transformaci Neurospora crassa.
Mutant, se kterým pracoval však nevykazoval stabilní transformaci. Práce
se přesunuly k využití baktérie Escherichia coli, připravoval nutriční
mutanty, sledoval rekombinaci a zabýval se sexuálním cyklem baktérií
(výměna gen. Informace při kontaktu buněk). Uvědomil si, že by potřeboval
alespoň dvojité nutriční mutanty, aby bylo možné jasně interpretovat
výsledky zvratů mutací.
V r. 1945 přešel Tatum na Yaleovu univerzitu do New Havenu a měl k
dispozici dvojité mutanty E. coli K-12. V l. 1946-1947 přijal Lederberga k
provedení potřebných experimentů. Lederberg and Tatum ukázali, že E. coli
může sdílet genetickou informaci cestou konjugace. V r. 1946 se Lederberg
oženil s Tatumovou a Beadleho studentkou (Esther M. Zimmer) a v r. 1947
získal na Yaleově univerzitě Ph.D.
Místo návratu na Kolumbijskou univerzitu a získání MD se Lederberg
rozhodl přijmout místo odborného asistenta na Katedře genetiky na Fakultě
zemědělství Wisconsinské univerzity v Madisonu.
Mechanismy přenosu genů u baktérií
Zde pracoval se svou ženou a studentem Nortonem Zinderem. V r. 1951
Lederberg a Zinder ukázali, že genetický materiál může být přenesen z
jedné bakteriální buňky Salmonella typhimurium do druhé pomocí viru (fágu
P22) jako prostředníka. Tento proces se nazývá transdukce. Rozdíl oproti
konjugaci je, že není nutný kontakt buněk a oproti transformaci není
přenášena isolovaná DNA.
V r. 1956 M. Laurance Morse, Esther Lederberg a Joshua Lederberg
objevili specializovanou transdukci u baktérie E. coli K-12. DNA fága
lambda se inkorporuje do bakteriálního chromozómu poblíž genů pro
metabolismus galaktosy. Přenášet pak může pouze geny umístěné poblíž
tohoto místa. Objevy transdukce vysvětlily možnost získání antibiotikové
rezistence.
Lederbergovi s L. L. Cavallim objevili též infekční fertilitní faktor F
(plazmid) u E. coli K-12, což byl jeden ze zásadních objevů molekulární
genetiky. Vyvinuli chromogenní substrát pro měření aktivity β-galaktosidasy,
což usnadnilo analýzu lac operonu. Potvrdili také při přenosu bakteriálních
mutantů otiskem, že mutace se nemusí objevovat v důsledku odezvy na
selektivní podmínky, ale může vznikat i bez nich. To už ostatně v r. 1943
naznačil Luria-Delbrückův experiment.
V r. 1957 byli Lederbergovi na pobytu v Austrálii, kde svými experimenty
ukázali, že protilátky se tvoří v klonech lymfocytů (jedna protilátka proti
jednomu antigenu).
V souvislosti s vypuštěním Sputniku se zabýval Lederberg problematikou
mimozemského života (exobiologie). V souvislosti s možným zavlečením
mikroorganismů na jiné planety či Měsíc a naopak zdůrazňoval důležitost
vypracování experimentů pro důkaz E.T. života a prosadil v NASA sterilizaci
a karanténu kosmických lodí.
V r. 1957 založil na Wisconsinské univerzitě katedru lékařské genetiky.
Po obdržení Nobelovy ceny (prosinec 1958) působil od ledna 1959 na lékařské
fakultě Stanfordovy univerzity (katedra genetiky). Do Stanfordu tehdy
přešel i Arthur Kornberg (vedl tam katedru biochemie), krátce poté dostal
Nobelovu cenu. Tyto dvě osobnosti přispěli k vedoucí úloze fakulty v
biomedicínském výzkumu. Na genetiku do Stanfordu Lederberg přizval např.
Leonarda A. Herzenberga (v r. 1970 vyvinul FACS) nebo Luigiho Lucu
Cavalliho-Sforzu (od r. 1970 profesor na Stanfordu).
Na Stanfordu se Lederberg dále zabýval bakteriální genetikou, zejména
DNA transformací u baktérie Bacillus subtilis.
Spolu s fyzikem Elliotem Levinthalem od r. 1960 rozvíjel přístrojovou
laboratoř podporovanou NASA, kde se pak řešila zadání v souvislosti s
detekcí známek biologické aktivity na Marsu (sondy Viking, 1975).
V návaznosti na práci pro NASA se vzdělával v oblasti výpočetní techniky. V
60. letech napsal svůj počítačový program DENDRAL pro výpočet
chemických struktur z hmotnostních spekter. S financemi od NIH
vybudoval počítačové zázemí pro medicínský výzkum.
V r. 1966 se rozvedl s první ženou a v r. 1968 se znovu oženil s lékařkou
Marguerite Stein Kirsch.
V článku z r. 1978 sepsal úvahy o významu elektronické komunikace pro
vědu, přístupu k vědecké literatuře a databázím.
V r. 1978 odešel Lederberg ze Stanfordu, protože se stal prezidentem
Rockefellerovy univerzity v NYC, funkci vykonával 12 let. Po odchodu na
odpočinek založil genetickou laboratoř a vrátil se k výzkumu.
Během své kariéry se zabýval též veřejným vystupováním ve prospěch vědy,
poradenstvím pro vládu a soukromé instituce, otázkami zdravotnictví
(infekční nemoci). Byl aktivní v řadě komisí a poradních orgánů.
Earl Reece Stadtman
(1919 -2008)
Stadman byl americký biochemik, který se
věnoval studiu enzymů a anaerobních
baktérií. V r. 1979 získal za své objevy
energetického metabolismu baktérií medaili
od prezidenta Jimmy Cartera. Byl vedoucím
biochemické laboratoře na Národním ústavu
srdce. Byl manželem Theresy Stadtman
(*1920) která objevila selenocystein a
zabývala se studiem selenoproteinů.
Narodil se v Novém Mexiku, střední školu navštěvoval v San Bernardinu,
Kalifornie. V r. 1942 získal bakalářský titul na Kalifornské univerzitě v
Berkeley (půdní vědy). V době války strávil rok na Aljašce ve vojenské
službě. Po návratu kontaktoval biochemika Horace A. Barkera, u kterého
předtím pracoval jako laboratorní asistent. Pracoval na problematice
hnědnutí sušeného ovoce. Zde potkal budoucí ženu Theresu Campbell.
V magisterském studiu po válce spolu s Barkerem studovali metabolismus
mastných kyselin u baktérie Clostridium kluyveri. Barker byl rok
postdokem v Holandsku u mikrobiologa a biochemika Alberta J. Kluyvera
(1888-1956) na Technické škole v Delftu, který v r. 1926 přišel s vizí, že
na biochemické úrovni jsou všechny organismy sjednocené.
Pojem
„komparativní biochemie“, se kterým přišel, znamenal extrapolaci dějů
studovaných u baktérií na vyšší organismy.
Baktérie Clostridium kluyveri produkuje z ethanolu krátké mastné
kyseliny. Barker se věnoval této biosyntéze a potvrdil, že ethanol je
přeměňován na acetát, který kondenzuje s dalším acetátem za vzniku
butyrátu, z butyrátu se pak takto tvoří kaproát. Našel tak princip skládání
dvouhlíkatých stavebních kamenů, přičemž využíval radioaktivní izotop 14C.
Barker se domníval, že aktivní formou acetátu pro biosyntézu mastných
kyselin je acetylfosfát. Stadtman se připojil k experimentům vedoucím ke
sledování metabolických drah prostřednictvím 14C. S pomocí Irwina C.
Gunsaluse z Cornellovy univerzity se naučil připravovat bakteriální
extrakt. S tímto extraktem pak bylo možné sledovat reakce konverze
ethanolu a acetátu na mastné kyseliny a též jejich oxidaci. Bylo to
průlomové proti domněnce, že MK se tvoří jen ve specializovaných
buňkách nebo organelách.
Objevili fosfotransacetylasu, později Stadtman při postdoktorálním pobytu
u Fritze Lipmanna zjistil, že aktivní formou acetátu v biosyntéze je acetylCoA. V r. 1949 získal na Kalifornské univerzitě titul Ph.D.
Spolu se svou ženou pak pracoval od r. 1950 v Národních ústavech zdraví
(NIH) v Bethesdě, Maryland. Pokračovalo se ve výzkumu mastných kyselin.
V r. 1952 připravil Stadtman acetyl-CoA in vitro s použitím
fosfotransacetylasy. Se studentem P. R. Vagelosem zjistili, že biosyntéza
MK zahrnuje enzymový komplex, ve kterém se využívá malonyl-CoA jako
zdroj aktivního acetátu.
Dalším dlouhodobým předmětem zájmu byl enzym glutaminsynthetasa.
Aktivita enzymu je ovlivňována zpětnovazebnou inhibicí sedmi odvozených
produktů. Stadtman prokázal, že inhibice je kumulativní. Synthetasa je k
této inhibici citlivá pouze v důsledku adenylace působením adenylyltransferasy (Atasa). ATasa je regulována uridylyltransferasou (UTasa)
prostřednictvím uridylace regulačního proteinu. Uridylovaný protein PII
stimuluje deadenylaci glutaminsynthetasy.
Na konci 70. let a počátkem 80. let Stadtman a P. Boon Cook teoreticky
analyzovali bicyklický kaskádový regulační systém enzymů. In vivo studie
tohoto tématu zahrnovaly permeabilizované buňky E.coli s inakt. UTasou.
Mahlon Bush Hoagland
(*5. 10. 1921 – †18. 9. 2009)
Hoagland byl americký biochemik, který
objevil tRNA
a přispěl k příchodu
molekulární biologie.
Narodil se v Bostonu, jeho otec vystudoval
Harvard v oboru fyziologie chování.
Pracoval na Clarkově univerzitě ve
Worcesteru , Massachusetts, v l. 1961-64
byl prezidentem Americké akademie umění
a věd.
V r. 1940 nastoupil na Williamsovu kolej a 1941 přešel na Harvard.
Vzhledem k válečné potřebě lékařů pokračoval od r. 1943 na Lékařské
fakultě Harvardovy univerzity s předpokladem stát se chirurgem. V r.
1945 prodělal těžkou tuberkulózu. Ačkoli se neléčil tehdy novým
streptomycinem, stimulovalo to jeho zájem o medicinální výzkum.
Po návratu na Harvard promoval v r. 1948. Protože však měl recidivu nemoci,
nestal se lékařem, ale přešel k výzkumu. Získal místo v Huntingtonově
laboratoři ve Všeobecné nemocnici státu Massachusetts (MGH), kde se
věnoval toxikologickému výzkumu berylia, přičemž Hoagland se
spolupracovníky potvrdil, že berylium inhibuje alkalickou fosfatasu, což má
za následek dekalcifikaci kostí a prokázal jeho roli v tvorbě osteosarkomů.
Paul Zamecnik (1912-2009), vedoucí skupiny ze stejné laboratoře, měl
zkušenosti z pobytu v Carlsberské laboratoři v Kodani (1939-1940,
přerušenou okupací Dánska) u K. Linderstrøma-Langa a zajímal se o vztah
mezi růstem buněk a proteosyntézou. Hoagland odjel v r. 1951 kvůli nabytí
zkušeností v oblasti biochemie do Carlsberské laboratoře, kde spolupracoval
s Hermanem Kalckarem.
Po návratu na MGH pracoval jako postdok u Fritze Lipmanna. Zabýval se
biosyntézou koenzymu A z panthotenátu. Pozdější Hoaglandův výzkum byl
předurčen Lipmannovým nápadem, že pro proteosyntézu musí být
aminokyseliny energeticky aktivovány.
Při studiu proteosyntézy v bezbuněčném systému z potkaních jater
připraveném jeho kolegy si povšimnul si, že při tom aminokyseliny podléhají
ATP-dependentní reakci vedoucí k tvorbě pyrofosfátu.
Klíčovým objevem týmu byla transferová
RNA. Zamecnik již dříve zkoušel, zda
bezbuněčný systém provádějící proteosyntézu
může vyrábět i RNA, tehdy nebylo o roli RNA
v proteosyntéze nic známo.
Do systému proto přidal 14C-CTP, jako
kontrolu dal do jiné zkumavky 14C-značenou
aminokyselinu a zjistil, že se inkorporuje.
J. Biol. Chem. 1956, 218:
345-358
Hoagland a spol. pak prokázali, že po aktivaci
se AK vážou na „rozpustnou“ RNA (1958). V
dalších experimentech s dávkou štěstí tak
byla nalezena chybějící část genové exprese.
Příslušná RNA byla nazvána rozpustná, protože nebyla součástí
mikrosomálních
ribonukleoprotoeinových částic (vlastně se jednalo o
ribosomy) z potkaních jater. Na jaře 1957 navštívil Hoaglanda a Zamecnika
Francis Crick. Ten pozval Hoaglanda pracovat k sobě do Cambridge
studovat problém kódování AK při translaci.
Paul Zamecnik
Pobyt u Cricka však nebyl úspěšný. V r. 1960 získal Hoagland první post na
fakultě: na Katedře bakteriologie a imunologie, LF, Harvard. Předmětem
jeho zájmu byla regulace buněčného růstu v regenerujících játrech potkanů
při částečné hepatektomii na úrovní translace.
V r. 1967 mu byla nabídnuta pozice šéfa katedry biochemie na Lékařské
fakultě univerzity v Dartmouthu, Massachusetts. Worcesterská nadace
pro experimentální biologii, kde působil jeho otec Hudson Hoagland, mu ve
stejném roce nabídla uvolněné místo prezidenta, které nejdříve odmítl, v
roce 1970 však napodruhé přijal, protože byl v Darthmouthu nespokojen.
Jeho nástup na toto místo byl spojen s rozhodnutím prezidenta Nixona
podpořit výzkum proti rakovině (National Cancer Act, 1971) jasným
mechanismem financování z Kongresu.
V 70. letech ustoupil od výzkumné práce a začal se věnovat přednášení pro
laickou veřejnou, psaní knih a lobování zájmové skupiny pro základní
biomedicínský výzkum (kde byli i A. Kornberg a J. Watson). Na odpočinek
odešel v r. 1985. O vědu se zajímal až do osmdesátky, zejména o výzkum
RNA, kde přišel velmi důležitý objev RNA interference a miRNA.
Daniel Edward Koshland Jr.
(*30. 3. 1920 – †23. 7. 2007)
Koshland byl americký biochemik. Působil
na Kalifornské univerzitě v Berkeley
(UCB),
byl
dlouholetým
editorem
časopisu Science.
Pocházel z židovské rodiny, jeho otec
Daniel
E.
Koshland
Sr.
byl
obchodníkem a v l. 1955-58 vysokým
manažerem ve firmě Levi Strauss & Co.
Po střední škole studoval chemii na UCB,
jeho učitel Wendell Mitchell Latimer
(1893-1955) byl zpochybněným objevitelem tritia v r. 1933. Chemickou
fakultu tehdy vedl Gilbert Newton
Lewis (1875-1946), který postuloval
valenční teorii a teorii acidobazických
reakcí. Poté, co Koshland Jr. získal
bakalářský titul, byl ve válečných letech
odmítnut v námořnictvu.
Zdroj: Annu. Rev. Biochem.
Na přímluvu Latimera byl přijat ke spolupráci na Projektu Manhattan.
Pracoval v týmu Glenna Theodora Seaborga (1912-1999) na Chicagské
univerzitě. Podílel se na izolaci a charakterizaci chemických vlastností
plutonia (1941-1946).
Po válce se rozhodl dokončit studium, což proběhlo na univerzitě v Chicagu.
Pracoval u Franka Henryho Westheimera (1912-2007), předmětem bylo
aplikování chemických postupů pro studium biologické problematiky. S
použitím izotopu 14C se studovala glykolýza, značená glukosa se připravovala
reakcí arabinosy s H14CN. Zde také získal Ph.D. v oboru organická chemie
(1949). Na katedře chemie působili v té době i nobelisté Harold Clayton
Urey (1893-1981) objevitel deuteria (1934) a původce teorií o vzniku
života na zemi nebo Willard („Bill“) Frank Libby (1908-1980), který
přispěl k objevu radiokarbonové metody datování (1949), či Henry Taube
(1915-2005), anorganik, který studoval mechanismy přenosu elektronů v
komplexech kovů.
Postdok pobyt vykonal na Harvardu u Paula Doughty Bartletta (19071997). Získaval zde zkušenosti v oblasti mechanismů enzymových reakcí a
krystalizace enzymů,
spolupracoval s nobelistou Fritzem Albertem
Lipmannem (1899-1986). Zaměstnání získal v Národní laboratoři v
Brookhavenu na Long Islandu, kde pracoval do r. 1964.
Na Brookhavenu se Koshland zabýval enzymy a jejich stereochemií. Zde v r.
1958 publikoval svou teorii indukovaného přizpůsobení enzymů, práce se
objevila v časopisu PNAS. Bylo postulováno, že enzymová molekula musí být
flexibilní a substráty nebo aktivátory svoji vazbou mohou indukovat novou
strukturu proteinu.
Nová teorie šla proti teorii zámku a klíče Emila Fischera (1852-1919) z
roku 1894 a trvalo dlouho, než byla přijata. Bylo k tomu třeba mnoho
experimentů, zejména krystalografických (jeden recenzent např. psal, že
„Fischerova stoletá teorie nemůže být překonána spekulacemi vědeckého
embrya“). Finální potvrzení vzešlo až z prací krystalografů Williama Nunna
Lipscomba Jr. (1919-2011), později nositele Nobelovy ceny za chemii v r.
1976 za struktury boranů, a Thomase Artura Steitze (*1940), později
nositele Nobelovy ceny za chemii v roce 2009 za strukturu podjednotky
ribosomu 50S, kteří analyzovali struktury enzymů karboxypeptidasy A
aspartáttranskarbamoylasy v přítomnosti ligandů. V roce např. 1967
publikovali v časopisu PNAS strukturní změny u karboxypeptidasy v komplexu
s glycyl-L-tyrosinem.
Problematika svalové kontrakce byla studována s pomocí H218O a svalů
humra. V reakci ATPasy nedocházelo k zabudování 18O do ADP, pouze do
odštěpeného fosfátu (1953). Koshland učil na Rockefellerově univerzitě.
V 80. - 90. letech se Koshlandův tým na UCB, kam předtím přešel z
Brookhavenu, zabýval fosforylací proteinů u baktérií. Objevili první
bakteriální fosfoprotein isocitrátdehydrogenasu (1982) – fosforylace zde
vede k inaktivaci; dále prokázali, že náhrada serinu za negativně nabitý
zbytek aspartátu mutagenezí má stejný efekt jako fosforylace serinu
tohoto enzymu (1987). Ukázali také, že regulaci chemotaxe baktérie E. coli
zprostředkovává protein CheY, který se reverzibilně fosforyluje na Asp
zbytku a má funkci fosfatasy (1989).
Kromě přednášení a experimentování na UCB Koshland od r. 1984 působil 9 let
jako editor časopisu Science. Jeho první manželkou byla imunoložka Marian
Elliott Koshland (1921-1997), která se zabývala specifičností protilátek.