RANK Pardubice 2014

Analýza velkých delecí a duplikací v genu FBN1 u
pacientů s Marfanovým syndromem
Dvořáková M.1,2, Cibulková P.1,2, Křenková R.1,2, Indráková J.1,2, Richterová R.1,2
1Laboratoř
lékařské genetiky – úsek molekulární biologie, Laboratoře AGEL a.s.
2 Vzdělávací a výzkumný institut AGEL, o.p.s. – pobočka Nový Jičín, Laboratoře AGEL, a.s.
Marfanův syndrom (MFS) je dědičné autozomálně dominantní onemocnění pojivové tkáně s incidencí 1 : 5 - 10 000. Přibližně u 25%
pacientů se MFS vyskytuje v důsledku de novo mutace. Klinicky se vyznačuje velkou variabilitou. Mezi hlavní příznaky patří poruchy
kardiovaskulárního systému – především dilatace a disekce vzestupné aorty, očního systému – ectopia lentis a kosterního systému –
pectus carinatum nebo excavatum, arachnodaktylie a další. Klinická diagnostika se řídí revidovanými Ghentskými kritérii*.
Příčinou onemocnění jsou mutace v genu FBN1 (15q15-q21.1). Produktem tohoto genu je extracelulární glykoprotein fibrillin-1, který
je součástí elastických i non-elastických mikrofibril pojivových tkání. Dalšími geny, které jsou asociovány s MFS jsou TGFBR2 (3p22)a
TGFBR1 (9q22).
Nejčastější příčinou vznik chybného proteinu fibrillinu-1 je missence nebo nonsense mutace (65%), dále pak splicingové mutace
(11%), malé delece nebo inzerce v rozsahu 1-20 nukleotidů (21%) a jako nejméně časté jsou velké delece a duplikace (3%, zdroj:
HGMD). V námi vyšetřovaném souboru pacientů tvoří velké delece nebo duplikace 0,5% mutací.
DNA byla izolována z periferní krve. Následná MLPA analýza (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) byla provedena kity
Marfan syndrom-1 a Marfan syndrom-2 (MRC-Holland) (schéma metody obr. 1). Pro vyhodnocení byl použit software Coffalyser.net
(MRC-Holland). V případě pozitivního záchytu bylo Sangerovým sekvenováním ověřeno, že se nejedná o sekvenční změnu v místě
sondy.
1. Denaturace a hybridizace
Představujeme
výsledky
dvou
pacientů,
kteří
byli
vyšetřeni
v
rámci
našeho
PCR primer sekvence Y
PCR primer sekvence X
souboru. U těchto pacientů, kteří splňují revidovaná Ghentská kritéria, byly
Stuffer sekvence
zjištěny
velké
delece
genu
FBN1.
Hybridizace sekvence (nalevo)
Hybridizace sekvence (vpravo)
V prvním případě se jedná o deleci exonu 10 (obr. 2). Konfirmace výsledku byla
provedena sekvenací exonu 10. Tím byla vyloučena přítomnost sekvenční změny
v místě nasedání sondy, která by neumožnila její nasednutí a způsobila by
2. Ligace
falešně pozitivní výsledek (obr. 3).
Pacient splňuje diagnostická
kritéria. Má dilataci aorty a
systémové skóre je rovno 7
3.PCR s univerzálními primery X a Y
(elongovaná oční bulva, přízexponenciální amplifikace pouze amplifikovaných prób
nak zápěstí a palce, zkrácený
horní segment, strie, obličejové znaky).
2. Fragmentační analýza
Obr. 1: Schéma MLPA analýzy
obr. 2: Vyhodnocení MLPA analýzy (kit Marfan-2)° pacienta s delecí exonu 10
(červená šipka)
obr. 3: Konfirmační sekvenace exonu 10
(černě vyznačena sonda)
V případě druhého pacienta se jedná o deleci exonů 7
až 66 (obr. 4 a 5). Ověření
delece nebylo z důvodu
jejího rozsahu provedeno.
obr. 4: Vyhodnocení MLPA analýzy (kit Marfan-1)° pacienta s delecí exonů 7-66
(červené šipky)
Pacient splňuje diagnostická kritéria. Má dilataci
aorty a systémové skóre je
rovno 7 (myopie, příznak
zápěstí a palce, skolióza,
plochá noha, obličejové
znaky a elongovaná oční
bulva).
obr. 5: Vyhodnocení MLPA analýzy (kit Marfan-2)° pacienta s delecí exonů 7-66
(červené šipky)
Tyto delece nejsou uvedeny v databázích mutací a nebyly popsány v odborné literatuře. Vzhledem k jejich rozsahu
předpokládáme, že se jedná o kauzální mutace a u pacientů lze potvrdit Marfanův syndrom na molekulární úrovni.
Na případech těchto dvou pacientů lze demonstrovat fenotypovou variabilitu onemocnění, která nemusí korespondovat s
molekulárně
genetickým nálezem.
* Faivre L. et al.: The new Ghent criteria for Marfan syndrome: What do they change?, Clin Genet 2012: 81:433-442
° pro analýzu byly použity kity Marfan-1 P065 (lot B1-0511 ) a Marfan-2 P066 (lot B1-0511) společnosti MRC-Holland